CN117448470B - 一种快速共检水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的序列组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种快速共检水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的序列组合及其应用，属于病原微生物检测技术领域，提供了一种快速共检水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的LAMP引物对、crRNA和ssDNA探针的序列组合，还提供了一种基于CRISPR/Cas12a‑LAMP快速共检水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的试剂盒、检测方法和应用。本发明的检测方法将LAMP扩增方法与CRISPR/Cas12a的检测方法结合来共检水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌，通过蓝光切胶仪和侧流层析试纸条实现可视化检测；本发明的检测方法具有良好的特异性、敏感性、只需要简单的仪器便可以进行检测，具有快速检测的优势。
Description
技术领域
本发明属于病原微生物检测技术领域，尤其涉及一种快速共检水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的序列组合及其应用，具体地是一种基于CRISPR/Cas12a-LAMP快速共检水稻细菌性条斑病菌的序列组合、试剂盒、检测方法和应用。
背景技术
水稻白叶枯病和细菌性条斑病都是由水稻黄单胞菌引起的细菌性病害，这两种病害严重破坏水稻产量。在2007年，水稻白叶枯病和细菌性条斑病被我国列为水稻的检疫性病害。水稻白叶枯病在各大洲中（除欧洲外）均有报道，在极端情况下，每年有数百万公顷的水稻受到影响，损失可高达75%。水稻细菌性条斑病分布于亚洲各地，在我国发病严重，造成水稻减产10~50%，甚至绝收，严重威胁水稻生产安全。在出现明显的症状之前，早期感染水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的水稻，难以通过非专业知识进行物理诊断，导致这两种病害的爆发引起水稻作物的大量死亡。因此，通过分子技术在水稻种子带菌阶段或者在水稻幼苗期检测到这两种病害，对于水稻的生产，农民的增收有着重要的意义。
目前，检测水稻白叶枯病和细菌性条斑病的方法主要是传统的检测方法和近些年发展的分子检测技术等。传统的检测方法主要有噬菌体检测法、育苗生长观察法、致病性测定、直接分离法、血清学检测技术等；近些年发展的分子检测技术主要有：普通PCR、数字PCR、荧光定量PCR法等。传统的检测方法耗时长，检测不方便，并且需要专门的技术人员进行检测。目前，我国检测水稻白叶枯病和细菌性条斑病的国家标准是基于含铁细胞接受因子基因利用PCR技术来检测。
CRISPR/Cas（簇状规则间隔短回文重复序列/CRISPR相关）是细菌和古细菌等原核生物中一种自然发生的适应性免疫***，随着不断发现具有不同活性的Cas蛋白，CRISPR/Cas***已被广泛应用于各种传染性微生物（包括病毒和细菌）的诊断。此外，该***还可用于检测microRNAs（miRNAs）、单核苷酸多态性（SNPs）和DNA甲基化等方面。II类CRISPR蛋白中的Cas12a酶，除了具有特异性靶向外，还表现出对邻近核酸非特异性切割的能力，已经结合等温扩增技术广泛应用于各种微生物的诊断。由于其特异性强、灵敏度高、方便快速，使得该方法可以在田间进行水稻白叶枯病或细菌性条斑病的快速检测和诊断具有广阔的应用前景。
目前对于水稻白叶枯病和细菌性条斑病的检测主要是通过分别对两种病菌单一检测的方式进行。而水稻白叶枯病和细菌性条斑病的防治方法基本相同，在水稻感染病害后，仅需判断水稻是否感染水稻白叶枯病或/和细菌性条斑病即可实施治理，无需判断两种病菌的具体种类，因此开发共检水稻白叶枯病和细菌性条斑病的检测方法，有利于快速对感染的水稻进行治理。但在实际应用过程中，采用现有的检测技术在对水稻白叶枯病和细菌性条斑病进行检测时，需要通过对其中一种病菌检测获得结果后再检测另一种病菌获得检测结果，才能判断水稻是否感染水稻白叶枯病或细菌性条斑病，从而进行治理，目前的技术无法很好的实现水稻白叶枯病或细菌性条斑病的共检，这就导致在对水稻白叶枯病和细菌性条斑病检测时，需要进行两次实验才能够获得检测结果，整体操作复杂。
中国发明专利CN104862404B，公开了一种水稻上两种种传病害的多重PCR检测试剂盒及其专用引物和多重PCR检测方法，通过分别针对水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的特定基因设计相应的专用引物，再经过多重PCR检测，实现了水稻白叶枯病和细菌性条斑病的共检，但该方法仪器设备和试剂昂贵、操作复杂、检测时间长等缺点。
发明内容
针对上述问题，本发明提供是一种快速共检水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的序列组合及其应用，具体地是一种基于CRISPR/Cas12a技术结合LAMP技术快速共检水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的序列组合、试剂盒、检测方法和应用，具有特异性好、灵敏度高、简单快速、样本要求低、高效等特点，可以实现在田间快速检测的要求，提高了检测效率，为水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的共检提供一种新的选择。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一种基于CRISPR/Cas12a-LAMP快速共检水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的序列组合，包括根据acnD基因设计的LAMP引物对序列、crRNA序列和ssDNA探针序列；
其中，LAMP引物对序列为：
上游外引物acnD-LAMP-F3的序列为：5’-CACCTGTAACGGCATGAGC-3’（SEQ ID NO：1）；
下游外引物acnD-LAMP-B3的序列为：5’-GCCCAGCACATCCTTTTCG-3’（SEQ ID NO：2）；
上游内外引物acnD-LAMP-FIP的序列为：5’-CGAGAGCACTGCTGTGGCAT-GGATCCGGTGATCCAACAG-3’ （SEQ ID NO：3）；
下游内引物acnD-LAMP-BIP的序列为：5’-GACGCATCCACCCATATGCCAA-CGGCGATTGCATAGGCA-3’ （SEQ ID NO：4）；
上游环状引物acnD-LAMP-LF的序列为：5’-ACAGATCGCGATCGATGATCT-3’ （SEQ IDNO：5）；
下游环状引物acnD-LAMP-LB的序列为：5’-GCAGGCATTTCTCGCCTCG-3’ （SEQ IDNO：6）；
crRNA的序列为：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGAUGGACGCAUCCACCCAUAUGC（SEQ ID NO：7）；
所述ssDNA探针序列是用于荧光定量PCR检测反应的ssDNA探针序列、用于可视化荧光检测反应的ssDNA探针序列或用于侧流层析试纸条的ssDNA探针序列；
用于荧光定量PCR检测反应的ssDNA探针序列为ssDNA-reporter-FAM或ssDNA-reporter-CY5；
其中，ssDNA-reporter-FAM为：5’-FAM-TTATT-BHQ1-3’；
ssDNA-reporter-CY5为：5’-CY5-TGTCTTATcccccATAAGACA-BHQ1-3’；
用于可视化荧光检测反应的ssDNA探针序列为ssDNA-reporter-FAM-2为：5’-FAM-TGTCTTATcccccATAAGACA-BHQ1-3’；
用于侧流层析试纸条的ssDNA探针序列为FB-reporter为：5’-FAM-TTTTTTTTT-Biotin-3’。
一种基于CRISPR/Cas12a-LAMP快速共检水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的试剂盒，所述试剂盒包含上述的LAMP引物对序列、crRNA序列和ssDNA探针序列。
进一步的，所述试剂盒还包含10×等温扩增缓冲液、Bst 3.0 DNA Polymerase、dNTP混合液、MgSO4、LbCas12a、甜菜碱、ddH2O。
进一步的，所述试剂盒包括用于进行LAMP扩增反应的反应体系和用于进行CRISPR/Cas12a反应的体系。
进一步的，用于进行LAMP扩增反应的反应体系的总体积为50μL，反应体系反应体系为：2.5μL的10×等温扩增缓冲液、1μL的Bst 3.0 DNA Polymerase（8000U/mL）、3.5μL的dNTP混合液（10mM）、1.5μL的MgSO4（100mM）、4μL的甜菜碱（5M）、0.5μL的SYBR green I（20x）、2.5μL的10×LAMP Primer Mix（其中，acnD-LAMP-FIP/BIP的浓度为16μM、acnD-LAMP-F3/B3的浓度为2μM、acnD-LAMP-LF/LB的浓度为4μM）、2μL基因组DNA模板，加入ddH2O补至25μL。
进一步的，用于进行CRISPR/Cas12a反应的体系总体积为20μL，所述体系选自如下任一种：
用于LAMP/Cas12a荧光检测反应的体系的总体积为20μL，体系为：2μL的SF缓冲液、1μL的crRNA（10μM）、1μL的RNA酶抑制剂（40U/μL）、2μL的ssDNA-reporter-CY5（10μM）或者2μL的ssDNA-reporter-FAM（10μM）、1μL的LbCas12a（1μM）、2μL的LAMP扩增产物，11μL的DEPC处理水；
用于LAMP/Cas12a可视化荧光检测反应的体系的总体积为20μL，反应体系为：2μL的SF缓冲液、1μL的crRNA（10μM）、1μL的RNA酶抑制剂（40U/μL）、2μL的ssDNA-reporter-FAM-2（10μM）、1μL的LbCas12a（1μM）、2μL的LAMP扩增产物，11μL的DEPC处理水；
用于侧流层析试纸条检测反应的体系的总体积为20μL，反应体系为：2μL的SF缓冲液、1μL的crRNA（10μM）、1μL的RNA酶抑制剂（40U/μL）、2.5μL的FB-reporter（100 nM）、1μL的LbCas12a（1μM）、2μL的LAMP扩增产物，10.5μL的DEPC处理水。
一种上述基于CRISPR/Cas12a-LAMP快速共检水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的试剂盒在检测田间水稻细菌性条斑病菌中的应用。
一种基于CRISPR/Cas12a-LAMP快速共检水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的检测方法，包括以下步骤：
1）提取疑似样品的基因组DNA；
2）以基因组DNA为基因组DNA模板（LAMP模板），利用上述试剂盒进行RPA扩增反应，得LAMP扩增产物；
3）利用上述试剂盒，取LAMP扩增产物进行CRISPR/Cas12a反应，从而进行荧光检测或者侧流层析试纸条检测。
进一步的，步骤1）中，提取疑似样品的基因组DNA的方法是取水稻白叶枯病和/或细菌性条斑病的疑似样品，剪成细小的碎片，放在干净的1.5mL无菌离心管中，加入浓度为0.5M的NaOH溶液，用灭菌的研磨棒将叶片捣烂，在室温下（室温一般为15~40℃）静置1 min，使用TE Buffer稀释50倍，即得基因组DNA；
步骤2）中，用于进行LAMP扩增反应的反应体系的总体积为50μL，反应体系反应体系为：2.5μL的10×等温扩增缓冲液、1μL的Bst 3.0 DNA Polymerase（8000U/mL）、3.5μL的dNTP混合液（10mM）、1.5μL的MgSO4（100mM）、4μL的甜菜碱（5M）、0.5μL的SYBR green I（20x）、2.5μL的10×LAMP Primer Mix（其中，acnD-LAMP-FIP/BIP的浓度为16μM、acnD-LAMP-F3/B3的浓度为2μM、acnD-LAMP-LF/LB的浓度为4μM）、2μL的LAMP模板，加入ddH2O补至25μL；反应条件为：65℃扩增40 min；
步骤3）中，用于进行CRISPR/Cas12a反应的体系总体积为20μL，所述体系选自如下任一种：
用于LAMP/Cas12a荧光检测的反应体系的总体积为20μL，具体为：2μL的SF缓冲液、1μL的crRNA（10μM）、1μL的RNA酶抑制剂（40U/μL）、2μL的ssDNA-reporter-CY5（10μM）或者2μL的ssDNA-reporter-FAM（10μM）、1μL的LbCas12a（1μM）、2μL的LAMP扩增产物，11μL的DEPC处理水；反应于实时荧光定量PCR仪器内进行，37℃反应1h；
用于LAMP/Cas12a可视化荧光检测反应的体系的总体积为20μL，具体为：2μL的SF缓冲液、1μL的crRNA（10μM）、1μL的RNA酶抑制剂（40U/μL）、2μL的ssDNA-reporter-FAM-2（10μM）、1μL的LbCas12a（1μM）、2μL的LAMP扩增产物，11μL的DEPC处理水；反应条件为：37℃反应5min，在470 nm蓝光切胶仪观察荧光结果；
用于侧流层析试纸条检测反应的体系的总体积为20μL，具体为：2μL的SF缓冲液、1μL的crRNA（10μM）、1μL的RNA酶抑制剂（40U/μL）、2.5μL的FB-reporter（100 nM）、1μL的LbCas12a（1μM）、2μL的LAMP扩增产物，10.5μL的DEPC处理水，37℃反应20min，用DEPC处理水补足至50μL，混匀，将其滴入试纸条的结合垫端，观察试纸条上检测线（T线）和控制线（C线）的颜色。
一种上述基于CRISPR/Cas12a-LAMP快速共检水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的检测方法在水稻细菌性条斑病菌检测方面的应用。
本发明的一种快速共检水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的序列组合及其应用的有益效果为：
本发明提供了一种快速共检水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的序列组合、试剂盒、检测方法和应用，能够直接一次性实现对水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的共检，仅需一次检测即可实施针对水稻进行水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌有关的防治工作，无需分别检测两种病害，整体操作简单；
与现有技术针对水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌共检时，分别针对两种病菌的不同特异性基因设计引物对相比，本发明针对水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌共有的acnD基因设计引物对，能够一次性共检水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌两种病菌两种病菌；
由于在设计LAMP共检引物对时，需要先确定侧切活性高的crRNA序列，LAMP引物对必须将crRNA序列包含进去，这样LAMP反应扩增出的序列才能够含有所需crRNA，这就进一步导致LAMP引物设计受到一定限制，本发明通过寻找到水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌共有的特异性基因——acnD基因，针对acnD基因设计出特异性强、灵敏度高的LAMP引物对，克服了crRNA对LAMP引物设计的限制，同时也克服了由于LAMP引物序列中的AT序列或者GC序列过高或过低产生假阳性的问题；
本发明的检测方法将LAMP的扩增方法与CRISPR/Cas12的检测方法结合，来共检水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌，通过LAMP/Cas12a荧光检测实现荧光检测，或者通过蓝光切胶仪/侧流层析试纸条实现可视化检测；本发明的检测方法具有良好的特异性、敏感性，只需要简单的仪器便可以进行检测，不需要昂贵的仪器设备，简便快速、具有快速检测的的优势，更有利于对水稻白叶枯病和细菌性条斑病的分子共检检测技术在农田间的推广和应用，可以做到对水稻白叶枯病和细菌性条斑病的有效监测和防控。
附图说明
图1是本发明中的基于LAMP/Cas12a共检水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的检测操作流程示意图；
图2是本发明实施例1中的LbCas12a-acnD crRNA序列的间隔序列比对结果；其中，PAM（原间隔序列相邻基序）：TTTN，Protospacer：间隔序列；
图3是本发明实施例2中的Cas12a荧光检测***针对水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的保守基因acnD基因的crRNA检测效率结果图；其中，LbCas12a-acnD是根据acnD基因设计的crRNA，LbCas12a-acnD-BC是以ddH2O作空白对照；荧光比值：通过酶标仪每隔5min反应时检测到的荧光强度与0 min时检测到的荧光强度的比值；
图4是本发明实施例2中的LAMP引物筛选结果图；其中，A图是acnD基因LAMP扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，M代表DL2000，1代表acnD基因的LAMP扩增产物，2代表以ddH2O为空白对照；B图是acnD基因LAMP扩增产物的实时荧光LAMP检测结果图；C图是acnD基因LAMP扩增产物的LAMP可视化检测结果图；
图5是本发明实施例3中的LAMP/Cas12a反应时间的优化结果图；其中，A图是LAMP反应时间的优化结果图；B图是Cas12a可视化荧光检测反应时间的优化；BC是以ddH2O作为空白对照；
图6是本发明实施例5中的LAMP/Cas12a荧光检测反应的灵敏度分析结果图；其中，A图是LAMP扩增反应20 min所得产物结合Cas12a荧光检测反应的灵敏度分析结果图，B图是LAMP反应40min所得产物结合Cas12a荧光检测反应的灵敏度分析结果图，C图是LAMP反应20min所得产物结合Cas12a可视化荧光检测反应的灵敏度分析结果图，D图是LAMP反应40min所得产物结合Cas12a可视化荧光检测反应的灵敏度分析结果图，E图是针对acnD基因的PCR检测反应灵敏度分析结果图；A图-E图中1-9分别代表：20ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL的水稻细菌性白叶枯病菌的标准基因组DNA稀释液，BC代表空白对照；误差线代表三次测量信号强度的标准误； P<0.0001；/> P<0.001；/> P<0.01；/>P<0.05；
图7是本发明实施例5中的LAMP/Cas12a荧光检测反应的特异性分析结果图；其中，A图是LAMP/Cas12a荧光检测反应的特异性分析结果图，B图是LAMP/Cas12a可视化荧光检测反应的特异性分析结果图；A图和B图中的BC是以ddH2O作为空白对照；
图8是本发明实施例6中的LAMP/Cas12a的荧光检测反应田间样品检测结果图；其中，A图是16份田间样品的基于acnD基因的PCR扩增反应结果图，B图是16份田间样品的LAMP/Cas12a可视化荧光检测结果图；A图和B图中的N是以健康叶子的DNA作阴性对照，P是以水稻白叶枯病菌的DNA作阳性对照；
图9是本发明实施例4-6中的LAMP/Cas12a-LFA检测反应结果图；其中，A图是本发明实施例4中的LAMP/Cas12a的LFA检测反应的初步建立结果图；B图是本发明实施例5中的LAMP/Cas12a-LFA检测反应的灵敏度分析结果图，B图中的1-9分别代表：20ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL的水稻细菌性白叶枯病菌的标准基因组DNA稀释液，BC代表空白对照；C图是本发明实施例5中的LAMP/Cas12a-LFA检测反应的特异性分析结果图；D图是本发明实施例6中的16份田间样品的LAMP/Cas12a-LFA的检测结果图，D图中的N是以健康水稻叶子的DNA作阴性对照，P是以水稻白叶枯病菌的DNA作阳性对照。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
另，实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂未注明生产厂商者，均为常规可购买产品。
本发明所提供的基于CRISPR/Cas12a检测水稻白叶枯病或细菌性条斑病的检测操作流程示意图如图1：首先采集疑似样品并进行DNA的粗提，然后通过LAMP扩增技术扩增靶标序列，再通过CRISPR/Cas12a反应，非特异性切割ssDNA探针，最后通过荧光定量PCR仪器、试纸条和蓝光切胶仪来读取结果。
实施例1 特异性基因的靶标保守性分析和引物设计
本发明通过查阅文献和在NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上查找水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌特异的基因，经过进行同源性分析以及在NCBI网站BLAST，筛选出水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌共有的基因：acnD基因。
crRNA序列由直接重复序列和间隔序列等两部分组成。将acnD基因序列在CRISPOR（http://crispor.tefor.net/）网站进行打靶，为了保证crRNA序列的工作的高效性，选取了分值高的间隔序列来设计crRNA。该间隔序列为：GAUGGACGCAUCCACCCAUAUGC。为了保证可以检测出大部分地区的病原菌，选取了不同地区典型菌株通过DNAMAN软件来比对间隔序列，各个菌株的间隔序列完全一致（图2）。送去生工生物公司合成crRNA序列：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGAUGGACGCAUCCACCCAUAUGC（SEQ ID NO：7）。通过Primer Primer 5.0软件设计acnD基因的LAMP和PCR引物，其包含PAM序列。具体设计的LAMP引物和PCR引物见下表：
表1所述的PCR引物和LAMP引物
由此，获得LAMP引物序列，其中包括上游外引物acnD-LAMP-F3（SEQ ID NO：1）、下游外引物acnD-LAMP-B3（SEQ ID NO：2）、上游内外引物acnD-LAMP-FIP（SEQ ID NO：3）、下游内引物acnD-LAMP-BIP（SEQ ID NO：4）、上游环状引物acnD-LAMP-LF（SEQ ID NO：5）、下游环状引物acnD-LAMP-LB（SEQ ID NO：6）。
实施例2 crRNA序列的有效性验证和LAMP扩增反应
S1、水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的基因组DNA快速提取
采集水稻白叶枯病菌或细菌性条斑病菌的疑似样品，用剪刀剪去待测叶片的叶中脉区域（约0.5cm×2cm），剪成细小的碎片，放在干净的1.5mL无菌离心管中，加入500μL浓度为0.5M的NaOH溶液，用灭菌研磨棒将叶片捣烂，在室温下静置1min，使用TE buffer（Tris-EDTA）稀释50倍，得基因组DNA模板，该基因组DNA模板也可以直接作为LAMP模板。
S2、crRNA序列的有效性验证
根据acnD基因的引物对分别设计合成荧光定量PCR仪器检测的水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的ssDNA探针序列（其中ssDNA探针序列为ssDNA-reporter-FAM：5’-FAM-TTATT-BHQ1-3’）；
首先通过PCR反应扩增含PAM序列的靶标序列，得PCR扩增产物；
PCR反应体系为：12.5μL的Green Master Mix酶、acnD-F/R（10μM）各1μL，基因组DNA模板1μL，用ddH2O补足至25μL。
PCR反应程序设置为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。
然后进行CRISPR/Cas12a反应。其中，CRISPR/Cas12a反应的反应体系（20μL）为：2μL的10×Buffer 2.1、1μL的crRNA（10μM）、1μL的RNA酶抑制剂（40U/μL）、2μL的ssDNA-reporter-FAM（10μM）、1μL的LbCas12a（1μM）、2μL的PCR扩增产物，11μL的DEPC处理水，于酶标仪（λex: 485 nm; λem: 535 nm）上进行反应，每隔5 min检测一次荧光值，37℃反应1 h。实验重复三次，使用GraphPad Prism 8作图。
采用ddH2O作为acnD基因设计的crRNA的空白对照，以保证实验未被污染。
结果如图3所示，LbCas12a-acnD的crRNA在10min左右就可以出峰，在35 min左右荧光比值达到最高，其荧光比值最高为6左右，说明此crRNA具有活性。因此，可以用于后续的CRISPR/Cas12a实验中。
S3、LAMP扩增反应
以步骤S1中获得的基因组DNA模板直接作为LAMP模板，分别采用实施例1中获得的各引物对进行LAMP扩增反应，得相应的LAMP扩增产物；
其中，LAMP扩增反应过程如下：
LAMP扩增反应体系的总体积为25μL，反应体系为：2.5μL的10×等温扩增缓冲液、1μL的Bst 3.0 DNA 聚合酶（8000U/mL）、3.5μL的dNTP混合液（10mM）、1.5μL的MgSO4（100mM）、4μL甜菜碱（5M）、0.5μL的SYBR green I（20x）、2.5μL的10×LAMP Primer Mix（其中，acnD-LAMP-FIP/BIP的浓度为16μM、acnD-LAMP-F3/B3的浓度为2μM、acnD-LAMP-LF/LB的浓度为4μM）、2μL基因组DNA模板，加入ddH2O补至25μL。LAMP扩增反应条件为：65℃恒温扩增40min。
分别通过琼脂糖凝胶电泳、实时荧光LAMP、LAMP可视化检测三种方法验证LAMP引物扩增的可行性。
LAMP扩增产物的琼脂糖凝胶电泳：配制1.5%的琼脂糖凝胶，将LAMP扩增产物和6×loading buffer混匀加入加样孔中，设置电压120V，电泳35min后取出琼脂糖凝胶，在凝胶电泳成像***进行拍照保存。如出现了梯形条带则发生了扩增，无梯形条带的则未发生扩增。结果如图4中的A图所示， acnD基因的LAMP扩增产物出现了梯形条带，证明其发生了扩增，而空白对照中未出现梯形条带，未发生扩增。
LAMP扩增产物的实时荧光LAMP检测：在LAMP反应体系中加入荧光染料SYBR greenI（20×），将反应体系加入荧光定量PCR管中，在实时荧光定量PCR仪器上65℃反应1h，每隔1min收集一次荧光信号。观察荧光信号强度的变化，当出现扩增时，在荧光定量PCR仪器上会出现S型曲线，无S型曲线时，则未发生扩增。结果如图4中的B图所示，acnD基因的LAMP扩增产物出现了S型曲线，呈现阳性，证明其发生了扩增，而空白对照未出现S型曲线，呈阴性，未发生扩增。
LAMP扩增产物的LAMP可视化检测：在LAMP反应结束后，在PCR管中加入1μL的SYBRgreen I（1000×）显色液，摇动均匀，肉眼观察颜色变化。若颜色由橙色变为绿色，则发生了扩增；颜色一直是橙色，则未发生扩增。结果如图4中的C图所示，acnD基因的LAMP扩增产物颜色由橙色变为绿色，呈现阳性，证明其发生了扩增，而空白对照颜色一直是橙色未发生变化，呈阴性，未发生扩增。
综上，三种引物筛选方法结果均表明，本发明的LAMP引物组具有较好的特异性。
实施例3 LAMP/Cas12a荧光检测反应时间的优化
一、LAMP反应时间的优化
采用实施例2步骤S3中的方法，在LAMP扩增反应过程中，孵育时间内保持65℃不变，将LAMP扩增反应的时间调整为5 min、10 min、15 min、20 min、30 min、40 min、60 min分别进行LAMP扩增反应，得不同反应时间的LAMP扩增产物。
将不同反应时间的LAMP扩增产物加入CRISPR/Cas12a反应体系中，进行切割反应。
其中，CRISPR/Cas12a反应体系为：2μL的SF缓冲液、1μL的crRNA（10μM）、1μL的RNA酶抑制剂（40U/μL）、2μL的ssDNA-reporter-CY5（10μM，ssDNA-reporter-CY5为：5’-CY5-TGTCTTATcccccATAAGACA-BHQ1-3’）、1μL的LbCas12a（1μM）、2μL的LAMP扩增产物，11μL的DEPC处理水，反应于实时荧光定量PCR仪器进行，37℃反应1h。结果如图5中的A图所示，当LAMP扩增反应的时间为15min时，便可以引起CRISPR/Cas12a检测反应；当LAMP扩增反应的时间为20min，CRISPR/Cas12a反应的荧光信号可以达到最大值。因此，在后续实验中LAMP扩增反应时间初步设为20min。
二、Cas12a反应时间的优化
使用LAMP扩增反应20min时的LAMP扩增产物，将其加入CRISPR/Cas12a反应体系中，孵育时间保持37℃不变，将Cas12a切割反应时间分别设为5 min、10 min、15 min、20min。
其中，CRISPR/Cas12a反应体系为：2μL的SF缓冲液、1μL的crRNA（10μM）、1μL的RNA酶抑制剂（40U/μL）、2μL的ssDNA-reporter-FAM-2（10μM，ssDNA-reporter-FAM-2为：5’-6’FAM-TGTCTTATcccccATAAGACA-BHQ1-3’）、1μL的LbCas12a（1μM）、2μL的LAMP扩增产物，11μL的DEPC处理水。通过蓝光切胶仪（470nm）观察荧光结果。结果如图5中的B图所示，当Cas12a切割反应为5 min时，便可以达到几乎饱和的荧光。因此若后续用肉眼观察Cas12a切割反应结果时，可以将Cas12a切割反应时间设为5 min。
最终，将优化的CRISPR/Cas12a反应***与优化的LAMP体系相结合，建立最佳LAMP/Cas12a反应体系。
实施例4 基于CRISPR/Cas12a-LAMP快速检测水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的方法的建立
1）采集水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的疑似样品，用剪刀剪去待测叶片的叶中脉区域（约0.5cm×2cm），剪成细小的碎片，放在干净的1.5 mL无菌离心管中，加入500μL浓度为0.5M的NaOH溶液，用灭菌研磨棒将叶片捣烂，在室温下静置1min，使用TE buffer（Tris-EDTA）稀释50倍，得基因组DNA模板，可以直接作为LAMP模板。并以ddH2O作为空白对照。
2）取LAMP模板进行LAMP扩增反应，得LAMP扩增产物，具体如下：
LAMP扩增反应体系的总体积为25μL，反应体系为：2.5μL的10×等温扩增缓冲液、1μL的Bst 3.0 DNA Polymerase（8000U/mL）、3.5μL的dNTP混合液（10mM）、1.5μL的MgSO4（100mM）、4μL的甜菜碱（5M）、0.5μL的SYBR green I（20x）、2.5μL的10×LAMP Primer Mix（其中，acnD-LAMP-FIP/BIP的浓度为16μM、acnD-LAMP-F3/B3的浓度为2μM、acnD-LAMP-LF/LB的浓度为4μM）、2μL的LAMP模板，加入ddH2O补至25μL。LAMP扩增反应条件为：65℃恒温扩增20min。
3）三种不同的检测方法
A、第一种检测方法——LAMP/Cas12a荧光检测
根据acnD基因的引物对分别设计合成用于荧光检测的水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的ssDNA探针序列ssDNA-reporter-CY5，具体为：5’-CY5-TGTCTTATcccccATAAGACA-BHQ1-3’；
取LAMP扩增产物进行LAMP/Cas12a荧光检测反应。
用于LAMP/Cas12a荧光检测反应的体系的总体积为20μL，反应体系为：2μL的SF缓冲液、1μL的crRNA（10μM）、1μL的RNA酶抑制剂（40U/μL）、2μL的ssDNA-reporter-CY5（10μM）、1μL的LbCas12a（1μM）、2μL的LAMP扩增产物，11μL的DEPC处理水，置于荧光定量PCR仪器上进行反应，将程序设置为65℃ 30s，65℃ 30s，反应过程中每隔1min收集荧光一次，60个循环，共1h，即得水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的荧光共检结果。
或者，也可以采用2μL的ssDNA-reporter-FAM（10μM）代替2μL的ssDNA-reporter-CY5（10μM）进行LAMP/Cas12a荧光检测，其它工艺过程及参数完全一致；其中，ssDNA-reporter-FAM为：5’-FAM-TTATT-BHQ1-3’。
B、第二种检测方法——LAMP/Cas12a可视化荧光检测
根据acnD基因的引物对分别设计合成用于荧光检测的水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的ssDNA探针序列ssDNA-reporter-FAM-2，具体为：5’-FAM-TGTCTTATcccccATAAGACA-BHQ1-3’。
取LAMP扩增产物进行LAMP/Cas12a可视化荧光检测反应。
用于LAMP/Cas12a可视化荧光检测反应的体系的总体积为20μL，反应体系为：2μL的SF缓冲液、1μL的crRNA（10μM）、1μL的RNA酶抑制剂（40U/μL）、2μL的ssDNA-reporter-FAM-2（10μM）、1μL的LbCas12a（1μM）、2μL的LAMP扩增产物，11μL的DEPC处理水，反应于37℃反应5min，反应结束后使用蓝光切胶仪观察结果，即得水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的可视化荧光共检结果。
C、第三种检测方法——LAMP/Cas12a-LFA检测反应（即侧流层析试纸条检测）
根据acnD基因的引物对分别设计合成用于荧光检测的水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的ssDNA探针序列FB-reporter，具体为：5’-FAM-TTTTTTTTT-Biotin-3’。
用于侧流层析试纸条检测反应的体系的总体积为20μL，反应体系为：2μL的SF缓冲液、1μL的crRNA（10μM）、1μL的RNA酶抑制剂（40U/μL）、2.5μL的FB-reporter（100 nM）、1μL的LbCas12a（1μM）、2μL的LAMP扩增产物，10.5μL的DEPC处理水，37℃反应20min，反应结束后，用DEPC处理水补足至50μL，所得产物滴入试纸条结合垫端，可以在控制线处观察到红色条带，如图9中的A图所示，左侧为样品检测结果，右侧为空白对照，本实施例中样品检测结果在控制线处未观察到红色条带，说明检测的结果是该样品感染了水稻白叶枯病菌和/或细菌性条斑病菌。
实施例5 LAMP/Cas12a的检测方法的灵敏度和特异性分析
一、DNA的提取：用广州美格生物科技有限公司HiPure Bacterial DNA Kit细菌基因组DNA提取试剂盒提取水稻白叶枯病菌的基因组DNA。
步骤如下：
（1）取过夜振荡培养的水稻白叶枯病菌的菌液2mL，转移至2mL无菌离心管中，10000 r/min离心1 min收集细菌，将残留的培养基尽量倒净。
（2）向沉淀的菌中加入220μL的Buffer STE Plus、10μL的RNaseA和30μL的Lysozyme，涡旋混匀，充分重悬细菌，室温静置10~15 min。向细菌重悬液中加入10μL的Proteinase K和250μL的Buffer DL，涡旋混匀，70℃水浴10 min。
（3）加入250μL无水乙醇至裂解液中，涡旋混匀15s。这一步若有絮状沉淀出现，用移液枪吸打几次尽量打散沉淀，得混合液（包括沉淀）。
（4）把HiPure DNA Mini Columnl装在2mL收集管中，再把步骤（3）中获得的混合液（包括沉淀）转移至柱子（即DNA结合柱）中，10000r/min离心1min；若柱子出现堵塞，提高离心速度至13000r/min，离心3min。
（5）倒弃流出液，把柱子装回收集管中，加入500μL的Buffer GW1（已用乙醇稀释）至柱子上，10000 r/min离心1min。
（6）倒弃滤液，把柱子装回收集管中。加入650 μL Buffer GW2(已用乙醇稀释至柱子中。10000 r/min离心1 min。
（7）倒弃流出液，把柱子装回收集管中，10000r/min离心2min，将柱子装在新的1.5mL无菌离心管中，加入30~100μL预热至70℃的Buffer AE至柱子膜中央，放置3min，10000r/min离心1min。
（8）丢弃DNA结合柱。将提取的水稻细菌性白叶枯病菌的标准基因组DNA用超微量分光光度计测浓度和质量。
二、LAMP/Cas12a的检测方法的灵敏度分析
将水稻细菌性白叶枯病菌的标准基因组DNA稀释到20ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL，并以ddH2O作为空白对照，按照实施例4中的方法分别进行LAMP/Cas12a荧光检测反应、LAMP/Cas12a可视化荧光检测和LAMP/Cas12a检测反应，实现灵敏度评价，试验重复3次。同时使用acnD-F/R引物进行PCR实验，比较二者之间的灵敏度差异。
结果如图6和图9中的B图所示，其中，图6中的A图是LAMP扩增反应20min所得产物结合Cas12a荧光检测反应的灵敏度分析结果图，B图是LAMP扩增反应40min所得产物结合Cas12a荧光检测反应的灵敏度分析结果图，C图是LAMP扩增反应20min所得产物结合Cas12a可视化荧光检测反应的灵敏度分析结果图，D图是LAMP扩增反应40min所得产物结合Cas12a可视化荧光检测反应的灵敏度分析结果图，E图是针对acnD基因的PCR检测反应的灵敏度分析结果图；图6的A图、B图和C图及图9的B图中的1-9分别代表：20g/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL的水稻细菌性白叶枯病菌的标准基因组DNA稀释液，BC代表空白对照。误差线代表三次测量信号强度的标准误； P<0.0001；/> P<0.001；/> P<0.01；/>P<0.05。
图6的A图、C图和E图可以表明，当LAMP扩增反应20min、Cas12a切割反应5min时，通过荧光定量PCR仪器检测到的DNA检测下限为1pg/μL，而通过蓝光切胶仪荧光可视化检测得到的DNA检测下限为1ng/μL，其灵敏度低于PCR灵敏度。然而，当LAMP扩增反应40min、Cas12a反应5min时，通过荧光定量PCR仪器、荧光检测及蓝光切胶仪荧光可视化检测到的DNA检测下限都是1pg/μL，荧光检测和荧光可视化检测的灵敏度均与PCR灵敏度一致。因此，LAMP/Cas12a荧光检测反应和荧光可视化检测可以在较短时间内达到与PCR反应一致的灵敏度。
图6的E图和图9的B图可以表明，LAMP/Cas12a-LFA检测到的DNA下限为1pg/μL，而PCR检测反应在检测浓度为1pg/μL水稻细菌性白叶枯病菌的标准基因组DNA稀释液时虽然能够检出，但其条带的亮度较弱，检测效果相对较差；而采用LAMP/Cas12a-LFA检测时，试纸条中检测线颜色明显未出现，说明LAMP/Cas12a-LFA检测效果明显优于PCR检测反应。
三、LAMP/Cas12a的检测方法的特异性分析
使用同属黄单胞菌属的其它近缘菌株的菌悬液（OD600=0.8）（菌株详细信息见表2），并以这些菌株的菌悬液作为LAMP扩增的模板，以ddH2O为空白对照。水稻细菌性白叶枯病菌的标准基因组DNA（缩写为Xoo）和水稻细菌性条斑病菌的标准基因组DNA（缩写为Xoc）分别作为实验菌株，按照实施例4中的方法分别进行LAMP/Cas12荧光检测反应、LAMP/Cas12可视化荧光检测和LAMP/Cas12-LFA检测反应，以评价特异性。
结果如图7和图9中的C图所示，其中图7中的A图是LAMP/Cas12a荧光检测反应的特异性分析结果图，B图是LAMP/Cas12a可视化荧光检测反应的特异性分析结果图；图9的中的C图是LAMP/Cas12a-LFA检测反应的特异性分析结果图；图7的A图和B图及图9的C图中的BC代表空白对照。
从图7的A图中可以看出，通过荧光定量PCR仪器特异性检测水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的菌株时，产生显著的荧光信号，近缘菌株会有微弱信号强度，与空白对照相差较近。从图7的B图中可以看出，通过蓝光切胶仪可视化观察结果时，只有水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌可以观察到显著的肉眼可见的荧光，近缘菌株不会产生肉眼可见的荧光。从图9的C图中可以看出，通过试纸条观察时，只有水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌菌株在测试线处没有红色条带，其它近缘菌株和空白对照在控制线处有红色条带。因此，本发明的LAMP/Cas12a的荧光检测反应和侧流试纸条检测反应对水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的菌株都具有较强的特异性，可以实现水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的菌株的共检。在实际应用过程中，仅需检测一次即可判断是否感染水稻白叶枯病菌和/或细菌性条斑病菌的菌株，无需针对两种病菌分别进行检测。
表2 本发明中所用对照菌株
实施例6 田间样品检测
从海南省三亚市周围不同水稻田中采集16份有疑似症状的样品，对采集到的叶片按照实施例4中的方法分别进行表面消毒、DNA粗提取后，再按照实施例4中的方法进行LAMP/Cas12a可视化荧光检测以及试纸条分析，并使用acnD-F/R引物进行PCR实验，比较验证。
结果如图8和图9中的D图所示，其中，图8中的A图是16份田间样品的基于acnD基因的PCR扩增反应结果图；B图是16份田间样品基于LAMP/Cas12a可视化荧光检测结果图；图9中的D图是16份田间样品基于LAMP/Cas12a-LFA检测结果图；图8的A图和B图及图9的D图中的N是以健康叶子的DNA作阴性对照；P是以水稻白叶枯病菌的DNA作阳性对照。
首先通过acnD基因PCR扩增进行验证，从图8的A图中可以看出，11个样品表现出了水稻白叶枯病菌或/和细菌性条斑病菌阳性扩增，其余样品均显示为阴性。接着进行LAMP/Cas12a荧光检测可视化检测反应和LAMP/Cas12a-LFA检测反应，从图8的B图和图9的D图中可以看出，16个样品检测结果与acnD基因PCR检测结果保持完全一致。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种基于CRISPR/Cas12a-LAMP快速共检水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的序列组合物，其特征在于，包括根据acnD基因设计的LAMP引物对序列、crRNA序列和ssDNA探针序列；
其中，所述的LAMP引物对序列为：
上游外引物acnD-LAMP-F3的序列如SEQ ID NO：1所示；
下游外引物acnD-LAMP-B3的序列如SEQ ID NO：2所示；
上游内外引物acnD-LAMP-FIP的序列如SEQ ID NO：3所示；
下游内引物acnD-LAMP-BIP的序列如SEQ ID NO：4所示；
上游环状引物acnD-LAMP-LF的序列如SEQ ID NO：5所示；
下游环状引物acnD-LAMP-LB的序列如SEQ ID NO：6所示；
所述的crRNA的序列如SEQ ID NO：7所示；
所述的ssDNA探针序列是用于荧光定量PCR检测反应的ssDNA探针序列、用于可视化荧光检测反应的ssDNA探针序列或用于侧流层析试纸条的ssDNA探针序列；
所述的用于荧光定量PCR检测反应的ssDNA探针序列为ssDNA-reporter-FAM或ssDNA-reporter-CY5；
其中，所述的ssDNA-reporter-FAM为：5’-FAM-TTATT-BHQ1-3’；
所述的ssDNA-reporter-CY5为：5’-CY5-TGTCTTATcccccATAAGACA-BHQ1-3’；
所述的用于可视化荧光检测反应的ssDNA探针序列为ssDNA-reporter-FAM-2：5’-FAM-TGTCTTATcccccATAAGACA-BHQ1-3’；
所述的用于侧流层析试纸条的ssDNA探针序列为FB-reporter：5’-FAM-TTTTTTTTT-Biotin-3’。
2.一种基于CRISPR/Cas12a-LAMP快速共检水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的LAMP引物对序列、crRNA序列和ssDNA探针序列。
3.根据权利要求2所述的一种基于CRISPR/Cas12a-LAMP快速共检水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含10×等温扩增缓冲液、Bst 3.0DNA 聚合酶、dNTP混合液、MgSO4、甜菜碱、LbCas12a、ddH2O。
4.根据权利要求2或3所述的一种基于CRISPR/Cas12a-LAMP快速共检水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于进行LAMP扩增反应的反应体系和用于进行CRISPR/Cas12a反应的体系。
5.根据权利要求4所述的一种基于CRISPR/Cas12a-LAMP快速共检水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的试剂盒，其特征在于，所述的用于进行LAMP扩增反应的反应体系包括：10×等温扩增缓冲液、Bst 3.0 DNA 聚合酶、dNTP混合液、MgSO4、甜菜碱、SYBR green I、10×LAMP 引物混合物、基因组DNA模板和ddH2O；其中，所述的10×LAMP 引物混合物中含有所述的acnD-LAMP-FIP、acnD-LAMP-BIP、acnD-LAMP-F3、acnD-LAMP-B3、acnD-LAMP-LF和acnD-LAMP-LB。
6.根据权利要求4所述的一种基于CRISPR/Cas12a-LAMP快速共检水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的试剂盒，其特征在于，所述的用于进行CRISPR/Cas12a反应的体系选自如下任一种：
用于LAMP/Cas12a荧光检测反应的体系包括SF缓冲液、crRNA、RNA酶抑制剂、所述的ssDNA-reporter-CY5或者所述的ssDNA-reporter-FAM、LbCas12a、LAMP扩增产物和DEPC处理水；
用于LAMP/Cas12a可视化荧光检测反应的体系包括SF缓冲液、crRNA、RNA酶抑制剂、所述的ssDNA-reporter-FAM-2、LbCas12a、LAMP扩增产物和DEPC处理水；
用于侧流层析试纸条检测反应的体系包括SF缓冲液、crRNA、RNA酶抑制剂、所述的FB-reporter、LbCas12a、LAMP扩增产物和DEPC处理水。
7.权利要求2-6中任一项所述的一种基于CRISPR/Cas12a-LAMP快速共检水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的试剂盒在检测田间水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌中的应用。
8.一种基于CRISPR/Cas12a-LAMP快速共检水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）提取疑似样品的基因组DNA；
2）以基因组DNA为基因组DNA模板，利用权利要求2-6中任一项所述的试剂盒进行LAMP扩增反应，得LAMP扩增产物；
3）利用权利要求2-6中任一项所述的试剂盒，取LAMP扩增产物进行CRISPR/Cas12a反应，从而进行荧光检测或者侧流层析试纸条检测。
9.根据权利要求8所述的一种基于CRISPR/Cas12a-LAMP快速共检水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的检测方法，其特征在于，
步骤1）中，提取疑似样品的基因组DNA的方法是取水稻白叶枯病和/或细菌性条斑病的疑似样品，加入NaOH溶液，捣烂，静置，使用TE Buffer稀释，即得基因组DNA；
步骤2）中，用于进行LAMP扩增反应的反应体系包括10×等温扩增缓冲液、Bst 3.0 DNA聚合酶、dNTP混合液、MgSO4、甜菜碱、SYBR green I、10×LAMP 引物混合物、2μL的LAMP模板，加入ddH2O补至25μL；反应条件为：65℃扩增40 min；
其中，10×LAMP 引物混合物中含有所述的acnD-LAMP-FIP、acnD-LAMP-BIP、acnD-LAMP-F3、acnD-LAMP-B3、acnD-LAMP-LF和acnD-LAMP-LB；
步骤3）中，用于进行CRISPR/Cas12a反应的体系选自如下任一种：
用于LAMP/Cas12a荧光检测反应的体系包括SF缓冲液、crRNA、RNA酶抑制剂、所述的ssDNA-reporter-CY5或者所述的ssDNA-reporter-FAM、LbCas12a、LAMP扩增产物和DEPC处理水；37℃反应1h；
用于LAMP/Cas12a可视化荧光检测反应的体系包括SF缓冲液、crRNA、RNA酶抑制剂、所述的ssDNA-reporter-FAM-2、LbCas12a、LAMP扩增产物和DEPC处理水；反应条件为：37℃反应5min，在470nm蓝光切胶仪观察荧光结果；
用于侧流层析试纸条检测反应的体系包括SF缓冲液、crRNA、RNA酶抑制剂、所述的FB-reporter、LbCas12a、LAMP扩增产物和DEPC处理水，37℃反应20min，用DEPC处理水补足至50μL，混匀，利用试纸条进行检测。
10.权利要求8或9所述的一种基于CRISPR/Cas12a-LAMP快速共检水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的检测方法在水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌检测方面的应用。
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| CN117089631A (zh) * | 2023-10-13 | 2023-11-21 | 中国热带农业科学院三亚研究院 | 一种基于CRISPR/Cas12a-RPA快速检测红火蚁的序列组合及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| PAM-free loop-mediated isothermal amplification coupled with CRISPR/Cas12a cleavage (Cas-PfLAMP) for rapid detection of rice pathogens;Zaobing Zhu 等;《Biosensors and Bioelectronics》;20220515;第204卷;摘要 * |
| 我国水稻白叶枯病和条斑病发生与防控研究进展;徐夏萌 等;《植物保护》;20230712;第49卷(第5期);摘要，第43-49页 * |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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