CN113151340A - 一种提高β-胡萝卜素产量的基因工程菌及其应用 - Google Patents

一种提高β-胡萝卜素产量的基因工程菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113151340A
CN113151340A CN202011341160.4A CN202011341160A CN113151340A CN 113151340 A CN113151340 A CN 113151340A CN 202011341160 A CN202011341160 A CN 202011341160A CN 113151340 A CN113151340 A CN 113151340A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
carotene
beta
catalyzing
pyrophosphate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011341160.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113151340B (zh
Inventor
吴世林
***
祝重阳
江华峰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Wisdom Bio Technology Co ltd
Original Assignee
Guangzhou Wisdom Bio Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Wisdom Bio Technology Co ltd filed Critical Guangzhou Wisdom Bio Technology Co ltd
Priority to CN202011341160.4A priority Critical patent/CN113151340B/zh
Publication of CN113151340A publication Critical patent/CN113151340A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113151340B publication Critical patent/CN113151340B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1229—Phosphotransferases with a phosphate group as acceptor (2.7.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01088—Hydroxymethylglutaryl-CoA reductase (1.1.1.88)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y103/00—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C12Y103/99—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with other acceptors (1.3.99)
    • C12Y103/99031—Phytoene desaturase (lycopene-forming) (1.3.99.31)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/19—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with oxidation of a pair of donors resulting in the reduction of molecular oxygen to two molecules of water (1.14.19)
    • C12Y114/19001—Stearoyl-CoA 9-desaturase (1.14.19.1), i.e. DELTA9-desaturase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/0102—Diacylglycerol O-acyltransferase (2.3.1.20)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/03—Acyl groups converted into alkyl on transfer (2.3.3)
    • C12Y203/0301—Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase (2.3.3.10)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01001—Dimethylallyltranstransferase (2.5.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01029—Geranylgeranyl diphosphate synthase (2.5.1.29)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01032—15-Cis-phytoene synthase (2.5.1.32)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01036—Mevalonate kinase (2.7.1.36)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/04—Phosphotransferases with a phosphate group as acceptor (2.7.4)
    • C12Y207/04002—Phosphomevalonate kinase (2.7.4.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01033—Diphosphomevalonate decarboxylase (4.1.1.33), i.e. mevalonate-pyrophosphate decarboxylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/02—Aldehyde-lyases (4.1.2)
    • C12Y401/02009—Phosphoketolase (4.1.2.9)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/02—Aldehyde-lyases (4.1.2)
    • C12Y401/02022—Fructose-6-phosphate phosphoketolase (4.1.2.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y502/00—Cis-trans-isomerases (5.2)
    • C12Y502/01—Cis-trans-Isomerases (5.2.1)
    • C12Y502/01013—Prolycopene isomerase (5.2.1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
    • C12Y503/03—Intramolecular oxidoreductases (5.3) transposing C=C bonds (5.3.3)
    • C12Y503/03002—Isopentenyl-diphosphate DELTA-isomerase (5.3.3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y604/00—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4)
    • C12Y604/01—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4.1)
    • C12Y604/01002—Acetyl-CoA carboxylase (6.4.1.2)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种提高β‑胡萝卜素产量的基因工程菌及其应用，所述基因工程菌中包含β‑胡萝卜素合成途径相关基因、磷酸转酮酶途径相关基因和脂滴合成途径相关基因，涵盖了β‑胡萝卜素的合成途径；并增加了磷酸转酮酶途径，减少了碳素损失，使碳源更多地生成合成β‑胡萝卜素的前体物质乙酰辅酶A；又增加了还原力物质NADPH和能量物质ATP的供给；还增加了脂滴合成途径，可以通过提高胞内脂滴含量和体积，来增加β‑胡萝卜素的存储。该基因工程菌的β‑胡萝卜素最高产量达到7.8g/L，显著提高了β‑胡萝卜素的产量。

Description

一种提高β-胡萝卜素产量的基因工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程及发酵工程领域，具体涉及一种可提高β-胡萝卜素生物合成产量的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
β-胡萝卜素是由8个异戊二烯单元经非饱和碳键连接而成的四萜化合物，具有优越的生理功能，被广泛应用于医药保健品、食品添加剂、化妆品和饲料添加剂等行业中。
β-胡萝卜素的制备主要依赖化学合成。不同于天然β-胡萝卜素为反式构型和顺式构型的混合物，化学合成的β-胡萝卜素几乎全为反式构型，这种结构大大降低了人体对β-胡萝卜素的吸收率，另外化学合成法工艺流程复杂、能耗高、污染大。微生物发酵法是指通过发酵培养产β-胡萝卜素的微生物菌株，然后分离提纯得到β-胡萝卜素的方法。相比之下，微生物发酵法不受原料限制、生产条件温和、生产过程绿色环保，具有很大的优势。微生物主要合成路径是首先通过脱氧木酮糖磷酸途径(MEP)或甲羟戊酸途径(MVA)途径合成异戊二烯焦磷酸 (IPP)，再经过异构酶(idi)作用生成二甲基丙烯焦磷酸(DAMPP)，IPP和DAMPP在香叶基焦磷酸合酶催化下缩合成香叶基焦磷酸(GPP)，后者在法尼酰基焦磷酸合酶催化下结合一分子 IPP形成法尼酰基焦磷酸(FPP)，FPP在双香叶基焦磷酸合酶(crtE)的催化下再结合一分子IPP 形成双香叶基焦磷酸(GGPP)。最后在茄红素合酶(crtB)、茄红素脱氢酶(crtI)和番茄红素环化酶(crtY)的催化下经过茄红素、番茄红素形成β-胡萝卜素。
微生物发酵生产β-胡萝卜素最大的瓶颈在于如何实现工业化，而工业化的必要条件是其产量必须满足可以工业化水平。虽然目前有很多利用遗传改造微生物工程菌合成β-胡萝卜素的报道，但是这些改造只强化从乙酰辅酶A经甲羟戊酸到β-胡萝卜素这一代谢通路的基因表达，而没有考虑碳源利用、还原力供给、终产物的存储这些短板问题，导致无法进一步突破产量以满足工业生成的要求。
发明内容
本发明的第一个目的，在于针对现有技术中β-胡萝卜素碳源利用、还原力供给、终产物的存储的技术不足，提供一种核酸分子。
本发明的第二个目的，在于提供一种表达***，含有上述的核酸分子。
本发明的第三个目的，在于提供一种细胞，含有上述的表达***。
本发明的第四个目的，提供一种重组工程菌，保藏编号为CCTCC NO：M 2020606，其命名为ZTQ5320，于2020年10月19日保藏于CCTCC-中国典型培养物保藏中心；地址：中国.武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，邮编：430072)；保藏号为CCTCC NO： M2020606，分类命名为解脂耶氏酵母ZTQ5320(Yarrowia lipolytica ZTQ5320)。
本发明的第五个目的，在于提供一种生产β-胡萝卜素的方法，通过发酵培养上述的细胞，提取细胞中的β-胡萝卜素。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种核酸分子，包含有以下基因的核酸序列：
(Ⅰ)β-胡萝卜素合成途径相关基因；
(Ⅱ)磷酸转酮酶途径相关基因；
(Ⅲ)脂滴合成途径相关基因。
进一步地，根据本发明第一个方面所述的核酸分子，所述脂滴合成途径相关基因包括以下基因的至少一种：
(1)乙酰辅酶A酸化酶基因ACC1；
(2)二酰基甘油酰基转移酶基因DAG1；
(3)Δ-9硬脂酰辅酶A去饱和酶基因SCD；
(4)介导脂滴融合的脂肪存储诱导跨膜蛋白基因FIT。
优选地，根据本发明第一个方面所述的核酸分子，所述脂滴途径相关基因为来源于解脂耶氏酵母W29的ACC1、DGA1、SCD和FIT的至少一种。
更优选地，根据本发明第一个方面所述的核酸分子，所述脂滴途径相关基因为来源于解脂耶氏酵母W29的ACC1、DGA1、SCD和FIT。
更具体地，所述的脂滴途径相关基因优选为来源于解脂耶氏酵母W29的ACC1(CP028450.1:1555944-1562432)、DGA1(CP028452.1:3883639-3885183)、SCD(CP028450.1:745375-746823)和FIT(CP028450.1:3104019-3105197)。
在本发明的部分实施中，选用的重组工程菌为解脂耶氏酵母，解脂耶氏酵母为产酯酵母，自然情况下，其细胞内不会产生大的脂滴，选用来源于解脂耶氏酵母ACC1、DGA1、SCD 和FIT基因，能最大提升解脂耶氏酵母中脂滴的含量以及β-胡萝卜素的储存量。
根据本发明第一个方面所述的核酸分子，所述β-胡萝卜素合成途径相关基因包括以下基因的至少一种：
(1)催化乙酰辅酶A缩合成乙酰乙酰辅酶A的基因AtoB；
(2)催化乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A缩合成HMG-CoA的基因HMGS；
(3)催化HMG-CoA还原为甲羟戊酸的基因tHMGR；
(4)催化甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸-5-磷酸的基因ERG12；
(5)催化甲羟戊酸-5-磷酸生成甲羟戊酸-5-焦磷酸的基因ERG8；
(6)催化甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧生成异戊二烯焦磷酸的基因ERG19；
(7)催化异戊二烯焦磷酸异构为二甲基烯丙基焦磷酸的基因IDI；
(8)催化异戊烯焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸生成法尼基焦磷酸的基因ERG20；
(9)催化法尼基焦磷酸结合一分子异戊二烯焦磷酸生成双香叶基焦磷酸的基因GGS1；
(10)催化茄红素脱氢生成番茄红素的基因CarB；
(11)催化两分子双香叶基焦磷酸生成茄红素以及催化番茄红素环化生成β-胡萝卜素的基因CarRP。
优选地，所述的β-胡萝卜素途径相关基因为来源于大肠杆菌BL21(DE3)的atoB、来源于解脂耶氏酵母W29的HMGS、tHMGR、ERG12、ERG8、ERG19、IDI、ERG20、GGS1、来源于卷枝毛霉的CarB和CarRP的至少一种。
更优选地，所述的β-胡萝卜素途径相关基因为来源于大肠杆菌BL21(DE3)的atoB、来源于解脂耶氏酵母W29的HMGS、tHMGR、ERG12、ERG8、ERG19、IDI、ERG20、GGS1、来源于卷枝毛霉的CarB和CarRP。
更具体地，所述的β-胡萝卜素途径相关基因为来源于大肠杆菌BL21(DE3)的 atoB(CP001509.3:2216470-2217654)、来源于解脂耶氏酵母W29的HMGS(CP028459.1: 3780129-3781469)、tHMGR(CP028452.1:571078-572577)、ERG12(CP028449.1: 2082357-2083706)、ERG8(CP028452.1:748052-746796)、ERG19(CP028453.1:818770-819933)、 IDI(CP028453.1:585662-584850)、ERG20(CP028452.1:673068-672034)、 GGS1(CP028451.1:2085775-2084792)和源于卷枝毛霉(Rhizomucor circinelloides)的 CarB(KJ999717.1)和CarRP(KJ999718.1)。
发明人的团队在早先的研究中发现，经摇瓶培养比较β-胡萝卜素产量，来源于卷枝毛霉的CarB和CarRP比来源于三孢布拉霉(Blakeslea trispora)的CarB和CarRA催化效率更高，因此选用来源于卷枝毛霉(Rhizomucor circinelloides)的CarB和CarRP。。
根据本发明第一个方面所述的核酸分子，所述磷酸转酮酶途径相关基因包括以下基因的至少一种：
(1)催化果糖6磷酸或木酮糖5磷酸生成乙酰磷酸的基因PK；
(2)催化乙酰磷酸生成乙酰辅酶A的基因PTA。
优选地，所述磷酸转酮酶途径相关基因为来源于肠膜明串珠菌的PK和来源于梭状芽孢杆菌的PTA中的至少一种。
更优选地，所述磷酸转酮酶途径相关基因为来源于肠膜明串珠菌的PK和来源于梭状芽孢杆菌的PTA。
更具体地，所述的磷酸转酮酶途径相关基因优选为以来源于肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的PK(CP000414.1:1936622-1934181)和来源于梭状芽孢杆菌(Clostridium kluyveri)的PTA(CP018335.1:1695414-1696415)。
发明人的团队在早先的研究中发现，经摇瓶培养比较β-胡萝卜产量，确定该组合的磷酸转酮酶途径能最大提升β-胡萝卜产量，因此选用上述组合。
优选地，根据本发明第一个方面所述的核酸分子，所述为了确保个基因可以在表达***或者重组细胞中高效表达，在每个基因的上游连接有启动子序列；
所选用的启动子序列包括但不限于：pTEF、pEXP、pFBA和pGPD。
更优选地，在每个基因的下游增加终止子序列。
本发明的第二个方面，提供一种表达***，包含有本发明第一个方面所述的核酸分子。
优选地，将所述核酸分子的基因拆解为若干组别，分别***于不同的表达载体中。
更优选地，为了确保个基因可以在表达***或者重组细胞中高效表达，在每个基因的上游添加启动子序列，下游增加终止子序列。
所选用的启动子序列包括但不限于：pTEF、pEXP、pFBA和pGPD。
在本发明的一个实施例中，将所述核酸分子的基因拆解6个组别，分别***于6个不同的表达载体中。
更具体地，质粒pZ1以pUC19为骨架载体，包含CarB、CarRP和GGS1基因；
质粒pZ2以pUC19为骨架载体，包含AtoB、HMGS、HMGR和ERG12基因；
质粒pZ3以pUC19为骨架载体，包含ERG8、ERG19、ERG20和IDI基因；
质粒pZ4以pUC19为骨架载体，包含PK和PTA基因；
质粒pZ5以pUC19为骨架载体，包含ACC1基因；
质粒pZ6以pUC19为骨架载体，包含DGA1、SCD和FIT基因。
更进一步地，所述的质粒pZ1、质粒pZ2、质粒pZ3、质粒pZ4、质粒pZ5、和质粒pZ6 分别都含有URA3尿嘧啶缺陷筛选基因。
本领域技术人员可以理解，采用其他的分组方式同样可以实现本发明的目的。
本发明的第三个方面，提供一种细胞，包含有本发明第一个方面所述的核酸分子或第二个方面所述的表达***。
进一步地，所述核酸分子***于所述细胞的基因组中。
更进一步地，所述核酸分子通过非同源性重组生物方式***于所述细胞的基因组中。
本领域技术人员可以理解，通过非同源性重组生物方式***于所述细胞的基因组中是为了得到更多可能稳定遗传的菌株，仅转化上述表达***同样可以实现本发明的目的。
此外，非同源性重组相比定点嵌入的方式，有几率获得多次嵌入的更高效的重组细胞或重组菌。
优选地，根据本发明第三个方面所述的细胞，所述细胞为酵母细胞。
更优选地，所述细胞为解脂耶氏酵母。
在本发明的一个实施例中，所述重组工程菌的构建方法为：通过非同源性重组方式将质粒pZ1、质粒pZ2、质粒pZ3、质粒pZ4、质粒pZ5、和质粒pZ6随机整合进解脂耶氏酵母基因组。
更具体地，上述重组工程菌的基因整合顺序是按照质粒pZ1、质粒pZ2、质粒pZ3、质粒pZ4、质粒pZ5、和质粒pZ6依次执行所得到的菌。
更进一步地，包括以下步骤：
S01.将质粒pZ1导入尿嘧啶合成缺陷的解脂耶氏酵母菌株Polf，筛选β-胡萝卜素产量最高的菌株完成第一轮菌株重组迭代；
S02.通过导入表达Cre酶的环状质粒Y-Cre切除URA3基因使第一代产β-胡萝卜素工程菌株恢复筛选标记，然后再次导入线性化的pZ2质粒并筛选高产β-胡萝卜素完成第二轮重组迭代；
S03.按照S02中相同的方法依次导入线性化的质粒pZ3、pZ4、pZ5和pZ6完成第三、第四、第五轮和第六轮重组迭代获得整合了pZ1、pZ2、pZ3、pZ4、pZ5和pZ6的重组菌。
本发明的第四个方面，提供一种重组工程菌，保藏编号为CCTCC NO：M 2020606，其命名为ZTQ5320，于2020年10月19日保藏于CCTCC-中国典型培养物保藏中心；地址：中国.武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，邮编：430072)；保藏号为CCTCC NO： M2020606，分类命名为解脂耶氏酵母ZTQ5320(Yarrowia lipolytica ZTQ5320)。
本发明的第五个方面，提供一种生产β-胡萝卜素的方法，通过培养本发明第三个方面所述的细胞，提取β-胡萝卜素；
或，通过发酵本发明第四个方面所述的重组工程菌，提取β-胡萝卜素。
具体地，重组工程菌的发酵方法包括以下步骤：
S1.一级种子液的培养；
S2.二级种子液的培养；
S3.二级种子液方法培养发酵。
更具体地，重组工程菌的发酵方法包括以下步骤：
S1.一级种子液的培养：将固体YPD平板上的重组菌株F5单菌落接种到含有20mlYPD 液体培养基的100ml锥形瓶中，28～32℃、摇床转速180～200rpm，培养24～48小时。
S2.二级种子液的培养：将步骤S1中得到的一级种子液按1％(wt)接种量转接到含有 100ml YPD液体培养基的300ml锥形瓶中，28～32℃、摇床转速180～200rpm，培养到细胞OD600达到10，得到二级种子液。
S3.将步骤S2中得到的二级种子液按10％(wt)接种量转接至含有1L发酵培养基的3L 发酵罐中进行发酵，初始培养基组成为30g/L酵母提取物、60g/L蛋白胨和50g/L葡萄糖，发酵温度28～32℃、搅拌速度300～800rpm、通气量大于2L/min、pH6.8和溶氧25％以上的条件下培养，以60％葡萄糖储液继续补料发酵。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种核酸分子，包含β-胡萝卜素合成途径相关基因；磷酸转酮酶途径相关基因和脂滴合成途径相关基因，涵盖了β-胡萝卜素的合成途径；并增加了磷酸转酮酶途径，减少了碳素损失，使碳源更多地生成合成β-胡萝卜素的前体物质乙酰辅酶A；又增加了还原力物质NADPH和能量物质ATP的供给；还增加了脂滴合成途径，可以通过提高胞内脂滴含量和体积，来增加β-胡萝卜素的存储。
本发明提供了一种表达***，包含β-胡萝卜素合成途径相关基因；磷酸转酮酶途径相关基因和脂滴合成途径相关基因的核酸分子，涵盖了β-胡萝卜素的合成途径；并增加了磷酸转酮酶途径，减少了碳素损失，使碳源更多地生成合成β-胡萝卜素的前体物质乙酰辅酶A；又增加了还原力物质NADPH和能量物质ATP的供给；还增加了脂滴合成途径，可以通过提高胞内脂滴含量和体积，来增加β-胡萝卜素的存储。
本发明提供了一种细胞，特别是酵母细胞，含有包含β-胡萝卜素合成途径相关基因；磷酸转酮酶途径相关基因和脂滴合成途径相关基因的表达***，可以在细胞内完成β-胡萝卜素合成，此外，增加的磷酸转酮酶途径，可以减少碳素损失，使碳源更多地生成合成β-胡萝卜素的前体物质乙酰辅酶A；还增加了还原力物质NADPH和能量物质ATP的供给；并且增加了脂滴合成途径，可以通过提高胞内脂滴含量和体积，提高β-胡萝卜素在胞内的存储。
本发明提供了一种提供一种重组工程菌，保藏编号为CCTCC NO：M 2020606，其命名为ZTQ5320，于2020年10月19日保藏于CCTCC-中国典型培养物保藏中心；地址：中国. 武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，邮编：430072)；保藏号为CCTCC NO： M2020606，分类命名为解脂耶氏酵母ZTQ5320(Yarrowia lipolytica ZTQ5320)。含有包含β-胡萝卜素合成途径相关基因；磷酸转酮酶途径相关基因和脂滴合成途径相关基因的表达***，从原料供给、合成途径、储存途径各个方法提高β-胡萝卜素的产量。
本发明还提供了一种生产β-胡萝卜素的方法，通过培养/发酵含有包含β-胡萝卜素合成途径相关基因；磷酸转酮酶途径相关基因和脂滴合成途径相关基因的表达***的细胞或者重组工程菌，使β-胡萝卜素流加补料发酵产量显著提高到7.8g/L，具有很好的工业应用前景。
附图说明
图1磷酸转酮酶途径示意图。
图2胞内脂滴合成途径示意图。
图3质粒pZ1示意图。
图4质粒pZ2示意图。
图5质粒pZ3示意图。
图6质粒pZ4示意图。
图7质粒pZ5示意图。
图8质粒pZ6示意图。
图9每轮迭代β-胡萝卜素产率最高的菌株产率图。
图10整合β-胡萝卜素途径和整合了磷酸转酮酶途径以及整合了磷酸转酮酶途径加脂滴途径菌株β-胡萝卜素发酵产量图。
具体实施方式
以下结合具体的实施例及附图对本发明的内容作进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
解脂耶氏酵母菌株为Polf(ATCC编号MAY-2613；基因型MATA ura3-302 leu2-270xpr-322 axp2-deltaNU49 XPR2::SUC2,购自ATCC)，所用限制性内切酶购自ThermoFisher公司，质粒提取及胶回收所用试剂盒购自美国OMEGA公司，PCR及无缝克隆所用试剂、分子克隆用大肠杆菌(DH5α)均购自南京诺唯赞生物科技有限公司，操作步骤按照产品说明书进行。
β-胡萝卜素测定方法：
(1)取1mL菌液离心去上清，沉淀重悬于0.7mL DMSO中。
(2)55℃孵育10min以后添加等体积丙酮0.7mL。
(3)45℃孵育15min，12000rpm离心5min。
(4)上清转移至一个新EP管，HPLC在450nm检测胡萝卜素产量(标样溶于丙酮作标准曲线)。
实施例1基因选择与载体构建
乙酰辅酶A是微生物合成脂肪酸、有机酸和萜类的重要前体物质，但是大部分微生物菌株天然合成乙酰辅酶A的途径会导致碳素的损失。磷酸转酮酶途径(如图1所示)的磷酸转酮酶(PK)和磷酸乙酰转移酶(PTA)能催化6-磷酸果糖(F6P)或5-磷酸木酮糖(X5P)生成乙酰辅酶A，过程不生成二氧化碳，没有碳素丢失，还产出ATP和NADPH，为细胞合成代谢提供能量和还原力。
脂滴(lipid droplets,LD)是广泛存在于细胞内的一种由单层磷脂膜包被中性脂的细胞器。脂滴是通过乙酰辅酶A在ACC1催化下生成丙二酰辅酶A，后者在FAS作用下生成棕榈酰辅酶A和硬脂酰辅酶A，这两种饱和脂肪酸在SCD作用下生成油酰辅酶A，再经过DGA1转酰基生成甘油三脂进入脂滴，脂滴再经过融合生成大脂滴，如图2所示。微生物菌株为了减少番茄红素、β-胡萝卜素以及虾青素等疏水性类胡萝卜素对细胞造成的伤害，会将这些疏水性类胡萝卜素存储在细胞的脂滴内，
因此，发明人想到利用增加脂滴的含量和体积来提高疏水性化合物在胞内的存储，达到增加β-胡萝卜素产量的目的。
发明人筛选出含有β-胡萝卜素合成途径、磷酸转酮酶途径和脂滴合成途径相关基因。
其中，β-胡萝卜素途径相关基因包括(1)催化乙酰辅酶A缩合成乙酰乙酰辅酶A的基因AtoB、(2)催化乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A缩合成HMG-CoA的基因HMGS、(3)催化HMG-CoA还原为甲羟戊酸的基因tHMGR、(4)催化甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸-5-磷酸的基因ERG12、(5)催化甲羟戊酸-5-磷酸生成甲羟戊酸-5-焦磷酸的基因ERG8、(6)催化甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧生成异戊二烯焦磷酸的基因ERG19、(7)催化异戊二烯焦磷酸异构为二甲基烯丙基焦磷酸的基因IDI、(8)催化异戊烯焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸生成法尼基焦磷酸的基因ERG20、(9)催化法尼基焦磷酸结合一分子异戊二烯焦磷酸生成双香叶基焦磷酸的基因GGS1、(10)催化茄红素脱氢生成番茄红素的基因CarB和(11)催化两分子双香叶基焦磷酸生成茄红素以及催化番茄红素环化生成β-胡萝卜素的基因CarRP。
β-胡萝卜素途径相关基因优选为来源于大肠杆菌BL21(DE3)的 atoB(CP001509.3:2216470-2217654)、来源于解脂耶氏酵母W29的HMGS(CP028459.1: 3780129-3781469)、tHMGR(CP028452.1:571078-572577)、ERG12(CP028449.1: 2082357-2083706)、ERG8(CP028452.1:748052-746796)、ERG19(CP028453.1:818770-819933)、 IDI(CP028453.1:585662-584850)、ERG20(CP028452.1:673068-672034)、 GGS1(CP028451.1:2085775-2084792)和源于卷枝毛霉(Rhizomucor circinelloides)的 CarB(KJ999717.1)和CarRP(KJ999718.1)。
发明人的团队在早先的研究中发现，经摇瓶培养比较β-胡萝卜素产量，来源于卷枝毛霉的CarB和CarRP比来源于三孢布拉霉(Blakeslea trispora)的CarB和CarRA催化效率更高，因此选用来源于卷枝毛霉(Rhizomucor circinelloides)的CarB和CarRP。
磷酸转酮酶途径相关基因包括(1)催化果糖6磷酸或木酮糖5磷酸生成乙酰磷酸的基因 PK和(2)催化乙酰磷酸生成乙酰辅酶A的基因PTA。
磷酸转酮酶途径相关基因优选为以来源于肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)的 PK(CP000414.1:1936622-1934181)和来源于梭状芽孢杆菌(Clostridium kluyveri)的PTA (CP018335.1:1695414-1696415)。
发明人的团队在早先的研究中发现，经摇瓶培养比较β-胡萝卜产量，确定该组合的磷酸转酮酶途径能最大提升β-胡萝卜产量，因此选用上述组合。
脂滴合成途径相关基因包括(1)乙酰辅酶A酸化酶基因ACC1、(2)二酰基甘油酰基转移酶基因DAG1、(3)Δ-9硬脂酰辅酶A去饱和酶基因SCD和(4)介导脂滴融合的脂肪存储诱导跨膜蛋白基因FIT。
脂滴途径相关基因优选为来源于解脂耶氏酵母W29的 ACC1(CP028450.1:1555944-1562432)、DGA1(CP028452.1:3883639-3885183)、 SCD(CP028450.1:745375-746823)和FIT(CP028450.1:3104019-3105197)。
选用来源于解脂耶氏酵母ACC1、DGA1、SCD和FIT基因，能最大提升解脂耶氏酵母中脂滴的含量以及β-胡萝卜素的储存量。
设计引物克隆上述基因，引物序列如表1所示。
表1引物列表
Figure RE-GDA0003108223420000091
Figure RE-GDA0003108223420000101
Figure RE-GDA0003108223420000111
构建质粒pZ1、质粒pZ2、质粒pZ3、质粒pZ4、质粒pZ5、和质粒pZ6。
为了确保个基因可以在载体或者重组细胞中高效表达，在每个基因的上游添加启动子序列，下游增加终止子序列。选用的启动子序列包括但不限于：pTEF、pEXP、pFBA和pGPD。
质粒pZ1以pUC19为骨架载体，包含CarB、CarRP和GGS1基因，启动子分别为pTEF、pEXP和pFBA，终止子分别为CYC1、tICL和tLIP；pZ1不含骨架载体的序列如SEQ ID NO.55 所示，质粒图谱如附图3所示。
质粒pZ2以pUC19为骨架载体，包含AtoB、HMGS、HMGR和ERG12基因，启动子分别为pTEF、pGPD、pFBA和pEXP，终止子分别为CYC1、tXPR2、tLIP和tICL；pZ2不含骨架载体的序列如SEQ ID NO.56所示；质粒图谱如附图4所示。
质粒pZ3以pUC19为骨架载体，包含ERG8、ERG19、ERG20和IDI基因，启动子分别为pGPD、pTEF、pFBA和pEXP，终止子分别为tXPR2、CYC1、tLIP和tICL；pZ3不含骨架载体的序列如SEQ ID NO.57所示；质粒图谱如附图5所示。
质粒pZ4以pUC19为骨架载体，包含PK和PTA基因，启动子分别为pTEF和pEXP，终止子分别为CYC1和tXPR2；pZ4不含骨架载体的序列如SEQ ID NO.58所示；质粒图谱如附图6所示。
质粒pZ5以pUC19为骨架载体，包含ACC1基因，启动子为pFBA，终止子为CYC1； pZ5不含骨架载体的序列如SEQ ID NO.59所示；质粒图谱如附图7所示。
质粒pZ6以pUC19为骨架载体，包含DGA1、SCD和FIT基因，启动子分别为pTEF、 pEXP和pFBA，终止子分别为CYC1、tICL和tLIP；pZ6不含骨架载体的序列如SEQ ID NO.60 所示；质粒图谱如附图8所示。
质粒pZ1、质粒pZ2、质粒pZ3、质粒pZ4、质粒pZ5、和质粒pZ6分别都含有URA3 尿嘧啶缺陷筛选基因(SEQ ID NO.61)，且URA3基因的上下游分别***了同向的loxP序列，其中上游lopP碱基序列为5'-ATCGCTTCGGATAACTCCTGCTATACGAAGTTAT-3'(SEQ ID NO.62)，下游lopP序列为5'-ATAACTTCGTATGATGTATGCTATACGAAGTTAT-3'(SEQ ID NO.63)。
具体来说，质粒骨架pUC19URA3构建
用引物loxP-URA3-F/loxP-URA3-R以解脂耶氏酵母Polf基因组DNA为模板扩增URA3 基因，再以PCR产物为模板，用引物pUC19-URA3-F/pUC19-URA3-R扩增URA3基因片段；质粒pUC19用内切酶NdeⅠ和KpnⅠ双酶切，再用无缝克隆(诺唯赞ClonExpress Ultra OneStep Cloning Kit)将URA3基因片段克隆到pUC19的NdeⅠ和KpnⅠ之间构建质粒骨架pUC19URA3。
质粒pZ1构建
分别用引物pUC19-pTEF-F/pTEF-R、pEXP-F/pEXP-R、pFBA-F/pFBA-R、tICL-F/pFBA-tICL-R和tLIP-F/pUC19-tLIP-R以解脂耶氏酵母Polf基因组DNA为模板扩增pTEF、pEXP、pFBA、tICL和tLIP片段；用引物CYC1-F/pEXP-CYC1-R以酿酒酵母CEN.PK2-1C 基因组DNA为模板扩增CYC1片段。来源于卷枝毛霉(Rhizomucor circinelloides)的CarB基因和CarRP基因为南京金斯瑞科技有限公司经密码子优化后基因合成，分别用引物 pTEF-CarB-F/tCYC1-CarB-R和pEXP-CarRP-F/tICL-CarRP-R以合成的基因为模板扩增CarB 和CarRP片段；用引物pFBA-GGS1-F/tLIP-GGS1-R以解脂耶氏酵母基因组DNA为模板扩增 GGS1片段。
用overlap PCR将启动子、基因和终止子拼接成pTEF-CarB-CYC1、pEXP-CarRP-tICL和 pFBA-GGS1-tLIP三个表达框，将质粒骨架pUC19URA3用BamHⅠ和HindⅢ双酶切纯化回收，再利用无缝克隆(诺唯赞ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit)将酶切质粒骨架和三个表达框组装构建质粒pZ1。
质粒pZ2构建
分别用引物pUC19-pEXP-F/pEXP-R、pFBA-F/pFBA-R、pGPD-F/pGPD-R、pTEF-F/pTEF-R、tICL-F/pFBA-tICL-R、tLIP-F/pGPD-tLIP-R、tXPR2-F/pTEF-tXPR2-R、pEXP-ERG12-F /tICL-ERG12-R、pFBA-HMGR-F/tLIP-HMGR-R和pGPD-HMGS-F/tXPR2-HMGS-R以解脂耶氏酵母Polf基因组DNA为模板扩增pEXP、pFBA、pGPD、pTEF、tICL、tLIP、tXPR2、ER G12、HMGR和HMGS片段；用引物CYC1-F/pUC19-CYC1-R以酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组DNA为模板扩增CYC1片段；用引物pTEF-AtoB-F/CYC1-AtoB-R以大肠杆菌BL21(DE 3)基因组DNA为模板扩增AtoB片段。
用overlap PCR将启动子、基因和终止子拼接成pEXP-ERG12-tICL、pFBA-HMGR-tLIP、 pGPD-HMGS-tXPR2和pTEF-AtoB-CYC1四个表达框，将质粒骨架pUC19URA3用BamHⅠ和HindⅢ双酶切纯化回收，再利用无缝克隆(诺唯赞ClonExpress Ultra One Step CloningKit) 将酶切质粒骨架和四个表达框组装构建质粒pZ2。
质粒pZ3构建
分别用引物pUC19-pGPD-F/pGPD-R、pGPD-ERG8-F/tXPR2-ERG8-R、tXPR2-F/pTEF-tX PR2-R、pTEF-F/pTEF-R、pTEF-ERG19-F/CYC1-ERG19-R、pEXP-F/pEXP-R、pEXP-IDI-F/tICL-IDI-R、tICL-F/pFBA-tICL-R、pFBA-F/pFBA-R、pFBA-ERG20-F/tLIP-ERG20-R和tLIP-F/pUC19-tLIP-R以解脂耶氏酵母Polf基因组DNA为模板扩增pGPD、ERG8、tXPR2、pTEF、 ERG19、pEXP、IDI、tICL、pFBA、ERG20和tLIP片段；用引物CYC1-F/pEXP-CYC1-R以酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组DNA为模板扩增CYC1片段。
用overlap PCR将启动子、基因和终止子拼接成pGPD-ERG8-tXPR2、pTEF-ERG19-CYC1、 pEXP-IDI-tICL和pFBA-ERG20-tLIP四个表达框，将质粒骨架pUC19URA3用BamHⅠ和HindⅢ双酶切纯化回收，再利用无缝克隆(诺唯赞ClonExpress Ultra One Step CloningKit)将酶切质粒骨架和四个表达框组装构建质粒pZ3。
质粒pZ4构建
分别用引物pUC19-pTEF-F/pTEF-R、pEXP-F/pEXP-R和tXPR2-F/pUC19-tXPR2-R以解脂耶氏酵母Polf基因组DNA为模板扩增pTEF、pEXP和tXPR2片段；用引物CYC1-F/pEX P-CYC1-R以酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组DNA为模板扩增CYC1片段；来源于肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的PKT和来源于梭状芽孢杆菌(Clostridium kluyveri)的PTA为南京金斯瑞科技有限公司经密码子优化后基因合成，分别用引物pTEF-PK-F/CYC1-PK-R和pEXP-PTA-F/tXPR2-PTA-R以合成的基因为模板扩增PK和PTA片段。
用overlap PCR将启动子、基因和终止子拼接成pTEF-PK-CYC1和pEXP-PTA-tXPR2两个表达框，将质粒骨架pUC19URA3用BamHⅠ和HindⅢ双酶切纯化回收，再利用无缝克隆(诺唯赞ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit)将酶切质粒骨架和两个表达框组装构建质粒p Z4。
质粒pZ5构建
分别用引物pUC19-pFBA-F/pFBA-R和pFBA-ACC1-F/CYC1-ACC1-R以解脂耶氏酵母Polf基因组DNA为模板扩增启动子pFBA和ACC1基因片段，用引物ACC1-CYC1-F/pUC19- CYC1-R以酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组DNA为模板扩增终止子CYC1。
将质粒骨架pUC19URA3用BamHⅠ和HindⅢ双酶切纯化回收，再利用无缝克隆(诺唯赞 ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit)将酶切质粒骨架、启动子pFBA、ACC1基因CDS 区和终止子CYC1组装构建质粒pZ5。
质粒pZ6构建
分别用引物pUC19-pTEF-F/pTEF-R、pEXP-F/pEXP-R和pFBA-F/pFBA-R以解脂耶氏酵母Polf基因组DNA为模板扩增启动子pTEF、pEXP和pFBA；用引物CYC1-F/pEXP-CYC1- R以酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组DNA为模板扩增终止子CYC1；用引物tICL-F/pFBA-tICL -R和tLIP-F/pUC19-tLIP-R以解脂耶氏酵母Polf基因组DNA为模板扩增终止子tICL和tLIP；分别用引物pTEF-DGA1-F/CYC1-DGA1-R、pEXP-SCD-F/tICL-SCD-R和pFBA-FIT-F/tLIP-FI T-R以解脂耶氏酵母Polf基因组DNA为模板扩增DGA1、SCD和FIT三个基因片段；
用overlap PCR将启动子、基因和终止子拼接成pTEF-DGA1-CYC1、pEXP-SCD-tICL和 pFBA-FIT-tLIP三个表达框，将质粒骨架pUC19URA3用BamHⅠ和HindⅢ双酶切纯化回收，再利用无缝克隆(诺唯赞ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit)将酶切质粒骨架和三个表达框组装构建质粒pZ6。
本领域技术人员可以理解，通过非同源性重组生物方式***于所述细胞的基因组中是为了得到更多可能稳定遗传的菌株，仅转化上述表达***同样可以实现本发明的目的。
此外，非同源性重组相比定点嵌入的方式，有几率获得多次嵌入的更高效的重组细胞或重组菌，从而进一步提高重组细胞或重组菌的生产效率。
实施例2高产β-胡萝卜素整合菌株的构建
重组工程菌是通过非同源性重组方式将质粒pZ1、质粒pZ2、质粒pZ3、质粒pZ4、质粒pZ5、和质粒pZ6随机整合进解脂耶氏酵母基因组；包括以下步骤：
(1)将构建好的重组质粒pZ1用NotⅠ切除原pUC19骨架部分使线性化后导入尿嘧啶合成缺陷的解脂耶氏酵母菌株Polf，检测β-胡萝卜素产量最高的菌株完成第一轮菌株重组迭代。
(2)通过导入表达Cre酶的环状质粒Y-Cre切除URA3基因使第一代产β-胡萝卜素工程菌株恢复筛选标记，然后再次导入线性化的pZ2质粒并筛选高产β-胡萝卜素完成第二轮重组迭代。
(3)按照步骤(2)中相同的方法依次导入线性化的质粒pZ3、pZ4、pZ5和pZ6完成第三、第四、第五轮和第六轮重组迭代获得整合了pZ1、pZ2、pZ3、pZ4、pZ5和pZ6的重组菌。
具体来说：将质粒pZ1用NotⅠ酶切胶回收含有β-胡萝卜素合成基因的片段通过醋酸锂法转化解脂耶氏酵母Polf,涂布SD-URA缺陷培养基，2～3天后挑取橙红颜色最深的60个转化子接入10ml液体YPD40培养基，200rpm、30℃培养72小时，在二次培养的60个转化子中筛选出橙红颜色最深的三个样品检测β-胡萝卜素产量，获得产率最高的菌株ZTQ01。
将质粒pZ2用NotⅠ酶切胶回收含有β-胡萝卜素合成基因的片段通过醋酸锂法转化解脂耶氏酵母ZTQ01,涂布SD-URA缺陷培养基，2-3天后挑取橙红颜色最深的60个转化子接入10 ml液体YPD40培养基，200rpm、30℃培养72小时，在二次培养的60个转化子中筛选出橙红颜色最深的三个样品检测β-胡萝卜素产量，获得产率最高的菌株ZTQ21。
将质粒pZ3用NotⅠ酶切胶回收含有β-胡萝卜素合成基因的片段通过醋酸锂法转化解脂耶氏酵母ZTQ21,涂布SD-URA缺陷培养基，2-3天后挑取橙红颜色最深的60个转化子接入10 ml液体YPD40培养基，200rpm、30℃培养72小时，在二次培养的60个转化子中筛选出橙红颜色最深的三个样品检测β-胡萝卜素产量，获得产率最高的菌株ZTQ211。
将质粒pZ4用NotⅠ酶切胶回收含有β-胡萝卜素合成基因的片段通过醋酸锂法转化解脂耶氏酵母ZTQ211,涂布SD-URA缺陷培养基，2-3天后挑取橙红颜色最深的60个转化子接入1 0ml液体YPD40培养基，200rpm、30℃培养72小时，在二次培养的60个转化子中筛选出橙红颜色最深的三个样品检测β-胡萝卜素产量，获得产率最高的菌株ZTQ30。
将质粒pZ5用NotⅠ酶切胶回收含有β-胡萝卜素合成基因的片段通过醋酸锂法转化解脂耶氏酵母ZTQ30,涂布SD-URA缺陷培养基，2-3天后挑取橙红颜色最深的60个转化子接入10 ml液体YPD40培养基，200rpm、30℃培养72小时，在二次培养的60个转化子中筛选出橙红颜色最深的三个样品检测β-胡萝卜素产量，获得产率最高的菌株ZTQ320。
将质粒pZ6用NotⅠ酶切胶回收含有β-胡萝卜素合成基因的片段通过醋酸锂法转化解脂耶氏酵母ZTQ320,涂布SD-URA缺陷培养基，2-3天后挑取橙红颜色最深的60个转化子接入 10ml液体YPD40培养基，200rpm、30℃培养72小时，在二次培养的60个转化子中筛选出橙红颜色最深的三个样品检测β-胡萝卜素产量，获得产率最高的菌株ZTQ5320。
每一轮基因整合迭代获得β-胡萝卜素产率最高的三个菌株产率如图9所示，最终筛选得到产率最高的菌株ZTQ5320。
ZTQ5320于2020年10月19日保藏于CCTCC-中国典型培养物保藏中心；地址：中国.武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，邮编：430072)；保藏号为CCTCC NO： M2020606，分类命名为解脂耶氏酵母ZTQ5320(Yarrowia lipolytica ZTQ5320)。
实施例3工业发酵试验
将实施例2中构建得到的基因工程菌ZTQ211、ZTQ30和ZTQ5320在3L发酵罐中进行高密度发酵后，检测β-胡萝卜素单位产量。
发酵方法包括以下步骤：
S1.一级种子液的培养：将固体YPD平板上的重组菌株F5单菌落接种到含有20mlYPD 液体培养基的100ml锥形瓶中，30℃、摇床转速200rpm，培养48小时。
S2.将步骤S1中得到的一级种子液按1％(wt)接种量转接到含有100mlYPD液体培养基的300ml锥形瓶中，30℃、摇床转速200rpm，培养10小时细胞OD600达到10，得到二级种子液。
S3.将步骤S2中得到的二级种子液按10％(wt)接种量转接至含有1L发酵培养基的3L 发酵罐中进行发酵，初始培养基组成为30g/L酵母提取物、60g/L蛋白胨和50g/L葡萄糖，发酵温度30℃、搅拌速度300-800rpm、通气量2L/min、pH6.8和溶氧25％以上的条件下培养，培养12小时开始以60％葡萄糖储液继续补料发酵264小时。
3种基因工程菌ZTQ211、ZTQ30和ZTQ5320中β-胡萝卜素单位产量结果如图10所示，导入磷酸转酮酶途径和强化脂滴途径的菌株ZTQ5320比ZTQ211产量增加了69％，β-胡萝卜素最高产量达到7.8g/L，显著提高了β-胡萝卜素的产量。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州智特奇生物科技股份有限公司
<120> 一种提高β-胡萝卜素产量的基因工程菌及其应用
<130>
<160> 63
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atcgcttcgg ataactcctg ctatacgaag ttatacgaat tcgcgcccag agagccattg 60
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ataacttcgt atagcataca tcatacgaag ttattctgaa ttccgagaaa cacaacaaca 60
tgc 63
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
attgtactga gagtgcacca gcggccgcat cgcttcggat aactcctg 48
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aggtcgactc tagaggatcc ccggataact tcgtatagca tacat 45
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgtatgcta tacgaagtta tccgggagag accgggttgg cggcg 45
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctgcggttag tactgcaaaa 20
<210> 7
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
actttttgca gtactaaccg cagatttatg tccaagaagc acattgt 47
<210> 8
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gcgtgacata actaattaca tgaattttta gatgacgtta gagttg 46
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tcatgtaatt agttatgtca cgc 23
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cgggcgccaa actccgcgat gcaaattaaa gccttcgagc 40
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ggagtttggc gcccgttttt 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tgctgtagat atgtcttgtg 20
<210> 13
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cacaagacat atctacagca tttatgctgc tgacctacat gg 42
<210> 14
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aatatatttt gctaaacaaa ctgcattttt agatggtgtt caggtttcgc 50
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gcagtttgtt tagcaaaata 20
<210> 16
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ccatttattg ttgggtgcag tttaaactgt atgattgatg ttactac 47
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tgcacccaac aataaatggg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ctgggttagt ttgtgtagag 20
<210> 19
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ctctctacac aaactaaccc agatggatta taacagcgcg ga 42
<210> 20
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gttgtaaaga gtgataaata gcgtcactgc gcatcctcaa agt 43
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gctatttatc actctttaca 20
<210> 22
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ctttttgcag tactaaccgc agatggctga cttcgactct aa 42
<210> 23
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gacataacta attacatgat tacttcaatg gagaccaagt c 41
<210> 24
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
cacacaagac atatctacag caatgaagtt gatggaaaac atc 43
<210> 25
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gggacaggcc atggaggtac ttaaccttga gcttgagctt g 41
<210> 26
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
tgaccatgat tacgccagcg gccgccatct cacttgcgta tgtat 45
<210> 27
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
ctatgaccat gattacgcca gcggccgcga cccttcgtgg gtctcaat 48
<210> 28
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
tcggccgatt catttcaacc gcgatgaccc ttcgtgggtc tcaat 45
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
tgttgatgtg tgtttaattc 20
<210> 30
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
cttgaattaa acacacatca acagatgtcg caaccccaga ac 42
<210> 31
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
ggggacaggc catggaggta cgctactgct tgatctcgta ct 42
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
gtacctccat ggcctgtccc 20
<210> 33
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
ccgccaaccc ggtctctgtt taaaccatct cacttgcgta tgtatgg 47
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
gtttaaacag agaccgggtt ggcgg 25
<210> 35
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
ctttttgcag tactaaccgc agatttatga agaactgtgt catcgtg 47
<210> 36
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
cataactaat tacatgaatt tttagttcag tcgctcaatg acc 43
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
tcatgtaatt agttatgtca cgc 23
<210> 38
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
tatgaccatg attacgccag cggccgcaaa ttaaagcctt cgagc 45
<210> 39
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
tgtatgctat acgaagttat ccgggggttg aaatgaatcg gccga 45
<210> 40
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
gaattaaaca cacatcaaca gatgaccacc tattcggctc c 41
<210> 41
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
gggacaggcc atggaggtac gctacttgaa ccccttctcg 40
<210> 42
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
tgcagtacta accgcagatt tatgatccac caggcctcca c 41
<210> 43
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
gacataacta attacatgaa tttctacttg ctgttcttca gag 43
<210> 44
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
caagacatat ctacagcatt tatgacgacg tcttacagcg a 41
<210> 45
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
tttgctaaac aaactgcatt tctacttgat ccaccgccg 39
<210> 46
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
ctctacacaa actaacccag atgtccaagg cgaaattcg 39
<210> 47
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
gtaaagagtg ataaatagcg ctacttctgt cgcttgtaaa 40
<210> 48
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
gaattaaaca cacatcaaca atgactatcg actcacaata c 41
<210> 49
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
gtaaagagtg ataaatagct tactcaatca ttcggaactc 40
<210> 50
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
ccgccaaccc ggtctctgtt taaacgaccc ttcgtgggtc tcaat 45
<210> 51
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
ctttttgcag tactaaccgc agatggtgaa aaacgtggac ca 42
<210> 52
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
cgtgacataa ctaattacat gactaagcag ccatgccaga ca 42
<210> 53
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
ctacacaaac taacccagat gtctagcaaa tggtttaatg 40
<210> 54
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
gtaaagagtg ataaatagcg tcatactgga cgtagcgcg 39
<210> 55
<211> 9527
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
ggccgcatcg cttcggataa ctcctgctat acgaagttat acgcgcccag agagccattg 60
acgttctttc taatttggac cgatagccgt atagtccagt ctatctataa gttcaactaa 120
ctcgtaacta ttaccataac atatacttca ctgccccaga taaggttccg ataaaaagtt 180
ctgcagacta aatttatttc agtctcctct tcaccaccaa aatgccctcc tacgaagctc 240
gagctaacgt ccacaagtcc gcctttgccg ctcgagtgct caagctcgtg gcagccaaga 300
aaaccaacct gtgtgcttct ctggatgtta ccaccaccaa ggagctcatt gagcttgccg 360
ataaggtcgg accttatgtg tgcatgatca agacccatat cgacatcatt gacgacttca 420
cctacgccag cactgtgctc cccctcaagg aacttgctct taagcacggt ttcttcctgt 480
tcgaggacag aaagttcgca gatattggca acactgtcaa gcaccagtac aagaacggtg 540
tctaccgaat cgccgagtgg tccgatatca ccaacgccca cggtgtaccc ggaaccggaa 600
tcattgctgg cctgcgagct ggtgccgagg aaactgtctc tgaacagaag aaggaggacg 660
tctctgacta cgagaactcc cagtacaagg agttcctggt cccctctccc aacgagaagc 720
tggccagagg tctgctcatg ctggccgagc tgtcttgcaa gggctctctg gccactggcg 780
agtactccaa gcagaccatt gagcttgccc gatccgaccc cgagtttgtg gttggcttcg 840
ttgcccagaa ccgacctaag ggcgactctg aggactggct tattctgacc cccggggtgg 900
gtcttgacga caagggagac gctctcggac agcagtaccg aactgttgag gatgtcatgt 960
ctaccggaac ggatatcata attgtcggcc gaggtctgta cggccagaac cgagatccta 1020
tcgaggaggc caagcgatac cagaaggctg gctgggaggc ttaccagaag attaactgtt 1080
agaggttaga ctatggatat gtaatttaac tgtgtatata gagagcgtgc aagtatggag 1140
cgcttgttca gcttgtatga tggtcagacg acctgtctga tcgagtatgt atgatactgc 1200
acaacctgtg tatccgcatg atctgtccaa tggggcatgt tgttgtgttt ctcgagaata 1260
acttcgtatg atgtatgcta tacgaagtta tgcgatcgca gagaccgggt tggcggcgta 1320
tttgtgtccc aaaaaacagc cccaattgcc ccaattgacc ccaaattgac ccagtagcgg 1380
gcccaacccc ggcgagagcc cccttcaccc cacatatcaa acctcccccg gttcccacac 1440
ttgccgttaa gggcgtaggg tactgcagtc tggaatctac gcttgttcag actttgtact 1500
agtttctttg tctggccatc cgggtaaccc atgccggacg caaaatagac tactgaaaat 1560
ttttttgctt tgtggttggg actttagcca agggtataaa agaccaccgt ccccgaatta 1620
cctttcctct tcttttctct ctctccttgt caactcacac ccgaaatcgt taagcatttc 1680
cttctgagta taagaatcat tcaaaatggt gagtttcaga ggcagcagca attgccacgg 1740
gctttgagca cacggccggg tgtggtccca ttcccatcga cacaagacgc cacgtcatcc 1800
gaccagcact ttttgcagta ctaaccgcag atttatgtcc aagaagcaca ttgtgatcat 1860
tggcgccggt gtcggcggca ccgctactgc tgctcgactg gctcgagagg gcttcaaggt 1920
gaccgtggtg gagaagaacg acttcggtgg tggtcgatgc tctctgattc accaccaggg 1980
ccaccgattc gaccagggcc cttccctgta cctgatgccc aagtacttcg aggacgcctt 2040
cgccgacctg gacgagcgaa ttcaggacca cctggagctg ctgcgatgcg acaacaacta 2100
caaggtccac ttcgacgacg gtgagtccat tcagctgtcc tctgacctga cccgaatgaa 2160
ggccgagctg gaccgagtcg agggccctct tggcttcggc cgattcctgg acttcatgaa 2220
ggagacccac atccactacg agtccggtac cctgatcgcc ctgaagaaga acttcgagtc 2280
tatctgggac ctgatccgaa tcaagtacgc ccccgagatt ttccgactgc acctgttcgg 2340
caagatctac gaccgagcct ccaagtactt caagaccaag aagatgcgaa tggccttcac 2400
cttccagacc atgtacatgg gtatgtctcc ctacgacgcc cccgccgtct actctctgct 2460
gcagtacacc gagttcgccg agggcatctg gtacccccga ggtggtttca acatggtggt 2520
ccagaagctg gaggccatcg ccaagcagaa gtacgacgcc gagttcatct ataacgcccc 2580
cgtcgccaag atcaacaccg acgacgccac caagcaggtc accggtgtca ccctggagaa 2640
cggtcacatt atcgacgccg acgccgtcgt ctgcaacgcc gatctggtct acgcctacca 2700
caacctgctg cccccctgtc gatggaccca gaacaccctg gcctccaaga agctgacctc 2760
ctcctccatc tctttctact ggtccatgtc caccaaggtc ccccagctgg acgtccacaa 2820
cattttcctg gccgaggcct accaggagtc cttcgacgag atcttcaagg acttcggtct 2880
gccctccgag gcctccttct acgtcaacgt cccctctcga atcgacccct ccgccgctcc 2940
tgacggaaag gactctgtca tcgtcctggt gcccattggc cacatgaagt ctaagaccgg 3000
tgacgcctct accgagaact accccgccat ggtcgacaag gcccgaaaga tggtcctggc 3060
cgtgattgag cgacgactgg gcatgtccaa cttcgccgac ctcatcgagc acgagcaggt 3120
caacgacccc gccgtgtggc agtccaagtt caacctgtgg cgaggttcta ttctgggtct 3180
gtctcacgac gtcctgcagg tgctgtggtt ccgaccctcc accaaggact ccaccggccg 3240
atacgacaac ctgttcttcg tgggcgcctc cacccacccc ggtactggtg ttcccatcgt 3300
cctggccggc tccaagctga cctctgacca ggtggtcaag tctttcggta aaacccccaa 3360
gccccgaaag atcgagatgg agaacaccca ggcccccctg gaggagcctg acgctgagtc 3420
taccttcccc gtctggttct ggctgcgagc cgccttctgg gtcatgttca tgttcttcta 3480
cttcttcccc cagtctaacg gtcagacccc cgcctctttc atcaacaacc tgctgcctga 3540
ggtgttccga gtccacaact ctaacgtcat ctaaaaattc atgtaattag ttatgtcacg 3600
cttacattca cgccctccct ccacatccgc tctaaccgaa aaggaaggag ttagacaacc 3660
tgaagtctag gtccctattt atttttttat agttatgtta gtattaagaa cgttatttat 3720
atttcaaatt tttctttttt ttctgtacag acgcgtgtac gcatgtaaca ttatactgaa 3780
aaccttgctt gagaaggttt tgggacgctc gaaggcttta atttgcatcg cggagtttgg 3840
cgcccgtttt ttcgagcccc acacgtttcg gtgagtatga gcggcggcag attcgagcgt 3900
ttccggtttc cgcggctgga cgagagccca tgatgggggc tcccaccacc agcaatcagg 3960
gccctgatta cacacccacc tgtaatgtca tgctgttcat cgtggttaat gctgctgtgt 4020
gctgtgtgtg tgtgttgttt ggcgctcatt gttgcgttat gcagcgtaca ccacaatatt 4080
ggaagcttat tagcctttct attttttcgt ttgcaaggct taacaacatt gctgtggaga 4140
gggatgggga tatggaggcc gctggaggga gtcggagagg cgttttggag cggcttggcc 4200
tggcgcccag ctcgcgaaac gcacctagga ccctttggca cgccgaaatg tgccactttt 4260
cagtctagta acgccttacc tacgtcattc catgcatgca tgtttgcgcc ttttttccct 4320
tgcccttgat cgccacacag tacagtgcac tgtacagtgg aggttttggg ggggtcttag 4380
atgggagcta aaagcggcct agcggtacac tagtgggatt gtatggagtg gcatggagcc 4440
taggtggagc ctgacaggac gcacgaccgg ctagcccgtg acagacgatg ggtggctcct 4500
gttgtccacc gcgtacaaat gtttgggcca aagtcttgtc agccttgctt gcgaacctaa 4560
ttcccaattt tgtcacttcg cacccccatt gatcgagccc taacccctgc ccatcaggca 4620
atccaattaa gctcgcattg tctgccttgt ttagtttggc tcctgcccgt ttcggcgtcc 4680
acttgcacaa acacaaacaa gcattatata taaggctcgt ctctccctcc caaccacact 4740
cacttttttg cccgtcttcc cttgctaaca caaaagtcaa gaacacaaac aaccacccca 4800
acccccttac acacaagaca tatctacagc atttatgctg ctgacctaca tggaggtcca 4860
cctgtactac accctgcccg tcctgggcgt cctgtcttgg ctgtcccgac cctactacac 4920
cgccaccgac gccctgaagt tcaagttcct gaccctggtg gccttcacca ccgcctccgc 4980
ttgggacaac tacattgtct accacaaggc ctggtcctac tgccccacct gcgtgaccgc 5040
cgtcattggt tacgtgcccc tggaggagta catgttcttc atcattatga ccctgctgac 5100
cgtggccttc actaacctgg tcatgcgatg gcacctgcac tctttcttca tccgacccga 5160
gacccccgtg atgcagtctg tcctggtgcg actggtcccc atcaccgccc tgctgatcac 5220
cgcctacaag gcctggcacc tggccgtccc tggtaaaccc ctgttctacg gctcttgcat 5280
tctgtggtac gcctgccccg tgctggccct tctgtggttc ggcgctggcg agtacatgat 5340
gcgacgaccc ctggccgtcc tggtgtctat tgccctgccc accctgttcc tgtgctgggt 5400
cgacgtggtc gccattggcg ccggaacctg ggacatctcc ctggctacct ccaccggcaa 5460
gttcgtggtg ccccacctgc ccgtggagga gttcatgttc ttcgccctga tcaacaccgt 5520
gctggtgttc ggtacctgcg ccatcgaccg aaccatggcc attctgcacc tgttcaagaa 5580
caagtccccc taccagcgac cctaccagca ctctaagtcc ttcctgcacc agatcctgga 5640
gatgacctgg gccttctgtc tgcccgacca ggtcctgcac tctgacacct tccacgacct 5700
gtccgtctct tgggacatcc tgcgaaaggc ctccaagtct ttctacaccg cctctgccgt 5760
cttccccggc gacgttcgac aggagctggg tgtcctgtac gccttctgcc gagccaccga 5820
cgacctgtgc gacaacgagc aggtgcccgt ccagacccga aaggagcagc tgatcctgac 5880
ccaccagttc gtctccgacc tgttcggcca gaagacctcc gcccccaccg ctattgactg 5940
ggacttctac aacgaccagc tgcccgcctc ctgcatttcc gccttcaagt ccttcacccg 6000
actgcgacac gtcctggagg ccggagctat taaggagctg ctggacggtt acaagtggga 6060
cctggagcga cgatccattc gagaccagga ggacctgcga tactactccg cctgcgtggc 6120
ctcctctgtc ggcgagatgt gcacccgaat cattctggcc cacgccgaca agcccgcctc 6180
ccgacagcag actcagtgga tcatccagcg agcccgagag atgggtctgg tcctgcagta 6240
caccaacatc gcccgagaca ttgtcaccga ctccgaggag ctgggccgat gttacctgcc 6300
ccaggactgg ctgaccgaga aggaggtggc cctgatccag ggcggtctgg ctcgagagat 6360
tggcgaggag cgactgctgt ctctgtctca ccgactgatc taccaggccg acgagctgat 6420
ggtcgtcgcc aacaagggca ttgacaagct gccctcccac tgccagggtg gcgtgcgagc 6480
tgcttgcaac gtctacgcct ccatcggcac caagctgaag tcctacaagc accactaccc 6540
ctcccgagcc cacgtgggaa actctaagcg agtggagatc gccctgctgt ctgtctacaa 6600
cctgtacacc gcccccattg ccacctcttc caccacccac tgtcgacagg gtaaaatgcg 6660
aaacctgaac accatctaaa aatgcagttt gtttagcaaa atatatttaa cgagtttgat 6720
agaggcgctg gactacataa ttactgaatc acgcgtacat gtttcagctc aaattgtatc 6780
acggtttctt tgtagcaatg gagggggaga gttgacaagg cattagagaa gagagcgaga 6840
ggagaagaca agtggataga cgactgcaat catatgatct gcacaaactg cgatgttttc 6900
ctgtcagatc atgttctttt gctcatagtt aagctatcgt gactttacgg atccgccgag 6960
catcttagta gcgaggtttg cggtctgggc tgatcggctt ttgttgatcg ggttcggaac 7020
gaattagaag tgggtcgata gcaatgatca attcggggtg agtgagtgcg gttagtggga 7080
aaccggggag atactgtggg gatttagggg acagtgttaa gaagaggaag gggtgaggga 7140
ggtgaggtga gggagaggga agtatagagg tttatgtagt aacatcaatc atacagttta 7200
aactgcaccc aacaataaat gggtagggtt gcaccaacaa agggatggga tggggggtag 7260
aagatacgag gataacgggg ctcaatggca caaataagaa cgaatactgc cattaagact 7320
cgtgatccag cgactgacac cattgcatca tctaagggcc tcaaaactac ctcggaactg 7380
ctgcgctgat ctggacacca cagaggttcc gagcacttta ggttgcacca aatgtcccac 7440
caggtgcagg cagaaaacgc tggaacagcg tgtacagttt gtcttagcaa aaagtgaagg 7500
cgctgaggtc gagcagggtg gtgtgacttg ttatagcctt tagagctgcg aaagcgcgta 7560
tggatttggc tcatcaggcc agattgaggg tctgtggaca catgtcatgt tagtgtactt 7620
caatcgcccc ctggatatag ccccgacaat aggccgtggc ctcatttttt tgccttccgc 7680
acatttccat tgctcggtac ccacaccttg cttctcctgc acttgccaac cttaatactg 7740
gtttacattg accaacatct tacaagcggg gggcttgtct agggtatata taaacagtgg 7800
ctctcccaat cggttgccag tctctttttt cctttctttc cccacagatt cgaaatctaa 7860
actacacatc acacaatgcc tgttactgac gtccttaagc gaaagtccgg tgtcatcgtc 7920
ggcgacgatg tccgagccgt gagtatccac gacaagatca gtgtcgagac gacgcgtttt 7980
gtgtaatgac acaatccgaa agtcgctagc aacacacact ctctacacaa actaacccag 8040
atggattata acagcgcgga tttcaaggag atatggggca aggccgccga caccgcgctg 8100
ctgggaccgt acaactacct cgccaacaac cggggccaca acatcagaga acacttgatc 8160
gcagcgttcg gagcggttat caaggtggac aagagcgatc tcgagaccat ttcgcacatc 8220
accaagattt tgcataactc gtcgctgctt gttgatgacg tggaagacaa ctcgatgctc 8280
cgacgaggcc tgccggcagc ccattgtctg tttggagtcc cccaaaccat caactccgcc 8340
aactacatgt actttgtggc tctgcaggag gtgctcaagc tcaagtctta tgatgccgtc 8400
tccattttca ccgaggaaat gatcaacttg catagaggtc agggtatgga tctctactgg 8460
agagaaacac tcacttgccc ctcggaagac gagtatctgg agatggtggt gcacaagacc 8520
ggtggactgt ttcggctggc tctgagactt atgctgtcgg tggcatcgaa acaggaggac 8580
catgaaaaga tcaactttga tctcacacac cttaccgaca cactgggagt catttaccag 8640
attctggatg attacctcaa cctgcagtcc acggaattga ccgagaacaa gggattctgc 8700
gaagatatca gcgaaggaaa gttttcgttt ccgctgattc acagcatacg caccaacccg 8760
gataaccacg agattctcaa cattctcaaa cagcgaacaa gcgacgcttc actcaaaaag 8820
tacgccgtgg actacatgag aacagaaacc aagagtttcg actactgcct caagaggata 8880
caggccatgt cactcaaggc aagttcgtac attgatgatc tagcagcagc tggccacgat 8940
gtctccaagc tacgagccat tttgcattat tttgtgtcca cctctgactg tgaggagaga 9000
aagtactttg aggatgcgca gtgacgctat ttatcactct ttacaacttc tacctcaact 9060
atctacttta ataaatgaat atcgtttatt ctctatgatt actgtatatg cgttcctcta 9120
agacaaatcg aaaccagcat gcgatcgaat ggcatacaaa agtttcttcc gaagttgatc 9180
aatgtcctga tagtcaggca gcttgagaag attgacacag gtggaggccg tagggaaccg 9240
atcaacctgt ctaccagcgt tacgaatggc aaatgacggg ttcaaagcct tgaatccttg 9300
caatggtgcc ttggatactg atgtcacaaa cttaagaagc agccgcttgt cctcttcctc 9360
gaaactctca aacacagtcc agaggtcctt tatagcttga tctgtatcca gatagcctcc 9420
gtaattggtg tgtgtcttca aatcccagac gtccacattg gcatgtcctc cactgataag 9480
catttgaagt tcatctgcgt tgaacattga gacccacgaa gggtcgc 9527
<210> 56
<211> 11544
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
ggccgcatcg cttcggataa ctcctgctat acgaagttat acgaattcgc gcccagagag 60
ccattgacgt tctttctaat ttggaccgat agccgtatag tccagtctat ctataagttc 120
aactaactcg taactattac cataacatat acttcactgc cccagataag gttccgataa 180
aaagttctgc agactaaatt tatttcagtc tcctcttcac caccaaaatg ccctcctacg 240
aagctcgagc taacgtccac aagtccgcct ttgccgctcg agtgctcaag ctcgtggcag 300
ccaagaaaac caacctgtgt gcttctctgg atgttaccac caccaaggag ctcattgagc 360
ttgccgataa ggtcggacct tatgtgtgca tgatcaagac ccatatcgac atcattgacg 420
acttcaccta cgccagcact gtgctccccc tcaaggaact tgctcttaag cacggtttct 480
tcctgttcga ggacagaaag ttcgcagata ttggcaacac tgtcaagcac cagtacaaga 540
acggtgtcta ccgaatcgcc gagtggtccg atatcaccaa cgcccacggt gtacccggaa 600
ccggaatcat tgctggcctg cgagctggtg ccgaggaaac tgtctctgaa cagaagaagg 660
aggacgtctc tgactacgag aactcccagt acaaggagtt cctggtcccc tctcccaacg 720
agaagctggc cagaggtctg ctcatgctgg ccgagctgtc ttgcaagggc tctctggcca 780
ctggcgagta ctccaagcag accattgagc ttgcccgatc cgaccccgag tttgtggttg 840
gcttcgttgc ccagaaccga cctaagggcg actctgagga ctggcttatt ctgacccccg 900
gggtgggtct tgacgacaag ggagacgctc tcggacagca gtaccgaact gttgaggatg 960
tcatgtctac cggaacggat atcataattg tcggccgagg tctgtacggc cagaaccgag 1020
atcctatcga ggaggccaag cgataccaga aggctggctg ggaggcttac cagaagatta 1080
actgttagag gttagactat ggatatgtaa tttaactgtg tatatagaga gcgtgcaagt 1140
atggagcgct tgttcagctt gtatgatggt cagacgacct gtctgatcga gtatgtatga 1200
tactgcacaa cctgtgtatc cgcatgatct gtccaatggg gcatgttgtt gtgtttctcg 1260
gaattcagaa taacttcgta tgatgtatgc tatacgaagt tatccggggg agtttggcgc 1320
ccgttttttc gagccccaca cgtttcggtg agtatgagcg gcggcagatt cgagcgtttc 1380
cggtttccgc ggctggacga gagcccatga tgggggctcc caccaccagc aatcagggcc 1440
ctgattacac acccacctgt aatgtcatgc tgttcatcgt ggttaatgct gctgtgtgct 1500
gtgtgtgtgt gttgtttggc gctcattgtt gcgttatgca gcgtacacca caatattgga 1560
agcttattag cctttctatt ttttcgtttg caaggcttaa caacattgct gtggagaggg 1620
atggggatat ggaggccgct ggagggagtc ggagaggcgt tttggagcgg cttggcctgg 1680
cgcccagctc gcgaaacgca cctaggaccc tttggcacgc cgaaatgtgc cacttttcag 1740
tctagtaacg ccttacctac gtcattccat gcatgcatgt ttgcgccttt tttcccttgc 1800
ccttgatcgc cacacagtac agtgcactgt acagtggagg ttttgggggg gtcttagatg 1860
ggagctaaaa gcggcctagc ggtacactag tgggattgta tggagtggca tggagcctag 1920
gtggagcctg acaggacgca cgaccggcta gcccgtgaca gacgatgggt ggctcctgtt 1980
gtccaccgcg tacaaatgtt tgggccaaag tcttgtcagc cttgcttgcg aacctaattc 2040
ccaattttgt cacttcgcac ccccattgat cgagccctaa cccctgccca tcaggcaatc 2100
caattaagct cgcattgtct gccttgttta gtttggctcc tgcccgtttc ggcgtccact 2160
tgcacaaaca caaacaagca ttatatataa ggctcgtctc tccctcccaa ccacactcac 2220
ttttttgccc gtcttccctt gctaacacaa aagtcaagaa cacaaacaac caccccaacc 2280
cccttacaca caagacatat ctacagcatt tatggactac atcatttcgg cgccaggcaa 2340
agtgattcta tttggtgaac atgccgctgt gtttggtaag cctgcgattg cagcagccat 2400
cgacttgcga acatacctgc ttgtcgaaac cacaacatcc gacaccccga cagtcacgtt 2460
ggagtttcca gacatccact tgaacttcaa ggtccaggtg gacaagctgg catctctcac 2520
agcccagacc aaggccgacc atctcaattg gtcgactccc aaaactctgg ataagcacat 2580
tttcgacagc ttgtctagct tggcgcttct ggaagaacct gggctcacta aggtccagca 2640
ggccgctgtt gtgtcgttct tgtacctcta catccaccta tgtccccctt ctgtgtgcga 2700
agattcatca aactgggtag ttcgatcaac gctgcctatc ggcgcgggcc tgggctcttc 2760
cgcatccatt tgtgtctgtt tggctgcagg tcttctggtt ctcaacggcc agctgagcat 2820
tgaccaggca agagatttca agtccctgac cgagaagcag ctgtctctgg tggacgactg 2880
gtccttcgtc ggtgaaatgt gcattcacgg caacccgtcg ggcatcgaca atgctgtggc 2940
tactcaggga ggtgctctgt tgttccagcg acctaacaac cgagtccctc ttgttgacat 3000
tcccgagatg aagctgctgc ttaccaatac gaagcatcct cgatctaccg cagacctggt 3060
tggtggagtc ggagttctca ctaaagagtt tggctccatc atggatccca tcatgacttc 3120
agtaggcgag atttccaacc aggccatgga gatcatttct agaggcaaga agatggtgga 3180
ccagtctaac cttgagattg agcagggtat cttgcctcaa cccacctctg aggatgcctg 3240
caacgtgatg gaagatggag ctactcttca aaagttgaga gatatcggtt cggaaatgca 3300
gcatctagtg agaatcaatc acggcctgct tatcgctatg ggtgtttccc acccgaagct 3360
cgaaatcatt cgaactgcct ccattgtcca caacctgggt gagaccaagc tcactggtgc 3420
tggaggagga ggttgcgcca tcactctagt cacttctaaa gacaagactg cgacccagct 3480
ggaggaaaat gtcattgctt tcacagagga gatggctacc catggcttcg aggtgcacga 3540
gactactatt ggtgccagag gagttggtat gtgcattgac catccctctc tcaagactgt 3600
tgaagccttc aagaaggtgg agcgggcgga tctcaaaaac atcggtccct ggacccatta 3660
gaaatgcagt ttgtttagca aaatatattt aacgagtttg atagaggcgc tggactacat 3720
aattactgaa tcacgcgtac atgtttcagc tcaaattgta tcacggtttc tttgtagcaa 3780
tggaggggga gagttgacaa ggcattagag aagagagcga gaggagaaga caagtggata 3840
gacgactgca atcatatgat ctgcacaaac tgcgatgttt tcctgtcaga tcatgttctt 3900
ttgctcatag ttaagctatc gtgactttac ggatccgccg agcatcttag tagcgaggtt 3960
tgcggtctgg gctgatcggc ttttgttgat cgggttcgga acgaattaga agtgggtcga 4020
tagcaatgat caattcgggg tgagtgagtg cggttagtgg gaaaccgggg agatactgtg 4080
gggatttagg ggacagtgtt aagaagagga aggggtgagg gaggtgaggt gagggagagg 4140
gaagtataga ggtttatgta gtaacatcaa tcatacagtt taaactgcac ccaacaataa 4200
atgggtaggg ttgcaccaac aaagggatgg gatggggggt agaagatacg aggataacgg 4260
ggctcaatgg cacaaataag aacgaatact gccattaaga ctcgtgatcc agcgactgac 4320
accattgcat catctaaggg cctcaaaact acctcggaac tgctgcgctg atctggacac 4380
cacagaggtt ccgagcactt taggttgcac caaatgtccc accaggtgca ggcagaaaac 4440
gctggaacag cgtgtacagt ttgtcttagc aaaaagtgaa ggcgctgagg tcgagcaggg 4500
tggtgtgact tgttatagcc tttagagctg cgaaagcgcg tatggatttg gctcatcagg 4560
ccagattgag ggtctgtgga cacatgtcat gttagtgtac ttcaatcgcc ccctggatat 4620
agccccgaca ataggccgtg gcctcatttt tttgccttcc gcacatttcc attgctcggt 4680
acccacacct tgcttctcct gcacttgcca accttaatac tggtttacat tgaccaacat 4740
cttacaagcg gggggcttgt ctagggtata tataaacagt ggctctccca atcggttgcc 4800
agtctctttt ttcctttctt tccccacaga ttcgaaatct aaactacaca tcacacaatg 4860
cctgttactg acgtccttaa gcgaaagtcc ggtgtcatcg tcggcgacga tgtccgagcc 4920
gtgagtatcc acgacaagat cagtgtcgag acgacgcgtt ttgtgtaatg acacaatccg 4980
aaagtcgcta gcaacacaca ctctctacac aaactaaccc aggtgtctac cgacgccaag 5040
aactctcgaa tttctggttt ccacaaggac gacatcccca cccgactggc ccgagtcgcc 5100
gctttcgccg gtctggacga cgagaccgtg cagcacctgg ccaacatggg taacctggac 5160
ccccagctgg ccgaccgact gattgagaac gtggtggcca ccctgaacgt ccccattggc 5220
atcgccacca acatgaaggt cgacggtgag gacgtgctgg tccccatggc caccgaggag 5280
tcctccgtcg tggccgctgt gtgcaacgcc gcccgacagt gttacgacca gggcggtttc 5340
accacctcta tgtccggttc cctgatgatt gcccaggtcc agctggtcga cgtccccgac 5400
gccgctcacg ctcgaatgcg aattctggag cacaaggccg aggtcaaggc cctgtgcgac 5460
gactgtgacc ccctgctggt caagctgggt ggtggtctgc aggacgtgga ggtccgaatc 5520
gtcgacgccg ccggtggtcc catggtggtc acccacctga tcgtggacac ccgagacgcc 5580
atgggtgcca acgccgtcaa ctccatggcc gagaagctgg ccccccacat cgagtcctgg 5640
accggcggtc gagtgtacct gcgaatcctg tccaacctgg ccgaccgacg actggcccga 5700
gcccgagctg tctggacctg tgacgccatc ggtggcgcct ctgtgcgaga cggtattatc 5760
tccgcctacc gattcgccgc cgccgaccct taccgagccg ctactcacaa caagggtatt 5820
atgaacggcg tgtccgccgt ggtgctggcc accggtaacg acacccgagc cgtggaggcc 5880
ggcgctcatg cttacgccgc ccgaaagggt tggtactcct ctctgaccga ctgggaggtc 5940
accgccgagg gccacctggc tggaaccctg gagatgccca tggccgtggg tctggtgggc 6000
ggtgctacca agctgcaccc caccgcccga gcctgcctga agatcctggg cgtgtccacc 6060
gccgagcgac tggctcgact gatcgccgcc gtcggcctgg ctcagaactt ctctgccctg 6120
aaggccctgg ccaccaccgg cattcagaag ggtcacatgt ccctgcacgc ccagaacatc 6180
gccatgatgg ccggtgccgt gggtgacgag atcgagcccg tcgccaaggc cctggtcgcc 6240
cagggtgctg tccgagtgga cgtcgccgag gccgagctgg ctcgactccg aggtcagggc 6300
taacgctatt tatcactctt tacaacttct acctcaacta tctactttaa taaatgaata 6360
tcgtttattc tctatgatta ctgtatatgc gttcctctaa gacaaatcga aaccagcatg 6420
cgatcgaatg gcatacaaaa gtttcttccg aagttgatca atgtcctgat agtcaggcag 6480
cttgagaaga ttgacacagg tggaggccgt agggaaccga tcaacctgtc taccagcgtt 6540
acgaatggca aatgacgggt tcaaagcctt gaatccttgc aatggtgcct tggatactga 6600
tgtcacaaac ttaagaagca gccgcttgtc ctcttcctcg aaactctcaa acacagtcca 6660
gaggtccttt atagcttgat ctgtatccag atagcctccg taattggtgt gtgtcttcaa 6720
atcccagacg tccacattgg catgtcctcc actgataagc atttgaagtt catctgcgtt 6780
gaacattgag acccacgaag ggtcatcgcg gttgaaatga atcggccgac gctcggtagt 6840
cggaaagagc cgggaccggc cggcgagcat aaaccggacg cagtaggatg tcctgcacgg 6900
gtctttttgt ggggtgtgga gaaaggggtg cttggagatg gaagccggta gaaccgggct 6960
gcttgggggg atttggggcc gctgggctcc aaagaggggt aggcatttcg ttggggttac 7020
gtaattgcgg catttgggtc ctgcgcgcat gtcccattgg tcagaattag tccggatagg 7080
agacttatca gccaatcaca gcgccggatc cacctgtagg ttgggttggg tgggagcacc 7140
cctccacaga gtagagtcaa acagcagcag caacatgata gttgggggtg tgcgtgttaa 7200
aggaaaaaaa aagaagcttg ggttatattc ccgctctatt tagaggttgc gggatagacg 7260
ccgacggagg gcaatggcgc catggaacct tgcggatatc gatacgccgc ggcggactgc 7320
gtccgaacca gctccagcag cgttttttcc gggccattga gccgactgcg accccgccaa 7380
cgtgtcttgg cccacgcact catgtcatgt tggtgttggg aggccacttt ttaagtagca 7440
caaggcacct agctcgcagc aaggtgtccg aaccaaagaa gcggctgcag tggtgcaaac 7500
ggggcggaaa cggcgggaaa aagccacggg ggcacgaatt gaggcacgcc ctcgaatttg 7560
agacgagtca cggccccatt cgcccgcgca atggctcgcc aacgcccggt cttttgcacc 7620
acatcaggtt accccaagcc aaacctttgt gttaaaaagc ttaacatatt ataccgaacg 7680
taggtttggg cgggcttgct ccgtctgtcc aaggcaacat ttatataagg gtctgcatcg 7740
ccggctcaat tgaatctttt ttcttcttct cttctctata ttcattcttg aattaaacac 7800
acatcaacag atgtcgcaac cccagaacgt tggaatcaaa gccctcgaga tctacgtgcc 7860
ttctcgaatt gtcaaccagg ctgagctcga gaagcacgac ggtgtcgctg ctggcaagta 7920
caccattggt cttggtcaga ccaacatggc ctttgtcgac gacagagagg acatctattc 7980
ctttgccctg accgccgtct ctcgactgct caagaacaac aacatcgacc ctgcatctat 8040
tggtcgaatc gaggttggta ctgaaaccct tctggacaag tccaagtccg tcaagtctgt 8100
gctcatgcag ctctttggcg agaacagcaa cattgagggt gtggacaacg tcaacgcctg 8160
ctacggagga accaacgccc tgttcaacgc tatcaactgg gttgagggtc gatcttggga 8220
cggccgaaac gccatcgtcg ttgccggtga cattgccctc tacgcaaagg gcgctgcccg 8280
acccaccgga ggtgccggct gtgttgccat gctcattggc cccgacgctc ccctggttct 8340
tgacaacgtc cacggatctt acttcgagca tgcctacgat ttctacaagc ctgatctgac 8400
ctccgagtac ccctatgttg atggccacta ctccctgacc tgttacacaa aggccctcga 8460
caaggcctac gctgcctaca acgcccgagc cgagaaggtc ggtctgttca aggactccga 8520
caagaagggt gctgaccgat ttgactactc tgccttccac gtgcccacct gcaagcttgt 8580
caccaagtct tacgctcgac ttctctacaa cgactacctc aacgacaaga gcctgtacga 8640
gggccaggtc cccgaggagg ttgctgccgt ctcctacgat gcctctctca ccgacaagac 8700
cgtcgagaag accttccttg gtattgccaa ggctcagtcc gccgagcgaa tggctccttc 8760
tctccaggga cccaccaaca ccggtaacat gtacaccgcc tctgtgtacg cttctctcat 8820
ctctctgctg acttttgtcc ccgctgagca gctgcagggc aagcgaatct ctctcttctc 8880
ttacggatct ggtcttgctt ccactctttt ctctctgacc gtcaagggag acatttctcc 8940
catcgtcaag gcctgcgact tcaaggctaa gctcgatgac cgatccaccg agactcccgt 9000
cgactacgag gctgccaccg atctccgaga gaaggcccac ctcaagaaga actttgagcc 9060
ccagggagac atcaagcaca tcaagtctgg cgtctactac ctcaccaaca tcgatgacat 9120
gttccgacga aagtacgaga tcaagcagta gcgtacctcc atggcctgtc cccacgttgc 9180
cggtcttgcc tcctactacc tgtccatcaa tgacgaggtt ctcacccctg cccaggtcga 9240
ggctcttatt actgagtcca acaccggtgt tcttcccacc accaacctca agggctctcc 9300
caacgctgtt gcctacaacg gtgttggcat ttaggcaatt aacagatagt ttgccggtga 9360
taattctctt aacctcccac actcctttga cataacgatt tatgtaacga aactgaaatt 9420
tgaccagata ttgttgtaaa tagaaaatct ggcttgtagg tggcaaaatc ccgtctttgt 9480
tcatcaattc cctctgtgac tactcgtcat ccctttatgt tcgactgtcg tatttttatt 9540
ttccatacat acgcaagtga gatggtttaa acagagaccg ggttggcggc gtatttgtgt 9600
cccaaaaaac agccccaatt gccccaattg accccaaatt gacccagtag cgggcccaac 9660
cccggcgaga gcccccttca ccccacatat caaacctccc ccggttccca cacttgccgt 9720
taagggcgta gggtactgca gtctggaatc tacgcttgtt cagactttgt actagtttct 9780
ttgtctggcc atccgggtaa cccatgccgg acgcaaaata gactactgaa aatttttttg 9840
ctttgtggtt gggactttag ccaagggtat aaaagaccac cgtccccgaa ttacctttcc 9900
tcttcttttc tctctctcct tgtcaactca cacccgaaat cgttaagcat ttccttctga 9960
gtataagaat cattcaaaat ggtgagtttc agaggcagca gcaattgcca cgggctttga 10020
gcacacggcc gggtgtggtc ccattcccat cgacacaaga cgccacgtca tccgaccagc 10080
actttttgca gtactaaccg cagatttatg aagaactgtg tcatcgtgtc cgccgtgcga 10140
accgccatcg gctccttcaa cggttctctg gcctccacct ccgccattga cctgggcgcc 10200
accgtcatta aggccgccat cgagcgagcc aagatcgact cccagcacgt ggacgaggtc 10260
attatgggta acgtcctgca ggccggcctg ggtcagaacc ccgctcgaca ggccctgctg 10320
aagtccggcc tggccgagac cgtctgtggt ttcaccgtga acaaggtgtg cggctccggt 10380
ctgaagtccg tcgccctggc cgcccaggct atccaggctg gacaggccca gtccatcgtg 10440
gccggcggaa tggagaacat gtccctggcc ccctacctgc tggacgccaa ggcccgatcc 10500
ggctaccgac tgggcgacgg tcaggtgtac gacgtgattc tgcgagacgg tctgatgtgt 10560
gccacccacg gttaccacat gggcatcacc gccgagaacg tcgccaagga gtacggtatc 10620
acccgagaga tgcaggacga gctggccctg cactcccagc gaaaggccgc cgctgccatc 10680
gagtccggtg ccttcaccgc cgagattgtc cccgtcaacg tcgtgacccg aaagaagacc 10740
ttcgtcttct cccaggacga gttccccaag gccaactcta ccgccgaggc cctgggcgct 10800
ctgcgacctg ctttcgacaa ggccggtacc gtgaccgccg gtaacgcctc cggtattaac 10860
gacggcgccg ccgccctggt cattatggag gagtccgccg ccctggccgc tggtcttacc 10920
cctctggccc gaatcaagtc ttacgcctct ggtggcgtgc cccccgccct tatgggcatg 10980
ggtcccgtgc ccgccaccca gaaggccctt cagctggccg gtctgcagct ggccgacatt 11040
gacctgatcg aggccaacga ggccttcgcc gcccagttcc tggccgtcgg aaagaacctg 11100
ggtttcgact ctgagaaggt caacgtgaac ggcggtgcca tcgccctggg ccaccctatc 11160
ggcgcttccg gagcccgaat cctggtcacc ctgctgcacg ccatgcaggc ccgagacaag 11220
accctgggcc tggccaccct gtgtattggt ggcggccagg gtattgccat ggtcattgag 11280
cgactgaact aaaaattcat gtaattagtt atgtcacgct tacattcacg ccctccctcc 11340
acatccgctc taaccgaaaa ggaaggagtt agacaacctg aagtctaggt ccctatttat 11400
ttttttatag ttatgttagt attaagaacg ttatttatat ttcaaatttt tctttttttt 11460
ctgtacagac gcgtgtacgc atgtaacatt atactgaaaa ccttgcttga gaaggttttg 11520
ggacgctcga aggctttaat ttgc 11544
<210> 57
<211> 10658
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
ggccgcatcg cttcggataa ctcctgctat acgaagttat acgaattcgc gcccagagag 60
ccattgacgt tctttctaat ttggaccgat agccgtatag tccagtctat ctataagttc 120
aactaactcg taactattac cataacatat acttcactgc cccagataag gttccgataa 180
aaagttctgc agactaaatt tatttcagtc tcctcttcac caccaaaatg ccctcctacg 240
aagctcgagc taacgtccac aagtccgcct ttgccgctcg agtgctcaag ctcgtggcag 300
ccaagaaaac caacctgtgt gcttctctgg atgttaccac caccaaggag ctcattgagc 360
ttgccgataa ggtcggacct tatgtgtgca tgatcaagac ccatatcgac atcattgacg 420
acttcaccta cgccagcact gtgctccccc tcaaggaact tgctcttaag cacggtttct 480
tcctgttcga ggacagaaag ttcgcagata ttggcaacac tgtcaagcac cagtacaaga 540
acggtgtcta ccgaatcgcc gagtggtccg atatcaccaa cgcccacggt gtacccggaa 600
ccggaatcat tgctggcctg cgagctggtg ccgaggaaac tgtctctgaa cagaagaagg 660
aggacgtctc tgactacgag aactcccagt acaaggagtt cctggtcccc tctcccaacg 720
agaagctggc cagaggtctg ctcatgctgg ccgagctgtc ttgcaagggc tctctggcca 780
ctggcgagta ctccaagcag accattgagc ttgcccgatc cgaccccgag tttgtggttg 840
gcttcgttgc ccagaaccga cctaagggcg actctgagga ctggcttatt ctgacccccg 900
gggtgggtct tgacgacaag ggagacgctc tcggacagca gtaccgaact gttgaggatg 960
tcatgtctac cggaacggat atcataattg tcggccgagg tctgtacggc cagaaccgag 1020
atcctatcga ggaggccaag cgataccaga aggctggctg ggaggcttac cagaagatta 1080
actgttagag gttagactat ggatatgtaa tttaactgtg tatatagaga gcgtgcaagt 1140
atggagcgct tgttcagctt gtatgatggt cagacgacct gtctgatcga gtatgtatga 1200
tactgcacaa cctgtgtatc cgcatgatct gtccaatggg gcatgttgtt gtgtttctcg 1260
gaattcagaa taacttcgta tgatgtatgc tatacgaagt tatccggggg ttgaaatgaa 1320
tcggccgacg ctcggtagtc ggaaagagcc gggaccggcc ggcgagcata aaccggacgc 1380
agtaggatgt cctgcacggg tctttttgtg gggtgtggag aaaggggtgc ttggagatgg 1440
aagccggtag aaccgggctg cttgggggga tttggggccg ctgggctcca aagaggggta 1500
ggcatttcgt tggggttacg taattgcggc atttgggtcc tgcgcgcatg tcccattggt 1560
cagaattagt ccggatagga gacttatcag ccaatcacag cgccggatcc acctgtaggt 1620
tgggttgggt gggagcaccc ctccacagag tagagtcaaa cagcagcagc aacatgatag 1680
ttgggggtgt gcgtgttaaa ggaaaaaaaa agaagcttgg gttatattcc cgctctattt 1740
agaggttgcg ggatagacgc cgacggaggg caatggcgcc atggaacctt gcggatatcg 1800
atacgccgcg gcggactgcg tccgaaccag ctccagcagc gttttttccg ggccattgag 1860
ccgactgcga ccccgccaac gtgtcttggc ccacgcactc atgtcatgtt ggtgttggga 1920
ggccactttt taagtagcac aaggcaccta gctcgcagca aggtgtccga accaaagaag 1980
cggctgcagt ggtgcaaacg gggcggaaac ggcgggaaaa agccacgggg gcacgaattg 2040
aggcacgccc tcgaatttga gacgagtcac ggccccattc gcccgcgcaa tggctcgcca 2100
acgcccggtc ttttgcacca catcaggtta ccccaagcca aacctttgtg ttaaaaagct 2160
taacatatta taccgaacgt aggtttgggc gggcttgctc cgtctgtcca aggcaacatt 2220
tatataaggg tctgcatcgc cggctcaatt gaatcttttt tcttcttctc ttctctatat 2280
tcattcttga attaaacaca catcaacaga tgaccaccta ttcggctccg ggaaaggccc 2340
tcctttgcgg cggttatttg gttattgatc cggcgtattc agcatacgtc gtgggcctct 2400
cggcgcgtat ttacgcgaca gtttcggctt ccgaggcctc caccacctct gtccatgtcg 2460
tctctccgca gtttgacaag ggtgaatgga cctacaacta cacgaacggc cagctgacgg 2520
ccatcggaca caacccattt gctcacgcgg ccgtcaacac cgttctgcat tacgttcctc 2580
ctcgaaacct ccacatcaac atcagcatca aaagtgacaa cgcgtaccac tcgcaaattg 2640
acagcacgca gagaggccag tttgcatacc acaaaaaggc gatccacgag gtgcctaaaa 2700
cgggcctcgg tagctccgct gctcttacca ccgttcttgt ggcagctttg ctcaagtcat 2760
acggcattga tcccttgcat aacacccacc tcgttcacaa cctgtcccag gttgcacact 2820
gctcggcaca gaagaagatt gggtctggat ttgacgtggc ttcggccgtt tgtggctctc 2880
tagtctatag acgtttcccg gcggagtccg tgaacatggt cattgcagct gaagggacct 2940
ccgaatacgg ggctctgttg agaactaccg ttaatcaaaa gtggaaggtg actctggaac 3000
catccttctt gccgccggga atcagcctgc ttatgggaga cgtccaggga ggatctgaga 3060
ctccaggtat ggtggccaag gtgatggcat ggcgaaaagc aaagccccga gaagccgaga 3120
tggtgtggag agatctcaac gctgccaaca tgctcatggt caagttgttc aacgacctgc 3180
gcaagctctc tctcactaac aacgaggcct acgaacaact tttggccgag gctgctcctc 3240
tcaacgctct aaagatgata atgttgcaga accctctcgg agaactagca cgatgcatta 3300
tcactattcg aaagcatctc aagaagatga cacgggagac tggtgctgct attgagccgg 3360
atgagcagtc tgcattgctc aacaagtgca acacttatag tggagtcatt ggaggtgttg 3420
tgcctggagc aggaggctac gatgctattt ctcttctggt gatcagctct acggtgaaca 3480
atgtcaagcg agagagccag ggagtccaat ggatggagct caaggaggag aacgagggtc 3540
tgcggctcga gaaggggttc aagtagcgta cctccatggc ctgtccccac gttgccggtc 3600
ttgcctccta ctacctgtcc atcaatgacg aggttctcac ccctgcccag gtcgaggctc 3660
ttattactga gtccaacacc ggtgttcttc ccaccaccaa cctcaagggc tctcccaacg 3720
ctgttgccta caacggtgtt ggcatttagg caattaacag atagtttgcc ggtgataatt 3780
ctcttaacct cccacactcc tttgacataa cgatttatgt aacgaaactg aaatttgacc 3840
agatattgtt gtaaatagaa aatctggctt gtaggtggca aaatcccgtc tttgttcatc 3900
aattccctct gtgactactc gtcatccctt tatgttcgac tgtcgtattt ttattttcca 3960
tacatacgca agtgagatgg tttaaacaga gaccgggttg gcggcgtatt tgtgtcccaa 4020
aaaacagccc caattgcccc aattgacccc aaattgaccc agtagcgggc ccaaccccgg 4080
cgagagcccc cttcacccca catatcaaac ctcccccggt tcccacactt gccgttaagg 4140
gcgtagggta ctgcagtctg gaatctacgc ttgttcagac tttgtactag tttctttgtc 4200
tggccatccg ggtaacccat gccggacgca aaatagacta ctgaaaattt ttttgctttg 4260
tggttgggac tttagccaag ggtataaaag accaccgtcc ccgaattacc tttcctcttc 4320
ttttctctct ctccttgtca actcacaccc gaaatcgtta agcatttcct tctgagtata 4380
agaatcattc aaaatggtga gtttcagagg cagcagcaat tgccacgggc tttgagcaca 4440
cggccgggtg tggtcccatt cccatcgaca caagacgcca cgtcatccga ccagcacttt 4500
ttgcagtact aaccgcagat ttatgatcca ccaggcctcc accaccgctc cggtgaacat 4560
tgcgacactc aagtactggg gcaagcgaga ccctgctctc aatctgccca ctaacaactc 4620
catctccgtg actttgtcgc aggatgatct gcggaccctc accacagcct cgtgttcccc 4680
tgatttcacc caggacgagc tgtggctcaa tggcaagcag gaggacgtga gcggcaaacg 4740
tctggttgcg tgtttccgag agctgcgggc tctgcgacac aaaatggagg actccgactc 4800
ttctctgcct aagctggccg atcagaagct caagatcgtg tccgagaaca acttccccac 4860
cgccgctggt ctcgcctcat cggctgctgg ctttgccgcc ctgatccgag ccgttgcaaa 4920
tctctacgag ctccaggaga cccccgagca gctgtccatt gtggctcgac agggctctgg 4980
atccgcctgt cgatctctct acggaggcta cgtggcatgg gaaatgggca ccgagtctga 5040
cggaagcgac tcgcgagcgg tccagatcgc caccgccgac cactggcccg agatgcgagc 5100
cgccatcctc gttgtctctg ccgacaagaa ggacacgtcg tccactaccg gtatgcaggt 5160
gactgtgcac acttctcccc tcttcaagga gcgagtcacc actgtggttc ccgagcggtt 5220
tgcccagatg aagaagtcga ttctggaccg agacttcccc acctttgccg agctcaccat 5280
gcgagactca aaccagttcc acgccacctg tctggactcg tatcctccca ttttctacct 5340
caacgacgtg tcgcgagcct ccattcgggt agttgaggcc atcaacaagg ctgccggagc 5400
caccattgcc gcctacacct ttgatgctgg acccaactgt gtcatctact acgaggacaa 5460
gaacgaggag ctggttctgg gtgctctcaa ggccattctg ggccgtgtgg agggatggga 5520
gaagcaccag tctgtggacg ccaagaagat tgatgttgac gagcggtggg agtccgagct 5580
ggccaacgga attcagcggg tgatccttac caaggttgga ggagatcccg tgaagaccgc 5640
tgagtcgctt atcaacgagg atggttctct gaagaacagc aagtagaaat tcatgtaatt 5700
agttatgtca cgcttacatt cacgccctcc ctccacatcc gctctaaccg aaaaggaagg 5760
agttagacaa cctgaagtct aggtccctat ttattttttt atagttatgt tagtattaag 5820
aacgttattt atatttcaaa tttttctttt ttttctgtac agacgcgtgt acgcatgtaa 5880
cattatactg aaaaccttgc ttgagaaggt tttgggacgc tcgaaggctt taatttgcat 5940
cgcggagttt ggcgcccgtt ttttcgagcc ccacacgttt cggtgagtat gagcggcggc 6000
agattcgagc gtttccggtt tccgcggctg gacgagagcc catgatgggg gctcccacca 6060
ccagcaatca gggccctgat tacacaccca cctgtaatgt catgctgttc atcgtggtta 6120
atgctgctgt gtgctgtgtg tgtgtgttgt ttggcgctca ttgttgcgtt atgcagcgta 6180
caccacaata ttggaagctt attagccttt ctattttttc gtttgcaagg cttaacaaca 6240
ttgctgtgga gagggatggg gatatggagg ccgctggagg gagtcggaga ggcgttttgg 6300
agcggcttgg cctggcgccc agctcgcgaa acgcacctag gaccctttgg cacgccgaaa 6360
tgtgccactt ttcagtctag taacgcctta cctacgtcat tccatgcatg catgtttgcg 6420
ccttttttcc cttgcccttg atcgccacac agtacagtgc actgtacagt ggaggttttg 6480
ggggggtctt agatgggagc taaaagcggc ctagcggtac actagtggga ttgtatggag 6540
tggcatggag cctaggtgga gcctgacagg acgcacgacc ggctagcccg tgacagacga 6600
tgggtggctc ctgttgtcca ccgcgtacaa atgtttgggc caaagtcttg tcagccttgc 6660
ttgcgaacct aattcccaat tttgtcactt cgcaccccca ttgatcgagc cctaacccct 6720
gcccatcagg caatccaatt aagctcgcat tgtctgcctt gtttagtttg gctcctgccc 6780
gtttcggcgt ccacttgcac aaacacaaac aagcattata tataaggctc gtctctccct 6840
cccaaccaca ctcacttttt tgcccgtctt cccttgctaa cacaaaagtc aagaacacaa 6900
acaaccaccc caaccccctt acacacaaga catatctaca gcatttatga cgacgtctta 6960
cagcgacaaa atcaagagta tcagcgtgag ctctgtggct cagcagtttc ctgaggtggc 7020
gccgattgcg gacgtgtcca aggctagccg gcccagcacg gagtcgtcgg actcgtcggc 7080
caagctattt gatggccacg acgaggagca gatcaagctg atggacgaga tctgtgtggt 7140
gctggactgg gacgacaagc cgattggcgg cgcgtccaaa aagtgctgtc atctgatgga 7200
caacatcaac gacggactgg tgcatcgggc cttttccgtg ttcatgttca acgaccgcgg 7260
tgagctgctt ctgcagcagc gggcggcgga aaaaatcacc tttgccaaca tgtggaccaa 7320
cacgtgctgc tcgcatcctc tggcggtgcc cagcgagatg ggcgggctgg atctggagtc 7380
ccggatccag ggcgccaaaa acgccgcggt ccggaagctt gagcacgagc tgggaatcga 7440
ccccaaggcc gttccggcag acaagttcca tttcctcacc cggatccact acgccgcgcc 7500
ctcctcgggc ccctggggcg agcacgagat tgactacatt ctgtttgtcc ggggcgaccc 7560
cgagctcaag gtggtggcca acgaggtccg cgataccgtg tgggtgtcgc agcagggact 7620
caaggacatg atggccgatc ccaagctggt tttcacccct tggttccggc tcatttgtga 7680
gcaggcgctg tttccctggt gggaccagtt ggacaatctg cccgcgggcg atgacgagat 7740
tcggcggtgg atcaagtaga aatgcagttt gtttagcaaa atatatttaa cgagtttgat 7800
agaggcgctg gactacataa ttactgaatc acgcgtacat gtttcagctc aaattgtatc 7860
acggtttctt tgtagcaatg gagggggaga gttgacaagg cattagagaa gagagcgaga 7920
ggagaagaca agtggataga cgactgcaat catatgatct gcacaaactg cgatgttttc 7980
ctgtcagatc atgttctttt gctcatagtt aagctatcgt gactttacgg atccgccgag 8040
catcttagta gcgaggtttg cggtctgggc tgatcggctt ttgttgatcg ggttcggaac 8100
gaattagaag tgggtcgata gcaatgatca attcggggtg agtgagtgcg gttagtggga 8160
aaccggggag atactgtggg gatttagggg acagtgttaa gaagaggaag gggtgaggga 8220
ggtgaggtga gggagaggga agtatagagg tttatgtagt aacatcaatc atacagttta 8280
aactgcaccc aacaataaat gggtagggtt gcaccaacaa agggatggga tggggggtag 8340
aagatacgag gataacgggg ctcaatggca caaataagaa cgaatactgc cattaagact 8400
cgtgatccag cgactgacac cattgcatca tctaagggcc tcaaaactac ctcggaactg 8460
ctgcgctgat ctggacacca cagaggttcc gagcacttta ggttgcacca aatgtcccac 8520
caggtgcagg cagaaaacgc tggaacagcg tgtacagttt gtcttagcaa aaagtgaagg 8580
cgctgaggtc gagcagggtg gtgtgacttg ttatagcctt tagagctgcg aaagcgcgta 8640
tggatttggc tcatcaggcc agattgaggg tctgtggaca catgtcatgt tagtgtactt 8700
caatcgcccc ctggatatag ccccgacaat aggccgtggc ctcatttttt tgccttccgc 8760
acatttccat tgctcggtac ccacaccttg cttctcctgc acttgccaac cttaatactg 8820
gtttacattg accaacatct tacaagcggg gggcttgtct agggtatata taaacagtgg 8880
ctctcccaat cggttgccag tctctttttt cctttctttc cccacagatt cgaaatctaa 8940
actacacatc acacaatgcc tgttactgac gtccttaagc gaaagtccgg tgtcatcgtc 9000
ggcgacgatg tccgagccgt gagtatccac gacaagatca gtgtcgagac gacgcgtttt 9060
gtgtaatgac acaatccgaa agtcgctagc aacacacact ctctacacaa actaacccag 9120
atgtccaagg cgaaattcga aagcgtgttc ccccgaatct ccgaggagct ggtgcagctg 9180
ctgcgagacg agggtctgcc ccaggatgcc gtgcagtggt tttccgactc acttcagtac 9240
aactgtgtgg gtggaaagct caaccgaggc ctgtctgtgg tcgacaccta ccagctactg 9300
accggcaaga aggagctcga tgacgaggag tactaccgac tcgcgctgct cggctggctg 9360
attgagctgc tgcaggcgtt tttcctcgtg tcggacgaca ttatggatga gtccaagacc 9420
cgacgaggcc agccctgctg gtacctcaag cccaaggtcg gcatgattgc catcaacgat 9480
gctttcatgc tagagagtgg catctacatt ctgcttaaga agcatttccg acaggagaag 9540
tactacattg accttgtcga gctgttccac gacatttcgt tcaagaccga gctgggccag 9600
ctggtggatc ttctgactgc ccccgaggat gaggttgatc tcaaccggtt ctctctggac 9660
aagcactcct ttattgtgcg atacaagact gcttactact ccttctacct gcccgttgtt 9720
ctagccatgt acgtggccgg cattaccaac cccaaggacc tgcagcaggc catggatgtg 9780
ctgatccctc tcggagagta cttccaggtc caggacgact accttgacaa ctttggagac 9840
cccgagttca ttggtaagat cggcaccgac atccaggaca acaagtgctc ctggctcgtt 9900
aacaaagccc ttcagaaggc cacccccgag cagcgacaga tcctcgagga caactacggc 9960
gtcaaggaca agtccaagga gctcgtcatc aagaaactgt atgatgacat gaagattgag 10020
caggactacc ttgactacga ggaggaggtt gttggcgaca tcaagaagaa gatcgagcag 10080
gttgacgaga gccgaggctt caagaaggag gtgctcaacg ctttcctcgc caagatttac 10140
aagcgacaga agtagcgcta tttatcactc tttacaactt ctacctcaac tatctacttt 10200
aataaatgaa tatcgtttat tctctatgat tactgtatat gcgttcctct aagacaaatc 10260
gaaaccagca tgcgatcgaa tggcatacaa aagtttcttc cgaagttgat caatgtcctg 10320
atagtcaggc agcttgagaa gattgacaca ggtggaggcc gtagggaacc gatcaacctg 10380
tctaccagcg ttacgaatgg caaatgacgg gttcaaagcc ttgaatcctt gcaatggtgc 10440
cttggatact gatgtcacaa acttaagaag cagccgcttg tcctcttcct cgaaactctc 10500
aaacacagtc cagaggtcct ttatagcttg atctgtatcc agatagcctc cgtaattggt 10560
gtgtgtcttc aaatcccaga cgtccacatt ggcatgtcct ccactgataa gcatttgaag 10620
ttcatctgcg ttgaacattg agacccacga agggtcgc 10658
<210> 58
<211> 6950
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
ggccgcatcg cttcggataa ctcctgctat acgaagttat acgaattcgc gcccagagag 60
ccattgacgt tctttctaat ttggaccgat agccgtatag tccagtctat ctataagttc 120
aactaactcg taactattac cataacatat acttcactgc cccagataag gttccgataa 180
aaagttctgc agactaaatt tatttcagtc tcctcttcac caccaaaatg ccctcctacg 240
aagctcgagc taacgtccac aagtccgcct ttgccgctcg agtgctcaag ctcgtggcag 300
ccaagaaaac caacctgtgt gcttctctgg atgttaccac caccaaggag ctcattgagc 360
ttgccgataa ggtcggacct tatgtgtgca tgatcaagac ccatatcgac atcattgacg 420
acttcaccta cgccagcact gtgctccccc tcaaggaact tgctcttaag cacggtttct 480
tcctgttcga ggacagaaag ttcgcagata ttggcaacac tgtcaagcac cagtacaaga 540
acggtgtcta ccgaatcgcc gagtggtccg atatcaccaa cgcccacggt gtacccggaa 600
ccggaatcat tgctggcctg cgagctggtg ccgaggaaac tgtctctgaa cagaagaagg 660
aggacgtctc tgactacgag aactcccagt acaaggagtt cctggtcccc tctcccaacg 720
agaagctggc cagaggtctg ctcatgctgg ccgagctgtc ttgcaagggc tctctggcca 780
ctggcgagta ctccaagcag accattgagc ttgcccgatc cgaccccgag tttgtggttg 840
gcttcgttgc ccagaaccga cctaagggcg actctgagga ctggcttatt ctgacccccg 900
gggtgggtct tgacgacaag ggagacgctc tcggacagca gtaccgaact gttgaggatg 960
tcatgtctac cggaacggat atcataattg tcggccgagg tctgtacggc cagaaccgag 1020
atcctatcga ggaggccaag cgataccaga aggctggctg ggaggcttac cagaagatta 1080
actgttagag gttagactat ggatatgtaa tttaactgtg tatatagaga gcgtgcaagt 1140
atggagcgct tgttcagctt gtatgatggt cagacgacct gtctgatcga gtatgtatga 1200
tactgcacaa cctgtgtatc cgcatgatct gtccaatggg gcatgttgtt gtgtttctcg 1260
gaattcagaa taacttcgta tgatgtatgc tatacgaagt tatccgggag agaccgggtt 1320
ggcggcgtat ttgtgtccca aaaaacagcc ccaattgccc caattgaccc caaattgacc 1380
cagtagcggg cccaaccccg gcgagagccc ccttcacccc acatatcaaa cctcccccgg 1440
ttcccacact tgccgttaag ggcgtagggt actgcagtct ggaatctacg cttgttcaga 1500
ctttgtacta gtttctttgt ctggccatcc gggtaaccca tgccggacgc aaaatagact 1560
actgaaaatt tttttgcttt gtggttggga ctttagccaa gggtataaaa gaccaccgtc 1620
cccgaattac ctttcctctt cttttctctc tctccttgtc aactcacacc cgaaatcgtt 1680
aagcatttcc ttctgagtat aagaatcatt caaaatggtg agtttcagag gcagcagcaa 1740
ttgccacggg ctttgagcac acggccgggt gtggtcccat tcccatcgac acaagacgcc 1800
acgtcatccg accagcactt tttgcagtac taaccgcaga tggctgactt cgactctaag 1860
gaatacttgg aattggttga caagtggtgg agagctacta actacttgtc tgctggtatg 1920
atcttcttga agtctaaccc attgttctct gttactaaca ctccaatcaa ggctgaagac 1980
gttaaggtta agccaatcgg tcactggggt actatctctg gtcaaacttt cttgtacgct 2040
cacgctaaca gattgatcaa caagtacggt ttgaacatgt tctacgttgg tggtccaggt 2100
cacggtggtc aagttatggt tactaacgct tacttggacg gtgcttacac tgaagactac 2160
ccagaaatca ctcaagacat cgaaggtatg tctcacttgt tcaagagatt ctctttccca 2220
ggtggtatcg gttctcacat gactgctcaa actccaggtt ctttgcacga aggtggtgaa 2280
ttgggttact ctttgtctca cgctttcggt gctgttttgg acaacccaga ccaagttgct 2340
ttcgctgttg ttggtgacgg tgaagctgaa actggtccat ctatggcttc ttggcactct 2400
atcaagttct tgaacgctaa gaacgacggt gctgttttgc cagttttgga cttgaacggt 2460
ttcaagatct ctaacccaac tatcttctct agaatgtctg acgaagaaat cactaagttc 2520
ttcgaaggtt tgggttactc tccaagattc atcgaaaacg acgacatcca cgactacgct 2580
acttaccacc aattggctgc taacatcttg gaccaagcta tcgaagacat ccaagctatc 2640
caaaacgacg ctagagaaaa cggtaagtac caagacggtg aaatcccagc ttggccagtt 2700
atcatcgcta gattgccaaa gggttggggt ggtccaactc acgacgcttc taacaaccca 2760
atcgaaaact ctttcagagc tcaccaagtt ccattgccat tggaacaaca cgacttggct 2820
actttgccag aattcgaaga ctggatgaac tcttacaagc cagaagaatt gttcaacgct 2880
gacggttctt tgaaggacga attgaaggct atcgctccaa agggtgacaa gagaatgtct 2940
gctaacccaa tcactaacgg tggtgctgac agatctgact tgaagttgcc aaactggaga 3000
gaattcgcta acgacatcaa cgacgacact agaggtaagg aattcgctga ctctaagaga 3060
aacatggaca tggctacttt gtctaactac ttgggtgctg tttctcaatt gaacccaact 3120
agattcagat tcttcggtcc agacgaaact atgtctaaca gattgtgggg tttgttcaac 3180
gttactccaa gacaatggat ggaagaaatc aaggaaccac aagaccaatt gttgtctcca 3240
actggtagaa tcatcgactc tcaattgtct gaacaccaag ctgaaggttg gttggaaggt 3300
tacactttga ctggtagagt tggtatcttc gcttcttacg aatctttctt gagagttgtt 3360
gacactatgg ttactcaaca cttcaagtgg ttgagacacg cttctgaaca agcttggaga 3420
aacgactacc catctttgaa cttgatcgct acttctactg ctttccaaca agaccacaac 3480
ggttacactc accaagaccc aggtatgttg actcacttgg ctgaaaagaa gtctaacttc 3540
atcagagaat acttgccagc tgacggtaac tctttgttgg ctgttcaaga aagagctttc 3600
tctgaaagac acaaggttaa cttgttgatc gcttctaagc aaccaagaca acaatggttc 3660
actgttgaag aagctgaagt tttggctaac gaaggtttga agatcatcga ctgggcttct 3720
actgctccat cttctgacgt tgacatcact ttcgcttctg ctggtactga accaactatc 3780
gaaactttgg ctgctttgtg gttgatcaac caagctttcc cagacgttaa gttcagatac 3840
gttaacgttg ttgaattgtt gagattgcaa aagaagtctg aaccaaacat gaacgacgaa 3900
agagaattgt ctgctgaaga attcaacaag tacttccaag ctgacactcc agttatcttc 3960
ggtttccacg cttacgaaaa cttgatcgaa tctttcttct tcgaaagaaa gttcactggt 4020
gacgtttacg ttcacggtta cagagaagac ggtgacatca ctactactta cgacatgaga 4080
gtttactctc acttggacag attccaccaa gctaaggaag ctgctgaaat cttgtctgct 4140
aacggtaaga tcgaccaagc tgctgctgac actttcatcg ctaagatgga cgacactttg 4200
gctaagcact tccaagttac tagaaacgaa ggtagagaca tcgaagaatt cactgactgg 4260
acttggtctc cattgaagta atcatgtaat tagttatgtc acgcttacat tcacgccctc 4320
cctccacatc cgctctaacc gaaaaggaag gagttagaca acctgaagtc taggtcccta 4380
tttatttttt tatagttatg ttagtattaa gaacgttatt tatatttcaa atttttcttt 4440
tttttctgta cagacgcgtg tacgcatgta acattatact gaaaaccttg cttgagaagg 4500
ttttgggacg ctcgaaggct ttaatttgca tcgcggagtt tggcgcccgt tttttcgagc 4560
cccacacgtt tcggtgagta tgagcggcgg cagattcgag cgtttccggt ttccgcggct 4620
ggacgagagc ccatgatggg ggctcccacc accagcaatc agggccctga ttacacaccc 4680
acctgtaatg tcatgctgtt catcgtggtt aatgctgctg tgtgctgtgt gtgtgtgttg 4740
tttggcgctc attgttgcgt tatgcagcgt acaccacaat attggaagct tattagcctt 4800
tctatttttt cgtttgcaag gcttaacaac attgctgtgg agagggatgg ggatatggag 4860
gccgctggag ggagtcggag aggcgttttg gagcggcttg gcctggcgcc cagctcgcga 4920
aacgcaccta ggaccctttg gcacgccgaa atgtgccact tttcagtcta gtaacgcctt 4980
acctacgtca ttccatgcat gcatgtttgc gccttttttc ccttgccctt gatcgccaca 5040
cagtacagtg cactgtacag tggaggtttt gggggggtct tagatgggag ctaaaagcgg 5100
cctagcggta cactagtggg attgtatgga gtggcatgga gcctaggtgg agcctgacag 5160
gacgcacgac cggctagccc gtgacagacg atgggtggct cctgttgtcc accgcgtaca 5220
aatgtttggg ccaaagtctt gtcagccttg cttgcgaacc taattcccaa ttttgtcact 5280
tcgcaccccc attgatcgag ccctaacccc tgcccatcag gcaatccaat taagctcgca 5340
ttgtctgcct tgtttagttt ggctcctgcc cgtttcggcg tccacttgca caaacacaaa 5400
caagcattat atataaggct cgtctctccc tcccaaccac actcactttt ttgcccgtct 5460
tcccttgcta acacaaaagt caagaacaca aacaaccacc ccaaccccct tacacacaag 5520
acatatctac agcaatgaag ttgatggaaa acatcttcga cttggctaag gctaacaaga 5580
agaagatcgt tttggctgaa ggtgaagaag aaagaaacat cagagcttct gaagaaatca 5640
tcaaggacgg tatcgctgac atcatcttgg ttggttctga atctgttatc aaggaatctg 5700
ctgctaagtt cggtgttaac ttggctggtg ttgaaatcgt tgacccagaa acttcttcta 5760
agactgctgg ttacgctaac gctttctacg aaatcagaaa gaacaagggt gttactttgg 5820
aaaaggctga caagatcgtt agagacccaa tctacttcgc tactatgatg gttaagttgg 5880
gtgacgctga aggtttggtt tctggtgcta tccacactac tggtgacttg ttgagaccag 5940
gtttgcaaat cgttaagact gttccaggtg cttctgttgt ttcttctgtt ttcttgatgt 6000
ctgttccaga ctgtgaatac ggtgaagacg gtttcttgtt gttcgctgac tgtgctgtta 6060
acgtttgtcc aactgctgaa gaattgtctt ctatcgctat cactactgct gaaactgcta 6120
agaacttgtg taagatcgaa ccaagagttg ctatgttgtc tttctctact atgggttctg 6180
cttctcacga attggttgac aaggttacta aggctactaa gttggctaag gaagctagac 6240
cagacttgga catcgacggt gaattgcaat tggacgcttc tatcgttaag aaggttgctg 6300
acttgaaggc tccaggttct aaggttgctg gtaaggctaa cgttttgatc ttcccagaca 6360
tccaagctgg taacatcggt tacaagttgg ttcaaagatt cgctaaggct gaagctatcg 6420
gtccaatctg tcaaggtttc gctaagccaa tcaacgactt gtctagaggt tgttctgttg 6480
acgacatcgt taaggttgtt gctgttactg ctgttcaagc tcaagctcaa ggttaagtac 6540
ctccatggcc tgtccccacg ttgccggtct tgcctcctac tacctgtcca tcaatgacga 6600
ggttctcacc cctgcccagg tcgaggctct tattactgag tccaacaccg gtgttcttcc 6660
caccaccaac ctcaagggct ctcccaacgc tgttgcctac aacggtgttg gcatttaggc 6720
aattaacaga tagtttgccg gtgataattc tcttaacctc ccacactcct ttgacataac 6780
gatttatgta acgaaactga aatttgacca gatattgttg taaatagaaa atctggcttg 6840
taggtggcaa aatcccgtct ttgttcatca attccctctg tgactactcg tcatcccttt 6900
atgttcgact gtcgtatttt tattttccat acatacgcaa gtgagatggc 6950
<210> 59
<211> 8883
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
ggccgcatcg cttcggataa ctcctgctat acgaagttat acgaattcgc gcccagagag 60
ccattgacgt tctttctaat ttggaccgat agccgtatag tccagtctat ctataagttc 120
aactaactcg taactattac cataacatat acttcactgc cccagataag gttccgataa 180
aaagttctgc agactaaatt tatttcagtc tcctcttcac caccaaaatg ccctcctacg 240
aagctcgagc taacgtccac aagtccgcct ttgccgctcg agtgctcaag ctcgtggcag 300
ccaagaaaac caacctgtgt gcttctctgg atgttaccac caccaaggag ctcattgagc 360
ttgccgataa ggtcggacct tatgtgtgca tgatcaagac ccatatcgac atcattgacg 420
acttcaccta cgccagcact gtgctccccc tcaaggaact tgctcttaag cacggtttct 480
tcctgttcga ggacagaaag ttcgcagata ttggcaacac tgtcaagcac cagtacaaga 540
acggtgtcta ccgaatcgcc gagtggtccg atatcaccaa cgcccacggt gtacccggaa 600
ccggaatcat tgctggcctg cgagctggtg ccgaggaaac tgtctctgaa cagaagaagg 660
aggacgtctc tgactacgag aactcccagt acaaggagtt cctggtcccc tctcccaacg 720
agaagctggc cagaggtctg ctcatgctgg ccgagctgtc ttgcaagggc tctctggcca 780
ctggcgagta ctccaagcag accattgagc ttgcccgatc cgaccccgag tttgtggttg 840
gcttcgttgc ccagaaccga cctaagggcg actctgagga ctggcttatt ctgacccccg 900
gggtgggtct tgacgacaag ggagacgctc tcggacagca gtaccgaact gttgaggatg 960
tcatgtctac cggaacggat atcataattg tcggccgagg tctgtacggc cagaaccgag 1020
atcctatcga ggaggccaag cgataccaga aggctggctg ggaggcttac cagaagatta 1080
actgttagag gttagactat ggatatgtaa tttaactgtg tatatagaga gcgtgcaagt 1140
atggagcgct tgttcagctt gtatgatggt cagacgacct gtctgatcga gtatgtatga 1200
tactgcacaa cctgtgtatc cgcatgatct gtccaatggg gcatgttgtt gtgtttctcg 1260
gaattcagaa taacttcgta tgatgtatgc tatacgaagt tatccgggct gcacccaaca 1320
ataaatgggt agggttgcac caacaaaggg atgggatggg gggtagaaga tacgaggata 1380
acggggctca atggcacaaa taagaacgaa tactgccatt aagactcgtg atccagcgac 1440
tgacaccatt gcatcatcta agggcctcaa aactacctcg gaactgctgc gctgatctgg 1500
acaccacaga ggttccgagc actttaggtt gcaccaaatg tcccaccagg tgcaggcaga 1560
aaacgctgga acagcgtgta cagtttgtct tagcaaaaag tgaaggcgct gaggtcgagc 1620
agggtggtgt gacttgttat agcctttaga gctgcgaaag cgcgtatgga tttggctcat 1680
caggccagat tgagggtctg tggacacatg tcatgttagt gtacttcaat cgccccctgg 1740
atatagcccc gacaataggc cgtggcctca tttttttgcc ttccgcacat ttccattgct 1800
cggtacccac accttgcttc tcctgcactt gccaacctta atactggttt acattgacca 1860
acatcttaca agcggggggc ttgtctaggg tatatataaa cagtggctct cccaatcggt 1920
tgccagtctc ttttttcctt tctttcccca cagattcgaa atctaaacta cacatcacac 1980
aatgcctgtt actgacgtcc ttaagcgaaa gtccggtgtc atcgtcggcg acgatgtccg 2040
agccgtgagt atccacgaca agatcagtgt cgagacgacg cgttttgtgt aatgacacaa 2100
tccgaaagtc gctagcaaca cacactctct acacaaacta acccagatgg ccacccccga 2160
agatctcgct gccaacgccg actacattag aatggccgat cagtacgtcg aggtgcccgg 2220
aggaaccaac aacaacaact acgccaacgt cgagctgatt gtcgacgtgg ctgagcgatt 2280
cggcgtcgat gccgtgtggg ccggatgggg ccatgccagt gaaaatcccc tgctccccga 2340
gtcgctagcg gcctctcccc gcaagattgt cttcatcggc cctcccggag ctgccatgag 2400
atctctggga gacaaaattt cttctaccat tgtggcccag cacgcaaagg tcccgtgtat 2460
cccgtggtct ggaaccggag tggacgaggt tgtggttgac aagagcacca acctcgtgtc 2520
cgtgtccgag gaggtgtaca ccaagggctg caccaccggt cccaagcagg gtctggagaa 2580
ggctaagcag attggattcc ccgtgatgat caaggcttcc gagggaggag gaggaaaggg 2640
tattcgaaag gttgagcgag aggaggactt cgaggctgct taccaccagg tcgagggaga 2700
gatccccggc tcgcccatct tcattatgca gcttgcaggc aatgcccggc atttggaggt 2760
gcagcttctg gctgatcagt acggcaacaa tatttcactg tttggtcgag attgttcggt 2820
tcagcgacgg catcaaaaga ttattgagga ggctcctgtg actgtggctg gccagcagac 2880
cttcactgcc atggagaagg ctgccgtgcg actcggtaag cttgtcggat atgtctctgc 2940
aggtaccgtt gaatatctgt attcccatga ggacgacaag ttctacttct tggagctgaa 3000
tcctcgtctt caggtcgaac atcctaccac cgagatggtc accggtgtca acctgcccgc 3060
tgcccagctt cagatcgcca tgggtatccc cctcgatcga atcaaggaca ttcgtctctt 3120
ttacggtgtt aaccctcaca ccaccactcc aattgatttc gacttctcgg gcgaggatgc 3180
tgataagaca cagcgacgtc ccgtcccccg aggtcacacc actgcttgcc gaatcacatc 3240
cgaggaccct ggagagggtt tcaagccctc cggaggtact atgcacgagc tcaacttccg 3300
atcctcgtcc aacgtgtggg gttacttctc cgttggtaac cagggaggta tccattcgtt 3360
ctcggattcg cagtttggtc acatcttcgc cttcggtgag aaccgaagtg cgtctcgaaa 3420
gcacatggtt gttgctttga aggaactatc tattcgaggt gacttccgaa ccaccgtcga 3480
gtacctcatc aagctgctgg agacaccgga cttcgaggac aacaccatca ccaccggctg 3540
gctggatgag cttatctcca acaagctgac tgccgagcga cccgactcgt tcctcgctgt 3600
tgtttgtggt gctgctacca aggcccatcg agcttccgag gactctattg ccacctacat 3660
ggcttcgcta gagaagggcc aggtccctgc tcgagacatt ctcaagaccc ttttccccgt 3720
tgacttcatc tacgagggcc agcggtacaa gttcaccgcc acccggtcgt ctgaggactc 3780
ttacacgctg ttcatcaacg gttctcgatg cgacattgga gttagacctc tttctgacgg 3840
tggtattctg tgtcttgtag gtgggagatc ccacaatgtc tactggaagg aggaggttgg 3900
agccacgcga ctgtctgttg actccaagac ctgccttctc gaggtggaga acgaccccac 3960
tcagcttcga tctccctctc ccggtaagct ggttaagttc ctggtcgaga acggcgacca 4020
cgtgcgagcc aaccagccct atgccgagat tgaggtcatg aagatgtaca tgactctcac 4080
tgctcaggag gacggtattg tccagctgat gaagcagccc ggttccacca tcgaggctgg 4140
cgacatcctc ggtatcttgg cccttgatga tccttccaag gtcaagcatg ccaagccctt 4200
tgagggccag cttcccgagc ttggaccccc cactctcagc ggtaacaagc ctcatcagcg 4260
atacgagcac tgccagaacg tgctccataa cattctgctt ggtttcgata accaggtggt 4320
gatgaagtcc actcttcagg agatggttgg tctgctccga aaccctgagc ttccttatct 4380
ccagtgggct catcaggtgt cttctctgca cacccgaatg agcgccaagc tggatgctac 4440
tcttgctggt ctcattgaca aggccaagca gcgaggtggc gagtttcctg ccaagcagct 4500
tctgcgagcc cttgagaagg aggcgagctc tggcgaggtc gatgcgctct tccagcaaac 4560
tcttgctcct ctgtttgacc ttgctcgaga gtaccaggac ggtcttgcta tccacgagct 4620
tcaggttgct gcaggccttc tgcaggccta ctacgactct gaggcccggt tctgcggacc 4680
caacgtacgt gacgaggatg tcattctcaa gcttcgagag gagaaccgag attctcttcg 4740
aaaggttgtg atggcccagc tgtctcattc tcgagtcgga gccaagaaca accttgtgct 4800
ggcccttctc gatgaataca aggtggccga ccaggctggc accgactctc ctgcctccaa 4860
cgtgcacgtt gcaaagtact tgcgacctgt gctgcgaaag attgtggagc tggaatctcg 4920
agcttctgcc aaggtatctc tgaaagcccg agagattctc atccagtgcg ctctgccctc 4980
tctaaaggag cgaactgacc agcttgagca cattctgcga tcttctgtcg tcgagtctcg 5040
atacggagag gttggtctgg agcaccgaac tccccgagcc gatattctca aggaggttgt 5100
cgactccaag tacattgtct ttgatgtgct tgcccagttc tttgcccacg atgatccctg 5160
gatcgtcctt gctgccctgg agctgtacat ccgacgagct tgcaaggcct actccatcct 5220
ggacatcaac taccaccagg actcggacct gcctcccgtc atctcgtggc gatttagact 5280
gcctaccatg tcgtctgctt tgtacaactc agtagtgtct tctggctcca aaacccccac 5340
ttccccctcg gtgtctcgag ctgattccgt ctccgacttt tcgtacaccg ttgagcgaga 5400
ctctgctccc gctcgaaccg gagcgattgt tgccgtgcct catctggatg atctggagga 5460
tgctctgact cgtgttctgg agaacctgcc caaacggggc gctggtcttg ccatctctgt 5520
tggtgctagc aacaagagtg ccgctgcttc tgctcgtgac gctgctgctg ctgccgcttc 5580
atccgttgac actggcctgt ccaacatttg caacgttatg attggtcggg ttgatgagtc 5640
tgatgacgac gacactctga ttgcccgaat ctcccaggtc attgaggact ttaaggagga 5700
ctttgaggcc tgttctctgc gacgaatcac cttctccttc ggcaactccc gaggtactta 5760
tcccaagtat ttcacgttcc gaggccccgc atacgaggag gaccccacta tccgacacat 5820
tgagcctgct ctggccttcc agctggagct cgcccgtctg tccaacttcg acatcaagcc 5880
tgtccacacc gacaaccgaa acatccacgt gtacgaggct actggcaaga acgctgcttc 5940
cgacaagcgg ttcttcaccc gaggtatcgt acgacctggt cgtcttcgag agaacatccc 6000
cacctcggag tatctcattt ccgaggctga ccggctcatg agcgatattt tggacgctct 6060
agaggtgatt ggaaccacca actcggatct caaccacatt ttcatcaact tctcagccgt 6120
ctttgctctg aagcccgagg aggttgaagc tgcctttggc ggtttcctgg agcgatttgg 6180
ccgacgtctg tggcgacttc gagtcaccgg tgccgagatc cgaatgatgg tatccgaccc 6240
cgaaactggc tctgctttcc ctctgcgagc aatgatcaac aacgtctctg gttacgttgt 6300
gcagtctgag ctgtacgctg aggccaagaa cgacaagggc cagtggattt tcaagtctct 6360
gggcaagccc ggctccatgc acatgcggtc tatcaacact ccctacccca ccaaggagtg 6420
gctgcagccc aagcggtaca aggcccatct gatgggtacc acctactgct atgacttccc 6480
cgagctgttc cgacagtcca ttgagtcgga ctggaagaag tatgacggca aggctcccga 6540
cgatctcatg acttgcaacg agctgattct cgatgaggac tctggcgagc tgcaggaggt 6600
gaaccgagag cccggcgcca acaacgtcgg tatggttgcg tggaagtttg aggccaagac 6660
ccccgagtac cctcgaggcc gatctttcat cgtggtggcc aacgatatca ccttccagat 6720
tggttcgttt ggccctgctg aggaccagtt cttcttcaag gtgacggagc tggctcgaaa 6780
gctcggtatt cctcgaatct atctgtctgc caactctggt gctcgaatcg gcattgctga 6840
cgagctcgtt ggcaagtaca aggttgcgtg gaacgacgag actgacccct ccaagggctt 6900
caagtacctt tacttcaccc ctgagtctct tgccaccctc aagcccgaca ctgttgtcac 6960
cactgagatt gaggaggagg gtcccaacgg cgtggagaag cgtcatgtga tcgactacat 7020
tgtcggagag aaggacggtc tcggagtcga gtgtctgcgg ggctctggtc tcattgcagg 7080
cgccacttct cgagcctaca aggatatctt cactctcact cttgtcacct gtcgatccgt 7140
tggtatcggt gcttaccttg ttcgtcttgg tcaacgagcc atccagattg agggccagcc 7200
catcattctc actggtgccc ccgccatcaa caagctgctt ggtcgagagg tctactcttc 7260
caacttgcag cttggtggta ctcagatcat gtacaacaac ggtgtgtctc atctgactgc 7320
ccgagatgat ctcaacggtg tccacaagat catgcagtgg ctgtcataca tccctgcttc 7380
tcgaggtctt ccagtgcctg ttctccctca caagaccgat gtgtgggatc gagacgtgac 7440
gttccagcct gtccgaggcg agcagtacga tgttagatgg cttatttctg gccgaactct 7500
cgaggatggt gctttcgagt ctggtctctt tgacaaggac tctttccagg agactctgtc 7560
tggctgggcc aagggtgttg ttgttggtcg agctcgtctt ggcggcattc ccttcggtgt 7620
cattggtgtc gagactgcga ccgtcgacaa tactacccct gccgatcccg ccaacccgga 7680
ctctattgag atgagcacct ctgaagccgg ccaggtttgg taccccaact cggccttcaa 7740
gacctctcag gccatcaacg acttcaacca tggtgaggcg cttcctctca tgattcttgc 7800
taactggcga ggcttttctg gtggtcagcg agacatgtac aatgaggttc tcaagtacgg 7860
atctttcatt gttgatgctc tggttgacta caagcagccc atcatggtgt acatccctcc 7920
caccggtgag ctgcgaggtg gttcttgggt tgtggttgac cccaccatca actcggacat 7980
gatggagatg tacgctgacg tcgagtctcg aggtggtgtg ctggagcccg agggaatggt 8040
cggtatcaag taccgacgag acaagctact ggacaccatg gctcgtctgg atcccgagta 8100
ctcctctctc aagaagcagc ttgaggagtc tcccgattct gaggagctca aggtcaagct 8160
cagcgtgcga gagaagtctc tcatgcccat ctaccagcag atctccgtgc agtttgccga 8220
cttgcatgac cgagctggcc gaatggaggc caagggtgtc attcgtgagg ctcttgtgtg 8280
gaaggatgct cgtcgattct tcttctggcg aatccgacga cgattagtcg aggagtacct 8340
cattaccaag atcaatagca ttctgccctc ttgcactcgg cttgagtgtc tggctcgaat 8400
caagtcgtgg aagcctgcca ctcttgatca gggctctgac cggggtgttg ccgagtggtt 8460
tgacgagaac tctgatgccg tctctgctcg actcagcgag ctcaagaagg acgcttctgc 8520
ccagtcgttt gcttctcaac tgagaaagga ccgacagggt actctccagg gcatgaagca 8580
ggctctcgct tctctttctg aggctgagcg ggctgagctg ctcaaggggt tgtgatcatg 8640
taattagtta tgtcacgctt acattcacgc cctccctcca catccgctct aaccgaaaag 8700
gaaggagtta gacaacctga agtctaggtc cctatttatt tttttatagt tatgttagta 8760
ttaagaacgt tatttatatt tcaaattttt cttttttttc tgtacagacg cgtgtacgca 8820
tgtaacatta tactgaaaac cttgcttgag aaggttttgg gacgctcgaa ggctttaatt 8880
tgc 8883
<210> 60
<211> 9095
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
ggccgcatcg cttcggataa ctcctgctat acgaagttat acgcgcccag agagccattg 60
acgttctttc taatttggac cgatagccgt atagtccagt ctatctataa gttcaactaa 120
ctcgtaacta ttaccataac atatacttca ctgccccaga taaggttccg ataaaaagtt 180
ctgcagacta aatttatttc agtctcctct tcaccaccaa aatgccctcc tacgaagctc 240
gagctaacgt ccacaagtcc gcctttgccg ctcgagtgct caagctcgtg gcagccaaga 300
aaaccaacct gtgtgcttct ctggatgtta ccaccaccaa ggagctcatt gagcttgccg 360
ataaggtcgg accttatgtg tgcatgatca agacccatat cgacatcatt gacgacttca 420
cctacgccag cactgtgctc cccctcaagg aacttgctct taagcacggt ttcttcctgt 480
tcgaggacag aaagttcgca gatattggca acactgtcaa gcaccagtac aagaacggtg 540
tctaccgaat cgccgagtgg tccgatatca ccaacgccca cggtgtaccc ggaaccggaa 600
tcattgctgg cctgcgagct ggtgccgagg aaactgtctc tgaacagaag aaggaggacg 660
tctctgacta cgagaactcc cagtacaagg agttcctggt cccctctccc aacgagaagc 720
tggccagagg tctgctcatg ctggccgagc tgtcttgcaa gggctctctg gccactggcg 780
agtactccaa gcagaccatt gagcttgccc gatccgaccc cgagtttgtg gttggcttcg 840
ttgcccagaa ccgacctaag ggcgactctg aggactggct tattctgacc cccggggtgg 900
gtcttgacga caagggagac gctctcggac agcagtaccg aactgttgag gatgtcatgt 960
ctaccggaac ggatatcata attgtcggcc gaggtctgta cggccagaac cgagatccta 1020
tcgaggaggc caagcgatac cagaaggctg gctgggaggc ttaccagaag attaactgtt 1080
agaggttaga ctatggatat gtaatttaac tgtgtatata gagagcgtgc aagtatggag 1140
cgcttgttca gcttgtatga tggtcagacg acctgtctga tcgagtatgt atgatactgc 1200
acaacctgtg tatccgcatg atctgtccaa tggggcatgt tgttgtgttt ctcgagaata 1260
acttcgtatg atgtatgcta tacgaagtta tgcgatcgca gagaccgggt tggcggcgta 1320
tttgtgtccc aaaaaacagc cccaattgcc ccaattgacc ccaaattgac ccagtagcgg 1380
gcccaacccc ggcgagagcc cccttcaccc cacatatcaa acctcccccg gttcccacac 1440
ttgccgttaa gggcgtaggg tactgcagtc tggaatctac gcttgttcag actttgtact 1500
agtttctttg tctggccatc cgggtaaccc atgccggacg caaaatagac tactgaaaat 1560
ttttttgctt tgtggttggg actttagcca agggtataaa agaccaccgt ccccgaatta 1620
cctttcctct tcttttctct ctctccttgt caactcacac ccgaaatcgt taagcatttc 1680
cttctgagta taagaatcat tcaaaatggt gagtttcaga ggcagcagca attgccacgg 1740
gctttgagca cacggccggg tgtggtccca ttcccatcga cacaagacgc cacgtcatcc 1800
gaccagcact ttttgcagta ctaaccgcag atttatgact atcgactcac aatactacaa 1860
gtcgcgagac aaaaacgaca cggcacccaa aatcgcggga atccgatatg ccccgctatc 1920
gacaccatta ctcaaccgat gtgagacctt ctctctggtc tggcacattt tcagcattcc 1980
cactttcctc acaattttca tgctatgctg cgcaattcca ctgctctggc catttgtgat 2040
tgcgtatgta gtgtacgctg ttaaagacga ctccccgtcc aacggaggag tggtcaagcg 2100
atactcgcct atttcaagaa acttcttcat ctggaagctc tttggccgct acttccccat 2160
aactctgcac aagacggtgg atctggagcc cacgcacaca tactaccctc tggacgtcca 2220
ggagtatcac ctgattgctg agagatactg gccgcagaac aagtacctcc gagcaatcat 2280
ctccaccatc gagtactttc tgcccgcctt catgaaacgg tctctttcta tcaacgagca 2340
ggagcagcct gccgagcgag atcctctcct gtctcccgtt tctcccagct ctccgggttc 2400
tcaacctgac aagtggatta accacgacag cagatatagc cgtggagaat catctggctc 2460
caacggccac gcctcgggct ccgaacttaa cggcaacggc aacaatggca ccactaaccg 2520
acgacctttg tcgtccgcct ctgctggctc cactgcatct gattccacgc ttcttaacgg 2580
gtccctcaac tcctacgcca accagatcat tggcgaaaac gacccacagc tgtcgcccac 2640
aaaactcaag cccactggca gaaaatacat cttcggctac cacccccacg gcattatcgg 2700
catgggagcc tttggtggaa ttgccaccga gggagctgga tggtccaagc tctttccggg 2760
catccctgtt tctcttatga ctctcaccaa caacttccga gtgcctctct acagagagta 2820
cctcatgagt ctgggagtcg cttctgtctc caagaagtcc tgcaaggccc tcctcaagcg 2880
aaaccagtct atctgcattg tcgttggtgg agcacaggaa agtcttctgg ccagacccgg 2940
tgtcatggac ctggtgctac tcaagcgaaa gggttttgtt cgacttggta tggaggtcgg 3000
aaatgtcgcc cttgttccca tcatggcctt tggtgagaac gacctctatg accaggttag 3060
caacgacaag tcgtccaagc tgtaccgatt ccagcagttt gtcaagaact tccttggatt 3120
cacccttcct ttgatgcatg cccgaggcgt cttcaactac gatgtcggtc ttgtccccta 3180
caggcgaccc gtcaacattg tggttggttc ccccattgac ttgccttatc tcccacaccc 3240
caccgacgaa gaagtgtccg aataccacga ccgatacatc gccgagctgc agcgaatcta 3300
caacgagcac aaggatgaat atttcatcga ttggaccgag gagggcaaag gagccccaga 3360
gttccgaatg attgagtaaa aattcatgta attagttatg tcacgcttac attcacgccc 3420
tccctccaca tccgctctaa ccgaaaagga aggagttaga caacctgaag tctaggtccc 3480
tatttatttt tttatagtta tgttagtatt aagaacgtta tttatatttc aaatttttct 3540
tttttttctg tacagacgcg tgtacgcatg taacattata ctgaaaacct tgcttgagaa 3600
ggttttggga cgctcgaagg ctttaatttg catcgcggag tttggcgccc gttttttcga 3660
gccccacacg tttcggtgag tatgagcggc ggcagattcg agcgtttccg gtttccgcgg 3720
ctggacgaga gcccatgatg ggggctccca ccaccagcaa tcagggccct gattacacac 3780
ccacctgtaa tgtcatgctg ttcatcgtgg ttaatgctgc tgtgtgctgt gtgtgtgtgt 3840
tgtttggcgc tcattgttgc gttatgcagc gtacaccaca atattggaag cttattagcc 3900
tttctatttt ttcgtttgca aggcttaaca acattgctgt ggagagggat ggggatatgg 3960
aggccgctgg agggagtcgg agaggcgttt tggagcggct tggcctggcg cccagctcgc 4020
gaaacgcacc taggaccctt tggcacgccg aaatgtgcca cttttcagtc tagtaacgcc 4080
ttacctacgt cattccatgc atgcatgttt gcgccttttt tcccttgccc ttgatcgcca 4140
cacagtacag tgcactgtac agtggaggtt ttgggggggt cttagatggg agctaaaagc 4200
ggcctagcgg tacactagtg ggattgtatg gagtggcatg gagcctaggt ggagcctgac 4260
aggacgcacg accggctagc ccgtgacaga cgatgggtgg ctcctgttgt ccaccgcgta 4320
caaatgtttg ggccaaagtc ttgtcagcct tgcttgcgaa cctaattccc aattttgtca 4380
cttcgcaccc ccattgatcg agccctaacc cctgcccatc aggcaatcca attaagctcg 4440
cattgtctgc cttgtttagt ttggctcctg cccgtttcgg cgtccacttg cacaaacaca 4500
aacaagcatt atatataagg ctcgtctctc cctcccaacc acactcactt ttttgcccgt 4560
cttcccttgc taacacaaaa gtcaagaaca caaacaacca ccccaacccc cttacacaca 4620
agacatatct acagcattta tggtgaaaaa cgtggaccaa gtggatctct cgcaggtcga 4680
caccattgcc tccggccgag atgtcaacta caaggtcaag tacacctccg gcgttaagat 4740
gagccagggc gcctacgacg acaagggccg ccacatttcc gagcagccct tcacctgggc 4800
caactggcac cagcacatca actggctcaa cttcattctg gtgattgcgc tgcctctgtc 4860
gtcctttgct gccgctccct tcgtctcctt caactggaag accgccgcgt ttgctgtcgg 4920
ctattacatg tgcaccggtc tcggtatcac cgccggctac caccgaatgt gggcccatcg 4980
agcctacaag gccgctctgc ccgttcgaat catccttgct ctgtttggag gaggagctgt 5040
cgagggctcc atccgatggt gggcctcgtc tcaccgagtc caccaccgat ggaccgactc 5100
caacaaggac ccttacgacg cccgaaaggg attctggttc tcccactttg gctggatgct 5160
gcttgtgccc aaccccaaga acaagggccg aactgacatt tctgacctca acaacgactg 5220
ggttgtccga ctccagcaca agtactacgt ttacgttctc gtcttcatgg ccattgttct 5280
gcccaccctc gtctgtggct ttggctgggg cgactggaag ggaggtcttg tctacgccgg 5340
tatcatgcga tacacctttg tgcagcaggt gactttctgt gtcaactccc ttgcccactg 5400
gattggagag cagcccttcg acgaccgacg aactccccga gaccacgctc ttaccgccct 5460
ggtcaccttt ggagagggct accacaactt ccaccacgag ttcccctcgg actaccgaaa 5520
cgccctcatc tggtaccagt acgaccccac caagtggctc atctggaccc tcaagcaggt 5580
tggtctcgcc tgggacctcc agaccttctc ccagaacgcc atcgagcagg gtctcgtgca 5640
gcagcgacag aagaagctgg acaagtggcg aaacaacctc aactggggta tccccattga 5700
gcagctgcct gtcattgagt ttgaggagtt ccaagagcag gccaagaccc gagatctggt 5760
tctcatttct ggcattgtcc acgacgtgtc tgcctttgtc gagcaccacc ctggtggaaa 5820
ggccctcatt atgagcgccg tcggcaagga cggtaccgct gtcttcaacg gaggtgtcta 5880
ccgacactcc aacgctggcc acaacctgct tgccaccatg cgagtttcgg tcattcgagg 5940
cggcatggag gttgaggtgt ggaagactgc ccagaacgaa aagaaggacc agaacattgt 6000
ctccgatgag agtggaaacc gaatccaccg agctggtctc caggccaccc gggtcgagaa 6060
ccccggtatg tctggcatgg ctgcttagaa atgcagtttg tttagcaaaa tatatttaac 6120
gagtttgata gaggcgctgg actacataat tactgaatca cgcgtacatg tttcagctca 6180
aattgtatca cggtttcttt gtagcaatgg agggggagag ttgacaaggc attagagaag 6240
agagcgagag gagaagacaa gtggatagac gactgcaatc atatgatctg cacaaactgc 6300
gatgttttcc tgtcagatca tgttcttttg ctcatagtta agctatcgtg actttacgga 6360
tccgccgagc atcttagtag cgaggtttgc ggtctgggct gatcggcttt tgttgatcgg 6420
gttcggaacg aattagaagt gggtcgatag caatgatcaa ttcggggtga gtgagtgcgg 6480
ttagtgggaa accggggaga tactgtgggg atttagggga cagtgttaag aagaggaagg 6540
ggtgagggag gtgaggtgag ggagagggaa gtatagaggt ttatgtagta acatcaatca 6600
tacagtttaa actgcaccca acaataaatg ggtagggttg caccaacaaa gggatgggat 6660
ggggggtaga agatacgagg ataacggggc tcaatggcac aaataagaac gaatactgcc 6720
attaagactc gtgatccagc gactgacacc attgcatcat ctaagggcct caaaactacc 6780
tcggaactgc tgcgctgatc tggacaccac agaggttccg agcactttag gttgcaccaa 6840
atgtcccacc aggtgcaggc agaaaacgct ggaacagcgt gtacagtttg tcttagcaaa 6900
aagtgaaggc gctgaggtcg agcagggtgg tgtgacttgt tatagccttt agagctgcga 6960
aagcgcgtat ggatttggct catcaggcca gattgagggt ctgtggacac atgtcatgtt 7020
agtgtacttc aatcgccccc tggatatagc cccgacaata ggccgtggcc tcattttttt 7080
gccttccgca catttccatt gctcggtacc cacaccttgc ttctcctgca cttgccaacc 7140
ttaatactgg tttacattga ccaacatctt acaagcgggg ggcttgtcta gggtatatat 7200
aaacagtggc tctcccaatc ggttgccagt ctcttttttc ctttctttcc ccacagattc 7260
gaaatctaaa ctacacatca cacaatgcct gttactgacg tccttaagcg aaagtccggt 7320
gtcatcgtcg gcgacgatgt ccgagccgtg agtatccacg acaagatcag tgtcgagacg 7380
acgcgttttg tgtaatgaca caatccgaaa gtcgctagca acacacactc tctacacaaa 7440
ctaacccaga tgtctagcaa atggtttaat gctatacacc tactggtgtg cccgttgacg 7500
gtactggtag gatatctcat gaacacgtat ggctacggtg cggcgctgca agcaaccctg 7560
aataaggatg gtctggtaaa tgctatgttg gtaaagaaag ggtggttttg gacttccttg 7620
gtcggatggt ggtgtattat acgctaccgt gcggtgccag gggcaaccga cagagaccgg 7680
agacacattg tccagtcatt caaaaggtat gccatactga cagtatggtg gtacgtattc 7740
acgcaaggta tatggtttgg cgtaggcccc atcatggact tggtattcgt atatacgggt 7800
ggccattgtc actatgacgt cttcgatgat gcaggtcacg tgaacgaaga cttccagggt 7860
tctgtcaccc ggaccaatcg cgcgttggcg ctcattcaca atgtcctcac tttgcacgga 7920
caccaccaag aacaccgtca gcaacaactc tgggaccgct ccatagggtc gatccagggc 7980
gccctgcagg cgacgcaacc gaaaacccca aaaaacgtaa cggccagcgc tgccgctgcc 8040
atcaatactt ttattcatga ccagatgcac aggtggcaag gtccgttaac cacctcggca 8100
cagtgcagac gttttggagg ccattgggct ggaggacacg atccatccgg gcacgtgttc 8160
ttggccacct tgatgtgcat gtttcttcta ggtgagctac gtgtgtttgg gcgtcgtgca 8220
ctggttcact tgtacgcgca gaaatggcag cttgtacgat tggtgacccg ccttttcgac 8280
actggaccgc tatggacgtg gcggcggtgt ggcggcggct caatgacctg tggcgcccgt 8340
ttgtggcgtg cgatagtcga gccgcctgtc acgtgcgctg ccgccctgct ccgtttgacg 8400
cgatgcatag catgcgacca cccagtaatc atactgctga cgctattggt cacgtggtta 8460
tggcagctgc tgttgactgc ggtggcgtcc cgtttccaca ccgtacgtga gcacatgtct 8520
ggattgctag ccgcgtacat agtgacaggc cttgtctacg ctcgcgacgc agccgcgcta 8580
cgtccagtat gacgctattt atcactcttt acaacttcta cctcaactat ctactttaat 8640
aaatgaatat cgtttattct ctatgattac tgtatatgcg ttcctctaag acaaatcgaa 8700
accagcatgc gatcgaatgg catacaaaag tttcttccga agttgatcaa tgtcctgata 8760
gtcaggcagc ttgagaagat tgacacaggt ggaggccgta gggaaccgat caacctgtct 8820
accagcgtta cgaatggcaa atgacgggtt caaagccttg aatccttgca atggtgcctt 8880
ggatactgat gtcacaaact taagaagcag ccgcttgtcc tcttcctcga aactctcaaa 8940
cacagtccag aggtccttta tagcttgatc tgtatccaga tagcctccgt aattggtgtg 9000
tgtcttcaaa tcccagacgt ccacattggc atgtcctcca ctgataagca tttgaagttc 9060
atctgcgttg aacattgaga cccacgaagg gtcgc 9095
<210> 61
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
atgccctcct acgaagctcg agctaacgtc cacaagtccg cctttgccgc tcgagtgctc 60
aagctcgtgg cagccaagaa aaccaacctg tgtgcttctc tggatgttac caccaccaag 120
gagctcattg agcttgccga taaggtcgga ccttatgtgt gcatgatcaa gacccatatc 180
gacatcattg acgacttcac ctacgccagc actgtgctcc ccctcaagga acttgctctt 240
aagcacggtt tcttcctgtt cgaggacaga aagttcgcag atattggcaa cactgtcaag 300
caccagtaca agaacggtgt ctaccgaatc gccgagtggt ccgatatcac caacgcccac 360
ggtgtacccg gaaccggaat cattgctggc ctgcgagctg gtgccgagga aactgtctct 420
gaacagaaga aggaggacgt ctctgactac gagaactccc agtacaagga gttcctggtc 480
ccctctccca acgagaagct ggccagaggt ctgctcatgc tggccgagct gtcttgcaag 540
ggctctctgg ccactggcga gtactccaag cagaccattg agcttgcccg atccgacccc 600
gagtttgtgg ttggcttcgt tgcccagaac cgacctaagg gcgactctga ggactggctt 660
attctgaccc ccggggtggg tcttgacgac aagggagacg ctctcggaca gcagtaccga 720
actgttgagg atgtcatgtc taccggaacg gatatcataa ttgtcggccg aggtctgtac 780
ggccagaacc gagatcctat cgaggaggcc aagcgatacc agaaggctgg ctgggaggct 840
taccagaaga ttaactgtta g 861
<210> 62
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
atcgcttcgg ataactcctg ctatacgaag ttat 34
<210> 63
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
ataacttcgt atgatgtatg ctatacgaag ttat 34

Claims (10)

1.一种核酸分子，包含有以下基因的核酸序列：
(Ⅰ)β-胡萝卜素合成途径相关基因；
(Ⅱ)磷酸转酮酶途径相关基因；
(Ⅲ)脂滴合成途径相关基因。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述脂滴合成途径相关基因包括以下基因的至少一种：
(1)乙酰辅酶A酸化酶基因ACC1；
(2)二酰基甘油酰基转移酶基因DAG1；
(3)Δ-9硬脂酰辅酶A去饱和酶基因SCD；
(4)介导脂滴融合的脂肪存储诱导跨膜蛋白基因FIT。
3.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述β-胡萝卜素合成途径相关基因包括以下基因的至少一种：
(1)催化乙酰辅酶A缩合成乙酰乙酰辅酶A的基因AtoB；
(2)催化乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A缩合成HMG-CoA的基因HMGS；
(3)催化HMG-CoA还原为甲羟戊酸的基因tHMGR；
(4)催化甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸-5-磷酸的基因ERG12；
(5)催化甲羟戊酸-5-磷酸生成甲羟戊酸-5-焦磷酸的基因ERG8；
(6)催化甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧生成异戊二烯焦磷酸的基因ERG19；
(7)催化异戊二烯焦磷酸异构为二甲基烯丙基焦磷酸的基因IDI；
(8)催化异戊烯焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸生成法尼基焦磷酸的基因ERG20；
(9)催化法尼基焦磷酸结合一分子异戊二烯焦磷酸生成双香叶基焦磷酸的基因GGS1；
(10)催化茄红素脱氢生成番茄红素的基因CarB；
(11)催化两分子双香叶基焦磷酸生成茄红素以及催化番茄红素环化生成β-胡萝卜素的基因CarRP。
4.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述磷酸转酮酶途径相关基因包括以下基因的至少一种：
(1)催化果糖6磷酸或木酮糖5磷酸生成乙酰磷酸的基因PK；
(2)催化乙酰磷酸生成乙酰辅酶A的基因PTA。
5.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述基因的上游连接有启动子序列，所述基因的下游优选连接有终止子序列。
6.一种表达***，包含有权利要求1至5任一项所述的核酸分子。
7.一种细胞，包含有权利要求1至5任一项所述的核酸分子或权利要求6所述的表达***；所述核酸分子优选***于所述细胞的基因组中。
8.根据权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述细胞为酵母细胞，优选为解脂耶氏酵母。
9.一种重组工程菌，保藏编号为为CCTCC NO：M 2020606，其命名为ZTQ5320。
10.一种生产β-胡萝卜素的方法，通过培养权利要求7或8所述的细胞，提取β-胡萝卜素；或，通过发酵权利要求9所述的重组工程菌，提取β-胡萝卜素。
CN202011341160.4A 2020-11-25 2020-11-25 一种提高β-胡萝卜素产量的基因工程菌及其应用 Active CN113151340B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011341160.4A CN113151340B (zh) 2020-11-25 2020-11-25 一种提高β-胡萝卜素产量的基因工程菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011341160.4A CN113151340B (zh) 2020-11-25 2020-11-25 一种提高β-胡萝卜素产量的基因工程菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113151340A true CN113151340A (zh) 2021-07-23
CN113151340B CN113151340B (zh) 2023-03-24

Family

ID=76882571

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011341160.4A Active CN113151340B (zh) 2020-11-25 2020-11-25 一种提高β-胡萝卜素产量的基因工程菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113151340B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114277040A (zh) * 2021-12-24 2022-04-05 江南大学 一种高效合成β-胡萝卜素菌株的构建方法及其应用
CN114317307A (zh) * 2021-12-30 2022-04-12 广州智特奇生物科技股份有限公司 一种可提高虾青素生物合成产量的基因工程菌及其构建方法与应用
CN115029257A (zh) * 2022-05-05 2022-09-09 南京工业大学 产β-胡萝卜素的重组解脂耶氏酵母及其构建方法和应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070015237A1 (en) * 2005-03-18 2007-01-18 Richard Bailey Production of carotenoids in oleaginous yeast and fungi
US20090175911A1 (en) * 2005-12-06 2009-07-09 Royal Holloway And Bedford New College Bacterial Production of Carotenoids
CN104372017A (zh) * 2014-11-05 2015-02-25 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种提高基因工程菌异戊二烯及其衍生物产量的方法及应用
CN105316246A (zh) * 2014-06-03 2016-02-10 上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司 β-胡萝卜素高产菌种及其应用
CN106987550A (zh) * 2017-05-18 2017-07-28 陕西师范大学 一种产β‑胡萝卜素的重组菌及其构建方法和应用
CN110628806A (zh) * 2019-09-23 2019-12-31 华南理工大学 一种高产β-紫罗兰酮基因工程菌及其构建方法和应用
CN111321087A (zh) * 2020-02-21 2020-06-23 华东理工大学 一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070015237A1 (en) * 2005-03-18 2007-01-18 Richard Bailey Production of carotenoids in oleaginous yeast and fungi
US20090175911A1 (en) * 2005-12-06 2009-07-09 Royal Holloway And Bedford New College Bacterial Production of Carotenoids
CN105316246A (zh) * 2014-06-03 2016-02-10 上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司 β-胡萝卜素高产菌种及其应用
CN104372017A (zh) * 2014-11-05 2015-02-25 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种提高基因工程菌异戊二烯及其衍生物产量的方法及应用
CN106987550A (zh) * 2017-05-18 2017-07-28 陕西师范大学 一种产β‑胡萝卜素的重组菌及其构建方法和应用
CN110628806A (zh) * 2019-09-23 2019-12-31 华南理工大学 一种高产β-紫罗兰酮基因工程菌及其构建方法和应用
CN111321087A (zh) * 2020-02-21 2020-06-23 华东理工大学 一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JINPENG WANG ET AL.: "Metabolic engineering for increased lipid accumulation in Yarrowia lipolytica– A Review", 《BIORESOURCE TECHNOLOGY》 *
SIMON ARHAR ET AL.: "Common aspects in the engineering of yeasts for fatty acid- and isoprene-based products", 《BBA - MOLECULAR AND CELL BIOLOGY OF LIPIDS》 *
杨晴玉: "解脂耶氏酵母乙酰CoA合成途径的重塑及其在β-紫罗兰酮生产中的应用研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114277040A (zh) * 2021-12-24 2022-04-05 江南大学 一种高效合成β-胡萝卜素菌株的构建方法及其应用
CN114277040B (zh) * 2021-12-24 2023-08-25 江南大学 一种高效合成β-胡萝卜素菌株的构建方法及其应用
CN114317307A (zh) * 2021-12-30 2022-04-12 广州智特奇生物科技股份有限公司 一种可提高虾青素生物合成产量的基因工程菌及其构建方法与应用
CN114317307B (zh) * 2021-12-30 2024-05-10 广州智特奇生物科技股份有限公司 一种可提高虾青素生物合成产量的基因工程菌及其构建方法与应用
CN115029257A (zh) * 2022-05-05 2022-09-09 南京工业大学 产β-胡萝卜素的重组解脂耶氏酵母及其构建方法和应用
CN115029257B (zh) * 2022-05-05 2023-09-26 南京工业大学 产β-胡萝卜素的重组解脂耶氏酵母及其构建方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113151340B (zh) 2023-03-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113151340B (zh) 一种提高β-胡萝卜素产量的基因工程菌及其应用
JP3894119B2 (ja) プレニルアルコールの製造方法
EA019482B1 (ru) Клетка, ферментирующая сахар-пентозу
CN111321087A (zh) 一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用
CN112831427B (zh) 一株高产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母及其应用
CN111434773A (zh) 一种高产檀香油的重组酵母菌及其构建方法与应用
CN108676766A (zh) 基因修饰的应用及其获得的菌株
Marques et al. Combined engineering of disaccharide transport and phosphorolysis for enhanced ATP yield from sucrose fermentation in Saccharomyces cerevisiae
CN110804561B (zh) 一种高产c6-c10乙基酯的酿酒酵母及其构建方法与用途
CN114058525A (zh) 一种高产角鲨烯基因工程菌及其构建方法与应用
CN114214218A (zh) 一种产虾青素的工程菌及其制备方法和应用
CN112608936B (zh) 调控酵母外源基因表达的启动子，调控方法及其应用
CN114107078A (zh) 一种高产瓦伦烯基因工程菌及其构建方法与应用
CN110791439B (zh) 一株基因工程构建发酵生产苹果酸的重组黑曲霉菌株及应用
CN114317307B (zh) 一种可提高虾青素生物合成产量的基因工程菌及其构建方法与应用
CN114107079B (zh) 一种耐油酿酒酵母基因工程菌及其构建方法
CN114525215B (zh) 产萜类化合物的重组菌株及其构建方法和发酵产萜类化合物的方法及应用
CN114806913B (zh) 具有线粒体定位还原tca途径的高产琥珀酸酵母工程菌株及其构建方法和应用
CN111849790B (zh) 重组顶头孢霉工程菌及其构建方法和应用
CN108913732B (zh) 一种莫纳可林j异源生产的方法及应用
CN111363709B (zh) 一种提高异戊二烯产量的基因工程菌及其构建方法与应用
CN114606146B (zh) 一种生产d-柠檬烯的酵母及其应用
CN111548980A (zh) 一种重组红霉素工程菌及其构建方法和筛选方法和应用
CN114806911B (zh) 一种利用解脂耶氏酵母线粒体途径定位合成α-红没药烯的方法
CN114015634B (zh) 高产琥珀酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant