CN112011632A

CN112011632A - 多粘菌素耐药基因mcr-4的RPA检测引物组、试剂盒和方法

Info

Publication number: CN112011632A
Application number: CN202010981014.1A
Authority: CN
Inventors: 刘少宁; 李有志; 徐恩民; 陈智; 刘霄飞; 王艳芬; 马艳芳; 赵向阳
Original assignee: Shandong Veterinary Drug Quality Examination Institute (shandong Animal Product Quality Testing Center)
Current assignee: Shandong livestock product quality and Safety Center (Shandong livestock and poultry slaughtering Technology Center)
Priority date: 2020-09-17
Filing date: 2020-09-17
Publication date: 2020-12-01
Also published as: ZA202104727B

Abstract

本发明公开了多粘菌素耐药基因mcr‑4的RPA检测引物组、试剂盒和方法。涉及分子生物学技术领域。包括1对引物和1个探针，并提供了检测试剂盒和非诊断治疗的检测方法和引物组的应用。本发明仅需具备温控功能的荧光检测仪器，可在39℃条件下对mcr‑4进行快速、实时、灵敏、准确、便捷的检测。

Description

多粘菌素耐药基因mcr-4的RPA检测引物组、试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，更具体的说是涉及多粘菌素耐药基因mcr-4的RPA检测引物组、试剂盒和方法。

背景技术

多粘菌素是聚阳离子多肽类药物，对革兰氏阴性耐药菌引起的感染具有良好的疗效，尤其是在耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(Carbapenem-resistant enterobacteriaceae,CRE)等超级耐药菌的治疗上，常作为最后一道防线类药物。2016年，由质粒介导的多粘菌素耐药基因mcr-1被发现，且被证明其可在不同菌株间进行水平转移，引起了全世界的广泛关注。多粘菌素在医学临床、畜牧业及农业上使用量的逐年增加，以及不合理用药情况，给公共卫生安全和畜牧业发展构成了严重威胁。目前，mcr基因家族的其它基因(mcr-2-8)也陆续被报道。已有的研究表明mcr-1、mcr-2和mcr-3基因在我国检出率较高，mcr-4基因检出率较低。检测方法大多采用常规PCR、Sanger测序、荧光定量PCR和LAMP等方法。这些技术有的耗时耗力，有的灵敏度低，有的需要借助于大型精密仪器。进一步确认mcr-4基因在我国畜禽养殖中的存在情况，值得深入研究。

因此，如何提供一种检测多粘菌耐药基因mcr-4的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了多粘菌素耐药基因mcr-4的RPA检测引物组、试剂盒和方法。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度约37℃。其原理是：重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。

RPA分析的关键在于扩增引物和探针的设计。需要注意的是与PCR引物不同，RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-38个碱基；且在设计RPA引物时，变性温度不再是影响扩增引物的关键因素；RPA的引物和探针设计不像传统PCR那样成熟，需要自己摸索条件进行优化。

本发明验证了检测的灵敏度和特异性，并成功检测了待检株中的mcr-4核酸。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种多粘菌素耐药基因mcr-4的RPA检测引物组，包括1对引物和1个探针，引物和探针如下：

mcr-4-F1：5’-CCTCGCCGTGCTAATGCTCAAGACACAGTGATT-3’，SEQ ID NO 1；

mcr-4-R3：5’-AGCAATACTTGGTCAAAACAATATTGGCCAGAA-3’，SEQ ID NO 2；

探针mcr-4-probe：5’-TCATAGTGGTATAAAAGTACAGTGGTTTATAATGATTCTGGCTC-3’，SEQ ID NO 3；

其中，离5’端碱基数27bp的胸腺嘧啶T由FAM荧光基团标记；离5’端碱基数28bp的T和29bp的A之间***四氢呋喃分子；离3’端碱基数15bp的T由荧光淬灭基团BHQ标记。

探针mcr-4-probe可表示为：5’-TCATAGTGGTATAAAAGTACAGTGGT[FAM-dT]T[THF]A[BHQ-dT]AATGATTCTGGCTC-3’；

通过参考GenBank中粘菌素耐药基因mcr-4序列，选择特异性保守区域，设计大量RPA引物，最终筛选出一套可快速有效检测出粘菌素耐药基因mcr-4成分的引物及探针组合。利用该对引物进行快速扩增及实时荧光检测。

本发明还提供了一种基于上述引物组的检测试剂盒，包括：冻干粉、去离子水、聚乙二醇、10μmol/L的mcr-4-F1、10μmol/L的mcr-4-R3，10μmol/L的探针和280mmol/L的醋酸镁溶液。

优选的：冻干粉由以下成分：220ng/μL重组酶RecA 11μg、200ng/μL单链DNA结合蛋白gp32 10μg、100ng/μL DNA聚合酶IKlenow 5μg、70ng/μL辅助蛋白uvsY 3.5μg、80ng/μL核酸外切酶exoIII 4μg、3％聚乙二醇1mg、30mM Tris 0.12mg、120mM乙酸钾0.49mg、3mM ATP0.05mg、50mM磷酸肌酸二钠盐0.51mg、275μM dNTP 250μM、6％蔗糖2.5mg和30％甘油1mg经冷冻干燥制得。

冻干条件为：在-80℃条件下预冻3～4小时，预冻结束后放入真空冷冻干燥机先于-20～-45℃干燥2～10小时，最后10～18℃干燥1～2小时。得到冻干粉。

优选的：反应体系为50μL，将所述冻干粉和去离子水28.4μL，聚乙二醇12.5μL、10μmol/L的mcr-4-F1 2μL、10μmol/L的mcr-4-R3 2μL，10μmol/L的探针0.6μL，模板DNA 2μL和280mmol/L的醋酸镁溶液2.5μL混合。

本发明还提供了一种非诊断目的多粘菌耐药基因mcr-4的RPA检测方法，包括下列步骤：

(1)提取待测样品的DNA为模板；

(2)利用上述引物组或试剂盒进行快速扩增及实时荧光检测。

优选的：扩增程序为：39℃恒温反应20min。

优选的：检测设备为RPA扩增检测仪或荧光定量PCR仪。

本发明还提供了上述引物组在制备检测多粘菌耐药基因mcr-4的试剂盒中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了多粘菌素耐药基因mcr-4的RPA检测引物组、试剂盒和方法，其技术效果为通过本发明提供的检测引物组，mcr-4出现特异性荧光信号，而mcr-1、mcr-2和mcr-3基因无特异性荧光信号，说明具有良好的特异性。将阳性模板稀释至10⁶～10⁰拷贝/μL，均出现良好的特异性荧光信号，表明具有较高的灵敏度。

本发明建立的粘菌素耐药基因mcr-4的RPA(等温扩增)检测方法结合了荧光PCR重复性好、灵敏度高以及等温扩增方法检测时间短等优势，其灵敏度高，检测限值为1拷贝/μL；其检测时间为20min，只有LAMP检测方法的一半，荧光PCR方法的三分之一。仅需具备温控功能的荧光检测仪器，可在39℃条件下对mcr-4进行快速、实时、灵敏、准确、便捷的检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明提供的引物筛选示意图，其中a:F1、R3引物对扩增曲线；b：F2、R2引物对扩增曲线；c:F1、R2引物对扩增曲线；d:F2、R1引物对扩增曲线；e:F2、R3引物对扩增曲线；f:F3、R1引物对扩增曲线；g:F1、R1引物对扩增曲线；h:F3、R2引物对扩增曲线；i:F3、R3引物对扩增曲线。

图2附图为本发明提供的特异性检测示意图，其中a:以pUC-mcr-4为模板的扩增曲线；b、c和d:以pUC-mcr-1、pUC-mcr-2和pUC-mcr-3为模板的扩增曲线，3条线拟合成一条线。

图3附图为本发明提供的灵敏度检测示意图，其中a:模板为10⁶拷贝/μL的扩增曲线；b:模板为10⁵拷贝/μL的扩增曲线c:模板为10⁴拷贝/μL的扩增曲线；d:模板为10³的扩增曲线；e:模板为10²拷贝/μL的扩增曲线；f:模板为10¹拷贝/μL的扩增曲线g:模板为10⁰拷贝/μL的扩增曲线；h:模板为10^-1拷贝/μL的扩增曲线。

图4附图为本发明提供的检测大肠杆菌示意图，其中a:样品MF1的扩增曲线；b:样品MF2的扩增曲线；c:样品MF3的扩增曲线；d:样品MF4的扩增曲线；e:阴性对照。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了多粘菌素耐药基因mcr-4的RPA检测引物组、试剂盒和方法。

实施例涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作，例如：

主要试剂

核酸提取试剂盒、质粒DNA小量抽提试剂盒，均购自凯杰(QIAGEN)生物工程有限公司

主要仪器

CFX96荧光定量PCR仪，伯乐公司产品。

生物材料样品MF1、MF2、MF3和MF4均为常规筛选方法筛选出的携带有目的基因mcr-4的菌株，仅用于对照，具有已知相同类似目的基因mcr-4的菌株均可。

实施例1

mcr-4及其他粘菌素耐药基因重组质粒的合成及拷贝数确定

根据GenBank数据库中mcr-4参考序列(NG_057471.1)，确定mcr-4基因序列信息，由华大基因合成并克隆至pUC载体，命名为pUC-mcr-4，将pUC-mcr-4质粒转化至感受态细胞DH5α，过夜培养后提取质粒并测定浓度。

根据粘菌素耐药基因质粒的分类地位、横向传播方式和临近耐药基因的亲缘关系，选择序列相近的mcr-1(MF084991.1)，mcr-2(NG_051171.1)以及mcr-3(NG_055505.1)三种耐药基因序列作为对照，由华大基因合成并克隆构建对照质粒pUC-mcr-1、pUC-mcr-2以及pUC-mcr-3。

根据下列公式，计算pUC-mcr-4等重组质粒拷贝数：拷贝数(拷贝/μL)＝6.02×10²³×质粒浓度(ng/μL)×10^-9/(质粒碱基数×660)。

实施例2

RPA引物(探针)组设计

参考GenBank中mcr-4基因序列，与mcr-1、mcr-2和mcr-3核酸序列比对，选择特异性保守区域，多组探针及引物对，经初步筛选，筛选出1条探针，及探针的上游区域的3条上游引物，探针的下游区域的3条下游引物。探针和引物均由上海生工合成(表1和表2)。

最佳引物对的确定

将所有的引物排列组合共得到9组扩增引物对，以10拷贝/μL的模板浓度进行多次比对实验，通过起峰时间、重复性等指标判定最佳引物。由图1可见，mcr-4-F1和mcr-4-R3起峰时间早，扩增效果好。并且多次重复比对实验表明该引物对扩增效果稳定(扩增序列CCTCGCCGTGCTAATGCTCAAGACACAGTGATTGATGTGTTAAGTCATAGTGGTATAAAAGTACAGTGGTTTGATAATGATTCTGGCTGTAAAGGTGTGTGTGATCGGGTTGAAAATCTCACGATAGATTTGAAGAGTGATCCGAAGCTGTGTTCTGGCCAATATTGTTTTGACCAAGTATTGCT，SEQ ID NO4；)据此可判定mcr-4-F1和mcr-4-R3是最佳扩增引物(最优引物组：mcr-4-F1、mcr-4-R3和mcr-4-probe)。

表1

引物名称	引物序列(5'-3')
		mcr-4-F1	CCTCGCCGTGCTAATGCTCAAGACACAGTGATT，SEQ ID NO1；
mcr-4-F2	CTAATGCTCAAGACACAGTGATTGATGTGTTAA，SEQ ID NO5；
		mcr-4-F3	CTATGATCCTCGCCGTGCTAATGCTCAAGACA，SEQ ID NO6；
mcr-4-R1	AACACAGCTTCGGATCACTCTTCAAATCTAT，SEQ ID NO7；
		mcr-4-R2	TATTGGCCAGAACACAGCTTCGGATCACTCTT，SEQ ID NO8；
mcr-4-R3	AGCAATACTTGGTCAAAACAATATTGGCCAGAA，SEQ ID NO2；

表2

注：其中，离5’端碱基数27bp的胸腺嘧啶T由FAM荧光基团标记；离5’端碱基数28bp的T和29bp的A之间***四氢呋喃分子；离3’端碱基数15bp的T由荧光淬灭基团BHQ标记。

实施例3

一种非诊断目的多粘菌耐药基因mcr-4的RPA检测方法，包括下列步骤：

(1)提取待测样品的DNA(或总DNA)作为模板；

(2)实施例2筛选出的最优引物组进行快速扩增及实时荧光检测。

反应体系为50μL，将冻干粉和去离子水28.4μL，聚乙二醇12.5uL、10μmol/L的mcr-4-F1 2μL、10μmol/L的mcr-4-R3 2μL，10μmol/L的探针0.6μL，模板DNA 2μL和280mmol/L的醋酸镁溶液2.5μL混合。

冻干粉成分参见表3，冻干方法为：在-80℃条件下预冻3～4小时，预冻结束后放入真空冷冻干燥机中进行干燥，先于-20～-45℃干燥2～10小时，最后10～18℃干燥1～2小时制得冻干粉，备用。

表3冻干粉反应单元组分

组分	用量
		重组酶RecA(220ng/μL)	11μg
单链DNA结合蛋白gp32(200ng/μL)	10μg
		DNA聚合酶IKlenow(100ng/μL)	5μg
辅助蛋白uvsY(70ng/μL)	3.5μg
		核酸外切酶exoIII(80ng/μL)	4μg
聚乙二醇(3％)	1mg
		Tris(30mM)	0.12mg
乙酸钾(120mM)	0.49mg
		ATP(3mM)	0.05mg
磷酸肌酸二钠盐(50mM)	0.51mg
		dNTP(275μM)	250μM
蔗糖(6％)	2.5mg
		甘油(30％)	1mg

扩增程序为：39℃恒温反应20min。

充分混匀后将反应试管放在CFX96荧光定量PCR仪中进行实时荧光扩增，39℃恒温反应20min(对于低拷贝数的模板DNA，4min后拿出反应管再次混匀，离心3～5s)。

阳性样品将会出现明显的扩增曲线，而阴性对照样品则无扩增曲线。

对照实验1

分别以pUC-mcr-4，pUC-mcr-1、pUC-mcr-2和pUC-mcr-3为模板，进行RPA检测(检测方法同实施例3)，通过荧光信号判定引物及探针的特异性。结果只有pUC-mcr-4出现特异性荧光信号，说明该方法具有良好的特异性(参见图2)。

对照实验2

将pUC-mcr-4进行10倍倍比稀释，其终浓度在10⁶～10^-1拷贝/μL之间，并将其作为模板进行RPA反应(同实施例3)，确定该方法的最低检测浓度，即为mcr-4荧光RPA方法的敏感性。(参见图3)试验结果显示RPA检测方法灵敏度良好，检测限值为1拷贝/μL。

实施例4

使用本发明的引物、探针、试剂对实际样本进行检测。实际样本情况参见表4。

表4实际样本信息

采用QIAGEN血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，按照说明步骤对表4中的实际样本提取其基因组DNA。采用本发明的引物、探针、试剂对提取的DNA进行检测。(参见图4)结果表明样品MF1、MF2、MF3和MF4均有荧光信号产生，证明本发明的引物、探针、试剂对实际样本的检测结果与已知结果一致。

本发明根据mcr-4保守基因序列设计一对可有效检测目的片段的RPA引物以及荧光检测探针。经验证，该mcr-4荧光RPA检测方法可特异性检测mcr-4核酸序列，检测限值为1拷贝/μL，20min即可获得结果，可为mcr-4耐药基因的检出和判定提供了有效的技术支撑。

实施例5

一种基于实施例2筛选的最优引物组的检测试剂盒，包括：冻干粉(参见实施例3表3)、聚乙二醇、10μmol/L的mcr-4-F1、10μmol/L的mcr-4-R3，10μmol/L的探针和280mmol/L的醋酸镁溶液。

操作步骤如下：

将冻干粉和去离子水28.4μL，聚乙二醇12.5μL、10μmol/L的mcr-4-F1 2μL、10μmol/L的mcr-4-R3 2μL，10μmol/L的探针0.6μL，模板DNA 2μL和280mmol/L的醋酸镁溶液2.5μL混合。

混匀，离心，将混匀离心后的混合物放入带温控功能的荧光仪器中，设定温度为39℃；每20秒检测一次荧光信号强度，共检测60次，共20min。

反应完成后，根据荧光强度曲线判断样本是否为阳性。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 山东省兽药质量检验所（山东省畜产品质量检测中心）

<120> 多粘菌素耐药基因mcr-4的RPA检测引物组、试剂盒和方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cctcgccgtg ctaatgctca agacacagtg att 33

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agcaatactt ggtcaaaaca atattggcca gaa 33

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcatagtggt ataaaagtac agtggtttat aatgattctg gctc 44

<210> 4

<211> 185

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cctcgccgtg ctaatgctca agacacagtg attgatgtgt taagtcatag tggtataaaa 60

gtacagtggt ttgataatga ttctggctgt aaaggtgtgt gtgatcgggt tgaaaatctc 120

acgatagatt tgaagagtga tccgaagctg tgttctggcc aatattgttt tgaccaagta 180

ttgct 185

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctaatgctca agacacagtg attgatgtgt taa 33

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctatgatcct cgccgtgcta atgctcaaga ca 32

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aacacagctt cggatcactc ttcaaatcta t 31

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tattggccag aacacagctt cggatcactc tt 32

Claims

1.一种多粘菌素耐药基因mcr-4的RPA检测引物组，其特征在于，包括1对引物和1个探针，引物和探针如下：

mcr-4-F1：5’-CCTCGCCGTGCTAATGCTCAAGACACAGTGATT-3’，SEQ ID NO 1；

mcr-4-R3：5’-AGCAATACTTGGTCAAAACAATATTGGCCAGAA-3’，SEQ ID NO 2；

探针mcr-4-probe：5’-TCATAGTGGTATAAAAGTACAGTGGTTTATAATGATTCTGGCTC-3’，SEQ IDNO 3；

2.一种基于权利要求1所述引物组的检测试剂盒，其特征在于，包括：冻干粉、去离子水、聚乙二醇、10μmol/L的mcr-4-F1、10μmol/L的mcr-4-R3，10μmol/L的探针和280mmol/L的醋酸镁溶液。

3.如权利要求2所述的的检测试剂盒，其特征在于，所述冻干粉由以下成分：220ng/μL重组酶RecA 11μg、200ng/μL单链DNA结合蛋白gp32 10μg、100ng/μL DNA聚合酶IKlenow 5μg、70ng/μL辅助蛋白uvsY 3.5μg、80ng/μL核酸外切酶exoIII 4μg、3％聚乙二醇1mg、30mMTris 0.12mg、120mM乙酸钾0.49mg、3mM ATP 0.05mg、50mM磷酸肌酸二钠盐0.51mg、275μMdNTP 250μM、6％蔗糖2.5mg和30％甘油1mg经冷冻干燥制得。

4.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，反应体系为50μL，将所述冻干粉和去离子水28.4μL，聚乙二醇12.5μL、10μmol/L的mcr-4-F1 2μL、10μmol/L的mcr-4-R3 2μL，10μmol/L的探针0.6μL，模板DNA 2μL和280mmol/L的醋酸镁溶液2.5μL混合。

5.一种非诊断目的多粘菌耐药基因mcr-4的RPA检测方法，其特征在于，包括下列步骤：

(1)提取待测样品的DNA为模板；

(2)利用权利要求1所述引物组或权利要求2或3所述试剂盒进行快速扩增及实时荧光检测。

6.如权利要求5所述的一种非诊断目的多粘菌耐药基因mcr-4的RPA检测方法，其特征在于，扩增程序为：39℃恒温反应20min。

7.如权利要求6所述的一种非诊断目的多粘菌耐药基因mcr-4的RPA检测方法，其特征在于，检测设备为RPA扩增检测仪或荧光定量PCR仪。

8.权利要求1所述引物组在制备检测多粘菌耐药基因mcr-4的试剂盒中的应用。