CN113817854B - 一种单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法 - Google Patents
一种单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113817854B CN113817854B CN202111148736.XA CN202111148736A CN113817854B CN 113817854 B CN113817854 B CN 113817854B CN 202111148736 A CN202111148736 A CN 202111148736A CN 113817854 B CN113817854 B CN 113817854B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rpa
- salmonella
- ssdna
- cas12a
- crrna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title claims abstract description 99
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 title claims abstract description 73
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 title claims abstract description 58
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 58
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 108700004991 Cas12a Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 16
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 19
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 19
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 8
- 102100035102 E3 ubiquitin-protein ligase MYCBP2 Human genes 0.000 claims description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 6
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 4
- 101150059443 cas12a gene Proteins 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 claims description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims 5
- 101000726844 Bartonella bacilliformis (strain ATCC 35685 / NCTC 12138 / KC583) RNA pyrophosphohydrolase Proteins 0.000 claims 1
- 101800005109 Triakontatetraneuropeptide Proteins 0.000 claims 1
- NMEHNETUFHBYEG-IHKSMFQHSA-N tttn Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 NMEHNETUFHBYEG-IHKSMFQHSA-N 0.000 claims 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 abstract description 6
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 abstract description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 abstract 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 22
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 17
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 14
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 7
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 5
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 5
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 4
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 4
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 description 3
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 2
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 2
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 2
- 241000607272 Vibrio parahaemolyticus Species 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- -1 pyrophosphate ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 206010004022 Bacterial food poisoning Diseases 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 208000002881 Colic Diseases 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000588720 Escherichia fergusonii Species 0.000 description 1
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 1
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 208000006731 Salmonella Food Poisoning Diseases 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 208000037280 Trisomy Diseases 0.000 description 1
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 244000000021 enteric pathogen Species 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229910021389 graphene Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 208000018555 lymphatic system disease Diseases 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 235000013622 meat product Nutrition 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种单标记单链DNA(ssDNA)探针可视化检测沙门氏菌基因的方法。通过RPA对沙门氏菌的特征基因进行扩增,利用Cas12a和crRNA组装的复合物识别并结合RPA扩增的特异产物上的特征序列以激活Cas12a的附属切割活性,从而对单荧光标记的ssDNA进行切割,使其被GO吸附的能力减弱,而无沙门氏菌DNA的样本因为不激活Cas12a的附属切割活性,单荧光基团标记的ssDNA无法被切割,被GO吸附而出现荧光淬灭;最终将沙门氏菌的基因信息转换为可视的荧光变化。本发明实现了对沙门氏菌基因的特异、单标记、可视化检测。
Description
技术领域
本发明属于微生物检测领域中的沙门氏菌检测,具体涉及了一种单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法。
背景技术
根据世界卫生组织报道,全球范围内年均有6亿例食源性疾病由食用受肠道病原体污染的食品引起,其中42万例死亡。在欧盟,2018年约有5146起食源性疫情,肉类和相关产品是主要的传染源,占2018年食源性疫情的17.9%,而其中最常见的病原体是沙门氏菌。沙门氏菌为肠杆菌科(Enter-obacteriaceae)沙门氏菌属(Salmonella)的革兰氏阴性需氧或兼性厌氧杆菌,目前全球已知有2523种血清型。沙门氏菌属食物中毒是一种常见的细菌性食物中毒,其中以鼠伤寒、肠炎和猪霍乱杆菌最常见。沙门氏菌主要存在于鸡蛋、肉类和肉制品中,会导致胃肠炎症状,包括持续腹泻、发烧、呕吐和腹部绞痛等。此外,在淋巴***入侵或炎症性肠病的情况下,感染沙门氏菌还可能导致败血症和伤寒。因此,为了保证食品安全,准确、高效地检测沙门氏菌也变得越来越重要。
食品中沙门氏菌的常规检测方法是平板培养法,包括菌落计数和标准生化鉴定,一般需要2到3天对致病菌进行初步鉴定,额外需要长达一周的时间进一步确认致病菌的种类,检测周期长,工作量大。免疫学检测方法主要是基于抗原和抗体间的相互作用而实现的,相比于传统的平板培养分离鉴定法检测时间已经大幅度缩短,但抗原和抗体之间的结合强度及细菌抗原交叉反应常影响检测结果的灵敏度和准确性。基于生物遗传信息发展起来的核酸检测技术具有特异性强、灵敏度高等优点,如聚合酶链式反应(PCR)。但PCR需要精密的温控设备,不适用于现场检测。
恒温核酸扩增不需要模板的热变性,在等温条件下即可实现目标序列的指数复制,仅简单的金属浴或水浴锅即可满足温控需求,避免对昂贵的仪器设备的依赖,具有省时、易操作、低成本的特点,且灵敏度极高。常规用于恒温扩增产物检测的方法主要包括实时荧光采集和凝胶电泳,前者需要精密的荧光采集装置,后者操作时间长,两者在现场检测领域都受到一定的限制。可视化检测法具有操作方便、结果直观等优点,在现场检测领域具有巨大的优势。扩增体系中各成分(如焦磷酸根离子、镁离子、氢离子等)在反应前后发生较大幅度变化,常被用于构建可视化判断扩增反应进程的方法,例如HNB法、钙黄绿素法、浊度法、pH染料法等。但引物、反应温度、缓冲溶液、酶等任一因素的非最佳条件都可能导致扩增反应过程中非特异性核酸链延伸与积累,而上述方法无法排除非特异信号所产生的干扰,进而影响检测结果的准确性。
CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是一种存在于几乎所有古生菌和多数细菌中的抵御病毒入侵的一种获得性免疫方式,可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。Cas12a是一种与CRISPR相关的DNA内切酶,在crRNA的引导下依赖PAM序列特异性识别双链DNA序列,形成三体复合物。与此同时,Cas12a的附属切割活性被激活,不加选择地切割体系中的所有ssDNA。CRISPR/Cas12a的这种特性已被成功应用于开发快速、低成本且高灵敏的核酸检测工具上,在核酸分子诊断领域具有重要的应用潜力。但是,CRISPR/Cas12a仅能检测pM甚至更高浓度的核酸序列,其灵敏度无法满足实际生产中沙门氏菌的检测需求。利用RPA的高灵敏度的特点,将其与CRISPR/Cas技术联用,能够很好的解决CRISPR自身灵敏度受限的问题,并排除RPA的非特异信号的干扰,实现沙门氏菌的特异检测。但是,当前利用CRISPR/Cas进行目标物检测时,主要依赖Cas12a对同时标记荧光基团和淬灭基团的ssDNA探针进行切割,检测成本较高。减少ssDNA探针的修饰,将有利于节约检测成本。
发明内容
为了解决基于CRISPR/Cas12a的核酸检测对同时修饰荧光基团和淬灭基团标记的ssDNA探针的依赖问题,本发明提供了一种利用CRISPR/Cas12a切割单标记的ssDNA报告探针,并利用GO对ssDNA的强吸附能力和对荧光的淬灭能力,实现沙门氏菌基因检测的方法。
本发明采用的技术方案包括以下步骤:
1)提取待测样品的基因组DNA;
2)表达并纯化Cas12a;
3)设计并合成RPA引物和crRNA;
4)RPA扩增:以步骤1)提取的基因组DNA作为模板,在含有RPA引物的RPA体系中进行扩增,得到RPA产物;
5)荧光可视检测:将步骤4)的RPA产物、步骤2)的Cas12a、步骤3)的crRNA、单荧光基团标记的ssDNA探针和NEBuffer2.1缓冲液混匀后,孵育10~60min,再添加GO(氧化石墨烯),通过荧光信号判断待测样品中是否含有沙门氏菌基因。
所述步骤3)中的设计并合成RPA引物具体为:针对沙门氏菌的侵袭蛋白A基因(InvA基因)合成RPA引物;
所述RPA引物包括RPA引物1、RPA引物2;RPA引物1序列为:GTCATTCCATTACCTACCTATCTGGTTGATTTCC;RPA引物2序列为:GCATCGGCTTCAATCAAGATAAGACGACTGGT。
所述步骤3)中设计并合成crRNA具体为:
根据RPA的靶标序列以及PAM序列选定crRNA的识别序列为:GTCAATGTAGAACGACCCCA,根据碱基互补配对的原则设计并合成crRNA的识别序列对应的crRNA序列为:
所述RPA的靶标序列为:
所述PAM序列为:TTTN。
所述步骤4)中:
50μL RPA体系包括13.2μL模板DNA、0.48μM RPA引物1、0.48μM RPA引物2、29.5μLRehydration buffer、14mM醋酸镁;
扩增条件为:37℃孵育10-20min。
所述步骤5)具体为:
取体积为1-10μL的RPA扩增产物、浓度为0.2-0.6μM Cas12a、浓度为0.2-0.6μM的crRNA、浓度为1μM的单荧光基团标记的ssDNA探针和1×NEB buffer 2.1,用DEPC处理水补足至20μL后混匀,35-37℃孵育10-60min后,添加0.2mg/mL GO。
所属步骤5)中,标记在ssDNA上的荧光染料为FAM、Cy5、HEX;荧光基团标记方式优选为:在ssDNA探针的3’最末端的位点修饰FAM荧光基团。
所属步骤5)中,ssDNA的长度优选为12个碱基。
所述步骤5)中:当RPA产物中含有沙门氏菌的特异扩增基因时,Cas12a-crRNA与特征序列结合,进而激活Cas12a的附属切割活性,切割荧光基团标记的ssDNA探针,使其无法被GO吸附,溶液发射荧光;
特征序列为能与crRNA的识别区域互补的序列,即识别序列;
当RPA产物中不含有沙门氏菌的特异扩增基因时,Cas12a的附属切割活性无法被激活,无法切割单荧光基团标记的ssDNA,使其被GO吸附,溶液不发射荧光。
本发明的有益效果是:
本发明采用RPA将沙门氏菌的特征基因信号进行放大,利用Casl2a和crRNA组装的复合物识别RPA特异产物上的特征序列以激活Cas12a的附属切割活性,对荧光基团标记的ssDNA进行切割,再利用GO对ssDNA的强吸附性能和对荧光的强淬灭能力进行信号输出,实现沙门氏菌可视化检测。
附图说明
图1为基于CRISPR/Cas12a的单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的示意图。图中A表示沙门氏菌DNA经RPA扩增,所得产物与Cas12a-crRNA结合形成三元复合物激活Cas12a的附属切割活性,将荧光基团标记的ssDNA探针切割为小片段,加入GO后发射明显的荧光。图中B表示非沙门氏菌DNA经过RPA扩增后无特异扩增产物,无法与Cas12a-crRNA形成三元复合物,无法切割荧光基团标记的ssDNA探针,加入GO后单荧光基团标记的ssDNA被GO吸附从而无荧光发射。
图2为Cas12a被dsDNA目标物激活后切割FAM标记的不同长度的ssDNA探针结合GO进行荧光检测的结果。A为荧光可视化图。B为荧光值柱状图以及信噪比趋势。N表示无dsDNA目标物激活Cas12a。P表示有dsDNA目标物激活Cas12a。
图3ssDNA探针上单荧光基团标记位点对荧光发射的影响。图中A和C为长度相同但荧光标记位点不同的ssDNA探针在经Cas12a切割后利用GO进行可视化检测结果。图中B和D为长度相同但荧光标记位点不同的ssDNA探针在经Cas12a切割后利用GO进行荧光检测的荧光值结果及阳性样本与阴性样本的荧光比值。N表示无dsDNA目标物激活Cas12a,P表示有dsDNA目标物激活Casl2a。
图4为RPA扩增产物激活Cas12a附属切割活性并切割单荧光基团标记的ssDNA并利用GO实现荧光可视化检测沙门氏菌基因的灵敏度。图A为可视化检测结果,图B为实时荧光PCR结果。NTC表示无模板的对照。
图5为RPA扩增产物激活Cas12a附属切割活性切割单荧光基团标记的ssDNA并利用GO实现荧光可视化检测沙门氏菌基因的特异性。所选用于特异性验证的菌种包括副溶血弧菌ATCC 17802(V.P 17802)、鼠伤寒沙门氏菌CMCC(B)50115(Salm 50115)、不动杆菌DSM25388(A.B 25388)、费格森埃希ATCC 35469(E.fergusonii 35469)以及大肠杆菌ATCC25922(E.Coli 25922)。图A为可视化检测结果。图B为RPA产物的凝胶电泳图。NTC表示无模板的对照。
图6为被不同浓度的沙门氏菌污染的鸡蛋样本经DNA提取后,采用RPA扩增,产物利用Cas12a切割单荧光标记的ssDNA,并结合GO进行荧光检测的结果。图中曲线图为实时荧光PCR的结果,嵌入的照片表示可视化检测结果。NTC表示无模板的对照。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
本发明的实施过程具体如下:
1、RPA引物及crRNA设计
针对沙门氏菌的侵袭蛋白A基因(InvA,GenBank编号NC_003197)合成了RPA引物。根据RPA的靶标序列以及PAM序列(TTTN)选定crRNA的识别序列为GTCAATGTAGAACGACCCCA,根据碱基互补配对的原则设计并合成相应的crRNA序列为:
RPA的靶标序列:
RPA引物1:GTCATTCCATTACCTACCTATCTGGTTGATTTCC
RPA引物2:GCATCGGCTTCAATCAAGATAAGACGACTGGT
2、Cas12a的表达与纯化
将Addgene上购买的含有编码LbCas12a蛋白基因和氨苄抗性基因的质粒转化到大肠杆菌rosetta(DE3)感受态细胞中,然后接种到LB固体培养基上,于恒温培养箱中37℃过夜培养;待LB固体培养基上长出菌落之后挑取单菌落转入LB液体培养基中,于摇床上37℃、250rpm培养12-14h的菌液;所述LB液体培养基中预先加入0.1mg/mL的氨苄。
将上述LB液体培养基中培养所得的菌液用重新配置且添加了0.1mg/mL氨苄的LB液体培养基稀释,其稀释比例为重新配置的LB液体培养基∶菌液=100∶1,再将所得稀释后的菌液在摇床中以37℃、250rpm培养直至菌液的吸光值为0.6-0.8,实现大量扩培;然后向扩培后的菌液中添加IPTG诱导剂,所述诱导剂的添加量为每100mL菌液加入24μL0.2g/mLIPTG诱导剂,再将添加了诱导剂的菌液在低温培养箱中以16℃、180rpm培养16h,诱导细菌表达LbCas12a蛋白。
将已表达LbCasl2a蛋白的菌液以8000rpm离心6分钟,弃掉上清液;用Bindingbuffer(50mM Tris-HCl、1.5M NaCl)重悬沉淀;然后用超声波细胞破碎仪破碎30min,使蛋白从细胞中释放到重悬液中,之后在4℃下,以10000rpm离心15分钟,取上清液;
先用Ni柱除去上清液中除目的蛋白外的杂蛋白,然后用Wash buffer(50mM Tris-HCl、1.5M NaCl、30mM咪唑)洗去杂蛋白,再用Elution buffer(50mM Tris-HCl,1.5M NaCl、600mM咪唑)将目的蛋白Cas12a从Ni柱中洗脱下来,再用脱盐柱进行脱盐纯化,将蛋白液先挂在脱盐柱上,然后用脱盐液(20mM Tris-HCl、600mM NaCl、2mM DTT、10%甘油)将目的蛋白Cas12a洗脱下来并用离心管收集,得到纯化后的LbCas12a蛋白。
3、RPA扩增得到RPA产物
RPA的扩增条件如下:RPA总体系为50μL,包括13.2μL模板DNA、0.48μM引物1、0.48μM引物2、29.5μL Rehydration buffer、14mM醋酸镁。
扩增条件为:37℃孵育10-20min。
4、CRISPR/Cas12a切割单荧光标记的ssDNA探针结合GO淬灭荧光的可视化检测
RPA扩增产物的体积为1-10μL、Cas12a的浓度为0.2-0.6μM、crRNA的浓度为0.2-0.6μM、FAM标记的ssDNA探针浓度为1μM、1×NEB buffer 2.1、用DEPC处理水补足至20μL。35-37℃孵育10-60min后,添加0.2mg/mL GO。
单荧光标记的ssDNA序列为:AAAAAAAAAAAA-FAM
5、结果判断
样品中存在沙门氏菌基因时,RPA特异性扩增目标序列,进而激活Cas12a的附属切割活性,切割FAM标记的ssDNA探针,使ssDNA无法被GO吸附,溶液发射荧光;
反之,当样品中不存在沙门氏菌基因时,RPA无法扩增特异性目标序列,Cas12a的附属切割活性无法被激活,无法切割FAM标记的ssDNA探针,使ssDNA被GO吸附,溶液不发射荧光。
实施例1:单荧光基团标记的ssDNA长度对荧光发射的影响
CRISPR反应总体积为20μL,其中包括2μL dsDNA目标物、400nM Cas12a蛋白、450nMcrRNA、750nM FAM标记的不同长度ssDNA探针、1×NEB buffer 2.1。37℃孵育15min,孵育结束后添加0.2mg/mL GO和5μL DEPC处理水。在蓝光切胶仪下观察荧光变化并使用手机拍照成像。
其中,单荧光基团标记的ssDNA探针分别为:
8A-FAM:AAAAAAAA-FAM
10A-FAM:AAAAAAAAAA-FAM
12A-FAM:AAAAAAAAAAAA-FAM
15A-FAM:AAA AAAAAAAAAAAA-FAM
结果如图2所示,12A-FAM表现出最强的信噪比。
实施例2:ssDNA探针的荧光基团修饰位点对荧光发射的影响
CRISPR反应总体积为20μL,其中包括2μL dsDNA目标物、400nM Cas12a蛋白、450nMcrRNA、750nM FAM标记的修饰位点不同的ssDNA探针、1×NEB buffer 2.1。37℃孵育15min,孵育结束后添加0.2mg/mL GO和5μL DEPC处理水。在蓝光切胶仪下观察荧光变化并使用手机拍照成像。
其中,ssDNA探针上荧光基团修饰位点分别为(从5’端开始计):
12号位点修饰:AAAAAAAAAAAA-FAM
11号位点修饰:AAAAAAAAAA/i6FAMdT/A
10号位点修饰:AAAAAAAAA/i6FAMdT/AA
9号位点修饰:AAAAAAAA/i6FAMdT/AAA
6号位点修饰:AAAAA/i6FAMdT/AAAAAA
3号位点修饰:AA/i6FAMdT/AAAAAAAAA
2号位点修饰:A/i6FAMdT/AAAAAAAAAA
1号位点修饰:FAM-AAAAAAAAAAAA
结果如图3所示,ssDNA探针在12号位点修饰荧光基团表现出最强的信噪比。
实施例3:灵敏度测试
利用市售的细菌基因组DNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)提取沙门氏菌CMCC(B)50115的基因组DNA,通过微量紫外分光光度计(Thermo Fisher,美国)测其浓度,算出拷贝数。
将所述提取的沙门氏菌基因组DNA用无菌水进行十倍梯度稀释,使其浓度为104,103,102,101拷贝/μL(copies/μL)。
将所述梯度稀释的沙门氏菌基因组DNA作为模板,利用RPA扩增:50μL体系包括13.2μL模板DNA、0.48μM引物1、0.48μM引物2、29.5μL Rehydration buffer、14mM醋酸镁。37℃孵育10-20min。得到RPA产物。
取出1μL RPA产物加入到20μL含400nM Cas12a蛋白、450nM crRNA、750nM FAM标记的ssDNA探针、1×NEB buffer 2.1的缓冲溶液中。35-37℃孵育10-60min,孵育结束后添加0.2mg/mL GO。
结果如图4所示,当沙门氏菌DNA浓度为5×100拷贝/反应时,样本无荧光。而当沙门氏菌DNA浓度为5×101拷贝/反应或更低时,样本发射明显的荧光,表明可视化检测灵敏度为5×101拷贝/反应。
实施例4:特异性实验
利用市售的细菌基因组DNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)从副溶血弧菌ATCC 17802、鼠伤寒沙门氏菌CMCC(B)50115(Salmonella 50115)、不动杆菌DSM 25388(Acinetobacter 25388)、费格森埃希056(Escherichia ferguson 056)以及大肠杆菌ATCC25922(Escherichia coli 25922)中提取基因组DNA,通过微量紫外分光光度计(ThermoFisher,美国)测其浓度,算出拷贝数。
以上述五种细菌的DNA作为模板,分别以InvA引物进行扩增得到五种扩增产物:50μL体系包括13.2μL模板DNA、0.48μM引物1、0.48μM引物2、29.5μL Rehydration buffer、14mM醋酸镁。37℃孵育10-20min。得到RPA产物。
从五种RPA扩增产物中分别取出1μL加入到20μL含400nM Cas12a蛋白、450nMcrRNA、750nM FAM修饰的ssDNA探针、1×NEB buffer 2.1的缓冲溶液中。35-37℃孵育10-60min,孵育结束后添加0.2mg/mL GO。在蓝光切胶仪下观察荧光变化。
结果如图5所示,当检测的样本为沙门氏菌时,样本不发射荧光。而检测其他细菌样本都发射明显的荧光,表明该方法具有良好的特异性。
实施例5:鸡蛋中沙门氏菌检测
沙门氏菌保藏菌株在平板培养基上划线分离后挑取单一菌落转接至LB肉汤液体培养基,37℃培养6小时,用生理盐水进行10倍梯度稀释,根据平板计数算出稀释液中分别含8×104CFU/mL至6.1×100CFU/mL的沙门氏菌。再分别取1ml稀释液接种到鸡蛋液中加无菌水进行100倍稀释。
以上述沙门氏菌污染的鸡蛋作为样本,利用市售的细菌基因组DNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)从中提取DNA。
将所述从污染的鸡蛋中提取的DNA作为模板,以InvA为靶标进行RPA扩增:50μL体系包括13.2μL模板DNA、0.48μM引物1、0.48μM引物2、29.5μL Rehydration buffer、14mM醋酸镁。37℃孵育10-20min。得到RPA产物。
取出1μL RPA产物加入到20μL含400nM Cas12a蛋白、450nM crRNA、750nM FAM修饰的ssDNA探针、1×NEB buffer 2.1的缓冲溶液中。35-37℃孵育10-60min,孵育结束后添加0.2mg/mL GO。在蓝光切胶仪下观察荧光变化。
结果如图6所示,当用8×101CFU/g或更高浓度的沙门氏菌污染鸡蛋时,样本呈现明显的荧光发射。而污染鸡蛋的沙门氏菌浓度为8×100CFU/g或更低时,样本无明显的绿色荧光。
序列表
<110> 浙江省农业科学院
<120> 一种单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法
<130> 2021.9.28
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtcattccat tacctaccta tctggttgat ttcc 34
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcatcggctt caatcaagat aagacgactg gt 32
<210> 3
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcatcggctt caatcaagat aagacgactg gtactgatcg ataatgccag acgaaagagc 60
gtggtaatta acagtaccgc aggaaacgtt gaaaaactga ggattctgtc aatgtagaac 120
gaccccataa acaccaatat cgccagtacg atattcagtg cgatcaggaa atcaaccaga 180
taggtaggta atggaatgac 200
<210> 4
<211> 41
<212> RNA
<213> crRNA
<400> 4
uaauuucuac uaaguguaga uuggggucgu ucuacauuga c 41
Claims (5)
1.一种非疾病诊断目的的单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)提取待测样品的基因组DNA;
2)表达并纯化Cas12a;
3)设计并合成RPA引物和crRNA;
4)RPA扩增:以步骤1)提取的基因组DNA作为模板,在含有RPA引物的RPA体系中进行扩增,得到RPA产物;
5)荧光可视检测:将步骤4)的RPA产物、步骤2)的Cas12a、步骤3)的crRNA、单荧光基团标记的ssDNA探针和NEBuffer2.1缓冲液混匀后,孵育10~60 min,再添加GO,通过荧光信号判断待测样品中是否含有沙门氏菌基因;
所述的单荧光基团标记的ssDNA探针为:AAAAAAAAAAAA-FAM;
所述步骤5)中:当RPA产物中含有沙门氏菌的特异扩增基因时,Cas12a-crRNA与特征序列结合,进而激活Cas12a的附属切割活性,切割荧光基团标记的ssDNA探针,使其无法被GO吸附,溶液发射荧光;
当RPA产物中不含有沙门氏菌的特异扩增基因时,Cas12a的附属切割活性无法被激活,无法切割荧光基团标记的ssDNA,使其被GO吸附,溶液不发射荧光。
2.根据权利要求1所述的一种非疾病诊断目的的单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法,其特征在于,所述步骤3)中的设计并合成RPA引物具体为:针对沙门氏菌的侵袭蛋白A基因合成RPA引物;
所述RPA引物包括RPA引物1、RPA引物2;RPA引物1序列为:GTCATTCCATTACCTACCTATCTGGTTGATTTCC;RPA引物2序列为:GCATCGGCTTCAATCAAGATAAGACGACTGGT。
3.根据权利要求1所述的一种非疾病诊断目的的单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法,其特征在于,所述步骤3)中设计并合成crRNA具体为:
根据RPA的靶标序列以及PAM序列选定crRNA的识别序列为:GTCAATGTAGAACGACCCCA,根据碱基互补配对的原则设计并合成crRNA的识别序列对应的crRNA序列为:
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUGGGGUCGUUCUACAUUGAC。
4.根据权利要求3所述的一种非疾病诊断目的的单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法,其特征在于,所述RPA的靶标序列为:
gcatcggcttcaatcaagataagacgactggtactgatcgataatgccagacgaaagagcgtggtaattaacagtaccgcaggaaacgttgaaaaactgaggattctgtcaatgtagaacgaccccataaacaccaatatcgccagtacgatattcagtgcgatcaggaaatcaaccagataggtaggtaatggaatgac;
所述PAM序列为:TTTN。
5.根据权利要求1所述的一种非疾病诊断目的的单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法,其特征在于,所述步骤5)具体为:
取体积为1-10 µL的RPA扩增产物、浓度为0.2 - 0.6 μM Cas12a、浓度为0.2 - 0.6 μM的crRNA、浓度为1 μM的单荧光基团标记的ssDNA探针和1 × NEB buffer 2.1,用DEPC处理水补足至20 μL后混匀,35-37℃孵育10-60 min后,添加0.2 mg/mL GO。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111148736.XA CN113817854B (zh) | 2021-09-28 | 2021-09-28 | 一种单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111148736.XA CN113817854B (zh) | 2021-09-28 | 2021-09-28 | 一种单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113817854A CN113817854A (zh) | 2021-12-21 |
CN113817854B true CN113817854B (zh) | 2024-02-20 |
Family
ID=78921717
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202111148736.XA Active CN113817854B (zh) | 2021-09-28 | 2021-09-28 | 一种单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113817854B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117947195A (zh) * | 2024-02-20 | 2024-04-30 | 江苏省家禽科学研究所 | 用于检测沙门氏菌的一步法CRISPR/Cas12b检测试剂盒及方法 |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104698055A (zh) * | 2015-03-08 | 2015-06-10 | 北京工业大学 | Dna与石墨烯有序组装在金电极表面的方法 |
CN105300950A (zh) * | 2015-11-29 | 2016-02-03 | 福建医科大学 | 基于部分还原氧化石墨烯的dna荧光检测方法及其试剂盒 |
CN105861295A (zh) * | 2016-05-24 | 2016-08-17 | 长沙医学院 | 一种检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器及制备、检测方法 |
CN110184329A (zh) * | 2019-05-31 | 2019-08-30 | 华南理工大学 | 一种基于CRISPR/Cas和恒温扩增的一步法核酸检测方法和试剂盒 |
CN111778357A (zh) * | 2020-07-13 | 2020-10-16 | 国家卫生健康委科学技术研究所 | 基于CRISPR/Cas12a的呼吸道合胞病毒核酸快速检测试剂盒及其检测方法 |
KR20210087303A (ko) * | 2020-01-02 | 2021-07-12 | 서강대학교산학협력단 | CRISPR/Cas12a를 이용한 표면증강 라만산란 기반 표적 DNA 검출용 센서 |
CN113186313A (zh) * | 2021-05-06 | 2021-07-30 | 常州市疾病预防控制中心 | 基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测引物组、方法与试剂盒 |
CN113337627A (zh) * | 2021-06-03 | 2021-09-03 | 浙江省农业科学院 | 基于CRISPR/Cas12a的免标记可视化检测副溶血弧菌基因的方法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011188855A (ja) * | 2010-03-11 | 2011-09-29 | Samsung Techwin Co Ltd | 切断可能なキメラプローブを使用したサルモネラのリアルタイム検出方法 |
US20200308577A1 (en) * | 2019-03-25 | 2020-10-01 | Massachusetts Institute Of Technology | Dna-responsive hydrogels, methods of altering a property of a hydrogel, and applications thereof |
-
2021
- 2021-09-28 CN CN202111148736.XA patent/CN113817854B/zh active Active
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104698055A (zh) * | 2015-03-08 | 2015-06-10 | 北京工业大学 | Dna与石墨烯有序组装在金电极表面的方法 |
CN105300950A (zh) * | 2015-11-29 | 2016-02-03 | 福建医科大学 | 基于部分还原氧化石墨烯的dna荧光检测方法及其试剂盒 |
CN105861295A (zh) * | 2016-05-24 | 2016-08-17 | 长沙医学院 | 一种检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器及制备、检测方法 |
CN110184329A (zh) * | 2019-05-31 | 2019-08-30 | 华南理工大学 | 一种基于CRISPR/Cas和恒温扩增的一步法核酸检测方法和试剂盒 |
KR20210087303A (ko) * | 2020-01-02 | 2021-07-12 | 서강대학교산학협력단 | CRISPR/Cas12a를 이용한 표면증강 라만산란 기반 표적 DNA 검출용 센서 |
CN111778357A (zh) * | 2020-07-13 | 2020-10-16 | 国家卫生健康委科学技术研究所 | 基于CRISPR/Cas12a的呼吸道合胞病毒核酸快速检测试剂盒及其检测方法 |
CN113186313A (zh) * | 2021-05-06 | 2021-07-30 | 常州市疾病预防控制中心 | 基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测引物组、方法与试剂盒 |
CN113337627A (zh) * | 2021-06-03 | 2021-09-03 | 浙江省农业科学院 | 基于CRISPR/Cas12a的免标记可视化检测副溶血弧菌基因的方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
CRISPR/Cas12a-Modulated fluorescence resonance energy transfer with nanomaterials for nucleic acid sensing;Xiaoxue Cheng 等;Sensors and Actuators: B. Chemical;20210315;第331卷;129458 * |
Graphene oxide assisting the visual detection of Salmonella by CRISPR/Cas12a;Liu Wang等;Microchemical Journal;20230516;第191卷;108870 * |
基因魔剪CRISPR/Cas:核酸精准检测的新宠和利器;冯春凤;王云霞;蒲晓允;熊瑜;刘飞;张立群;;国际检验医学杂志(第03期);257-261 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113817854A (zh) | 2021-12-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109207567B (zh) | 一种基于适配体和链置换扩增反应对金黄色葡萄球菌的测定方法 | |
CA2596059C (en) | Method of quantitatively analysing microorganism targeting rrna | |
CN109072283B (zh) | 用于检测生殖支原体的组合物和方法 | |
CN111321234A (zh) | 一种基于CRISPR-Cas13a***检测微生物的方法及应用 | |
CN113249499B (zh) | 一种伤寒沙门氏菌的检测试剂盒、其制备方法及其应用 | |
US20090226895A1 (en) | Method of detecting vibrio parahaemolyticus via real-time PCR-hybridization | |
CN109913565B (zh) | 一种用于检测副溶血弧菌的试剂盒、引物对、探针及方法 | |
CN113913552B (zh) | 小鼠肝炎病毒实时荧光rt-rpa检测的引物和探针、试剂盒及检测方法 | |
US20220098645A1 (en) | Fast and portable microfluidic detection system as an alternative to salmonella's classical culture method | |
CN113718045A (zh) | 用于检测4种鲍特菌和特异性检测百日咳鲍特菌的dna片段、引物、探针和试剂盒及应用 | |
CN111676304A (zh) | 一种用于阪崎肠杆菌o抗原实时荧光pcr检测的方法及应用 | |
CN115747353A (zh) | 一种用于单核细胞增生李斯特菌检测的引物组、试剂、试剂盒及检测方法 | |
CN113817854B (zh) | 一种单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法 | |
KR101990163B1 (ko) | 독소 산생성 클로스트리듐·디피실의 검출 방법 | |
CN113337627B (zh) | 基于CRISPR/Cas12a的免标记可视化检测副溶血弧菌基因的方法 | |
CN115747351A (zh) | 基于CRISPR/Cas12a方法检测志贺氏菌的试剂盒及其使用方法 | |
CN113502341A (zh) | ***16s RNA的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针 | |
US20130210016A1 (en) | Nucleic acid detection and related compositions methods and systems | |
JP4766878B2 (ja) | ハイブリダイゼーションアッセイを使用する真正細菌群の検出、同定および識別 | |
CN112111584A (zh) | 快速检测水中大肠埃希氏菌的方法 | |
CN113897417B (zh) | 一组检测牛结核杆菌的探针、检测试剂盒和检测方法 | |
CN118222571A (zh) | 用于检测嗜酸耐热菌的引导rna、引物及试剂盒和方法 | |
CN112899377A (zh) | 一种具有沙眼衣原体感染诊断和/或预后评估的试剂盒 | |
Hou et al. | Establishment and application of a rapid visualization method for detecting Vibrio parahaemolyticus nucleic acid | |
CN118207211A (zh) | 一种基于LAMP-CRISPR/Cas12b检测肺炎支原体的方法及试剂盒 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |