CN114317307A - 一种可提高虾青素生物合成产量的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可提高虾青素生物合成产量的基因工程菌及其构建方法与应用，在解脂耶氏酵母Polf菌导入AtoB、tHMGR、IDI、GGS1、pFBA‑CrtZ‑tXPR2、pGPD‑CarRP‑tLIP、pTEF‑CrtW‑CYC1、pEXP‑CarB‑tICL、pHXT2‑FTO‑tLIP。本发明优点有：通过引入葡萄糖浓度感应型启动子结合RNA去甲基化酶实现微生物发酵生产过程中菌体生长和产物生产有效转换，提高了酵母发酵生产虾青素的产量，简化了操作流程、降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程菌构建技术领域，尤其涉及一种提高虾青素产量的基因工程菌构建技术。
背景技术
虾青素是一种红色酮基化类胡萝卜素，具备很强的抗氧化功能。其主要作为饲料添加剂用于水产养殖以改善鱼肉的色泽。由于其具备很强的抗氧化功能，虾青素也越来越多地被用于食品和化妆品领域。另外，有研究显示虾青素还具有抗肿瘤、抗炎症和增强免疫***的功效。由于虾青素具备这些功能，其全球年需求量已经达到250吨，销售额接近4.5亿美元，到2025年有望达到25亿美元。
目前虾青素主要是通过化学合成获得，但是化学合成的虾青素是外消旋混合物，无法被人体吸收利用，只能用于动物和水产养殖着色。虽然有多种生物法合成虾青素，但普遍存在生产效率低、经济上不具有竞争力的问题，相比之下，微生物发酵法不受原料限制，生产过程绿色清洁，具有明显优势。解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)含有丰富的合成类胡萝卜素化合物前体原料乙酰辅酶A，且其细胞内积累有大量的脂质，为脂溶性类胡萝卜素类化合物提供储存空间，这些特性使解脂耶氏酵母成为合成类胡萝卜素的优良底盘菌。
由于微生物生产目标产物往往由外源代谢通路执行，这势必对细胞生长造成负担，这一直是生物合成产业面临的难题。以往的解决方法有通过设计不同温度敏感型启动子，通过改变发酵温度将发酵进程由菌株生长阶段转换成产物累积阶段，还有通过微生物细胞密度感应促进这一转换。由于大部分菌株都只在特定温度区间生长，不能跨温度区间生长，而密度感应灵敏度不高，还要另外设计感应因子释放和接收的信号通路，影响菌株的生长，增加菌株的代谢负担，这些问题限制了其实际应用。酵母细胞HXT2上游启动子能根据葡萄糖浓度高或低抑制或开启下游基因转录(
et al.,1996)。葡萄糖作为发酵生产的常用碳源，且类胡萝卜素类发酵生产在生物量生产阶段需要高浓度葡萄糖、在产物生产阶段只需要低浓度葡萄糖(Gao et al.,2017)。N6-腺苷酸甲基化(m6A)修饰是mRNA常见的一种转录后可逆修饰。m6A甲基化酶和去甲基化酶通过甲基化和去甲基化调控RNA的加工和代谢，同时还可以促进染色体开放而促进基因转录表达(Chandola et al.,2014；Yu etal.,2021)。因此解决类胡萝卜素类发酵生产过程中目标产物累积抑制菌株生长的难题提高目标产物产量是具有重要意义的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可提高虾青素生物合成产量的基因工程菌及其构建方法与应用，以解决现有微生物生产虾青素产量不高的问题。
为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：
一种可提高虾青素生物合成产量的基因工程菌，所述基因工程菌是在解脂耶氏酵母Polf菌导入AtoB、tHMGR、IDI、GGS1、pFBA-CrtZ-tXPR2、pGPD-CarRP-tLIP、pTEF-CrtW-CYC1、pEXP-CarB-tICL、pHXT2-FTO-tLIP获得的菌株F2；
其中pHXT2序列如SEQ ID NO:34所示；FTO序列如SEQ ID NO:35所示。
本发明还提供一种所述的可提高虾青素生物合成产量的基因工程菌的构建方法，步骤包括：
(1)构建含有pFBA-CrtZ-tXPR2、pGPD-CarRP-tLIP、pTEF-CrtW-CYC1和pEXP-CarB-tICL的质粒pMA、含有pHXT2-FTO-tLIP的质粒pMB；
(2)在解脂耶氏酵母Polf菌中导入甲羟戊酸途径和法尼基焦磷酸途径相关基因AtoB、tHMGR、IDI和GGS1获得菌株F0；
(3)酶切后的质粒pMA转化所述菌株F0，得到基因工程菌F1；
(4)酶切后的质粒pMB转化所述基因工程菌F1，得到基因工程菌F2。
进一步地，所述构建含有pFBA-CrtZ-tXPR2、pGPD-CarRP-tLIP、pTEF-CrtW-CYC1和pEXP-CarB-tICL的质粒pMA的过程包括：
提取酿酒酵母CEN.PK2-1C和解脂耶氏酵母Polf基因组DNA；
用引物loxP-URA3-F/loxP-URA3-R以解脂耶氏酵母Polf基因组DNA为模板PCR扩增URA3基因，再以该PCR产物为模板，用引物URA3-F和URA3-R扩增URA3基因片段；质粒pUC19用内切酶NdeⅠ和KpnⅠ双酶切，再用无缝克隆将URA3基因片段克隆到pUC19的NdeⅠ和KpnⅠ之间构建质粒pUC19URA3；
分别用引物pFBA-F/pFBA-R、tXPR2-F/tXPR2-R、pGPD-F/pGPD-R、tLIP-F/tLIP-R、pTEF-F/pTEF-R、pEXP-F/pEXP-R和tICL-F/tICL-R以解脂耶氏酵母Polf基因组DNA为模板扩增pFBA、tXPR2、pGPD、tLIP、pTEF、pEXP和tICL片段；用引物CYC1-F/CYC1-R以酵母CEN.PK2-1C基因组DNA为模板扩增CYC1片段；
来源于卷枝毛霉(Rhizomucor circinelloides)的CarRP和CarB以及源于雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)的CrtZ和CrtW基因经密码子优化后，作为模板，分别用引物CarRP-F/CarRP-R、CarB-F/CarB-R、CrtZ-F/CrtZ-R和CrtW-F/CrtW-R扩增密码子优化后的CarRP、CarB、CrtZ和CrtW片段；
拼接pFBA-CrtZ-tXPR2、pGPD-CarRP-tLIP、pTEF-CrtW-CYC1和pEXP-CarB-tICL四个表达框，将质粒pUC19URA3用BamHⅠ和HindⅢ双酶切纯化回收，再将酶切质粒骨架和四个表达框组装构建质粒pMA。
进一步地，所述含有pHXT2-FTO-tLIP的质粒pMB的构建过程包括：
提取解脂耶氏酵母Polf基因组DNA；
用引物loxP-URA3-F/loxP-URA3-R以解脂耶氏酵母Polf基因组DNA为模板PCR扩增URA3基因，再以该PCR产物为模板，用引物URA3-F和URA3-R扩增URA3基因片段；质粒pUC19用内切酶NdeⅠ和KpnⅠ双酶切，再用无缝克隆将URA3基因片段克隆到pUC19的NdeⅠ和KpnⅠ之间构建质粒pUC19URA3；
分别用引物pHXT2-F/pHXT2-R和tLIP-F/tLIP-R1以解脂耶氏酵母Polf基因组DNA为模板扩增pHXT2和tLIP片段；
来源于人(Homo sapiens)的FTO基因经密码子优化后，作为模板，用引物FTO-F/FTO-R扩增优化后的FTO基因片段；
拼接pHXT2-FTO-tLIP表达框，将质粒pUC19URA3用BamHⅠ和HindⅢ双酶切纯化回收，再将酶切质粒骨架和pHXT2-FTO-tLIP表达框组装构建质粒pMB。
进一步地，所述扩增pHXT2片段得到的pHXT2序列如SEQ ID NO:34所示。
进一步地，所述扩增优化后的FTO基因片段得到的FTO序列如SEQ ID NO:35所示。
进一步地，所述步骤(3)的操作过程是：
将质粒pMA用NotⅠ酶切1小时并琼脂糖凝胶电泳回收不含有大肠杆菌复制子和氨苄抗性基因的片段，接下来用醋酸锂法将线性化的pMA转化菌株F0,涂布SD-URA缺陷培养基，2-3天后挑取橙红颜色最深的120个转化子分别接入10ml液体YPD40培养基，200rpm、30℃培养72小时，检测虾青素产量，获得产量最高的基因工程菌F1；
所述步骤(4)的过程是将质粒pMB用NotⅠ酶切1小时并琼脂糖凝胶电泳回收不含有大肠杆菌复制子和氨苄抗性基因的片段，接下来用醋酸锂法将线性化的pMB转化菌株F1,涂布SD-URA缺陷培养基，2-3天后挑取橙红颜色最深的120个转化子分别接入10ml液体YPD40培养基，200rpm、30℃培养72小时，检测虾青素产量，获得产量最高的基因工程菌F2，-80℃甘油管保存。
进一步地，按质量分数计，所述YPD40培养基成分包括1％酵母膏，2％蛋白胨，4％葡萄糖。
本发明还提供一种所述的可提高虾青素生物合成产量的基因工程菌在虾青素生产上的应用，步骤如下：
1)一级种子液的培养：取-80℃甘油管保存的菌株F2在固体YPD平板画线30℃培养24小时，将固体YPD平板上的菌株F2单菌落接种到含有10ml YPD液体培养基的50ml锥形瓶中，30℃、摇床转速220rpm，培养24小时；
2)二级种子液的培养：将一级种子液按10％wt接种量转接到含有100ml YPD液体培养基的300ml锥形瓶中，30℃、摇床转速220rpm，培养8小时细胞OD600达到10，得到二级种子液；
3)将二级种子液按10％wt接种量转接至含有2L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵。
更优地，所述步骤3)的详细过程是：将二级种子液按10％wt接种量转接至含有2L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵，初始培养基组成为30g/L酵母提取物、60g/L蛋白胨和100g/L葡萄糖，发酵温度30℃、搅拌速度300-800rpm、通气量4L/min、pH6.8和溶氧25％以上的条件下培养，培养到48小时一次补600g/L葡糖糖200ml，培养到72小时开始按10ml/小时流加补料600g/L葡萄糖直到240小时发酵结束。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
利用酵母HXT2基因启动子随葡萄糖浓度高或低抑制或激活下游基因表达这一特性，结合RNA去甲基化酶FTO增强基因表达活性，通过引入葡萄糖浓度感应型启动子结合RNA去甲基化酶，将两者结合很好地解决了微生物发酵生产过程中菌体生长和产物生产不能有效转换的矛盾，提高了酵母发酵生产虾青素的产量，简化了操作流程、降低了生产成本。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
图1是质粒pMA示意图；
图2是质粒pMB示意图；
图3是本发明虾青素生产菌株(F1和F2)发酵罐生产虾青素结果图。
具体实施方式
下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
本发明所涉及解脂耶氏酵母菌株为Polf(ATCC编号MAY-2613；基因型MATAura3-302 leu2-270 xpr-322axp2-deltaNU49 XPR2::SUC2,购自ATCC)，所用限制性内切酶购自ThermoFisher公司，质粒提取及胶回收所用试剂、PCR及无缝克隆所用试剂、分子克隆用大肠杆菌(DH5α)均购自南京诺唯赞生物科技有限公司，酿酒酵母、解脂耶氏酵母和大肠杆菌基因组DNA提取所用试剂购自Qiagen公司。
实施例中所用到的引物如表1所示：
表1引物列表
实施例1虾青素合成途径质粒构建
用Qiagen公司的Blood&Cell Culture DNA Mini Kit提取酿酒酵母CEN.PK2-1C和解脂耶氏酵母Polf基因组DNA。
用引物loxP-URA3-F/loxP-URA3-R以解脂耶氏酵母Polf基因组DNA为模板PCR扩增URA3基因，再以该PCR产物为模板，用引物URA3-F和URA3-R扩增URA3基因片段；质粒pUC19用内切酶NdeⅠ和KpnⅠ双酶切，再用无缝克隆(诺唯赞ClonExpress Ultra One Step CloningKit)将URA3基因片段克隆到pUC19的NdeⅠ和KpnⅠ之间构建质粒pUC19URA3。
所述loxP-URA3-F碱基序列如SEQ ID NO:1所示；loxP-URA3-R碱基序列如SEQ IDNO:2所示；URA3-F碱基序列如SEQ ID NO:3所示；URA3-R碱基序列如SEQ ID NO:4所示。
(1)质粒pMA的构建
分别用引物pFBA-F/pFBA-R、tXPR2-F/tXPR2-R、pGPD-F/pGPD-R、tLIP-F/tLIP-R、pTEF-F/pTEF-R、pEXP-F/pEXP-R和tICL-F/tICL-R以解脂耶氏酵母Polf基因组DNA为模板扩增pFBA、tXPR2、pGPD、tLIP、pTEF、pEXP和tICL片段；用引物CYC1-F/CYC1-R以酵母CEN.PK2-1C基因组DNA为模板扩增CYC1片段；
来源于卷枝毛霉(Rhizomucor circinelloides)的CarRP和CarB以及源于雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)的CrtZ和CrtW基因由南京金斯瑞科技有限公司经密码子优化处理，分别用引物CarRP-F/CarRP-R、CarB-F/CarB-R、CrtZ-F/CrtZ-R和CrtW-F/CrtW-R以上述优化后的基因为模板扩增CarRP、CarB、CrtZ和CrtW片段；
pFBA-F碱基序列如SEQ ID NO:23所示；pFBA-R碱基序列如SEQ ID NO:24所示；tXPR2-F碱基序列如SEQ ID NO:27所示；tXPR2-R碱基序列如SEQ ID NO:28所示；pGPD-F碱基序列如SEQ ID NO:29所示；pGPD-R碱基序列如SEQ ID NO:30所示；tLIP-F碱基序列如SEQID NO:9所示；tLIP-R碱基序列如SEQ ID NO:10所示；pTEF-F碱基序列如SEQ ID NO:11所示；pTEF-R碱基序列如SEQ ID NO:12所示；pEXP-F碱基序列如SEQ ID NO:17所示；pEXP-R碱基序列如SEQ ID NO:18所示；tICL-F碱基序列如SEQ ID NO:21所示；tICL-R碱基序列如SEQID NO:22所示；CYC1-F碱基序列如SEQ ID NO:15所示；CYC1-R碱基序列如SEQ ID NO:16所示；CarRP-F碱基序列如SEQ ID NO:31所示；CarRP-R碱基序列如SEQ ID NO:32所示；CarB-F碱基序列如SEQ ID NO:19所示；CarB-R碱基序列如SEQ ID NO:20所示；CrtZ-F碱基序列如SEQ ID NO:25所示；CrtZ-R碱基序列如SEQ ID NO:26所示；CrtW-F碱基序列如SEQ ID NO:13所示；CrtW-R碱基序列如SEQ ID NO:14所示；
用overlap PCR将启动子、基因和终止子拼接成pFBA-CrtZ-tXPR2、pGPD-CarRP-tLIP、pTEF-CrtW-CYC1和pEXP-CarB-tICL四个表达框，将质粒pUC19URA3用BamHⅠ和HindⅢ双酶切纯化回收，再用吉布森连接(诺唯赞ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit)将酶切质粒骨架和四个表达框组装构建质粒pMA。质粒pMA如图1所示。
(2)质粒pMB的构建
分别用引物pHXT2-F/pHXT2-R和tLIP-F/tLIP-R1以解脂耶氏酵母Polf基因组DNA为模板扩增pHXT2和tLIP片段；
来源于人(Homo sapiens)的FTO基因由南京金斯瑞科技有限公司经密码子优化处理，用引物FTO-F/FTO-R以该优化后的基因为模板扩增FTO基因片段。
pHXT2-F碱基序列如SEQ ID NO:5所示；pHXT2-R碱基序列如SEQ ID NO:6所示；FTO-F碱基序列如SEQ ID NO:7所示；FTO-R碱基序列如SEQ ID NO:8所示；tLIP-F碱基序列如SEQ ID NO:9所示；tLIP-R1碱基序列如SEQ ID NO:33所示。
扩增得到的pHXT2序列如SEQ ID NO:34所示：
AGAAGAAGCAGGACTACTTTTTCGAGATCAGAGGCGAGCTTGATCGGGAGTTCAAGGAGGTTTTCTACAGACTACACGAGCATCTTGTCTACAAGTTCCATCTCTTCTGGAAGCATGGTGTGCAGGAGAAGAAGATTCAGAGCGTTCTGCAGACTGACAACCACCTGAAGATCTTCCTGGAGAAATACGACGCAAACCTGCGACGGGGAGACTGGAAATAAAACATGAGAGACACACACGTGCAACACACAAACATTAGTTAATTGATTCATCTGATCTGCAAAAACATGTTGGTGATGGTTAAGAGTCACATAACAAGCAGGGTCCATGCACTCGCTTTCTTACATAGCACCATAGAATACGGTGTTGTCGGCATTATCAAGACAGAATTTACTTTGGTGATGTTATCACATGAGCCGGGGGGCATAGGGTGGGCACTCGTACTCTATGCGTTATTGGTTGCAGACCCATAATCTCAAGGGCGTTCCAGAACATACACTATGCGACCGCAGGGACCCTCGATATGGACGATGAATAGTATGGCAACATAAACCAGAAACTATTATATAGAGATGATGGGGGCGACATTTCGGTAATTACGTTCATCCACCTTCGATC
扩增得到的FTO序列如SEQ ID NO:35所示：
ATGAAGCGAACTCCCACCGCCGAAGAACGGGAGCGAGAGGCCAAAAAGCTGCGGCTGCTCGAAGAACTCGAGGACACGTGGCTCCCATATCTCACCCCCAAGGACGATGAGTTCTACCAGCAGTGGCAGCTCAAGTACCCTAAACTGATTCTGAGAGAAGCAAGCTCAGTTTCTGAGGAGCTCCACAAGGAGGTTCAGGAGGCGTTTCTGACGCTCCATAAGCACGGATGTCTGTTTAGAGATCTGGTGCGAATCCAGGGAAAGGATCTTTTGACCCCGGTATCGCGGATTCTCATCGGAAACCCGGGCTGTACCTACAAGTATCTCAACACCCGTCTCTTCACCGTCCCCTGGCCCGTCAAGGGCTCCAACATCAAGCATACAGAGGCAGAGATTGCCGCGGCTTGTGAGACTTTCTTGAAGCTCAACGACTATCTTCAGATAGAGACCATTCAGGCCTTAGAAGAGTTGGCAGCCAAGGAGAAGGCCAACGAGGATGCCGTGCCTCTTTGCATGTCTGCTGATTTCCCACGAGTCGGTATGGGTTCGTCATACAACGGTCAGGACGAGGTGGATATCAAGTCTCGCGCTGCCTACAATGTGACTCTGCTGAACTTTATGGACCCCCAGAAAATGCCCTACCTGAAAGAGGAGCCCTACTTTGGAATGGGCAAGATGGCTGTTTCATGGCACCACGATGAAAACCTCGTGGATAGATCCGCAGTTGCTGTCTACTCTTACTCGTGCGAGGGACCTGAGGAGGAAAGTGAGGACGACTCCCATCTTGAGGGGCGAGACCCCGACATCTGGCACGTGGGCTTCAAGATTTCGTGGGACATTGAAACGCCTGGTCTTGCCATCCCCCTACACCAGGGCGACTGCTACTTCATGCTGGACGATCTAAATGCGACACATCAACATTGTGTGCTGGCCGGAAGTCAACCTCGATTCAGCTCGACCCACAGAGTGGCTGAATGCTCCACTGGAACATTGGACTACATCCTGCAACGGTGCCAACTGGCTCTGCAGAATGTCTGTGATGACGTTGACAACGATGATGTGTCCCTTAAGAGCTTTGAGCCTGCTGTCCTAAAGCAGGGCGAGGAAATCCACAACGAAGTCGAGTTTGAGTGGCTGAGACAGTTCTGGTTCCAAGGTAACCGATACCGACGATGCACCGACTGGTGGTGCCAGCCCATGGCCCAGCTGGAGGCACTGTGGAAGAAGATGGAGGGTGTGACCAATGCCGTTCTCCACGAGGTCAAACGCGAGGGCTTACCGGTGGAGCAACGAAACGAGATCCTGACTGCCATTCTGGCGTCTCTTACGGCCCGTCAGAACCTACGTCGAGAATGGCATGCTCGCTGTCAGTCTCGAATCGCTCGGACTTTGCCAGCTGACCAGAAGCCCGAGTGTCGACCTTACTGGGAGAAGGACGACGCCTCCATGCCTCTGCCCTTTGACTTGACAGACATTGTCTCCGAGCTGCGAGGCCAGCTGCTTGAAGCAAAGCCTTGA
用overlap PCR将pHXT2、FTO和tLIP拼接成pHXT2-FTO-tLIP表达框，将质粒pUC19URA3用BamⅠ和HindⅢ双酶切纯化回收，再用吉布森连接(诺唯赞ClonExpress UltraOne Step Cloning Kit)将酶切质粒骨架和pHXT2-FTO-tLIP表达框组装构建质粒pMB。质粒pMB如图2所示。
实施例2产虾青素菌株的构建
在解脂耶氏酵母Polf菌中导入甲羟戊酸途径和法尼基焦磷酸途径相关基因AtoB、tHMGR、IDI和GGS1获得菌株F0。
将质粒pMA用NotⅠ酶切1小时并琼脂糖凝胶电泳回收不含有大肠杆菌复制子和氨苄抗性基因的片段，接下来用醋酸锂法将线性化的pMA转化菌株F0,涂布SD-URA缺陷培养基，2-3天后挑取橙红颜色最深的120个转化子分别接入10ml液体YPD40培养基，按质量分数计，YPD40培养基成分包括1％酵母膏，2％蛋白胨，4％葡萄糖，200rpm、30℃培养72小时，检测虾青素产量，获得产量最高的菌株F1，-80℃甘油管保存备用。
将质粒pMB用NotⅠ酶切1小时并琼脂糖凝胶电泳回收不含有大肠杆菌复制子和氨苄抗性基因的片段，接下来用醋酸锂法将线性化的pMB转化菌株F1,涂布SD-URA缺陷培养基，2-3天后挑取橙红颜色最深的120个转化子分别接入10ml液体YPD40培养基，200rpm、30℃培养72小时，检测虾青素产量，获得产量最高的菌株F2，-80℃甘油管保存备用。
实施例3上罐发酵生产虾青素
将实施例2制备的菌株F1和菌株F2分别于5L发酵罐中发酵生产虾青素。方法如下：
1)一级种子液的培养：取-80℃甘油管保存的菌株F1/菌株F2在固体YPD平板画线30℃培养24小时，将固体YPD平板上的菌株F1/菌株F2单菌落接种到含有10ml YPD液体培养基的50ml锥形瓶中，30℃、摇床转速220rpm，培养24小时；
2)二级种子液的培养：将一级种子液按10％(wt)接种量转接到含有100mlYPD液体培养基的300ml锥形瓶中，30℃、摇床转速220rpm，培养8小时细胞OD600达到10，得到二级种子液；
3)将二级种子液按10％(wt)接种量转接至含有2L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵，初始培养基组成为30g/L酵母提取物、60g/L蛋白胨和100g/L葡萄糖，发酵温度30℃、搅拌速度300-800rpm、通气量4L/min、pH6.8和溶氧25％以上的条件下培养，培养到48小时一次补充600g/L葡萄糖200ml，培养到72小时开始按10ml/小时流加补料600g/L葡萄糖直到240小时发酵结束。
测定菌株F1、菌株F2不同培养时间的虾青素产量并记录。
虾青素产量测定方法：
1)取1mL菌液离心去上清，沉淀重悬于0.7mL DMSO中。
2)55℃孵育10min以后添加等体积丙酮0.7mL。
3)45℃孵育15min，12000rpm离心5min。
4)上清转移至一个新EP管，HPLC在475nm检测虾青素产量(标准样品溶于丙酮作标准曲线)。
结果如图3所示：经过264小时发酵，菌株F1发酵液中虾青素产量358mg/L,而菌株F2发酵液中虾青素产量明显提高，菌株F2发酵液中虾青素产量达到763mg/L，菌株F2发酵液中虾青素产量与菌株F1发酵液中虾青素产量相比增加了一倍以上。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
序列表
<110> 广州智特奇生物科技股份有限公司
<120> 一种可提高虾青素生物合成产量的基因工程菌及其构建方法与应用
<130> 2021
<160> 35
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
atcgcttcgg ataactcctg ctatacgaag ttatacgaat tcgcgcccag agagccattg 60
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
ataacttcgt atagcataca tcatacgaag ttattctgaa ttccgagaaa cacaacaaca 60
tgc 63
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
attgtactga gagtgcacca gcggccgcat cgcttcggat aactcctg 48
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
aggtcgactc tagaggatcc ccggataact tcgtatagca tacat 45
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
cgaagttatc cggggatcca gaagaagcag gactactttt tc 42
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
gatcgaaggt ggatgaacgt 20
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
ttcatccacc ttcgatcatg aagcgaactc ccacc 35
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
gtaaagagtg ataaatagct caaggctttg cttcaagcag 40
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
gctatttatc actctttaca ac 22
<210> 10
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
ccgccaaccc ggtctctgac ccttcgtggg tctcaat 37
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
agagaccggg ttggcggc 18
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
ctgcggttag tactgcaaaa 20
<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
ctttttgcag tactaaccgc agatgcacgt ggcctctgct 40
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
gacataacta attacatgat taggccagag cggggacc 38
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
tcatgtaatt agttatgtc 19
<210> 16
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
aacgggcgcc aaactccgca aattaaagcc ttcgagc 37
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
ggagtttggc gcccgttt 18
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 18
tgctgtagat atgtcttgtg 20
<210> 19
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 19
caagacatat ctacagcaat gtccaagaag cacattg 37
<210> 20
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 20
ttttgctaaa caaactgctt agatgacgtt agagttg 37
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 21
gcagtttgtt tagcaaaata 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 22
gaccatgatt acgccaagct ttgtatgatt gatgttacta c 41
<210> 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 23
acgaagttat ccggggatcc tgcacccaac aataaatggg 40
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 24
ctgggttagt ttgtgtagag 20
<210> 25
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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ctacacaaac taacccagat gctgtctaag ctgcagtc 38
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<211> 37
<212> DNA
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<400> 26
caggccatgg aggtacttat cgcttagacc agtccag 37
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 27
gtacctccat ggcctgtcc 19
<210> 28
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 28
ggccgattca tttcaaccca tctcacttgc gtatgtatgg 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 29
ggttgaaatg aatcggccg 19
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 30
tgttgatgtg tgtttaatt 19
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 31
ttaaacacac atcaacaatg ctgctgacct acatgg 36
<210> 32
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 32
taaagagtga taaatagctt agatggtgtt caggtttc 38
<210> 33
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 33
ccatgattac gccaagcttg acccttcgtg ggtctcaatg 40
<210> 34
<211> 618
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母Polf(Yarrowia)
<400> 34
agaagaagca ggactacttt ttcgagatca gaggcgagct tgatcgggag ttcaaggagg 60
ttttctacag actacacgag catcttgtct acaagttcca tctcttctgg aagcatggtg 120
tgcaggagaa gaagattcag agcgttctgc agactgacaa ccacctgaag atcttcctgg 180
agaaatacga cgcaaacctg cgacggggag actggaaata aaacatgaga gacacacacg 240
tgcaacacac aaacattagt taattgattc atctgatctg caaaaacatg ttggtgatgg 300
ttaagagtca cataacaagc agggtccatg cactcgcttt cttacatagc accatagaat 360
acggtgttgt cggcattatc aagacagaat ttactttggt gatgttatca catgagccgg 420
ggggcatagg gtgggcactc gtactctatg cgttattggt tgcagaccca taatctcaag 480
ggcgttccag aacatacact atgcgaccgc agggaccctc gatatggacg atgaatagta 540
tggcaacata aaccagaaac tattatatag agatgatggg ggcgacattt cggtaattac 600
gttcatccac cttcgatc 618
<210> 35
<211> 1518
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 35
atgaagcgaa ctcccaccgc cgaagaacgg gagcgagagg ccaaaaagct gcggctgctc 60
gaagaactcg aggacacgtg gctcccatat ctcaccccca aggacgatga gttctaccag 120
cagtggcagc tcaagtaccc taaactgatt ctgagagaag caagctcagt ttctgaggag 180
ctccacaagg aggttcagga ggcgtttctg acgctccata agcacggatg tctgtttaga 240
gatctggtgc gaatccaggg aaaggatctt ttgaccccgg tatcgcggat tctcatcgga 300
aacccgggct gtacctacaa gtatctcaac acccgtctct tcaccgtccc ctggcccgtc 360
aagggctcca acatcaagca tacagaggca gagattgccg cggcttgtga gactttcttg 420
aagctcaacg actatcttca gatagagacc attcaggcct tagaagagtt ggcagccaag 480
gagaaggcca acgaggatgc cgtgcctctt tgcatgtctg ctgatttccc acgagtcggt 540
atgggttcgt catacaacgg tcaggacgag gtggatatca agtctcgcgc tgcctacaat 600
gtgactctgc tgaactttat ggacccccag aaaatgccct acctgaaaga ggagccctac 660
tttggaatgg gcaagatggc tgtttcatgg caccacgatg aaaacctcgt ggatagatcc 720
gcagttgctg tctactctta ctcgtgcgag ggacctgagg aggaaagtga ggacgactcc 780
catcttgagg ggcgagaccc cgacatctgg cacgtgggct tcaagatttc gtgggacatt 840
gaaacgcctg gtcttgccat ccccctacac cagggcgact gctacttcat gctggacgat 900
ctaaatgcga cacatcaaca ttgtgtgctg gccggaagtc aacctcgatt cagctcgacc 960
cacagagtgg ctgaatgctc cactggaaca ttggactaca tcctgcaacg gtgccaactg 1020
gctctgcaga atgtctgtga tgacgttgac aacgatgatg tgtcccttaa gagctttgag 1080
cctgctgtcc taaagcaggg cgaggaaatc cacaacgaag tcgagtttga gtggctgaga 1140
cagttctggt tccaaggtaa ccgataccga cgatgcaccg actggtggtg ccagcccatg 1200
gcccagctgg aggcactgtg gaagaagatg gagggtgtga ccaatgccgt tctccacgag 1260
gtcaaacgcg agggcttacc ggtggagcaa cgaaacgaga tcctgactgc cattctggcg 1320
tctcttacgg cccgtcagaa cctacgtcga gaatggcatg ctcgctgtca gtctcgaatc 1380
gctcggactt tgccagctga ccagaagccc gagtgtcgac cttactggga gaaggacgac 1440
gcctccatgc ctctgccctt tgacttgaca gacattgtct ccgagctgcg aggccagctg 1500
cttgaagcaa agccttga 1518
Claims (10)
1.一种可提高虾青素生物合成产量的基因工程菌，其特征在于：
所述基因工程菌是在解脂耶氏酵母Polf菌导入AtoB、tHMGR、IDI、GGS1、pFBA-CrtZ-tXPR2、pGPD-CarRP-tLIP、pTEF-CrtW-CYC1、pEXP-CarB-tICL、pHXT2-FTO-tLIP获得的菌株F2；
其中pHXT2序列如SEQ ID NO:34所示；FTO序列如SEQ ID NO:35所示。
2.一种如权利要求1所述的可提高虾青素生物合成产量的基因工程菌的构建方法，其特征在于：
步骤包括：
(1)构建含有pFBA-CrtZ-tXPR2、pGPD-CarRP-tLIP、pTEF-CrtW-CYC1和pEXP-CarB-tICL的质粒pMA、含有pHXT2-FTO-tLIP的质粒pMB；
(2)在解脂耶氏酵母Polf菌中导入甲羟戊酸途径和法尼基焦磷酸途径相关基因AtoB、tHMGR、IDI和GGS1获得菌株F0；
(3)酶切后的质粒pMA转化所述菌株F0，得到基因工程菌F1；
(4)酶切后的质粒pMB转化所述基因工程菌F1，得到基因工程菌F2。
3.根据权利要求2所述的一种可提高虾青素生物合成产量的基因工程菌的构建方法，其特征在于：
所述构建含有pFBA-CrtZ-tXPR2、pGPD-CarRP-tLIP、pTEF-CrtW-CYC1和pEXP-CarB-tICL的质粒pMA的过程包括：
提取酿酒酵母CEN.PK2-1C和解脂耶氏酵母Polf基因组DNA；
用引物loxP-URA3-F/loxP-URA3-R以解脂耶氏酵母Polf基因组DNA为模板PCR扩增URA3基因，再以该PCR产物为模板，用引物URA3-F和URA3-R扩增URA3基因片段；质粒pUC19用内切酶NdeⅠ和KpnⅠ双酶切，再用无缝克隆将URA3基因片段克隆到pUC19的NdeⅠ和KpnⅠ之间构建质粒pUC19URA3；
分别用引物pFBA-F/pFBA-R、tXPR2-F/tXPR2-R、pGPD-F/pGPD-R、tLIP-F/tLIP-R、pTEF-F/pTEF-R、pEXP-F/pEXP-R和tICL-F/tICL-R以解脂耶氏酵母Polf基因组DNA为模板扩增pFBA、tXPR2、pGPD、tLIP、pTEF、pEXP和tICL片段；用引物CYC1-F/CYC1-R以酵母CEN.PK2-1C基因组DNA为模板扩增CYC1片段；
来源于卷枝毛霉(Rhizomucor circinelloides)的CarRP和CarB以及源于雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)的CrtZ和CrtW基因经密码子优化后，作为模板，分别用引物CarRP-F/CarRP-R、CarB-F/CarB-R、CrtZ-F/CrtZ-R和CrtW-F/CrtW-R扩增密码子优化后的CarRP、CarB、CrtZ和CrtW片段；
拼接pFBA-CrtZ-tXPR2、pGPD-CarRP-tLIP、pTEF-CrtW-CYC1和pEXP-CarB-tICL四个表达框，将质粒pUC19URA3用BamHⅠ和HindⅢ双酶切纯化回收，再将酶切质粒骨架和四个表达框组装构建质粒pMA。
4.根据权利要求2所述的一种可提高虾青素生物合成产量的基因工程菌的构建方法，其特征在于：
所述含有pHXT2-FTO-tLIP的质粒pMB的构建过程是：
提取解脂耶氏酵母Polf基因组DNA；
用引物loxP-URA3-F/loxP-URA3-R以解脂耶氏酵母Polf基因组DNA为模板PCR扩增URA3基因，再以该PCR产物为模板，用引物URA3-F和URA3-R扩增URA3基因片段；质粒pUC19用内切酶NdeⅠ和KpnⅠ双酶切，再用无缝克隆将URA3基因片段克隆到pUC19的NdeⅠ和KpnⅠ之间构建质粒pUC19URA3；
分别用引物pHXT2-F/pHXT2-R和tLIP-F/tLIP-R1以解脂耶氏酵母Polf基因组DNA为模板扩增pHXT2和tLIP片段；
来源于人(Homo sapiens)的FTO基因经密码子优化后，作为模板，用引物FTO-F/FTO-R扩增优化后的FTO基因片段；
拼接pHXT2-FTO-tLIP表达框，将质粒pUC19URA3用BamHⅠ和HindⅢ双酶切纯化回收，再将酶切质粒骨架和pHXT2-FTO-tLIP表达框组装构建质粒pMB。
5.根据权利要求4所述的一种可提高虾青素生物合成产量的基因工程菌的构建方法，其特征在于：
所述扩增pHXT2片段得到的pHXT2序列如SEQ ID NO:34所示。
6.根据权利要求4所述的一种可提高虾青素生物合成产量的基因工程菌的构建方法，其特征在于：
所述扩增优化后的FTO基因片段得到的FTO序列如SEQ ID NO:35所示。
7.根据权利要求2所述的一种可提高虾青素生物合成产量的基因工程菌的构建方法，其特征在于：
所述步骤(3)的操作过程是：
将质粒pMA用NotⅠ酶切1小时并琼脂糖凝胶电泳回收不含有大肠杆菌复制子和氨苄抗性基因的片段，接下来用醋酸锂法将线性化的pMA转化菌株F0,涂布SD-URA缺陷培养基，2-3天后挑取橙红颜色最深的120个转化子分别接入10ml液体YPD40培养基，200rpm、30℃培养72小时，检测虾青素产量，获得产量最高的基因工程菌F1；
所述步骤(4)的过程是将质粒pMB用NotⅠ酶切1小时并琼脂糖凝胶电泳回收不含有大肠杆菌复制子和氨苄抗性基因的片段，接下来用醋酸锂法将线性化的pMB转化菌株F1,涂布SD-URA缺陷培养基，2-3天后挑取橙红颜色最深的120个转化子分别接入10ml液体YPD40培养基，200rpm、30℃培养72小时，检测虾青素产量，获得产量最高的基因工程菌F2，-80℃甘油管保存。
8.根据权利要求7所述的一种可提高虾青素生物合成产量的基因工程菌的构建方法，其特征在于：
按质量分数计，所述YPD40培养基成分包括1％酵母膏，2％蛋白胨，4％葡萄糖。
9.一种如权利要求1所述的可提高虾青素生物合成产量的基因工程菌在虾青素生产上的应用，其特征在于：
步骤如下：
1)一级种子液的培养：取-80℃甘油管保存的菌株F2在固体YPD平板画线30℃培养24小时，将固体YPD平板上的菌株F2单菌落接种到含有10ml YPD液体培养基的50ml锥形瓶中，30℃、摇床转速220rpm，培养24小时；
2)二级种子液的培养：将一级种子液按10％wt接种量转接到含有100ml YPD液体培养基的300ml锥形瓶中，30℃、摇床转速220rpm，培养8小时细胞OD600达到10，得到二级种子液；
3)将二级种子液按10％wt接种量转接至含有2L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵。
10.根据权利要求9所述的一种可提高虾青素生物合成产量的基因工程菌在虾青素生产上的应用，其特征在于：
所述步骤3)的详细过程是：将二级种子液按10％wt接种量转接至含有2L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵，初始培养基组成为30g/L酵母提取物、60g/L蛋白胨和100g/L葡萄糖，发酵温度30℃、搅拌速度300-800rpm、通气量4L/min、pH6.8和溶氧25％以上的条件下培养，培养到48小时一次补600g/L葡糖糖200ml，培养到72小时开始按10ml/小时流加补料600g/L葡萄糖直到240小时发酵结束。
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