CN114075607B - 一种基于sherlock检测单增李斯特菌的现场可视化试剂盒及应用 - Google Patents

一种基于sherlock检测单增李斯特菌的现场可视化试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于SHERLOCK检测单增李斯特菌的现场可视化试剂盒及应用，所述试剂盒包含用于扩增单增李斯特菌侵袭性相关分泌型内肽酶(invasion associated secreted endopeptidase，iap)基因片段的T7‑RPA引物对，所述的引物对由上游引物和下游引物组成，其中，上游引物、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；Cas13a蛋白和crRNA或二者形成的复合体；以及RNA荧光报告分子。此外，本发明还公开了一种使用所述的现场可视化试剂盒检测单增李斯特菌的方法。利用本发明的试剂盒及检测方法进行单增李斯特菌的检测，可以实现37～42℃条件下恒温检测，结果实现可视化。本发明的方法具有操作简单、检测快速、结果可视化等优点。从而为提高食品行业检测单增李斯特菌水平，降低消费者感染风险提供技术手段。

Description

一种基于SHERLOCK检测单增李斯特菌的现场可视化试剂盒及 应用
技术领域
本发明涉及一种用于快速检测单增李斯特菌的SHERLOCK现场可视化试剂盒及应用，属于分子生物学诊断技术领域。
背景技术
单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogene,简称单增李斯特菌)是革兰氏阳性无芽孢杆菌，广泛存在于自然界中。可在许多物体表面形成生物膜，不易清除，在4℃环境中也能生长，是冷藏食品的主要污染菌。单增李斯特菌病在全世界呈散发性，疫情爆发时死亡率可达到20％～40％。
目前我国对单增李斯特菌的检测包括细菌学、免疫学和分子生物学。细菌学是金标准但费时费力、免疫学检测对非富集食品病原菌检测灵敏度不高。而单增李斯特菌在食品中的浓度极低，对于检测技术的灵敏度有较高要求。随着分子生物学技术的发展，包括PCR、RPA、LAMP在内的核酸扩增方法逐步用于单增李斯特菌的鉴定。但现有分子生物学技术对仪器要求高，或者在操作中易污染、样品处理复杂等问题，而且扩增产物需要通过琼脂糖凝胶电泳或荧光定量检测等设备才能得到检测结果，无法达到现场可视化。
近年来，基于CRISPR***的基因编辑技术炙手可热。CRISPR本是细菌体内的自适应性免疫***，当再次受到外来微生物入侵时，CRISPR可对其进行识别，并通过crRNA激活相应Cas蛋白分解入侵者的DNA或RNA。而CRISPR/Cas13a的非特异性RNA靶向切割活性为核酸检测带来新的灵感。结合RPA和荧光报告分子建立的核酸检测平台SHERLOCK(SpecificHigh Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)效果突出，可以使单增李斯特菌检测技术的灵敏度提高100倍，且无需任何仪器。检测结果能够达到单碱基的痕量检测水平，且高效、低廉、操作简单、省时省力。上述优势使得SHERLOCK方法可以用于基层普通实验室或野外进行单增李斯特菌的快速检测和诊断。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种基于SHERLOCK技术检测单增李斯特菌的现场可视化试剂盒及其应用。
本发明的目的之二在于提供一种使用上述试剂盒检测单增李斯特菌的方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明的一种基于SHERLOCK检测单增李斯特菌的现场可视化试剂盒，其中包含以下组分：
1)用于扩增单增李斯特菌侵袭性相关分泌型内肽酶(invasion associatedsecreted endopeptidase，iap)基因片段的T7-RPA引物对，所述的引物对由上游引物和下游引物组成，其中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
2)Cas13a蛋白和crRNA，或二者形成的复合体，所述的crRNA用于结合经所述T7-RPA引物扩增并转录后得到的目的ssRNA，同时结合并引导Cas13a蛋白，所述的crRNA包括用于与Cas13a结合的重复序列和靶向单增李斯特菌iap基因保守区的向导序列；以及
3)RNA荧光报告分子。
其中，优选的，所述的crDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
其中，优选的，所述的Cas13a蛋白为LwCas13a蛋白。
其中，优选的，所述的单增李斯特菌侵袭性相关分泌型内肽酶(invasionassociated secreted endopeptidase，iap)基因片段位于GenBank ID：985140的单增李斯特菌iap基因的第545-678位。
其中，优选的，所述的试剂盒中还包含RPA basic冻干粉、MgOAc、T7转录酶、10×RPA反应缓冲液以及NTP Mix；其中，所述RPA basic冻干粉包含重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换聚合酶。
其中，优选的，所述试剂盒还包含阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为单增李斯特菌的基因组DNA；所述阴性对照品为DEPC水。
进一步的，本发明还提出了所述的现场可视化试剂盒在检测样品中单增李斯特菌中的应用，其中，优选的，所述的样品包括奶制品和肉制品(生/熟肉(如牛肉、猪肉等)组织样本)。
更进一步的，本发明还提出了一种使用所述的现场可视化试剂盒检测单增李斯特菌的方法，包括以下步骤：
步骤(1)提取待检样品中的基因组DNA；
步骤(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，进行SHERLOCK反应；
其中，优选的，进行SHERLOCK反应所采用的反应体系以50μL计，包括：4mg RPABasic冻干粉、10μM上下游引物各2.4μL、100nM Cas13a蛋白、10×RPA反应缓冲液10μL、100nM crRNA、NTP Mix 6μL、T7转录酶2μL、5μM RNA荧光报告分子、100ng模板、280mM MgOAc水溶液2.5μL和DEPC水补足至50μL；
步骤(3)在步骤(2)所述的SHERLOCK反应结束后，根据荧光强度分析检测结果。
其中，优选的，步骤(2)中还包括分别以单增李斯特菌的基因组DNA和DEPC水为模板进行SHERLOCK反应；所述以单增李斯特菌的基因组DNA为模板的SHERLOCK反应结果作为阳性对照，以DEPC水为模板的SHERLOCK反应结果作为阴性对照。
其中，优选的，步骤(2)中所述SHERLOCK反应的反应条件为：反应温度为37～42℃、反应时间为5～40min，优选的，反应温度为40℃，反应时间为40min，所述分析检测结果的操作过程可为本领域的常规方法，具体可为室温蓝光透射仪检测、荧光定量PCR仪检测、酶标仪检测结果的分析。优选的，在470～520nm波长的蓝光透射仪下观察反应体系产生的荧光情况，若反应体系扩增产物呈现荧光，则样品中含有单增李斯特菌，若反应体系扩增产物不呈现荧光，则样品中不含单增李斯特菌。
其中，优选的，所述RNA荧光报告分子可为任一合适的商品化产品，本发明具体实施中，所述的RNA荧光报告分子(RNase Alert)为博莱斯公司产品，货号M20801-P001(A)。
其中，优选的，检测试剂盒用于检测的单增李斯特菌ssRNA的浓度不小于10fM。
进一步地，所述试剂盒还可包括样本核酸提取试剂；可采用目前商品试剂盒提取，本发明具体的实验中商品试剂盒提取法和煮沸-裂解法提取样本核酸，进一步地，所述核酸提取试剂包括溶菌酶、缓冲液、裂解液、洗脱缓冲液、收集管等。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种基于SHERLOCK检测单增李斯特菌的现场可视化试剂盒；也提供了一种使用所述的现场可视化试剂盒检测单增李斯特菌的方法，通过使用本发明的方法，成功地检测了食物中的污染样品，缩短了操作时间，检测时间在40min以内，同时对于任何革兰氏阳性菌株或食物背景天然菌群没有观察到交叉反应，具有很高的特异性和敏感性。结合RNA荧光报告分子可对单增李斯特菌进行现场可视化检测，只使用470～520nm波长的蓝光透射仪进行照射，观察反应体系扩增产物是否呈现荧光，就可以判定检测结果。或者使用酶标仪、荧光定量PCR对荧光强度进行定量。它不需要昂贵的设备，并且减少了诊断的成本和时间进行现场检测。本发明的引物组具有特异性强、敏感性好，所发明的试剂盒操作简单、检测快速、结果可视化等优点，使得本发明建立的SHERLOCK方法可以用于单增李斯特菌的现场可视化检测，从而为提高食品行业检测单增李斯特菌水平，降低消费者感染风险提供技术手段。
附图说明
图1为针对单增李斯特菌iap基因的T7-RPA引物的筛选结果；
图2为单增李斯特菌T7-RPA和SHERLOCK三次扩增鉴定结果；
其中：泳道1-3均为阳性样本的核酸电泳鉴定；
图3为设计的单增李斯特菌T7-RPA引物特异性扩增结果；
其中：泳道1为单增李斯特菌阳性样本的核酸电泳鉴定，泳道2-7为沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、小肠结肠炎耶氏菌(Yersinia enterocolitica)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)基因组样本，泳道8为阴性对照。
图4为LwCas13a蛋白的序列图谱(2751…6209＝3459bp)；
图5为LwCas13a蛋白诱导表达、纯化及浓缩的考马斯亮蓝染色鉴定；
其中：左：不同咪唑浓度的洗脱液洗脱蛋白；1.用含220mM咪唑的缓冲液洗脱；2.用含150mM咪唑的缓冲液洗脱3.用含有80mM咪唑的缓冲液洗脱；M.Marker；右：LwCas13a蛋白的纯化和浓缩；1.经80mM咪唑洗脱的蛋白；2.透析酶切后的蛋白；3.浓缩后的蛋白；M.Marker；
图6为候选3种基因引物-crRNA复合体的SHERLOCK检测单增李斯特菌的时间-荧光曲线；
图7为选用最优iap基因引物-crRNA复合体的SHERLOCK检测单增李斯特菌荧光柱状图；
图8为不同菌种的SHERLOCK反应特异性荧光直观图和柱状图；
其中：柱1为单增李斯特菌阳性标准品；柱2至柱8分别为沙门氏菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌、小肠结肠耶尔森氏菌、福氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和阴性对照；
图9为SHERLOCK检测单增李斯特菌不同浓度模板灵敏度的荧光直观图和柱状图；
其中：柱1至柱8的模板浓度分别为150ng,15ng,1.5ng,150pg,15pg,1.5fg,150ag，阴性对照。
图10为人工加标牛奶样品灵敏度检测结果；
其中：1～7:单增李斯特菌菌体浓度分别为5.34×106CFU/mL、5.34×105CFU/mL、5.34×104CFU/mL、5.34×103CFU/mL、5.34×102CFU/mL、5.34×101CFU/mL、5.34×100CFU/mL；
图11为人工加标牛肉样品灵敏度检测结果；
其中：1～7:单增李斯特菌菌体浓度分别为5.34×106CFU/g、5.34×105CFU/g、5.34×104CFU/g、5.34×103CFU/g、5.34×102CFU/g、5.34×101CFU/g、5.34×100CFU/g。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照本领域常规方法和条件，或按照商品说明书选择。下述实施例中未注明具体成分的试剂和原料均市售可得。下列实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
本发明所提供的基于SHERLOCK检测单增李斯特菌DNA的方法的基本原理是：单增李斯特菌靶序列首先通过T7-RPA扩增技术扩增特异性DNA片段，随后进行转录变成ssRNA，再通过crRNA特异性结合目的片段，最后利用Cas13a的RNA非特异酶切活性切割RNA荧光报告分子，通过荧光信号来检测单增李斯特菌。
实施例1引物的筛选以及T7-RPA扩增检测
本发明中所使用的细菌基因组提取试剂盒和DNA纯化回收试剂盒为天根公司产品。
本发明针对单增李斯特菌侵袭相关的分泌性内肽酶(invasion associatedsecreted endopeptidase，iap)基因共设计得到了三对引物，该基因高度保守一致，存在于单增李斯特菌所有致病性血清型的基因组中；所述iap序列参考GenBank登录号:985140。所述引物的核苷酸序列如表1所示：
表1所用T7-RPA引物
小写碱基为T7启动子。所述引物由长春库美生物科技有限公司合成。通过T7-RPA反应筛选出最适引物对。
本发明中，所述扩增iap基因保守区的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：
5’-GCCTAAAGTAGCAGAAACGAAAGAAACTCCAGTAGTAGATCAAAATGCTACTACACACGCTGTTAAAAGCGGTGACACTATTTGGGCTTTATCCGTAAAATACGGTGTTTCTGTTCAAGACATTATGTCATGG-3’
使用细菌基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，并参照试剂盒说明书，提取单增李斯特菌(Listeria monotygenes)1/2C、沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、小肠结肠炎耶氏菌(Yersinia enterocolitica)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)基因组，最后将DNA用50μL水溶解，即得扩增模板。所有菌株均为吉林大学***共患病研究所保存。分别以不同细菌基因组为模板，利用单增李斯特菌引物iap-1F和iap-1R，进行T7-RPA反应。反应程序为：40℃、20min。图1显示为三对引物中iap-1F/R扩增效果最优；图2显示为iap-1F/R扩增单增李斯特菌基因组模板重复性良好，图3显示为iap-1F/R扩增上述各细菌基因组T7-RPA反应的特异性良好。T7-RPA反应体系参见表2。
表2实施例1的T7-RPA反应体系
反应成分 用量(μL)
上游引物(10μM) 2.4μL
下游引物(10μM) 2.4μL
RPA Basic冻干粉 4mg
10×RPA反应缓冲液 29.5μL
DNA模板 1.5μL
无菌水 11.7μL
280mM MgOAc 2.5μL
总计 50μL
实施例2crRNA的制备
本发明中，crRNA的制备与纯化方法如下：
pre-crRNA包含5’端的37nt的重复区域(repeat region)，靶点序列以及3’端的一个PFS(该段序列可与LwCas13a蛋白结合，序列为：5’-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAAC-3’)，以pre-crRNA的单链的DNA序列作为扩增模板设计退火引物，设计上游引物iap-crRNA-F包含T7序列(5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’)和20nt的重复序列(5’-GATTTAGACTACCCCAAAAA-3’)；设计下游引物iap-crRNA-R包含靶序列20nt左右的反向互补序列和上游crRNA重复序列的反向互补序列，引物序列如表3所示。随后回收PCR退火后的双链DNA，使用Nanodrop分光光度计检测浓度后取1μg作为转录模板，转录体系如表4所示。使用T7转录酶转录为crRNA，37℃转录过夜后用无RNase的DNase I降解其中的模板DNA。得到的crRNA利用柱式RNA快速纯化试剂盒(生工)进行纯化。并用分光光度计测量浓度，分装保存于-80℃冰箱备用。所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：
gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacacggauaaagcccaaauaguguc。
表3 crRNA序列的引物
名称 序列5’-3’
iap-crRNA-F TAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAAAAA
iap-crRNA-R GGATAAAGCCCAAATAGTGTTTTTTGGGGTAGTCTAAATC
表4 crRNA转录体系
反应成分 用量(μL)
T7转录酶 2μL
T7反应缓冲液 3μL
NTP Mix 7μL
pre-crRNA双链DNA模板 1μg
无RNase水 补至20μL
实施例3 LwCas13a蛋白的表达纯化
一、LwCas13a蛋白的诱导表达
1.转化
将LwCas13a蛋白表达质粒按照参考说明书转化Rosetta感受态细胞中，转化后的菌液加至对应抗性的LB平板上，涂布棒涂匀液体。挑取单菌落至对应抗性的LB液体培养基中，于37℃恒温摇床培养过夜。提取质粒并进行测序鉴定，将测序正确的单克隆保存甘油菌。
2.诱导
取过夜培养的10mL菌液接入1L对应抗性LB液体培养基，37℃培养1.5～2h，加入终浓度为500μM的IPTG，16℃培养24h诱导蛋白表达。预冷4℃离心机，8000g离心10min收集菌体，进行后续纯化过程。
二、LwCas13a蛋白的纯化
LwCas13a蛋白含有1,152个氨基酸，大小约150kD左右，由表达该蛋白质粒图谱可知(图4)，重组的LwCas13a蛋白后带有2个标签(His-tag和Strep-tag)可用于蛋白的初步纯化，并且在标签与蛋白之间，设置了SUMO酶切位点，可用于纯化时蛋白与固相介质的分离，也可防止标签对蛋白活性的影响。
1.亲和层析法进行LwCas13a蛋白的纯化
菌体称重，取3g菌体加入30mL PBS清洗两次，使用Binding Buffer重悬菌体，并按照1:100比例加入溶菌酶和蛋白酶抑制剂。超声破碎，30％功率，超声2s，间隔4s，超声时间20min，超声破碎后可发现菌液澄清。若超声后菌液仍浑浊或无明显变化，可适当增加缓冲液用量，稀释菌体继续超声。充分破碎的菌液放入离心管中，8000rpm，4℃离心40min。收集离心后的上清，使用0.22μm滤膜过滤准备后续镍柱蛋白纯化。使用Binding Buffer将镍柱(HisTrap HP column)平衡后，进行蛋白上样。目的蛋白通过His标签与柱子结合，使用Binding Buffer洗脱柱子上非特异结合的杂蛋白,800mM(16％B)洗脱目的蛋白，收集样品进行电泳鉴定(图5)。
2.LwCas13a蛋白透析和SUMO酶切
为了防止LwCas13a蛋白液中的高浓度咪唑和蛋白上的标签对蛋白的活性产生影响，需要通过透析置换缓冲液以及利用SUMO蛋白酶去除相应标签结构，将上一步洗脱得到的目的蛋白加入透析袋，封口，放入500mL SUMO消化缓冲液中，4℃搅拌透析，约1h换一次外液，2h后测定透析袋中的蛋白浓度，参考说明书并根据蛋白总量加入SUMO蛋白酶，4℃旋转混合酶切过夜，收集样品进行电泳鉴定(图5)。
3.LwCas13a蛋白浓缩
为了提高蛋白活性，使用微孔超滤离心管将蛋白进行超滤浓缩并置换为StorageBuffer。预冷4℃离心机，3500rpm离心5min，将酶切后蛋白液全部浓缩后，管内余500～1000μL的蛋白液时加入1～2mL的Storage Buffer，再次离心收集至干净ep管中，放入-80℃冻存(图5)。
实施例4反应体系的建立和优化
1.核酸提取及模板ssRNA制备
对于DNA样品，取100μL组织上清液或样本，按DNA抽提试剂盒(市售可得，例如购自TIANGEN的试剂盒)说明书要求进行细菌DNA提取，最后将DNA用50μL水溶解，即得扩增模板；T7-RPA扩增，RPA产物经纯化、测定浓度后，DNA通过T7转录酶转录为ssRNA，使用柱式RNA快速纯化试剂盒(生工)纯化后放于-80℃冻存。
按照实施例1所述的方法提取各细菌基因组后使用Nanodrop分光光度计测定其浓度，经上述T7-RPA扩增后(条件与体系参照实施例1)进行37℃体外转录过夜，转录产物经纯化后分装后放于-80℃冻存，准备后续检测使用。
2.最佳引物及crRNA的筛选
本发明的实验过程中共设计得到三对针对三个不同靶点的引物对以及相应的三条crRNA，具体如表5及表6：
表5 T7-RPA引物设计
引物名称 序列5’-3’
prfA-F taatacgactcactatagggTATGCGGAATCACGCGGCTGGAAA
prfA-R ACGCTCATCTTGCATCGAAACGACA
hly-F taatacgactcactatagggATTGATTATGATGACGAAATGGCTTA
hly-R TGACTTCTTCTTGCATTTTCCCTTCA
iap-F taatacgactcactatagggACTATTTGGGCTTTATCCG
iap-R CTGTTTGTTGTTGCGTTGC
表6 crRNA设计
本发明所述实验的反应体系和条件如表7。在反应体系中其他组分浓度不变的情况下，分别利用设计的三对引物与3条crRNA分别对同一核酸样本进行SHERLOCK-LM检测，反应条件为37℃，40min。结果发现含iap-crRNA及其引物对的反应体系的荧光-时间曲线以及荧光强度明显优于含有prfA-crRNA及其引物对的反应体系及含有hly-crRNA及其引物对的反应体系(图6、图7)，因此选取iap-crRNA及其引物对用于后续反应体系优化研究。
表7 SHERLOCK检测体系
反应成分 用量
LwaCas13a蛋白 100nM
蛋白反应缓冲液 4μL
crRNA 100nM
RNase Alert 5μM
RNase inhibitor 1μL
ssRNA模板 100ng
RNase free water 补至20μL
本发明将含有上述SHERLOCK反应体系的PCR管放入荧光定量PCR仪中，设置通道激发光波长490nm，发射光波长520nm，37℃，每分钟读取一次荧光值，循环40次，检测体系中荧光强度变化。
3.一步法SHERLOCK检测体系的建立
本发明将SHERLOCK检测体系各组分的浓度以及反应时间的优化，以表8所述体系和条件进行一步法SHERLOCK检测：
表8一步法SHERLOCK检测体系
反应成分 用量
上下游引物 各2.4μL
RPA basic冻干粉 4mg
LwaCas13a蛋白 100nM
10×RPA反应缓冲液 10μL
crRNA 100nM
NTP Mix 6μL(1mM each)
T7转录酶 2μL
RNase Alert 5μM
MgOAc 2.5μL
DNA模板 100ng
RNase free water 补至50μL
反应条件：检测反应条件为40℃，每1min读取荧光值，循环40次。
4.基于SHERLOCK检测方法的特异性和灵敏度
特异性检测的模板采用实施例1中提取的基因组进行检测，包括单增李斯特菌(Listeria monotygenes)1/2C、沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、副溶血弧菌(VibrioParahemolyticus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、小肠结肠炎耶氏菌(Yersiniaenterocolitica)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，同时加入DEPC水为阴性对照。按照上述一步法SHERLOCK检测体系以验证本发明方法的特异性。图8检测结果显示，SHERLOCK对含有单增李斯特菌基因的荧光强度有很高的特异性，其他细菌和阴性对照则没有荧光反应，本发明方法在检测过程中不存在交叉反应，特异性良好，可以实现可视化。
将灵敏度检测所用的单增李斯特菌基因组模板进行定量并梯度稀释，制备成的模板浓度每μL分别为150ng、15ng、1.5ng、150pg、15pg、1.5fg、150ag，同时以DEPC水为阴性对照。与阴性对照相比，图9荧光柱状图的荧光强度均具有统计学差异(one way ANOVA检验，**P＝0.0023,****P<0.0001；bars represent mean±s.e.m.)，结果表明本发明方法的灵敏度可达到1.5fg，同时也可实现可视化。
实施例5人工对牛奶样品、牛肉样品进行加标检测。
本发明针对食物样品中单增李斯特菌的提取采用煮沸-裂解液法，具体方法如下：
人工加标牛奶样品：对单增李斯特菌菌液通过平板计数，得出菌液浓度。将牛奶煮沸10min，12000rpm离心2min，去除脂肪蛋白质等杂质，留下上清。将菌液与牛奶上清混合，使牛奶中单增李斯特菌终浓度为5.34×106CFU/mL，12000rpm/分钟离心5min收集菌体，无菌生理盐水洗涤两遍，最后加入100μL生理盐水重悬菌体，沸水煮10min，离心加入裂解液，37℃放置10min，再次离心取上清基因组，然后将其进行10倍倍比稀释作为模板，用于分析牛奶样品中单增李斯特菌检测灵敏度。使用实施例5建立的一步法SHERLOCK检测体系及反应条件对所制备样品进行检测，利用蓝光透射仪对检测结果进行视觉观察，作为对照，进行T7-RPA扩增，并使用2％的琼脂糖凝胶电泳对扩增结果进行检测。
人工加标牛肉样品：对单增李斯特菌通过平板计数，得出菌液浓度，将牛肉使用小型绞肉机绞成肉泥，将菌体与肉泥混合，使肉泥中单增李斯特菌终浓度为5.34×106CFU/g，使用同体积的无菌生理盐水重悬肉泥，并过滤肉泥，过滤液通过12000rpm/分钟离心2min收集菌体，无菌生理盐水洗涤两遍，最后加入100μL生理盐水重悬菌体，沸水煮10min，离心加入裂解液，37℃放置10min，再次离心取上清基因组，然后将其进行10倍倍比稀释作为模板，用于分析牛肉样品中单增李斯特菌检测灵敏度。使用实施例5建立的一步法SHERLOCK检测体系及反应条件对所制备样品进行检测，利用蓝光透射仪对检测结果进行视觉观察，作为对照，进行T7-RPA扩增，并使用2％的琼脂糖凝胶电泳对扩增结果进行检测。
本发明对人工加标牛奶样品中单增李斯特菌检测灵敏度结果如图10(1～7:单增李斯特菌菌体浓度分别为5.34×106CFU/mL、5.34×105CFU/mL、5.34×104CFU/mL、5.34×103CFU/mL、5.34×102CFU/mL、5.34×101CFU/mL、5.34×100CFU/mL)，可见在T7-RPA反应中，对牛奶样品中单增李斯特菌最低检测浓度为5.34×104CFU/mL，而在SHERLOCK中，对牛奶样品中单增李斯特菌最低检测浓度为5.34×101CFU/mL。本发明对人工加标牛肉样品中单增李斯特菌检测结果如图11(1～7:单增李斯特菌菌体浓度分别为5.34×106CFU/g、5.34×105CFU/g、5.34×104CFU/g、5.34×103CFU/g、5.34×102CFU/g、5.34×101CFU/g、5.34×100CFU/g)，可见在T7-RPA反应中，牛肉样品中单增李斯特菌最低检测浓度为5.34×105CFU/g，而在SHERLOCK中，对人工加标牛肉样品单增李斯特菌最低检测浓度为5.34×102CFU/g。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 吉林大学
<120> 一种基于SHERLOCK检测单增李斯特菌的现场可视化试剂盒及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 1
taatacgact cactataggg actatttggg ctttatccg 39
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 2
ctgtttgttg ttgcgttgc 19
<210> 3
<211> 133
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 3
gcctaaagta gcagaaacga aagaaactcc agtagtagat caaaatgcta ctacacacgc 60
tgttaaaagc ggtgacacta tttgggcttt atccgtaaaa tacggtgttt ctgttcaaga 120
cattatgtca tgg 133
<210> 4
<211> 59
<212> RNA
<213> artificial sequence
<400> 4
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacacgg auaaagccca aauaguguc 59

Claims (9)

1.一种基于SHERLOCK检测单增李斯特菌的现场可视化试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含以下组分：
1）用于扩增单增李斯特菌侵袭性相关分泌型内肽酶（invasion associated secretedendopeptidase，iap）基因片段的T7-RPA引物对，所述的单增李斯特菌iap基因片段位于GenBank ID：985140的单增李斯特菌iap基因的第545-678位，所述的引物对由上游引物和下游引物组成，其中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
2）Cas13a蛋白和crRNA，或二者形成的复合体，所述的crRNA用于结合经所述T7-RPA引物扩增并转录后得到的目的ssRNA，同时结合并引导Cas13a蛋白，所述的crRNA包括用于与Cas13a结合的重复序列和靶向单增李斯特菌iap基因保守区的向导序列，所述的crDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述的Cas13a蛋白为LwCas13a蛋白；以及
3）RNA荧光报告分子。
2.根据权利要求1所述的现场可视化试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包含RPAbasic 冻干粉、MgOAc、T7转录酶、10×RPA反应缓冲液以及NTP Mix；其中，所述RPA basic冻干粉包含重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换聚合酶。
3.根据权利要求2所述的现场可视化试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为单增李斯特菌的基因组DNA；所述阴性对照品为DEPC水。
4.权利要求1-3任一项所述的现场可视化试剂盒在检测奶制品或肉制品中单增李斯特菌中的应用。
5.一种使用权利要求1~3任一项所述的现场可视化试剂盒检测奶制品或肉制品中单增李斯特菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)：提取待检样品中的基因组DNA；
步骤(2)：以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，进行SHERLOCK反应；
步骤(3)：在步骤(2)所述的SHERLOCK反应结束后，根据荧光强度分析检测结果。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中还包括分别以单增李斯特菌的基因组DNA和DEPC水为模板进行SHERLOCK反应；所述以单增李斯特菌的基因组DNA为模板的SHERLOCK反应结果作为阳性对照，以DEPC水为模板的SHERLOCK反应结果作为阴性对照。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中进行SHERLOCK反应所采用的反应体系以50μL计，包括：4mg RPA Basic冻干粉、10μM上下游引物各2.4μL、100nM Cas13a蛋白、10×RPA反应缓冲液10μL、crRNA 100nM、NTP Mix 6μL、T7 转录酶 2μL、5μM RNA荧光报告分子、100ng模板、280mM MgOAc水溶液2.5μL和DEPC水补足至50μL。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述SHERLOCK反应的反应条件为：反应温度为37～42℃、反应时间为5～40min，在470~520 nm波长的蓝光透射仪下观察反应体系产生的荧光情况，若反应体系扩增产物呈现荧光，则样品中含有单增李斯特菌，若反应体系扩增产物不呈现荧光，则样品中不含单增李斯特菌。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述SHERLOCK反应的反应条件为：反应温度为40℃，反应时间为40min。
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