CN116287139A - 检测金黄色葡萄球菌的方法 - Google Patents

检测金黄色葡萄球菌的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116287139A
CN116287139A CN202211716362.1A CN202211716362A CN116287139A CN 116287139 A CN116287139 A CN 116287139A CN 202211716362 A CN202211716362 A CN 202211716362A CN 116287139 A CN116287139 A CN 116287139A
Authority
CN
China
Prior art keywords
staphylococcus aureus
protein
optionally
magnetic beads
egfp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211716362.1A
Other languages
English (en)
Inventor
李建
李之琦
赵锋
詹文瑶
赵琦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chengdu University
Original Assignee
Chengdu University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chengdu University filed Critical Chengdu University
Publication of CN116287139A publication Critical patent/CN116287139A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/44—Staphylococcus
    • C12R2001/445—Staphylococcus aureus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提出了一种吸附磁珠。所述吸附磁珠包括：Ni‑聚甲基丙烯酸酯磁珠；结合蛋白，所述结合蛋白用于结合金黄色葡萄球菌，所述Ni‑聚甲基丙烯酸酯磁珠和结合蛋白相连。在本发明中，该吸附磁珠中的结合蛋白可结合金黄色葡萄球菌，将该吸附磁珠加入到待测样本中，通过结合蛋白结合金黄色葡萄球菌，进而可实现吸附磁珠对金黄色葡萄球菌的捕获和富集，有助于后续金黄色葡萄球菌检出。本发明的吸附磁珠和试剂盒及金黄色葡萄球菌的检测方法，菌种培养步骤减少，检测时间短，检测效率得到了切实提高。

Description

检测金黄色葡萄球菌的方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体地，本发明涉及一种检测金黄色葡萄球菌的方法，更具体地，本发明涉及一种吸附磁珠及其用途、试剂盒和用途以及检测金黄色葡萄球菌的方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌(S.aureus)在自然界广泛分布，其易污染牛奶、蔬菜等食品，是导致人类和动物感染的主要病原体之一。金黄色葡萄球菌可产生毒力因子，包括与中毒性休克综合征、食物中毒和严重过敏性疾病以及自身免疫性疾病相关的肠毒素、脱落毒素、中毒性休克综合症毒素-1和泛素-瓦伦丁白细胞素。有报告表明，金黄色葡萄球菌广泛存在于生奶和乳制品中。近年来，金黄色葡萄球菌已成为继沙门氏菌和副溶血性弧菌之后的第三大食源性微生物病原体。由于缺乏有效、快速和可视化的检测方法，金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件时有发生。
因此，亟需建立一种快速、灵敏可大批量应用的检测方法。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种检测金黄色葡萄球菌的方法，该方法可有效检测金黄色葡萄球菌。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
现如今开发了几种快速检测和鉴定食品样品中金黄色葡萄球菌的方法，如聚合酶链反应(PCR)、酶联免疫传感器以及基于核酸的分子生物学方法，这些先进的微生物检测方法将检测时间从几天缩短到几个小时，但仍然存在一些局限性，例如，这些方法通常价格昂贵，需要高科技实验室设备和熟练的技术人员，并且不能用作现场检测方法。此外，在偏远地区，实验设备的缺乏严重地限制了食源性病原体的检测。
噬菌体为特异性感染细菌的病毒，又称为“细菌病毒”，其大小通常在20～200nm之间，生命周期短(约20min～60min)，并被公认为地球上最丰富的生物实体，数量约达到1031种，在细菌内可能也会有细菌相应的噬菌体存在，噬菌体在微生物生命的生态平衡中发挥着重要作用。噬菌体的主要结构可分为核衣壳或头部，复杂的尾部结构与基部。头部衣壳和尾部由蛋白质组成，头部衣壳内含有噬菌体的遗传物质核酸DNA或RNA。衣壳附着在带有纤维的尾巴上，用于识别并粘附于细菌细胞表面的受体。
免疫磁珠分离技术(IMS)为免疫学技术与磁珠相结合的技术，原理主要是通过将特异性抗体与磁珠结合制备为免疫磁珠，再与混合溶液中特异性抗原相结合，通过磁分离作用，使目的抗原与其余杂质彻底分离，从而达到富集分离的目的。与传统方法相比，不仅具有快速简单，而且还可提高检测的灵敏度与真实性。
基于此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种吸附磁珠。根据本发明的实施例，所述吸附磁珠包括：Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠；结合蛋白，所述结合蛋白用于结合金黄色葡萄球菌，所述Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠和结合蛋白相连。
发明人还发现，该吸附磁珠中的结合蛋白可结合(尤其是可特异性结合)金黄色葡萄球菌。将该吸附磁珠加入到待测样本中，通过结合蛋白可结合金黄色葡萄球菌，进一步通过磁分离作用实现磁珠对金黄色葡萄球菌的捕获和富集，有助于后续对其进行检测，减少菌种培养步骤，缩短检测时间，提高检测效率。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种前述的吸附磁珠在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测金黄色葡萄球菌。由前可知，吸附磁珠中的结合蛋白可结合金黄色葡萄球菌，进而可实现吸附磁珠对金黄色葡萄球菌的捕获和富集，以便分离获取金黄色葡萄球菌。由此，含有上述吸附磁珠的试剂盒可对金黄色葡萄球菌进行检测，且具有检测时间短和检测效率高等优点。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：前述的吸附磁珠。由前可知，吸附磁珠中的结合蛋白可结合金黄色葡萄球菌，进而可实现吸附磁珠对金黄色葡萄球菌的捕获和富集，以便分离获取金黄色葡萄球菌。由此，含有上述吸附磁珠的试剂盒可对金黄色葡萄球菌进行检测，且具有检测时间短和检测效率高等优点。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种前述的吸附磁珠或前述的试剂盒在制备产品中的用途，所述产品用于检测金黄色葡萄球菌。由前可知，吸附磁珠中的结合蛋白可结合金黄色葡萄球菌，进而可实现吸附磁珠对金黄色葡萄球菌的捕获和富集，以便分离获取金黄色葡萄球菌；并且，含有上述吸附磁珠的试剂盒可对金黄色葡萄球菌进行捕获和富集，以便分离获取金黄色葡萄球菌。由此，采用本发明的产品可对金黄色葡萄球菌进行检测，且具有检测时间短和检测效率高等优点。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种检测金黄色葡萄球菌的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：采用前述的吸附磁珠或前述的试剂盒对待测样本进行接触处理，以便检测所述待测样本中是否含有金黄色葡萄球菌或所述金黄色葡萄球菌的含量。如前所述，利用前述吸附磁珠或试剂盒可结合金黄色葡萄球菌，以实现对金黄色葡萄球菌的捕获和富集，因此，本发明的方法无需对其进行菌种培养即可实现对金黄色葡萄球菌的检测，具有检测步骤简化、检测时间短和检测效率高等优点。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为本发明实施例1中80αendolysin不同结构域与克隆片段示意图；
图2为本发明实施例2中80αendolysin不同结构域蛋白纯化图；
图3为本发明实施例3中荧光显微镜、流式细胞仪检测对不同蛋白和金黄色葡萄球菌的结合情况分析结果图；
图4为本发明实施例3中Western检测对不同蛋白和金黄色葡萄球菌的结合情况分析结果图；
图5为本发明实施例4中不同浓度的NaCl对EGFP-amidase 3-CBD蛋白稳定性的分析结果；
图6为本发明实施例4中不同温度对EGFP-amidase 3-CBD蛋白稳定性的分析结果；
图7为本发明实施例4中不同pH对EGFP-amidase 3-CBD蛋白稳定性的分析结果；
图8为本发明实施例5中pET28a-EGFP-RBP重组质粒的双酶切电泳图，其中，(A)为PMV-RBP与pET28a-EGFP双酶切电泳图，(B)为pET28a-EGFP-RBP双酶切电泳图；
图9为本发明实施例5中EGFP-RBP蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳图，其中，(A)为EGFP蛋白电泳图，(B)为EGFP-RBP蛋白电泳图；
图10为本发明实施例6中EGFP-RBP与金黄色葡萄球菌的结合情况，其中，(A)为荧光显微成像结果，(B)为流式细胞仪定量分析结果，(C)为Western Blot结果；
图11为本发明实施例7中EGFP-RBP-Ni磁珠制备荧光显微镜验证结果；
图12为本发明实施例7中EGFP-amidase 3-CBD-Ni磁珠捕获金黄色葡萄球菌的结果图，其中，(A)为EGFP-amidase3-CBD-Ni磁珠在荧光显微镜下的观察结果，(B)为EGFP-amidase 3-CBD-Ni磁珠在荧光显微镜下明暗场观察结果；
图13为本发明实施例7中EGFP-amidase 3-CBD-Ni磁珠捕获示意图与回收效率；
图14为本发明实施例7中EGFP-RBP-Ni-NTA磁珠的敏感性分析；
图15为本发明实施例7中EGFP-RBP-Ni-NTA磁珠的捕获效率图，其中，(A)为不同EGFP-RBP蛋白浓度的捕获效率图，(B)为不同Ni磁珠数量的捕获效率图；
图16为本发明实施例8中endolysin+水煮法与水煮法提取金黄色葡萄球菌基因组DNA的分析结果；
图17为本发明实施例9中RPA方法对不同细菌的nuc片段扩增后的琼脂糖凝胶电泳图；
图18为本发明实施例9中RPA方法对不同浓度的金黄色葡萄球菌基因组DNA扩增后的琼脂糖凝胶电泳图；
图19为本发明实施例10中RPA方法对不同来源的样本中的金黄色葡萄球菌基因组DNA扩增后的琼脂糖凝胶电泳图；
图20为本发明实施例10中EGFP-RBP-Ni磁珠结合PCR特异性分析(A)和EGFP-RBP-Ni磁珠结合PCR的灵敏度分析(B)；
图21为本发明实施例10中EGFP-RBP-Ni磁珠结合PCR检测不同基质中的金黄色葡萄球菌，其中，泳道1为Tris-HCl，泳道2为橙汁，泳道3为牛奶；
图22为本发明实施例11中crRNA-1、crRNA-2、crRNA-3纯化后琼脂糖凝胶电泳图；
图23为本发明实施例11中cas12a/crRNA切割检测的示意图和检测结果分析；
图24为本发明实施例11中EGFP-amidase 3-CBD-Ni磁珠捕获结合cas12a/crRNA切割检测特异性分析；
图25为本发明实施例11中EGFP-amidase 3-CBD-Ni磁珠捕获结合cas12a/crRNA切割检测结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
本发明提出了一种吸附磁珠及其用途、试剂盒和用途以及检测金黄色葡萄球菌的方法，下面将分别对其进行详细描述。
吸附磁珠
在本发明的一个方面，本发明提出了一种吸附磁珠。根据本发明的实施例，所述吸附磁珠包括：Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠；结合蛋白，所述结合蛋白用于结合金黄色葡萄球菌，所述Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠和结合蛋白相连。
发明人还发现，该吸附磁珠中的结合蛋白可结合(尤其是可特异性结合)金黄色葡萄球菌，将该吸附磁珠加入到待测样本中，通过结合蛋白可结合金黄色葡萄球菌，可实现吸附磁珠对金黄色葡萄球菌的捕获和富集，有助于后续对其进行检测，减少菌种培养步骤，缩短检测时间，提高检测效率。
根据本发明的实施例，上述吸附磁珠还可以进一步包括如下技术特征的至少之一：
根据本发明的实施例，所述结合蛋白的N端与所述Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠相连。
在本文中，术语“相连”可为结合蛋白和Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠直接相连，也可为结合蛋白和Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠间接相连，具体不受限制。例如通过蛋白标签将结合蛋白和Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠相连。
根据本发明的实施例，所述吸附磁珠进一步包括蛋白标签。
在本发明的一些可选实施例中，所述Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠通过His-tag标签序列与所述结合蛋白相连。
根据本发明的实施例，所述蛋白标签的C端与所述结合蛋白的N端相连，所述蛋白标签的N端与所述Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠相连。
根据本发明的实施例，所述蛋白标签包括选自His标签、Flag标签、GST标签、MBP标签、SUMO标签和C-Myc标签中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述蛋白标签为His标签。
根据本发明的实施例，所述Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠与结合蛋白是以Ni和His-tag标签序列相结合的方式提供的。
根据本发明的实施例，所述结合蛋白来源于金黄色葡萄球菌噬菌体。发明人进一步发现，来源于金黄色葡萄球菌噬菌体的结合蛋白，尤其是来源于金黄色葡萄球菌噬菌体的受体结合蛋白和/或Amidase蛋白，可有效实现Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠对金黄色葡萄球菌的捕获富集，进一步缩短后续细菌检测步骤操作时间，从而提高检测效率。
在具体的实施方式中，所述结合蛋白是金黄色葡萄球菌噬菌体的内溶素或包含所述内溶素的细胞壁结合结构域(C-terminal cell wall binding domain，CBD)的截短体。
在一种具体的实施方式中，所述结合蛋白可以是金黄色葡萄球菌噬菌体内溶素SA97(LysSA97)或含有LysSA97的细胞壁结合结构域蛋白的截短体。LysSA97特异性裂解金黄色葡萄球菌菌株并使其生物膜被破坏，具有特定的细胞壁结合结构域(CBD)以及两个酶活性结构域(EAD)，含半胱氨酸、组氨酸依赖性酰胺水解酶/肽酶(CHAP，PF05257)和N-乙酰壁酰-L-L-丙氨酸-九个酰胺酶(酰胺酶-3，PF01520)结构域。
在一种具体的实施方式中，所述结合蛋白可以是金黄色葡萄球菌噬菌体80α或包含其中心酰胺酶3催化结构域(又称Amidase 3、Amidase_3或Amidase-3)和C末端SH3b细胞结合域(简称SH3b)的截短体。
根据本发明的实施例，所述结合蛋白还可以是金黄色葡萄球菌噬菌体的受体结合蛋白(Receptor binding protein，简称RBP)。
根据本发明的实施例，所述结合蛋白来源于金黄色葡萄球菌噬菌体80α。发明人发现，来源于金黄色葡萄球菌噬菌体80α的蛋白与金黄色葡萄球菌的结合能力较强，由此，将其与Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠制备成吸附磁珠，可有效捕获待测样本中的金黄色葡萄球菌，可提高对待测样本中金黄色葡萄球菌检测的准确度。
在一些具体的实施方式中，所述金黄色葡萄球菌噬菌体的Amidase蛋白是Amidase3-CBD蛋白。在一种更具体的实施方式中，所述金黄色葡萄球菌噬菌体是金黄色葡萄球菌噬菌体80α。
本发明中的Amidase蛋白或Amidase 3-CBD蛋白特指来源于金黄色葡萄球菌噬菌体的Amidase酶。Amidase酶，又被称为n-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(NAMLAAEC)，是一种PGN水解酶，能够特异性切割胞壁酸的乳酰基和L-丙氨酸的α-氨基之间的酰胺键。在噬菌体中，Amidase酶在病毒的裂解周期中具有关键作用，它们负责宿主细胞裂解，从而允许噬菌体后代的释放和传播。本发明利用金黄色葡萄球菌噬菌体Amidase蛋白与金黄色葡萄球菌的结合性能，巧妙地通过Amidase蛋白，实现了磁珠对金黄色葡萄球菌的特异性捕获和富集，进而为进一步改良和提高现有检测和鉴定食品样品中金黄色葡萄球菌的方法提供了可能。
根据本发明的实施例，所述结合蛋白包括选自来源于金黄色葡萄球菌噬菌体80α的受体结合蛋白和Amidase 3CBD蛋白中的至少之一。
发明人意外发现，与其他结合蛋白相比，来源于金黄色葡萄球菌噬菌体80α的受体结合蛋白和Amidase 3CBD蛋白与金黄色葡萄球菌的结合能力更强，由此，发明人将RBP和/或Amidase 3CBD蛋白与Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠制备获得的吸附磁珠，并将其用于金黄色葡萄球菌的检测发现，该吸附磁珠与其他技术(例如抗体)相比，具有稳定性强、配体特异性和对碳水化合物表位的亲和力强、灵敏度高等优点。
根据本发明的实施例，所述受体结合蛋白具有如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
MDNKLITDLSRVFDYRYVDENEYNFKLISDMLTDFNFSLEYHRNKEVFAHNGEQIKYEHLNVTSSVSDFLTYLNGRFSNMVLGHNGDGINEVKDARVDNTGYDHKTLQDRLYHDYSTLDAFTKKVEKAVDENYKEYRATEYRFEPKEQEPEFITDLSPYTNAVMQSFWVDPRTKIIYMTQARPGNHYMLSRLKPNGQFIDRLLVKNGGHGTHNAYRYIGNELWIYSAVLDANENNKFVRFQYRTGEITYGNEMQDVMPNIFNDRYTSAIYNPIENLMIFRREYKASERQLKNSLNFVEVRSADDIDKGIDKVLYQMDIPMEYTSDTQPMQGITYDAGILYWYTGDSKPANPNYLQGFDIKTKELLFKRRIDIGGVNNNFKGDFQEAEGLDMYYDLETGRKALLIGVTIGPGNNRHHSIYSIGQRGVNQFLKNIAPQVSMTDSGGRVKPLPIQNPAYLSDITEVGHYYIYTQDTQNALDFPLPKAFRDAGWFFDVLPGHYNGALRQVLTRNSTGRNMLKFERVIDIFNKKNNGAWNFCPQNAGYWEHIPKSITKLSDLKIVGLDFYITTEESNRFTDFPKDFKGIAGWILEVKSNTPGNTTQVLRRNNFPSAHQFLVRNFGTGGVGKWSLFEGKVVE(SEQ ID NO:13)。
进一步地，根据本发明的实施例，所述受体结合蛋白包括与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列或与SEQ ID NO:13所示受体结合蛋白具有同等或相近金黄色葡萄球菌结合性能的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述Amidase 3CBD蛋白具有如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。发明人经过试验发现，Amidase 3-CBD蛋白对金黄色葡萄球菌的捕获效果优于CBD蛋白对金黄色葡萄球菌的捕获效果。
KIMLVAGHGYNDPGAVGNGTNERDFIRKYITPNIAKYLRHAGHEVALYGGSSQSQDMYQDTAYGVNVGNKKDYGLYWVKSQGYDIVLEIHLDAAGESASGGHVIISSQFNADTIDKSIQDVIKNNLGQIRGVTPRNDLLNVNVSAEININYRLSELGFITNKNDMDWIKKNYDLYSKLIAGAIHGKPIGGLVAGNVKTSAKNKKNPPVPAGYTLDKNNVPYKKEQGNYTVANVKGNNVRDGYSTNSRITGVLPNNTTITYDGAYCINGYRWITYIANSGQRRYIATGEVDKAGNRISSFGKFSTI(SEQ ID NO:14)。
进一步地，根据本发明的实施例，所述Amidase 3CBD蛋白包括与SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列具有至少90％同源性的或与SEQ ID NO:14所示Amidase 3CBD蛋白具有同等或相近金黄色葡萄球菌结合性能的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述结合蛋白连接有荧光基团。由此，有助于蛋白的追踪。
根据本发明的实施例，所述荧光基团为EGFP基团。
根据本发明的实施例，所述吸附磁珠是采用如下方法制备获得的：将所述Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠和结合蛋白进行第一混合处理，以便获得所述吸附磁珠。
根据本发明的实施例，所述结合蛋白为受体结合蛋白(RBP)，所述受体结合蛋白的添加量为20～80ng，所述Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠的添加量为(1.0～10)×105个。
在本发明的一个优选实施例中，所述受体结合蛋白的添加量为40～80ng，更优选为5～60ng。
在本发明的一个优选实施例中，所述Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠的添加量为(1.0～2.0)×105个。
试剂盒
在本发明的另一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：前述的吸附磁珠。由前可知，吸附磁珠中的结合蛋白可结合金黄色葡萄球菌，进而可实现吸附磁珠对金黄色葡萄球菌的捕获和富集，以便分离获取金黄色葡萄球菌。由此，含有上述吸附磁珠的试剂盒可对金黄色葡萄球菌进行检测，且具有检测时间短、检测效率高和检测灵敏度高等优点。
需要说明的是，本发明试剂盒中Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠和具有His-tag标签序列的结合蛋白的提供方式不做严格限定，既可以单独提供，待使用时，将两者接触，从而实现两者的结合；也可以直接以偶联物的形式提供，即，Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠与结合蛋白是以Ni和His-tag标签序列相结合，也即是以前述的吸附磁珠的形式提供。待使用时，直接将该偶联物与待测样本接触，实现捕获病原体的目的。
根据本发明的实施例，所述试剂盒进一步包括：Cas12a、crRNA和ssDNA-FQreporter中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述试剂盒进一步包括Cas12a、crRNA和ssDNA-FQreporter。其中，Cas12a蛋白与crRNA结合形成复合物后，与扩增产物结合，当复合物识别到扩增产物中目的序列后，Cas12a中的Dnase区域被激活，先切割掉目的序列片段，然后切割单链ssDNA，并产生可检测的荧光信号。由此，在常温(30-40℃)条件下，将扩增产物、Cas12a、crRNA和ssDNA-FQ reporter进行混合并反应，可快速对扩增产物中DNA片段进行检测，无需使用仪器，操作简单。
用途
在本发明的又一方面，本发明提出了一种前述的吸附磁珠在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测金黄色葡萄球菌。由前可知，吸附磁珠中的结合蛋白可结合金黄色葡萄球菌，进而可实现吸附磁珠对金黄色葡萄球菌的捕获和富集，以便分离获取金黄色葡萄球菌。由此，含有上述吸附磁珠的试剂盒可对金黄色葡萄球菌进行检测，且具有检测时间短、检测效率高和检测灵敏度高等优点。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种前述的吸附磁珠或前述的试剂盒在制备产品中的用途，所述产品用于检测金黄色葡萄球菌。由前可知，吸附磁珠中的结合蛋白可结合金黄色葡萄球菌，进而可实现吸附磁珠对金黄色葡萄球菌的捕获和富集，以便分离获取金黄色葡萄球菌；并且，含有上述吸附磁珠的试剂盒可对金黄色葡萄球菌进行捕获和富集，以便分离获取金黄色葡萄球菌。由此，采用本发明的产品可对金黄色葡萄球菌进行检测，且具有检测时间短、检测效率高和检测灵敏度高等优点。
检测金黄色葡萄球菌的方法
在本发明的又一方面，本发明提出了一种检测金黄色葡萄球菌的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：采用前述的吸附磁珠或前述的试剂盒对待测样本进行接触处理，以便检测所述待测样本中是否含有金黄色葡萄球菌或所述金黄色葡萄球菌的含量。如前所述，利用前述吸附磁珠或试剂盒可结合金黄色葡萄球菌，以实现对金黄色葡萄球菌的捕获和富集，因此，本发明的方法无需对其进行菌种培养即可实现对金黄色葡萄球菌的检测，具有检测步骤简化、检测时间短、检测效率高和检测灵敏度高等优点。
需要说明的是，本发明的方法为非疾病诊断目的方法，用于检测食品、物品等非动物组织或血液样本的金黄色葡萄球菌。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：将接触处理产物进行DNA提取处理；将DNA提取处理产物进行扩增处理；将扩增处理产物进行检测，以便检测所述待测样本中是否含有金黄色葡萄球菌或所述金黄色葡萄球菌的含量。
根据本发明的实施例，在一种具体的实施方式中，所述吸附磁珠是通过如下方式获得的：将Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠和结合蛋白进行第一混合处理。
根据本发明的实施例，所述结合蛋白为Amidase 3-CBD蛋白，所述第一混合处理是在温度为(2-30)℃、pH值为5-9的条件下进行的。由此，可提高吸附磁珠对金黄色葡萄球菌的捕获效率。
根据本发明的实施例，所述结合蛋白为Amidase 3-CBD蛋白，在所述接触处理之前，将NaCl和所述吸附磁珠进行第二混合处理。
根据本发明的实施例，所述NaCl的终浓度为(50～200)mM，例如(50～150)mM、(50～100)mM，优选为100mM。由此，吸附磁珠上的结合蛋白与金黄色葡萄球菌的结合效果较佳。尤其是，随着NaCl浓度的增高，Amidase 3-CBD蛋白与金黄色葡萄球菌的结合效果不断减弱。
根据本发明的实施例，所述吸附磁珠的添加个数不低于1.0×105个，例如不低于1.1×105个、不低于1.2×105个、不低于1.3×105个、不低于1.4×105个、不低于1.5×105个、不低于2.0×105个、不低于1.0×106个、不低于1.0×107个。由此，可进一步提高吸附磁珠的结合蛋白对金黄色葡萄球菌的捕获能力，尤其是提高RBP对金黄色葡萄球菌的捕获能力。
根据本发明的实施例，所述DNA提取处理包括：将所述接触处理产物与内溶素进行水煮处理。发明人经过大量试验发现，内溶素能特异性裂解金黄色葡萄球菌细胞壁，导致金黄色葡萄球菌胞内物质释放，然后通过水煮即可对金黄色葡萄球菌中的DNA进行提取，并可极大提升金黄色葡萄球菌DNA的提取量，具有缩短提取时间、方便操作、提取量大等优点。
根据本发明的实施例，所述水煮处理之前，将所述内溶素和所述接触处理产物反应20-40min。由此，可充***解金黄色葡萄球菌细胞壁，提高对金黄色葡萄球菌DNA的提取量。
根据本发明的实施例，所述水煮处理的时间为5-20min。由此，金黄色葡萄球菌DNA的提取效果较佳。
根据本发明的实施例，所述内溶素和所述待测样本的体积比为1：(40-60)，其中，所述内溶素的浓度为(1-3)mg/ml。由此，金黄色葡萄球菌DNA的提取效果较佳。
需要说明的是，待测样本在采用上述吸附磁珠或上述试剂盒处理之前可预先进行前处理，前处理包括但不限于稀释处理和去杂处理，具体方式不受限制。
根据本发明的实施例，所述内溶素选自来源于所述金黄色葡萄球菌的噬菌体内溶素。
根据本发明的实施例，所述内溶素选自来源于所述金黄色葡萄球菌的噬菌体80α内溶素(简称endolysin或80αendolysin)。
根据本发明的实施例，所述噬菌体80α内溶素具有如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
MLMTKNQAEKWFDNSLGKQFNPDGWYGFQCYDYANMFFMLATGERLQGLYAYNIPFDNKAKIEKYGQIIKNYDSFLPQKLDIVVFPSKYGGGAGHVEIVESANLNTFTSFGQNWNGKGWTNGVAQPGWGPETVTRHVHYYDNPMYFIRLNFPNNLSVGNKAKGIIKQATTKKEAVIKPKKIMLVAGHGYNDPGAVGNGTNERDFIRKYITPNIAKYLRHAGHEVALYGGSSQSQDMYQDTAYGVNVGNKKDYGLYWVKSQGYDIVLEIHLDAAGESASGGHVIISSQFNADTIDKSIQDVIKNNLGQIRGVTPRNDLLNVNVSAEININYRLSELGFITNKNDMDWIKKNYDLYSKLIAGAIHGKPIGGLVAGNVKTSAKNKKNPPVPAGYTLDKNNVPYKKEQGNYTVANVKGNNVRDGYSTNSRITGVLPNNTTITYDGAYCINGYRWITYIANSGQRRYIATGEVDKAGNRISSFGKFSTI(SEQ ID NO:15)。
需要说明的是，所述内溶素的获取采用常规的克隆表达法进行。
根据本发明的实施例，所述扩增处理是采用重组酶聚合酶扩增方法进行的。由此，采用重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，简称RPA)方法可在低温恒温下工作，不需要模板的热变性，无需使用仪器，具有操作简单等优点。具体地，本发明对于重组酶聚合酶扩增方法的具体步骤和所需试剂不做严格限定，可以采用本领域常规手段获得。
根据本发明的实施例，所述检测包括：将所述扩增处理产物、Cas12a、crRNA和ssDNA-FQ reporter进行第三混合处理；基于所述第三混合处理产生的荧光信号，以便检测所述待测样本中是否含有金黄色葡萄球菌或所述金黄色葡萄球菌的含量。其中，Cas12a蛋白与crRNA结合形成复合物后，与扩增产物结合，当复合物识别到扩增产物中目的序列后，Cas12a中的Dnase区域被激活，先切割掉目的序列片段，然后切割单链ssDNA，并产生可检测的荧光信号。由此，在常温(30-40℃)条件下，将扩增产物、Cas12a、crRNA和ssDNA-FQreporter进行混合并反应，可快速对扩增产物中DNA片段进行检测，无需使用仪器，操作简单。
根据本发明的实施例，所述第三混合处理产生荧光信号，是所述待测样本中含有金黄色葡萄球菌的指示；或者，所述第三混合处理不产生荧光信号，是所述待测样本中不含有金黄色葡萄球菌的指示。
根据本发明的实施例，所述检测进一步包括：基于标准曲线，确定所述待测样品中金黄色葡萄球菌的含量，所述标准曲线为预定量金黄色葡萄球菌与荧光信号强度的对应曲线。
根据本发明的实施例，所述crRNA具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列或与其具有至少90％以上同源性的核苷酸序列。由此，可进一步提高对金黄色葡萄球菌检测的灵敏度，其最低检出限可为1×101CFU/mL。
UAAUACGACUCACUAUAGGGUAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGUUGAAGUUGCACUAUAUAC(SEQIDNO:7)。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
在下述实施例中的核苷酸序列可根据其对应的氨基酸序列采用常规方法或常规的软件(例如在线程序Vectorbuilder(网址：https://www.vectorbuilder.cn/tool/codon-optimization.html)、GeneOptimizer在线程序等)得到。
实施例1：金黄色葡萄球菌噬菌体80αendolysin生物信息学分析
从噬菌体80α基因组中分析查找到80αEndolysin基因，用Interpro分析80αEndolysin结构域，使用计算pI/Mw程序ExPASy计算蛋白质的分子量和等电点。
从噬菌体80α基因组中分析查找到80αEndolysin基因序列，用Interpro进行功能结构域的搜索，结果显示，80αEndolysin基因由N端CHAP催化结构域(简称CHAP)、中心酰胺酶3催化结构域(又称Amidase 3、Amidase_3或Amidase-3)和C末端SH3b细胞结合域(简称SH3b)三个结构域所构成，如图1所示。
因此，本发明后续选择Amidase 3-CBD与CBD这两段基因进行克隆表达。其中，噬菌体80αEndolysin的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，Amidase 3-CBD的氨基酸序列如SEQID NO:14所示，CBD的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
YKKEQGNYTVANVKGNNVRDGYSTNSRITGVLPNNTTITYDGAYCINGYRWITYIANSGQRRYIATGEVDKAGNRIS SFGKFSTI(SEQ ID NO:16)。
实施例2：EGFP-Amidase 3-CBD、EGFP-CBD蛋白的克隆、表达与纯化
将实施例1中的Amidase 3-CBD、CBD蛋白所对应的核苷酸序列克隆于PET28a-EGFP载体中，利用大肠杆菌基因表达***与亲和层析Ni-NTA柱纯化获取重组蛋白，分别得到带有EGFP的Amidase 3-CBD和CBD，将其命名为EGFP-Amidase 3-CBD、EGFP-CBD，并进行SDS-PAGE分析。
如图2所示，结果表明EGFP-Amidase 3-CBD蛋白质的大小大约在60kDa左右(即为图2A中泳道8的纯化产物)，EGFP-CBD蛋白质的大小大约在40kDa左右(图2B中泳道7的纯化产物)，两者的在SDS-PAGE凝胶上的蛋白质大小与生物信息学预测的64和40.1kDa相匹配(图2A和图2B)，同时，阴性对照EGFP蛋白质在SDS-PAGE凝胶上的蛋白质大小(大约33kDa)与生物信息学预测(33.2kDa)相匹配(图2C中泳道8的纯化产物)。
实施例3：EGFP-Amidase 3-CBD、EGFP-CBD结合活性分析
实验方法：将金黄色葡萄球菌在37℃震荡培养的条件下生长至对数中期，然后将培养物以12000rpm离心5min，加入50mMTris-HCl洗涤一次后离心，利用50mMTris-HCl重悬细菌并将OD600调至0.8。取200μl OD600＝0.8的菌液于离心管中，分别加入实施例2中获得的100μl浓度为0.5mg/ml的EGFP-Amidase 3-CBD、EGFP-CBD蛋白，并在室温下孵育20分钟。通过离心(10000rpm，3min)用50mM的Tris-HCl洗涤金黄色葡萄球菌3次以去除未结合的蛋白质，将洗涤后的沉淀重新悬浮在100μL浓度为50mMTris-HCl中，得到细菌蛋白混合悬液，通过利用荧光显微镜、流式细胞仪、western进行检测。
荧光显微镜检测：在载玻片上加入10μl最终的细菌蛋白混合悬液，并盖上盖玻片，通过配备U-RFL-T光源(放大倍数1000倍)的落射荧光显微镜下，在明场和FITC滤光片下观察(激发BP 470-490nm；发射：LP 516nm)蛋白与金黄色葡萄球菌结合效果，同时制备EGFP蛋白用作阴性对照。为了评估EGFP-Amidase 3-CBD的特异性和敏感性，将金黄色葡萄球菌菌株、Escherichia coli O157:H、Salmonella typHimurium、Bacillus cereus、Propionibacterium acnes、Listeria monocytogenes所列出的细菌分别与该蛋白一起孵育(具体步骤同上述实验方法)，按照上述相同程序并在落射荧光显微镜下观察，结果如表1所示。
表1：80αendolysin、EGFP-amidase 3-CBD对不同微生物细胞壁的裂解情况
Figure BDA0004026603430000071
/>
Figure BDA0004026603430000081
注：a+，有裂解活性；-，没有裂解活性；b+，有细胞壁结合活性；-，没有细胞壁结合活性。
流式细胞术检测：取50μl最终的细菌蛋白混合悬液，使用配备有二极管蓝色激光器(激发波长为488nm)的Accuri C6 Plus流式细胞仪分析样品，采集40000个事件。通过FL1通道上的525/50nm带通滤波器检测荧光，并使用FlowJo-V10软件进行了数据分析。
western检测：吸取5μl 5ⅹSDS loading buffer加入到20μl最终细菌蛋白混合悬液中，100℃下煮沸5分钟，使用SDS-PAGE预制凝胶进行电泳分析，再通过转膜技术将蛋白转移到PVDF膜上，使用抗组氨酸抗体进行蛋白质印迹分析。
荧光显微镜检测的结果表明，融合蛋白EGFP-Amidase 3-CBD、EGFP-CBD都能与金黄色葡萄球菌细胞结合；显微镜下的荧光强度观察结果显示，EGFP-Amidase 3-CBD具有比EGFP-CBD更强的结合能力。而阴性对照EGFP在荧光显微镜下没有观察到荧光细胞，具体参见图3A。
如图3B和图3C所示，流式细胞的检测结果显示，EGFP-Amidase 3-CBD的峰值比阳性对照的峰值出现了明显的右移，且EGFP-Amidase 3-CBD的平均荧光强度比EGFP-CBD的平均荧光强度大，两者具有极显著差异(P<0.0001)，说明EGFP-Amidase 3-CBD具有比EGFP-CBD更强的结合能力，而在图3C中阴性对照EGFP也出现平均荧光强度值，分析是由于在蛋白结合金黄色葡萄球菌后，没有将未结合的蛋白洗涤干净所导致的，属于正常的实验误差。
如图4所示，EGFP-Amidase 3-CBD条带的灰度值要高于EGFP-CBD，并且从非特异性条带的比较也可以看出，EGFP-Amidase 3-CBD的非特异性条带比EGFP-CBD的要淡许多，说明EGFP-Amidase 3-CBD具有比EGFP-CBD更强的结合能力。
实施例4：EGFP-amidase 3-CBD蛋白稳定性考察
将实施例2中获得的EGFP-amidase 3-CBD蛋白分别于温度为4-60℃、pH值为3-12和NaCl浓度为0-1000mM的范围下进行稳定性考察，每种条件下蛋白处理时间为30min，使用80αEndolysin C端的功能分析中测定方法测定amidase3-CBD与金黄色葡萄球菌结合活性。
其中，不同pH条件通过不同pH的缓冲液实现：甘氨酸-HCl pH＝3、乙酸钠pH＝5、Tris-HCl pH＝7、甘氨酸-NaOH pH＝9、KCl-NaOH pH＝12。
其中，每种条件下，蛋白处理时间为30min，使用80αEndolysin C端的功能分析中测定方法测定amidase 3-SH3b与细菌结合活性。
如图5所示，结果表明，在100mM的NaCl处理后的结合能力是最强的，随着NaCl的浓度的不断增加，EGFP-amidase3-CBD蛋白与金黄色葡萄球菌的结合能力逐渐减弱，在流失细胞仪检测中，100mM的NaCl处理后的EGFP-amidase 3-CBD蛋白的荧光峰值和平均荧光强度最大。当NaCl浓度超过200mM时，EGFP-amidase 3-CBD结合能力显著下降。
如图6-7所示，在不同的温度与pH处理EGFP-amidase 3-CBD蛋白的结果中显示，当温度为4℃、pH＝7时，EGFP-amidase 3-CBD蛋白结合金黄色葡萄球菌的效果最佳。
实施例5：EGFP-RBP的表达与纯化
1、从NCBI(Genbank登录号码为ABF71632.1)中获取到噬菌体80αRBP基因序列，使用snapgene软件进行模拟克隆，并利用ExPASy计算蛋白质的分子量和等电点。其中，噬菌体80αRBP的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
2、人工合成编码步骤1中噬菌体80αRBP的基因，并将合成的基因序列(DNA序列)克隆于PMV载体中，得到质粒PMV-RBP。通过双酶消化(BamHI/XhoI)将其克隆含有EGFP的pET28载体中以产生pET28a-EGFP-RBP重组表达载体。并采用热激法将重组表达载体转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞。随后挑取单菌落于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养后，利用碱裂解法提取质粒，并进行测序(测序结果如图8所示)，将序列正确的确定为阳性转化子。
3、将步骤2中测序正确的pET28a-EGFP-RBP转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，在OD600达到约0.6时，向培养物中加入终浓度为1mM IPTG(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)，并在19℃下诱导蛋白表达20h。为了纯化，将收获的细胞重悬于裂解缓冲液(50mMTris-HCl、500mM NaCl、5mM咪唑)中，超声处理3min，然后在10000rpm条件下离心30min获得可溶性蛋白上清，将收集的上清样品加入已平衡的Ni柱中，从Ni柱中流出的溶液为穿透液，然后分别使用含50mM咪唑的缓冲液(洗涤溶液)、含250mM咪唑的缓冲液(洗涤溶液1)与含500mM咪唑的洗脱液(洗涤溶液2)依次洗脱穿透液中的目的蛋白。在此之后，使用浓缩柱浓缩蛋白并置换buffer，将蛋白储存于50mM Tris-HCl中。纯化后，使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)预制凝胶分析蛋白。使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，结果参见图9。
图9A显示阴性对照EGFP蛋白质在SDS-PAGE凝胶上的蛋白质大小(大约33KDa)与生物信息学预测的分子量(33.2KDa)相匹配。图9B显示纯化后的产物经SDS-PAGE电泳分析显示约100kDa单一条带，与生物信息学预测的分子量(104.1kDa)相匹配。
以上试验结果表明：成功表达并纯化得到噬菌体80αRBP。
实施例6：EGFP-RBP与金黄色葡萄球菌结合活性考察
通过荧光显微镜、流式细胞仪、western检测实施例5获得的EGFP-RBP与金黄色葡萄球菌的结合能力。
试验方法：将金黄色葡萄球菌在37℃的LB肉汤中培养至对数期，然后将培养物在12000rpm条件下离心5min，接着重悬于50mM Tris-HCl中并将OD600调至0.6。取100μL OD600为0.6的菌液于离心管中，分别加入50μL 0.5mg/mL的EGFP-RBP蛋白，并在室温下孵育30min。通过离心(10000rpm，3min)用50mM Tris-HCl洗涤细菌3次以去除未结合的蛋白质。将洗涤后的沉淀重新悬浮在100μL 50mM Tris-HCl中。
荧光显微镜检测：在载玻片上加入10μL重悬液，并盖上盖玻片。在明场和FITC滤光片下观察(激发BP 470-490nm；发射：LP 516nm)蛋白与细菌结合效果。同时制备添加EGFP蛋白的细菌细胞作为阴性对照。当80αRBP与绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达后，便可通过荧光成像的方式直观地看到RBP与金黄色葡萄球菌的结合能力。
流式细胞术检测：取50μL重悬菌液，使用配备有二极管蓝色激光器(激发波长为488nm)的Accuri C6 Plus流式细胞仪分析样品，共采集10000个事件，通过FL1通道上的533/30nm荧光检测器检测荧光。并使用FlowJo-V10软件进行数据分析。
Western Blot检测：吸取20μL重悬菌液与5μL 5×SDS Loading buffer混合，100℃下煮沸5分钟。使用SDS-PAGE预制凝胶进行电泳分析，再通过转膜技术将蛋白转移到PVDF膜上，使用抗组氨酸的一级抗体与HRP标记的二级抗体进行蛋白质印迹分析，使用ECL试剂盒和图像分析仪对蛋白质带进行可视化。
荧光显微镜检测结果显示(图10A)，EGFP-RBP能与金黄色葡萄球菌细胞结合，并在蓝色激发光下显示绿色荧光。
流式细胞检测结果显示(图10B)，EGFP-RBP的平均荧光强度显著强于EGFP的平均荧光强度，两者具有极显著差异(P<0.0001)。
Western结果也显示(图10C)，EGFP-RBP条带的灰度值要高于与EGFP。
上述三种实验结果都验证了EGFP-RBP具有与金黄色葡萄球菌的结合能力。
实施例7：带有结合蛋白的Ni-NTA磁珠捕获金黄色葡萄球菌效率的考察
1、EGFP-amidase 3-CBD-Ni-NTA磁珠(又称EGFP-amidase 3-CBD-Ni磁珠)的制备
Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠(Ni-NTA磁珠，无锡百迈格生物科技有限公司)在其表面具有Ni-聚甲基丙烯酸酯基团，Ni-聚甲基丙烯酸酯磁性上的亲和配体Ni离子可以与蛋白上的N端6×His-tag标签进行结合的特性，将实施例2获得EGFP-amidase 3-CBD蛋白的N端融合6×His-tag标签，然后将100μl含有His-tag标签的EGFP-amidase 3-CBD蛋白(缓冲液配方：50mM tris-HCl、100mM NaCl、pH＝7.4)与100μl Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠进行孵育结合在混合器中混合20min，其中，与Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠相比，EGFP-amidase 3-CBD蛋白添加过量；然后通过磁力架分离Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠，用T100洗涤两次。再用50mM Tris-HCl进行洗涤2次，最终将磁珠重悬于100μl浓度为50mMTris-HCl中，即为磁珠悬浮液，并储存于4℃，采用荧光显微镜观察Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠的涂覆情况，结果发现，未被EGFP-amidase 3-CBD蛋白标记的磁珠在FITC滤光片下未观察到荧光信号，而被EGFP-amidase 3-CBD蛋白标记的磁珠在FITC滤光片下可以观察到强烈的绿色荧光信号。
2、EGFP-RBP-Ni-NTA磁珠(又称EGFP-RBP-Ni磁珠)的制备
(1)取100μL Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠(Ni-NTA磁珠，无锡百迈格生物科技有限公司)置于1.5mL EP管中，置于磁力架，弃上清，加入500μL 50mM Tris-HCl重悬磁珠，混合均匀，置于磁分离架，弃上清，反复洗涤3次，最终悬浮100μL的50mM Tris-HCl中。
(2)加入60μL实施例5制备的EGFP-RBP(1mg/mL)蛋白，该EGFP-RBP蛋白的N端含有6×His-tag标签，手动旋转混匀20min标记磁珠，弃上清。
(3)加入500μL 50mM Tris-HCl重悬磁珠，混合均匀，置于磁分离架上10s，弃上清，反复洗涤2次，最终悬浮于100μL 50mM Tris-HCl中，即为磁珠悬浮液，取10μL样品用荧光显微镜观察。剩余保存于-4℃。
从图11的结果显示，未被EGFP-RBP蛋白标记的磁珠在FITC滤光片下未观察到荧光信号，而被EGFP-RBP蛋白标记的磁珠在FITC滤光片下可以观察到强烈的绿色荧光信号。进一步地，通过荧光显微镜观察，发明人惊喜地观察到，EGFP-RBP蛋白均匀地覆盖在Ni-NTA磁珠表面。而在加入EGFP-RBP后观察发现，在激发光峰值为488nm时，所观察到的绿色荧光与明场的金黄色葡萄球菌的位置是一一对照的。
以上结果表明，本发明得到的EGFP-RBP蛋白容易实现Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠表面均匀涂覆，且EGFP-RBP-Ni磁珠(又称EGFP-RBP-Ni-NTA磁珠)制备成功。
3、将上述获得的涂有EGFP-RBP蛋白的Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠(EGFP-RBP-Ni-NTA磁珠)和涂有EGFP-amidase3-CBD蛋白的Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠(EGFP-amidase 3-CBD-Ni-NTA磁珠)分别进行对金黄色葡萄球菌捕获效率的检测，将捕获金黄色葡萄球菌的磁珠进行平板培养并计数，具体操作如下：
将1ml金黄色葡萄球菌(101-104CFU/ml)与100μl磁珠悬浮液于混合器上孵育40min，通过磁力架分离磁珠，用50mM Tris-HCl进行洗涤2次，最终将磁珠重悬于1ml浓度为50mM Tris-HCl中，将1ml磁珠悬液直接涂板，37℃孵育24h后，通过菌落计数细胞，EGFP-amidase 3-CBD-Ni-NTA磁珠的结果参见图12～13，EGFP-RBP-Ni-NTA磁珠的结果参见图14。其中，磁珠捕获效率(100％)＝(磁珠捕获数/上清残留数+磁珠捕获数)×100％。
如图12所示，通过荧光显微镜观察，发明人惊喜地发现，EGFP-amidase 3-CBD蛋白非常均匀的覆盖在Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠表面，而在加入RFP-amidase 3-CBD后观察发现，在激发光峰值为488nm与532nm时，所观察到的绿色荧光、红色荧光与明场的金黄色葡萄球菌的位置是一一对照的。以上结果表明，本发明得到的EGFP-amidase 3-CBD蛋白容易实现Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠表面均匀涂覆。
如图13所示，涂有EGFP-amidase 3-CBD蛋白的Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠在金黄色葡萄球菌生物负荷(bioburden)在1×104CFU/ml时的捕获效率为25％；随着细菌载量逐渐减少，磁珠的捕获效率也在不断上升，在1×101CFU/ml时，磁珠的捕获效率达到78％，可实现很好的捕获效果。
如图14所示，当金黄色葡萄球菌数量为1×104CFU时，EGFP-RBP-Ni-NTA磁珠的数量还不足以捕获全部的金黄色葡萄球菌，随着金黄色葡萄球菌的减少，磁珠的捕获效率也在不断上升，在1×101CFU/ml时，磁珠的数量相对细菌而言充足，磁珠的捕获效率达到82％，因此回收金黄色葡萄球菌的效率也在增加。
进一步地，发明人对制得的EGFP-RBP-Ni-NTA磁珠对金黄色葡萄球菌的捕获条件进行了优化。
4、EGFP-RBP-Ni-NTA磁珠捕获条件的优化
(1)EGFP-RBP蛋白浓度
EGFP-RBP蛋白浓度的高低直接影响到磁珠被标记的效率，进而影响到目的细菌的捕获率。本实验分别用10ng、60ng、100ng的EGFP-RBP蛋白浓度标记磁珠，用50mM Tris-HCl梯度稀释金黄色葡萄球菌至约1×103CFU/mL。按照步骤3进行实验，计算磁珠捕获效率，进而确定最佳EGFP-RBP蛋白浓度。
由图15A可知，当EGFP-RBP蛋白的添加量为10ng标记磁珠时，EGFP-RBP-Ni-NTA磁珠的捕获效率为50％，随着EGFP-RBP蛋白添加量的增加，磁珠的回收率也相应的增加，但当蛋白的添加量到达100ng时，磁珠的回收率为65％，与蛋白添加量为60ng在捕获率上无显著性差异(P>0.05)，这可能是由于60ng EGFP-RBP蛋白的添加量已经使得磁珠到达饱和状态。因此，选择60ng EGFP-RBP蛋白的添加量进行下一步的实验。
(2)Ni-NTA磁珠数量
本实验利用50mM Tris-HCl将金黄色葡萄球菌稀释至约1×103CFU/mL，选择添加6×104、7.2×104、9×104、1.2×105个不同数量的EGFP-RBP-Ni-NTA磁珠进行偶联与捕获实验(具体步骤参见本实施例的步骤3)，根据平板的菌落个数计算捕获率，从而确定Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠的最佳数量。
由图15B所示，随着Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠数量的不断增加，磁珠的捕获率也在相对应增加，在1.2×105个磁珠数量时，回收率达到60％，但这种对应性并不是一直都存在的，过多的磁珠可能会导致目标细菌捕获效率降低，且过多的磁珠捕获时无法进行有效的分散。因此，针对EGFP-RBP-Ni-NTA磁珠选择1.2×105个磁珠数量进行下述的实验。
实施例8：采用不同的提取方法对金黄色葡萄球菌基因组提取的考察
1、endolysin+水煮法提取金黄色葡萄球菌基因组DNA的步骤如下：
从噬菌体80α基因组中分析查找到80αEndolysin基因，由华大基因进行合成并克隆于PMV载体中，通过双酶切(BamHI/XhoI)的方式将80αEndolysin基因克隆在PET28a载体中，将构建好的PET28a-endolysin转化BL21中，在OD600＝0.6时加入1mM IPTG，19℃诱导20h。10000RPM，5min收集已诱导细菌，再将细菌悬浮于裂解缓冲液中(50mMTris-HCl、500mMNaCl、5mM咪唑)中，超声处理3min，在10000rpm条件下离心30min，获得可溶性蛋白上清，然后通过实施例2获得的EGFP-amidase 3-CBD-Ni-NTA磁珠纯化得到目的蛋白，在此之后，使用Amicon Ultra-4centrifugal filters Ultracel-30K浓缩蛋白，并置换洗脱缓冲液(50mMTris-HCl、500mM咪唑、100mM Nacl)，将蛋白(80αEndolysin蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示)储存于50mM Tris-HCl中。纯化后，使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)预制凝胶分析蛋白质，如图16A所示，纯化后的80αendolysin蛋白在SDS-PAGE分析显示大约为57KDa左右(即为图16A中泳道9的纯化产物)，与80αendolysin蛋白的生物信息学预测大小相匹配(57.3kDa)。因此，可获得80αEndolysin(内溶素)。
取1mL OD600＝0.8的金黄色葡萄球菌菌液(金黄色葡萄球菌ATCC29213)置于离心管中，在10000rpm条件下离心3min，弃掉上清；加入100μl Tris-HCl(pH＝7.4)缓冲液将细菌悬浮起来；加入上述获得的40μl 400μg/ml 80αendolysin蛋白，反应30min；沸水水浴10min，离心10000r，3min，吸取上清进行qPCR。
其中，qPCR体系如下所示：
基因组DNA 总体积10μl
Sybergreen mix 5μl
Nuc(F)：5’-GGCATATGTATGGCAATTGTTTC-3’(SQE ID NO:1) 0.3μl
Nuc(R)：5’-CGTATTGCCCTTTCGAAACATT-3’(SQE ID NO:2) 0.3μl
H2O 3.4μl
循环体系为：95℃、15min；95℃、15s，60℃、20s，30个循环，72℃、45s。
2、水煮法提取金黄色葡萄球菌基因组DNA的步骤如下：
取1mL OD600＝0.8的金黄色葡萄球菌菌液(金黄色葡萄球菌ATCC29213)置于离心管中，在10000rpm条件下离心3min，弃掉上清；加入140μl Tris-HCl(pH＝7.4)缓冲液将细菌悬浮起来；100℃水浴10min，离心10000r，3min，吸取上清进行qPCR。
其中，qPCR体系如下所示：
基因组DNA 总体积10μl
Sybergreen mix 5μl
Nuc(F)：5’-GGCATATGTATGGCAATTGTTTC-3’(SQE ID NO:1) 0.3μl
Nuc(R):5’-CGTATTGCCCTTTCGAAACATT-3’(SQE ID NO:2) 0.3μl
H2O 3.4μl
循环体系为：95℃、15min；95℃、15s，60℃、20s、30个循环，72℃、45s。
图16B所示，endolysin蛋白(浓度为400μg/ml)对金黄色葡萄球菌ATCC29213进行的裂解实验中，80αendolysin可以在400μg/ml下60分钟内将600nm处的吸光度从1.0降低到0.2，结果表明，endolysin蛋白有很好的裂解活性。
图16C和图16D所示，当QPCR中的Ct Threshold设定为2000时，endolysin+水煮法与水煮法的Ct值分别为10和15，这表明endolysin+水煮法的金黄色葡萄球菌基因组DNA提取量是远远高于水煮法，这是由于金黄色葡萄球菌细胞壁较厚，普通的水煮法无法有效的破除金黄色葡萄球菌细胞壁，从而导致基因组DNA效率低，而endolysin是噬菌体编码的肽聚糖水解酶，可特异性裂解宿主细菌细胞壁，从而导致胞内物质的释放，因此，endolysin与水煮法联用时要比单独的水煮法提取得率更高，对后续快速检测提供了非常重要的作用。
实施例9：金黄色葡萄球菌的特异性片段基因组nuc片段扩增验证
采用RPA技术扩增金黄色葡萄球菌基因组nuc片段实验方法如下。
(一)EGFP-amidase 3-CBD-Ni磁珠的制备
1、吸取混匀的100μl Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠于EP管中，用500μl T100洗涤2次，每次2min，弃去上清，悬浮于100μl的T100。
2、加入100μl浓度为1mg/ml的EGFP-amidase 3-CBD蛋白孵育20min，每隔2min，将EP管倾斜50°，用手轻轻旋转晃动。
3、将孵育好的EGFP-amidase 3-CBD蛋白悬浮液放在磁力架上，静置去上清。用500μl的50mM Tris-HCl，洗2次，最后悬浮于100μl的50mM Tris-HCl。
(二)采用EGFP-amidase 3-CBD-Ni磁珠对金黄色葡萄球菌进行捕获
4、取3ml金黄色葡萄球菌离心，用1ml Tris-HCl洗涤一次，再用Tris-HCl调至OD600＝0.6，再稀释成1×104CFU/ml、1×103CFU/ml、1×102CFU/ml、1×101CFU/ml，得到四种稀释度的菌液。
5、分别取1ml的上述四种稀释度的菌液于EGFP-amidase 3-CBD蛋白悬浮液中，孵育20min，每隔2min，将EP管倾斜50°，用手轻轻旋转晃动。
6、将孵育好的EGFP-amidase 3-CBD蛋白-金黄色葡萄球菌，悬浮液放在磁力架上，弃去上清，加入500μl 50mM Tris-HCl洗2次，每次2min，再悬浮于40μl的50mM Tris-HCl。
(三)金黄色葡萄球菌DNA的提取
7、加入10μl 2mg/ml的endolysin蛋白(具体参见实施例8的步骤1)，孵育30min，然后再放入沸水水浴10min，吸取上清液得到粗提液。
(四)金黄色葡萄球菌基因组nuc片段的扩增
8、将粗提液进行RPA，具体步骤如下：
RPA反应使用的引物由Primer Premier 5.0进行设计，引物长度在30nt-35nt之间。
其中，RPA-1-F：5’-GCATCACAAACAGATAACGGCGTAAATAGAAG-3’(SQE ID NO:3)；
RPA-1-R：5’-ACATTAATTTAACCGTATCACCATCAATCGCT-3’(SQE ID NO:4)；
RPA-2-F：5’-CATCACAAACAGGTAACGGCGTAAATAGAAGT-3’(SQE ID NO:5)；
RPA-2-R：5’-TCTCTACACCTTTTTTAGGATGCTTTGTTTCA-3’(SQE ID NO:6)。
RPA的反应体系为：10μM的上游引物(RPA-1-F或RPA-2-F)和10μM的下游引物(RPA-1-R或RPA-2-R)、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、100mM醋酸钾、14mM醋酸镁、2mM二硫苏糖醇(DTT)、5％聚乙烯二醇、200μM dNTP、3mM ATP、1μl 5000units/ml Bsu DNA聚合酶和2μl的扩增产物。将上述混合物在常规水浴中在37℃下孵育以进行RPA反应，其中，上述混合物中各物质的浓度均为终浓度，RPA-1-F和RPA-1-R扩增得到nuc片段1、RPA-2-F和RPA-2-R扩增得到nuc片段2。
RPA扩增大肠杆菌基因组nuc片段实验方法与RPA扩增金黄色葡萄球菌基因组nuc片段实验方法相同，区别仅在于选择的菌液不同。
将上述金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的扩增产物分别用苯酚/氯仿提取，1％琼脂糖凝胶电泳，结果参见图17。
图17结果显示，金黄色葡萄球菌泳道上可以看到清晰的条带，而大肠杆菌泳道上没有条带，这说明了nuc基因是金黄色葡萄球菌特异性的基因，并且能通过RPA等温扩增的方式扩增出来。
如图18所示，对于RPA的灵敏度，采用10倍连续稀释的金黄色葡萄球菌基因组DNA作为模板进行RPA等温扩增，在琼脂糖凝胶电泳显示RPA的检测下限为102aM。
以上实验结果表明，本实施例成功扩增出了金黄色葡萄球菌特异性nuc基因片段。
实施例10：采用EGFP-RBP-Ni-NTA磁珠或EGFP-amidase 3-CBD-Ni磁珠检测金黄色葡萄球菌
1、EGFP-amidase 3-CBD-Ni磁珠结合重组酶聚合酶扩增(RPA)检测金黄色葡萄球菌方法的特异性考察
采用实施例2获得的EGFP-amidase 3-CBD-Ni磁珠对样本中的金黄色葡萄球菌进行捕获和提取金黄色葡萄球菌基因组DNA，将1×104CFU/ml金黄色葡萄球菌污染Tris-HCl、牛奶、橙汁和奶酪，利用实施例2获得的EGFP-amidase 3-CBD-Ni磁珠结合并捕获金黄色葡萄球菌，使用endolysin+水煮的方法提取基因组DNA，紧接着利用RPA等温扩增nuc片段(具体参见实施例9)，并于1％琼脂糖凝胶电泳跑胶，如图19所示。
结果显示，被污染的Tris-HCl、牛奶、橙汁和奶酪都能成功扩增出nuc基因片段，并且条带的亮度几乎相同。
以上试验结果表明，本发明磁珠捕获金黄色葡萄球菌不受食品基质的影响。
2、EGFP-RBP-Ni-NTA磁珠结合PCR法检测金黄色葡萄球菌方法的特异性考察
2.1分别取1mL的1×107CFU/mL金黄色葡萄球菌与大肠杆菌，加入实施例5获得的1.2×105个EGFP-RBP-Ni磁珠进行富集分离(具体参见实施例7的步骤3)，最终重悬于50μL50mM Tris-HCl中。再使用水煮法(沸水处理10min，具体参见实施例8的步骤1)提取基因组DNA。以提取出的基因组DNA为模板，采用PCR方式扩增金黄色葡萄球菌特异性基因nuc，从而验证EGFP-RBP-Ni磁珠的捕获金黄色葡萄球菌的特异性。
其中，PCR的引物为Nuc R：CGTATTGCCCTTTCGAAACATT(SEQ ID NO:2)，Nuc F：GGCATATGTATGGCAATTGTTTC(SEQ ID NO:1)。PCR的体系如下表所示：
Figure BDA0004026603430000131
正反向引物各1uL，98℃预变性5min，98℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸10s，30个循环。72℃终延伸5min，4℃终止。
如图20A所示，泳道1为依靠EGFP-RBP-Ni-NTA磁珠捕获金黄色葡萄球菌后结合PCR反应条件下扩增的nuc基因片段产物。
结果表明：EGFP-RBP-Ni磁珠可有效富集分离金黄色葡萄球菌，并可进一步用于PCR法检测待测样本中的金黄色葡萄球菌。
2.2EGFP-RBP-Ni磁珠结合PCR法检测金黄色葡萄球菌方法的灵敏度考察
取实施例5获得的1.2×105个EGFP-RBP-Ni-NTA磁珠，分别加入1mL不同浓度(0、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107CFU/mL)的金黄色葡萄球菌进行富集分离(具体参见实施例7的步骤3)，并重悬于50μL 50mM Tris-HCl中。再使用水煮法(沸水处理10min，具体参见实施例8的步骤1)提取基因组DNA。以提取出的基因组DNA为模板，采用PCR方式扩增金黄色葡萄球菌特异性nuc基因片段，考察EGFP-RBP-Ni磁珠检测金黄色葡萄球菌方法的灵敏度。
结果如图20B显示，当EGFP-RBP-Ni-NTA磁珠用量为1.2×105个、待检样品量为1mL时，待测样本中金黄色葡萄球菌的最低检出浓度是103CFU/mL。以上实验结果表明，本发明的方法有较好的灵敏度。
2.3研究磁珠捕获金黄色葡萄球菌在实际食品样品质量检测中的应用
目前主要挑战是在不同食品环境下是否均能普遍应用。因此，发明人将金黄色葡萄球菌污染Tris-HCl、牛奶、橙汁，使其金黄色葡萄球菌的污染浓度为1×103CFU/mL，利用实施例5制得的EGFP-RBP-Ni-NTA磁珠，捕获被污染食品样品中的金黄色葡萄球菌后，使用水煮法提取基因组DNA，再采用PCR扩增金黄色葡萄球菌特异性的nuc基因片段，按照本实施例步骤2.2的方法，并于1％琼脂糖凝胶电泳跑胶。
实验结果如图21所示，被金黄色葡萄球菌污染的Tris-HCl、牛奶、橙汁都能扩增出nuc基因片段，并且各样品的条带亮度基本无差异。表明EGFP-RBP-Ni-NTA磁珠捕获金黄色葡萄球菌不受食品基质的影响，可广泛应用于食品中金黄色葡萄球菌的质量检测，检测限为1×103CFU/mL。
实施例11：磁珠捕获结合cas12a/crRNA切割检测牛奶中的金黄色葡萄球菌
1、选取了三种不同的crRNA(参见图23A)对实施例9中得到的nuc片段1和nuc片段2进行cas12a/crRNA切割检测，cas12a/crRNA切割检测方法如下所示：
将500nM crRNA、250nM Cas12a、2.5μM ssDNA-FQ reporter(序列为5’-FAM-TTATT-BHQ-1-3’)、2μL NEB buffer 3.1、3μL的实施例7中得到的扩增产物进行混合，加入ddH2O至20μL。反应在37℃下进行，在qPCR机器上进行30min，每1min进行一次荧光测量，检测结果具体参见图22-23。其中，crRNA-1用于识别nuc片段1，crRNA-2和crRNA-3用于识别nuc片段2，crRNA如下所示：
Figure BDA0004026603430000132
Figure BDA0004026603430000141
如图23C所示，crRNA-1激活cas12a/crRNA切割ssDNA-FQ reporter所产生的荧光值最强，因此这也就说明crRNA-1是三种crRNA最优的选择。如图23B所示，在cas12a/crRNA切割反应的不同组分分析中可以看出，只有当反应体系中的所有溶剂全部加入时，才能产生荧光值，缺一不可。
2、为了快速检测出食品中的金黄色葡萄球菌，防止由金黄色葡萄球菌导致的食源性疾病的发生，利用实施例2获得的上游的EGFP-amidase 3-CBD-Ni磁珠对金黄色葡萄球菌进行捕获，并结合下游的RPA、cas12a切割检测，在紫外光的照射下，通过肉眼观测并评估食品是否被污染，并考察了该方法的特异性和灵敏性。
试验方法：将500nM crRNA-1(具体参见本实施例的步骤1)、250nM Cas12a、2.5μMssDNA-FQ reporter(序列为5’-FAM-TTATT-BHQ-1-3’)、2μL NEB buffer 3.1、3μL的实施例9中得到的RPA扩增产物(包含黄色葡萄球菌基因组nuc片段)进行混合，加入ddH2O至20μL。反应在37℃下进行，在qPCR机器上进行30min，每1min进行一次荧光测量。
特异性考察及结果：选取1×104CFU/ml大肠杆菌和金黄色葡萄球菌污染无菌牛奶，采用实施例9中的方法对样本中的金黄色葡萄球菌进行捕获、提取金黄色葡萄球菌基因组DNA和RPA扩增金黄色葡萄球菌基因组nuc片段，并以cas12a/crRNA切割检测是否特异性的检测金黄色葡萄球菌。
如图24所示，金黄色葡萄球菌激活了cas12a，并切割ssDNA-FQ reporter产生荧光值。
上述实验结果表明，本发明EGFP-amidase 3-CBD-Ni磁珠捕获金黄色葡萄球菌病、并结合cas12a/crRNA切割检测法，可特异性地检测出食品中的金黄色葡萄球菌。
灵敏度考察及结果：分别将1×103CFU/ml、1×102CFU/ml、1×101CFU/ml金黄色葡萄球菌污染无菌牛奶，然后加入100μlEGFP-amidase 3-CBD-Ni磁珠，利用endolysin+水煮法提取金黄色葡萄球菌基因组DNA，在37℃下进行RPA反应30min后(具体参见实施例9)，在37℃下进行Cas12a切割30min。在紫外光的照射下，通过肉眼检查荧光信号；并用GraphPadPrism 8.0软件进行分析数据并用平均值±标准偏差进行呈现，其中，数据均值之间的差异性通过t检验进行分析，P<0.05时则表示差异显著。
如图25所示，图A、B、C分别为利用EGFP-amidase 3-CBD-Ni磁珠捕获结合cas12a/crRNA切割的方法检测牛奶中1×103CFU/ml、1×102CFU/ml、1×101CFU/ml金黄色葡萄球菌，图中的曲线为切割反应在设定为37℃30min的QPCR仪器中所显示出的荧光累积曲线，曲线中的试管图为对应的在37℃切割30min后在紫外光照射下的荧光图。
结果显示，EGFP-amidase 3-CBD-Ni磁珠捕获结合cas12a/crRNA切割检测的最低检测限可进一步低至1×101CFU/ml。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种吸附磁珠，其特征在于，包括：
Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠；
结合蛋白，所述结合蛋白用于结合金黄色葡萄球菌，所述Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠和结合蛋白相连。
2.根据权利要求1所述的吸附磁珠，其特征在于，所述结合蛋白的N端与所述Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠相连；
任选地，所述结合蛋白来源于金黄色葡萄球菌噬菌体，优选为来源于金黄色葡萄球菌噬菌体80α；
任选地，所述结合蛋白包括源于金黄色葡萄球菌噬菌体的受体结合蛋白和Amidase蛋白中的至少之一；
优选地，所述结合蛋白包括选自来源于金黄色葡萄球菌噬菌体80α的受体结合蛋白和Amidase蛋白中的至少之一；
任选地，所述Amidase蛋白为Amidase 3-CBD蛋白；
任选地，所述受体结合蛋白具有如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列、与SEQ ID NO:13具有至少90％同源性的氨基酸序列、以及与SEQ ID NO:13所示受体结合蛋白具有同等或相近的金黄色葡萄球菌结合性能的氨基酸序列中的至少之一；
任选地，所述Amidase 3CBD蛋白具有如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列、与SEQ IDNO:14具有至少90％同源性的氨基酸序列、以及与SEQ ID NO:14所示Amidase 3CBD蛋白具有同等或相近的金黄色葡萄球菌结合性能的氨基酸序列；
任选地，所述结合蛋白连接有荧光基团；
优选地，所述荧光基团为EGFP基团；
任选地，进一步包括蛋白标签；
任选地，所述蛋白标签的C端与所述结合蛋白的N端相连，所述蛋白标签的N端与所述Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠相连；
任选地，所述蛋白标签包括选自His标签、Flag标签、GST标签、MBP标签、SUMO标签和C-Myc标签中的至少之一；
优选地，所述蛋白标签为His标签。
3.权利要求1～2任一项所述的吸附磁珠在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测金黄色葡萄球菌。
4.一种试剂盒，其特征在于，包括：
权利要求1～2任一项所述的吸附磁珠；
任选地，进一步包括：
Cas12a、crRNA和ssDNA-FQ reporter中的至少之一；
优选为，进一步包括Cas12a、crRNA和ssDNA-FQ reporter。
5.权利要求1～2任一项所述的吸附磁珠或权利要求4所述的试剂盒在制备产品中的用途，所述产品用于检测金黄色葡萄球菌。
6.一种检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，包括：
采用权利要求1～2任一项所述的吸附磁珠或权利要求4所述的试剂盒对待测样本进行接触处理，以便检测所述待测样本中是否含有金黄色葡萄球菌或所述金黄色葡萄球菌的含量。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，进一步包括：
将接触处理产物进行DNA提取处理；
将DNA提取处理产物进行扩增处理；
将扩增处理产物进行检测，以便检测所述待测样本中是否含有金黄色葡萄球菌或所述金黄色葡萄球菌的含量；
任选地，所述吸附磁珠是通过如下方式获得的：将Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠和结合蛋白进行第一混合处理；
任选地，所述结合蛋白为Amidase 3-CBD蛋白，所述第一混合处理是在温度为(2-30)℃、pH值为5-9的条件下进行的；
任选地，所述结合蛋白为Amidase 3-CBD蛋白，在所述接触处理之前，将NaCl和所述吸附磁珠进行第二混合处理；
任选地，所述NaCl的终浓度为50～200mM；
任选地，所述吸附磁珠的添加个数不低于1.0×105个。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述DNA提取处理包括：
将所述接触处理产物与内溶素进行水煮处理；
任选地，所述水煮处理之前，将所述内溶素和所述接触处理产物反应20-40min；
任选地，所述水煮处理的时间为5-20min；
任选地，所述内溶素和所述待测样本的体积比为1：(40-60)，其中，所述内溶素的浓度为1-3mg/ml；
任选地，所述内溶素选自来源于所述金黄色葡萄球菌的噬菌体内溶素；
任选地，所述扩增处理是采用重组酶聚合酶扩增方法进行的。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述检测包括：
将所述扩增处理产物、Cas12a、crRNA和ssDNA-FQ reporter进行第三混合处理；
基于所述第三混合处理产生的荧光信号，以便检测所述待测样本中是否含有金黄色葡萄球菌或所述金黄色葡萄球菌的含量；
任选地，所述第三混合处理产生荧光信号，是所述待测样本中含有金黄色葡萄球菌的指示；或者
所述第三混合处理不产生荧光信号，是所述待测样本中不含有金黄色葡萄球菌的指示；
任选地，所述检测进一步包括：
基于标准曲线，确定所述待测样品中金黄色葡萄球菌的含量，所述标准曲线为预定量金黄色葡萄球菌与荧光信号强度的对应曲线。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述crRNA具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列或与其具有至少90％同源性的核苷酸序列。
CN202211716362.1A 2021-12-29 2022-12-29 检测金黄色葡萄球菌的方法 Pending CN116287139A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2021116430156 2021-12-29
CN202111643015.6A CN114317787A (zh) 2021-12-29 2021-12-29 吸附磁珠及其试剂盒和用途以及检测金黄色葡萄球菌的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116287139A true CN116287139A (zh) 2023-06-23

Family

ID=81017664

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111643015.6A Pending CN114317787A (zh) 2021-12-29 2021-12-29 吸附磁珠及其试剂盒和用途以及检测金黄色葡萄球菌的方法
CN202211716362.1A Pending CN116287139A (zh) 2021-12-29 2022-12-29 检测金黄色葡萄球菌的方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111643015.6A Pending CN114317787A (zh) 2021-12-29 2021-12-29 吸附磁珠及其试剂盒和用途以及检测金黄色葡萄球菌的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (2) CN114317787A (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023240564A1 (zh) * 2022-06-16 2023-12-21 深圳华大智造科技股份有限公司 含甘氨酸-NaOH缓冲液的切除试剂及其在核酸测序中的应用

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101701252B (zh) * 2009-11-20 2012-01-11 吉林大学 一种快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的试剂盒
MX340446B (es) * 2011-06-19 2016-07-08 Univ New York Metodos para tratar y prevenir infecciones por estafilococo dorado y condiciones asociadas.
CN104364395B (zh) * 2012-04-06 2018-03-23 基因欧姆科技加拿大公司 用于检测和鉴定MREJ型xxi的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的序列
US9206411B2 (en) * 2012-06-13 2015-12-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Staphylococcal Phage2638A endolysin amidase domain is lytic for Staphylococcus aureus
CN106442987B (zh) * 2016-09-30 2018-11-20 西南大学 金黄色葡萄球菌的荧光检测试剂盒及其使用方法
CN110734988B (zh) * 2018-07-20 2024-06-18 上海仁度生物科技股份有限公司 一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（mrsa）核酸恒温扩增方法
CN110229918A (zh) * 2019-06-18 2019-09-13 暨南大学 一种快速检测食品中金黄色葡萄球菌的方法及其试剂盒
CN110658338A (zh) * 2019-09-12 2020-01-07 武汉大学 便携式哺乳期乳腺炎致病菌mrsa检测方法
CN112062856A (zh) * 2020-09-16 2020-12-11 华侨大学 一种共价捕获目标蛋白的磁性载体制备方法
CN113667765A (zh) * 2021-07-20 2021-11-19 浙江大学 一种利用CRISPR/Cas12a体系可视化检测金黄色葡萄球菌的方法
CN113686934A (zh) * 2021-08-13 2021-11-23 广东海洋大学 一种CRISPR/Cas12a-RCA电化学传感器检测体系及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114317787A (zh) 2022-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Loessner et al. Construction of luciferase reporter bacteriophage A511:: luxAB for rapid and sensitive detection of viable Listeria cells
US5824468A (en) Detection of listeria by means of recombinant bacteriophages
CN112538544B (zh) 具有特异性分子靶标的食源性致病菌标准菌株活菌的检测方法及应用
CN114075607B (zh) 一种基于sherlock检测单增李斯特菌的现场可视化试剂盒及应用
CN113046475B (zh) 一种快速检测突变型新型冠状病毒的引物组合物及试剂盒
CN107988340B (zh) 一种快速检测绵羊肺炎支原体的pcr扩增引物及其应用
CN113637056B (zh) 一种用于鉴别牛种布鲁氏菌与其它种布鲁氏菌的试剂盒
CN110564881A (zh) 一种重组酶等温扩增技术检测副溶血性弧菌的方法
CN116287139A (zh) 检测金黄色葡萄球菌的方法
CN109402069A (zh) 一种假病毒颗粒及其制备方法和应用
CN111206021A (zh) 基于CL7-CVN和Im7***分离、富集和检测囊膜病毒的方法
CN113817854B (zh) 一种单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法
CN114605503A (zh) 沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白rbp-55及其在检测沙门氏菌中的应用
CN115216552A (zh) 一种基于CRISPR/Cas12a-LAMP快速检测青枯菌的方法和试剂盒
US9212383B2 (en) Biological detection system and method
CN107604099B (zh) 鸽新型腺病毒lamp检测引物组及试剂盒
CN111996268A (zh) 溶藻弧菌双重TaqMan探针实时荧光定量PCR检测试剂盒及其制备方法
CN112725532A (zh) 用于鉴别FAdV-4和DAdV-4的实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒
CN112725533B (zh) 用于鸭1型腺病毒和鸭4型腺病毒实时荧光定量pcr鉴别的引物组
CN114015664B (zh) 荧光素酶突变体及其应用
CN116462742B (zh) 一种猴痘病毒假病毒颗粒及其制备方法
CN116121446B (zh) 基于CRISPR-Cas检测猪流感病毒的方法、试剂盒及应用
CN118122294A (zh) 一种检测金黄色葡萄球菌的方法及吸附磁珠
CN108287244B (zh) 热休克蛋白groEL在制备幽门螺杆菌检测的试剂中的应用
CN116732238A (zh) CRISPR-Cas12a侧向流试纸条快速可视化检测非洲猪瘟病毒的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination