CN112176108A - 基于raa技术检测鸭腺病毒3型的引物探针组合、试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于RAA技术检测鸭腺病毒3型的引物探针组合、试剂盒及检测方法，引物探针组合依据鸭腺病毒3型病毒特异性Hexon基因进行设计，该试剂盒及检测方法利用上述引物探针组合对待测样品进行RAA反应，根据扩增反应结果判断待测样品中是否含有鸭腺病毒3型病毒。该试剂盒及检测方法应用于对鸭腺病毒3型病毒的快速检测，实现了对鸭腺病毒3型病毒进行准确、快速、灵敏、方便的检测。
Description
技术领域
本发明涉及鸭腺病毒检测方法技术领域，特别是涉及一种基于RAA技术检测鸭腺病毒3型的引物探针组合、试剂盒及检测方法。
背景技术
禽腺病毒是全球家禽和野禽常见的传染病病原体。多数禽腺病毒可在健康禽体内复制，症状非常轻微或不表现感染症状，在混合感染时，禽腺病毒可成为条件性病原。近年有研究者从广东某番鸭场发病的番鸭中分离出1株新病毒，感染鸭临床剖检病变为肝脏黄化、质地变脆、肿大、出血及坏死，通过高通量测序获得该病毒的全基因序列(GenBankNo.KR135164.1,CH-GD-12-2014株)，通过基因序列及遗传进化分析将该病原初步命名为鸭腺病毒3型(DAdV-3)。目前关于该病毒的研究主要围绕形态学、致病性、基因序列分析等，还没有一种准确、快速的检测方法。
针对上述问题，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于RAA技术检测鸭腺病毒3型的引物探针组合、试剂盒及检测方法，该试剂盒及检测方法应用于对鸭腺病毒3型病毒的快速检测，实现了对鸭腺病毒3型病毒进行准确、快速、灵敏、方便的检测。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种检测鸭腺病毒3型的引物探针组合，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
一种检测鸭腺病毒3型的试剂盒，包括上述的引物探针组合。
优选的，上游引物、下游引物和探针的浓度均为10pmol/μL。
优选的，还包括RAA反应的试剂。
一种基于RAA技术检测鸭腺病毒3型病毒的检测方法，包括如下步骤：
(1)配置阴性对照、阳性对照以及待检测样品的RAA反应体系，其中，RAA反应体系中所使用的引物探针组合为上述的引物探针组合；
(2)RAA反应体系扩增；
(3)根据RAA反应体系的扩增曲线判定待测样品中是否含有鸭腺病毒3型病毒。
优选的，步骤(1)中的RAA反应体系为：
RT荧光基础反应单元；
待检测的样品DNA模板或鸭腺病毒3型病毒DNA模板或去除RNA酶的水 2μL；
总体积 50μL；
其中，所述RT荧光基础反应单元为冻干粉。
优选的，步骤(2)中RAA反应体系扩增的条件为39℃下恒温扩增20min。
优选的，步骤(3)中待测样品中是否含有鸭腺病毒3型病毒的判定方式为：
在阴性对照RAA反应体系经扩增反应后无扩增曲线，且阳性对照RAA反应体系经扩增反应后出现扩增曲线的前提下，待检测样品的RAA反应体系扩增反应后具有扩增曲线，则样品为阳性，待检测样品的RAA反应体系扩增反应后无扩增曲线，则样品为阴性。
上述基于RAA技术检测鸭腺病毒3型病毒的检测方法在检测鸭腺病毒3型病毒中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明提供了一种基于RAA技术检测鸭腺病毒3型的引物探针组合、试剂盒及检测方法，引物探针组合依据鸭腺病毒3型病毒特异性Hexon基因进行设计，该试剂盒及检测方法利用上述引物探针组合对待测样品进行RAA反应，根据扩增反应结果判断待测样品中是否含有鸭腺病毒3型病毒，该试剂盒及检测方法应用于对鸭腺病毒3型病毒的快速检测，实现了对鸭腺病毒3型病毒进行准确、快速、灵敏、方便、高通量的快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足，并且此方法非常适用于现场快速检测，与PCR法相比，RAA法是在恒温下反应，操作简单，摆脱了复杂仪器的束缚，不需变温，大大缩短了反应时间。
附图说明
图1为用于鸭腺病毒3型病毒检测的引物探针组合的优化结果图。
图2为引物探针组合的灵敏度检测结果图。
图3为引物探针组合的特异性检测结果图。
具体实施方式
为了使本领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合本发明的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其它类同实施例，都应当属于本申请保护的范围。
重组酶介导扩增(Recombinase-aid Amplification，RAA)技术也是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。与重组酶聚合酶扩增(Recombinase PolymeraseAmplification，RPA)不同的是，RAA扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在恒温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-strandedDNA binding，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指数级增长，通常在1小时内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。在RAA反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个RAA扩增过程，20分钟内，可实现对起始模板的定量及定性分析。整个反应简单快速，因为不需要高温循环，所以特别适大量样本的快速检测。
实施例1
本发明还提供了一种检测鸭腺病毒3型的引物探针组合，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，探针的核苷酸序列如SEQID NO:5所示。
本具体实施例提供了一种基于RAA技术检测鸭腺病毒3型病毒的检测方法，该检测方法中所使用的引物探针组合为上述的引物探针组合。该检测方法具体包括如下步骤：
(1)配置阴性对照、阳性对照以及待检测样品的RAA反应体系，RAA反应体系为：
RT荧光基础反应单元；
待检测的样品DNA模板或鸭腺病毒3型病毒DNA模板或去除RNA酶的水 2μL；
总体积 50μL；
其中，所述RT荧光基础反应单元为包含重组酶、逆转录酶和聚合酶等的冻干粉，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
(2)RAA反应体系扩增，RAA反应体系扩增的条件为39℃下恒温扩增20min。
(3)根据RAA反应体系的扩增曲线判定待测样品中是否含有鸭腺病毒3型病毒，待测样品中是否含有鸭腺病毒3型病毒的判定方式为：
在阴性对照RAA反应体系经扩增反应后无扩增曲线，且阳性对照RAA反应体系经扩增反应后出现扩增曲线的前提下，待检测样品的RAA反应体系扩增反应后具有扩增曲线，则样品为阳性，待检测样品的RAA反应体系扩增反应后无扩增曲线，则样品为阴性。
上述基于RAA技术检测鸭腺病毒3型病毒的检测方法应用于检测鸭腺病毒3型病毒中，能够对鸭腺病毒3型病毒进行快速检测，实现了对鸭腺病毒3型病毒进行准确、快速、灵敏、方便、高通量的快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足，并且此方法非常适用于现场快速检测，与PCR法相比，RAA法是在恒温下反应，操作简单，摆脱了复杂仪器的束缚，不需变温，大大缩短了反应时间。
实施例2鸭腺病毒3型病毒检测引物及探针的设计与筛选
根据鸭腺病毒3型病毒特异性Hexon基因(Hexon基因序列如SEQ ID NO:6所示)作为目的基因进行引物探针设计，根据NCBI数据库中DAdV-3代表株(CH-GD-12-2014株，参考序列GenBank登录号：KR135164)的Hexon基因序列特征，设计Hexon基因特异性引物和探针。
设计2条上游引物和2条下游引物分别组合筛选最佳引物和探针，上游引物所在区域对应的参考序列第1230位碱基，在2636条Hexon基因序列中对应该位置的碱基有C和T两种，因此引物序列中设计成简并碱基Y，第1248位碱基，在2636条Hexon基因序列中对应该位置的碱基有C和T两种，因此引物序列中设计成简并碱基Y；下游引物所在区域对应的参考序列第1392位碱基，在2636条Hexon基因序列中对应该位置的碱基有T和C两种，下游引物取参考序列的反向互补序列，对应A和G，因此引物序列中设计成简并碱基R。
两条上游引物分别为DAdV-3-HF1和DAdV-3-HF2，其对应的核苷酸序列分别如SEQID NO:1和SEQ ID NO:3所示，两条下游引物分别为DAdV-3-HR1和DAdV-3-HR2，其对应的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示。
设计1条探针与引物进行组合筛选。探针的5′端第30位T碱基标记羧基荧光素(carboxyfluorescein，FAM)，第30位碱基后连接脱碱基位点四氢呋喃(Tetrahydrofuran，THF)，第31位碱基标记BHQ1淬灭基团，3′端进行C3-spacer阻断修饰；修饰后探针为DAdV-3-P，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
2对引物和1条探针两两配对形成4个组合进行最佳引物和探针组合筛选。
组合1：DAdV-3-HF1、DAdV-3-HR1和DAdV-3-P
组合2：DAdV-3-HF1、DAdV-3-HR2和DAdV-3-P
组合3：DAdV-3-HF2、DAdV-3-HR1和DAdV-3-P
组合4：DAdV-3-HF2、DAdV-3-HR2和DAdV-3-P
引物对和探针的筛选方法为实施例1提供的检测方法，具体包括如下步骤：
1)配制RAA反应体系，本具体实施例采用杭州众测生物科技有限公司的分子检测试剂(RAA-荧光型)进行RAA反应，RAA反应体系具体为：
RT荧光基础反应单元；
待检测的样品DNA模板或鸭腺病毒3型病毒DNA模板或去除RNA酶的水 2μL；
总体积 50μL；
其中，所述RT荧光基础反应单元为包含重组酶、逆转录酶和聚合酶等的冻干粉，上游引物、下游引物和探针的浓度均为10pmol/μL。
2)RAA反应体系扩增：扩增的条件为39℃下恒温扩增20min。
试验结果如图1所示，图中1、2、3、4分别对应组合1、组合2、组合3、组合4，实验结果表明，相同反应条件，组合3的扩增效率优于其他3个组合，因此将组合3的引物对和探针作为最终确定的引物和探针的序列信息。
实施例3引物探针的检测灵敏度
参照DNA提取试剂盒说明书提取鸭腺病毒3型病毒DNA，测定所提取的DNA模板原始浓度，按照比例稀释至107拷贝/μL，再以10倍梯度稀释成106拷贝/μL、105拷贝/μL、104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL、10拷贝/μL，分别取2μL作为反应模板，按照实施例1的检测方法检测组合3的引物、探针的灵敏度。
结果如图2所示，图中1-6分别对应10拷贝/μL、102拷贝/μL、103拷贝/μL、104拷贝/μL、105拷贝/μL、106拷贝/μL，本发明设计的组合3的引物和探针组合在鸭腺病毒3型病毒DNA模板浓度为106拷贝/μL、105拷贝/μL、104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL时出现扩增曲线，检测灵敏度为DNA终浓度为102拷贝/μL时能够保证检测时的灵敏性。
实施例4引物探针的检测特异性
选取鸭腺病毒3型病毒以及其他鸭群常见病原(核酸类型均为DNA)的DNA作为组合3的引物探针的检测特异性的模板，其他鸭群常见病原为富AT腺病毒属的鸭源腺病毒A型(Duck atadenovirus A,DAdV-A)、番鸭细小病毒(MDPV)、鸭瘟病毒(DPV)、鹅细小病毒(GPV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭肝炎病毒I型(DHAV-1)、鸭肝炎病毒3型(DHAV-3)，分别提取鸭腺病毒3型病毒以及其他鸭群常见病原的DNA作为引物探针的检测特异性的模板，按照实施例1的检测方法检测组合3中的引物探针的特异性。
结果如图3显示，图中1-3分别对应鸭腺病毒3型病毒、鸭坦布苏病毒和鸭瘟病毒，其他鸭群常见病原和阴性对照曲线重合于水平线位置，结果表明，鸭腺病毒3型病毒DNA模板对应的试验组出现了正常荧光检测曲线，其他病毒的试验组及阴性对照组均未出现扩增曲线。结果表明，此方法可以实现对鸭腺病毒3型病毒的特异性检测，不与其他鸭群常见病原发生交叉反应。
本具体实施例与实施例3的结合表明，实施例2中最终确定的组合3的引物和探针具有较好的灵敏性和特异性。
将实施例1中基于RAA技术检测鸭腺病毒3型病毒的检测方法应用于检测鸭腺病毒3型病毒中，能够实现对鸭腺病毒3型病毒进行准确、快速、灵敏、方便、高通量的快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足，并且此方法非常适用于现场快速检测，与PCR法相比，RAA法是在恒温下反应，操作简单，摆脱了复杂仪器的束缚，不需变温，大大缩短了反应时间。
实施例5临床样品的检测应用
1.样品采集：
采集鸭场病鸭肝脏样品共30份。采用PBS液(pH5.0～7.4，0.01mol/L)作为保存液(含青霉素2000IU/mL、链霉素2000IU/mL、制霉菌素1000IU/mL，BSA 5 mg/mL)。样品采集后置于加冰的保温箱中密封，24小时内送至实验室进行处理或置于-70℃保存。
2.样品制备
按1∶5(w/v)比例加无菌PBS匀浆，反复冻融3次后6000r/min离心10分钟，取上清液经0.22μm滤器过滤除菌后进行核酸提取。
3.核酸提取
参照DNA提取试剂盒说明书提取待检的30份临床样品、阳性对照和阴性对照DNA。若长时间保存，须置于-70℃条件下。
4.鉴定
4.1对比方法：参考地方标准《DB35/T 1872-2019鸭3型腺病毒病诊断技术》中的PCR诊断方法，作为对比方法。
4.2样品检测
采用地方标准方法和实施例1中提供的检测方法方法同时检测此临床样品，其中实施例1的检测方法中所使用的引物探针组合为实施例2最终确定的最优的引物探针组合。
4.3检测结果
结果如表1所示，结果显示，采用地方方法鉴定结果为有25份临床样品有荧光信号，形成扩增曲线，判定为鸭腺病毒3型阳性，其余样品均没有荧光信号；采用本发明中的方法鉴定结果为有25份临床样品有荧光信号，形成扩增曲线，判定为鸭腺病毒3型阳性，其余样品均没有荧光信号，采用本发明中的方法鉴定为阳性的样品与采用地方方法鉴定为阳性的样品一一对应，即采用地方方法鉴定为阳性的样品，采用本发明中的方法鉴定也为阳性；阴性对照组两种方法均没有荧光信号，且阳性对照组两种方法均出现荧光信号，结果准确可信。
综上所述，采用本发明所提供的方法对30份临床样品进行检测的结果与地方标准提供的方法对30份临床样品进行检测的结果一致，结果均有25份样品判定为鸭腺病毒3型阳性，其余样品均为阴性，所以说本发明所提供的基于RAA技术检测鸭腺病毒3型病毒的检测方法是准确可行的，其可以应用于对鸭腺病毒3型病毒的检测中。本发明提供的检测方法可以快速、准确的鉴定鸭腺病毒3型病毒，满足了当前对于鸭腺病毒3型病毒检测的需求；且该检测方法是一种恒温检测方法，操作简单、用时短，非常适用于野外现场检测，为鸭腺病毒3型的疫病防控提供助力。
表1两种检测的方法检测临床样品的结果表
注：表中“+”表示检测结果为阳性，“-”表示检测结果为阴性。
实施例6
本具体实施例提供了一种检测鸭腺病毒3型的试剂盒，该试剂盒包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的上游引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的下游引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的探针以及RAA反应的试剂，其中，上游引物、下游引物和探针的浓度均为10pmol/μL。
上述检测鸭腺病毒3型的试剂盒应用于检测鸭腺病毒3型病毒中，该试剂盒为鸭腺病毒3型病毒的检测提供了便利。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
序列表
<120> 基于RAA技术检测鸭腺病毒3型的引物探针组合、试剂盒及检测方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtctggcgg ygaggtggcc aacacat 27
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcgtatgagt tctrgtccac accgt 25
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tggccaacac atyaagtgca tttgga 26
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acaatgttgg taagaggtac acgcttgtt 29
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttacctgcca gacaaataca aggtcagcat agactcaaca gac 43
Claims (9)
1.一种检测鸭腺病毒3型的引物探针组合，其特征在于，上游引物的核苷酸序列如SEQID NO:2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，探针的核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示。
2.一种检测鸭腺病毒3型的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物探针组合。
3.根据权利要求2所述的检测鸭腺病毒3型的试剂盒，其特征在于，上游引物、下游引物和探针的浓度均为10pmol/μL。
4.根据权利要求2所述的检测鸭腺病毒3型的试剂盒，其特征在于，还包括RAA反应的试剂。
5.一种基于RAA技术检测鸭腺病毒3型病毒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配置阴性对照、阳性对照以及待检测样品的RAA反应体系，其中，RAA反应体系中所使用的引物探针组合为权利要求1所述的引物探针组合；
(2)RAA反应体系扩增；
(3)根据RAA反应体系的扩增曲线判定待测样品中是否含有鸭腺病毒3型病毒。
6.根据权利要求5所述的基于RAA技术检测鸭腺病毒3型病毒的检测方法，其特征在于，步骤(1)中的RAA反应体系为：
RT荧光基础反应单元；
待检测的样品DNA模板或鸭腺病毒3型病毒DNA模板或去除RNA酶的水 2μL；
总体积 50μL；
其中，所述RT荧光基础反应单元为冻干粉。
7.根据权利要求5所述的基于RAA技术检测鸭腺病毒3型病毒的检测方法，其特征在于，步骤(2)中RAA反应体系扩增的条件为39℃下恒温扩增20min。
8.根据权利要求5所述的基于RAA技术检测鸭腺病毒3型病毒的检测方法，其特征在于，步骤(3)中待测样品中是否含有鸭腺病毒3型病毒的判定方式为：
在阴性对照RAA反应体系经扩增反应后无扩增曲线，且阳性对照RAA反应体系经扩增反应后出现扩增曲线的前提下，待检测样品的RAA反应体系扩增反应后具有扩增曲线，则样品为阳性，待检测样品的RAA反应体系扩增反应后无扩增曲线，则样品为阴性。
9.权利要求5-8任意一项所述的基于RAA技术检测鸭腺病毒3型病毒的检测方法在检测鸭腺病毒3型病毒中的应用。
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