CN103865818A

CN103865818A - 一种产虾青素基因工程菌的构建方法

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Publication number: CN103865818A
Application number: CN201210526173.8A
Authority: CN
Inventors: 朱丽; 蒋宇; 高书良; 夏兴; 杨晟; 戈梅
Original assignee: SHANGHAI RESEARCH AND DEVELOPMENT CENTER OF INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGY; Shanghai Laiyi Biomedical Research And Development Center LLC
Current assignee: SHANGHAI RESEARCH AND DEVELOPMENT CENTER OF INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGY; Shanghai Laiyi Biomedical Research And Development Center LLC
Priority date: 2012-12-07
Filing date: 2012-12-07
Publication date: 2014-06-18

Abstract

本发明公开了一种产虾青素基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：A）构建基因表达模块，所述基因表达模块包括虾青素生产相关的基因、所述虾青素生产相关的基因上游的启动子和所述虾青素生产相关的基因下游的终止子；B）将所述基因表达模块共转化至酿酒酵母中。本发明的方法具有简单快速高效的优点，避免了多级的克隆，也不需要依赖酶切位点，多片段共同转化，同源重组效率高，可以明显缩短工程菌构建时间。

Description

一种产虾青素基因工程菌的构建方法

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体地说，是关于一种产虾青素基因工程菌的构建方法。

背景技术

迄今为止，已报道了600多种类胡萝卜素，来源细菌，藻类，酵母和植物兼有，虾青素是其中之一。虾青素的化学全称为3,3′-二羟基-4,4′-二酮基-β,β’-胡萝卜素，结构式为：

虾青素作为目前最有效的天然着色剂，在食品、纺织行业有着广泛的应用。此外虾青素还是一种极其有效的抗氧化物质，可以保护细胞免于自由基的损伤，由于有着良好的抗癌、增强机体免疫力和抗衰老等重要作用，而倍受医药、保健和化妆品行业关注。

目前生产虾青素的方法主要有化学合成法和微生物发酵法。上世纪80年代，F.Hoffmann-La Roche公司首次完成了虾青素的的化学合成，并成功商品化，但是化学合成工艺较为复杂，同时设备要求比较高，成本较高，并且与天然虾青素相比存在产品结构单一的缺点，导致化学合成生产的虾青素日益遭到消费者的警惕，并开始受到部分国家的立法限制。目前微生物发酵生产虾青素的来源主要是雨生红球藻和红发夫酵母，发酵工艺成熟，并且都成功实现了工业化生产，雨生红球藻的虾青素含量可高达细胞干重的2.0％，而红发夫酵母所产类胡萝卜素中虾青素所占比例可高达85%。与化学合成法相比，微生物发酵法由于其工艺简单，绿色环保，工业生产成本低，产品质量好而愈受各生产公司的青睐。但是雨生红球藻和红发夫酵母均因其菌株自身特性而在一定程度上限制了其进一步的发展以及生产优化，寻找更优良的虾青素生产菌株成为了越来越多研究者的追求目标。

模式菌如大肠杆菌、酿酒酵母等已经被证明是良好的基因工程菌宿主。目前，研究者已经鉴定了包括雨生红球藻，红发夫酵母在内的多种微生物的虾青素合成途径。

酵母的同源重组效率远远高于细菌或是其他的高等真核生物，酵母已作为一种工程菌操作平台，在途径工程和代谢工程领域被广泛用于生物化学途径的异源表达，同时染色体重组获得工程菌，具有遗传稳定，避免外源基因丢失的优点。

Ken等使用酿酒酵母作为宿主菌，构建包含虾青素表达所需基因的多个质粒，然后导入宿主菌并生产虾青素（Ken Ukibe,Keisuke Hashida,NobuyukiYoshida,and Hiroshi Takagi.Metabolic Engineering of Saccharomyces cerevisiaefor Astaxanthin Production and Oxidative Stress Tolerance.APPLIED ANDENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，2009:7205-7211）。然而，这种虾青素基因工程菌构建的方法需要依次将虾青素表达相关的基因整合于酵母菌染色体上，涉及多级克隆，且依赖于合适的酶切位点选择，操作繁琐，周期长。

发明内容

本研究是基于红发夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）的类胡萝卜素合成途径，以及来源于Brevundimonas sp.和Nostoc punctiforme虾青素合成的相关基因，以酿酒酵母为宿主菌，构建了产虾青素基因工程菌。

本发明旨在提供一种产虾青素基因工程菌的构建方法。

本发明的产虾青素基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

A）构建基因表达模块，所述基因表达模块包括虾青素生产相关的基因、所述虾青素生产相关的基因上游的启动子和所述虾青素生产相关的基因下游的终止子；

B）将所述基因表达模块共转化至酿酒酵母中。

根据本发明，所述步骤A）中所述基因表达模块还包括抗性基因、所述抗性基因上游的启动子和所述抗性基因下游的终止子。

根据本发明，所述步骤A）中所述构建基因表达模块包括以下步骤：

A1）通过PCR扩增获得所述虾青素生产相关的基因、所述抗性基因片段、所述虾青素生产相关的基因上游的启动子片段、所述抗性基因上游的启动子片段、所述虾青素生产相关的基因下游的终止子片段和所述抗性基因下游的终止子片段；

A2）以所述虾青素生产相关的基因、所述抗性基因片段、所述虾青素生产相关的基因上游的启动子片段、所述抗性基因上游的启动子片段、所述虾青素生产相关的基因下游的终止子片段和所述抗性基因下游的终止子片段为模板，通过重叠PCR扩增获得基因表达模块。

根据本发明的优选实施例，所述步骤A）中所述虾青素生产相关的基因为crtE、crtYB、crtI、crtZ和crtW。

根据本发明的优选实施例，所述crtE的GenBank登录号为DQ016502.1，所述crtYB的GenBank登录号为AY177204.1，所述crtI的GenBank登录号为AY177424.1，所述crtZ的GenBank登录号为AB181388.1，所述crtW的GenBank登录号为CP001037.1。

根据本发明的优选实施例，所述步骤A）中所述启动子选自ADH1p、TEF1p、TPI1p、PGK1p、FBA1p和PDC1p。

根据本发明的优选实施例，所述启动子来源于酿酒酵母。

根据本发明的优选实施例，所述步骤A）中所述终止子选自TKL1t、ADH1t、ENO2t、TDH2t、CYC1t和TPI1t。

根据本发明的优选实施例，所述终止子来源于酿酒酵母。

根据本发明的优选实施例，所述抗性基因为ble基因。

根据本发明的优选实施例，所述抗性基因来源于pGAPZαA。

本发明的有益效果：将外源基因片段同时转入酵母细胞内，利用酵母自身胞内生物质***一步将各片段组装，并进一步同源整合到设计的染色***置，具有简单快速高效的优点，避免了多级的克隆，也不需要依赖酶切位点，多片段共同转化，同源重组效率高，1~2周即可获得工程菌株，这种良好的酵母基因工程方法可以明显缩短工程菌构建时间。按照本发明的方法获得的基因工程菌的虾青素的发酵产量可达到大约600μg/gDCW，具有良好的工业应用前景。

附图说明

图1为本发明的工程菌的虾青素合成途径，其中，S.c代表酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），X.d代表红发夫酵母（Xanthophyllomycesdendrorhous），BTS1，crtE代表四异戊二烯焦磷酸合成酶，crtI代表八青番茄红素脱氢酶，crtYB代表八青番茄红素合酶/番茄红素环化酶，crtZ代表β-胡萝卜素羟化酶，crtW代表β-胡萝卜素酮酶。

图2为各基因模块在染色体上的整合组装顺序示意图。

图3为本发明的工程菌的PCR验证电泳检测图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

实施例1、实验方案及引物设计

本发明的实验方案设计如下：

在酿酒酵母BY4742（购自EUROSCARF，编号Y10000，菌株信息：MATα；his3△1；leu2△0；lys2△0；ura3△0）中表达虾青素合成途径的5个基因crtE（GenBank：DQ016502.1，来源于Xanthophyllomyces dendrorhous ATCC24202）、crtYB（GenBank：AY177204.1，来源于Xanthophyllomyces dendrorhousATCC24202）、crtI（GenBank：AY177424.1，来源于Xanthophyllomycesdendrorhous ATCC24202）、crtZ（GenBank：AB181388.1，来源于Brevundimonassp.SD212）和crtW（GenBank：CP001037.1，来源于Nostoc punctiforme PCC73102），并同时表达ble基因（Zeocin抗性基因）作为筛选标记，选择酵母染色体δ位点作为整合位点，各基因模块在染色体上的整合组装顺序如图1所示。将各启动子和基因分别编号，如表1所示。

表1、各启动子和基因编号

启动子编号	启动子名称	基因编号	基因名称
				A	TEF1p	1	CrtE
B	TPI1p	2	CrtYB
				C	PGK1p	3	CrtI
D	FBA1p	4	CrtZ
				E	PDC1p	5	CrtW

利用重叠PCR（overlap PCR）的方法构建以下基因表达模块：delta53’-ADH1p-ble-TKL1t，TEFlp-CrtE-ADH1t，TPI1p-CrtYB-ENO2t，PGK1p-CrtI-TDH2t，FBA1p-crtZ-TPI1t，PDC1p-crtW-CYC1t-delta5 5’，即A1B2C3D4E5的组合。

其中，途径构建需PCR扩增的小DNA片段的信息如表2所示。

表2、小DNA片段

按照重叠PCR的技术要求，使用Vector NTI10.0设计PCR引物序列用于扩增以上各小片段，引物序列如表3所示。

表3、引物序列

实施例2、基因工程菌的构建

2.1、质粒pYES2-CrtE，pYES2-CrtYB、pYES2-CrtI、pYES2-CrtZ和pSH62-CrtW的构建

参照文献（Ken Ukibe,Keisuke Hashida,Nobuyuki Yoshida,and HiroshiTakagi.Metabolic Engineering of Saccharomyces cerevisiae for AstaxanthinProduction and Oxidative Stress Tolerance.APPLIED AND ENVIRONMENTALMICROBIOLOGY，2009:7205-7211；Verwaal R,Wang J,Meijnen JP et al.High-level production of Beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae by successivetransformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous.Appl Environ Microbiol,2007,73:4342-4350）的方法，获得crtE、crtYB和crtI基因，并分别***到pYES2.0（购自Invitrogen公司）中，获得质粒pYES2-CrtE，pYES2-CrtYB和pYES2-CrtI，转化到E.coli菌株DH5α，保存质粒。

委托合成公司（南京金斯瑞生物科技有限公司）构建包含CrtZ和CrtW基因片段的质粒pYES2-CrtZ和pSH62-CrtW。首先，采用化学合成DNA序列的方法获得CrtZ和CrtW基因片段，其中，CrtZ序列与Brevundimonas sp.SD212类胡萝卜素基因簇中10188bp～10673bp的crtZ基因序列（GenBank:AB181388.1）相同，CrtW序列与Nostoc punctiforme PCC73102基因组的orf148序列（GenBank：CP001037.1）相同。然后将合成的基因CrtZ***到质粒载体pYES2.0上得到pYES2-CrtZ，将合成的基因CrtW***到质粒载体pSH62（购自EUROSCARF）上得到pSH62-CrtW。

2.2、模板DNA的提取

酿酒酵母BY4742染色体DNA的提取方法如下：挑取饱满单菌落接于3mlYPD液体培养基试管（20ml摇瓶），30℃，220rpm/min，过夜培养约18h左右，收集菌液，使用基因组抽提试剂盒（购自Axygen公司）提取基因组。

质粒的提取方法如下：接种含有相应质粒的DH5α菌于3ml LB液体培养基（20ml摇瓶），其中含有氨苄青霉素终浓度为100μg/ml，37℃，220rpm/min，过夜培养约15h左右，使用质粒重提试剂盒（购自Axygen公司）抽提质粒pGAPZαA（购自Invitrogen公司）、pYES2-CrtE、pYES2-CrtYB、pYES2-CrtI、pYES2-crtZ和pSH62-crtW。

2.3、小DNA片段的PCR扩增

各小DNA片段扩增均使用高保真KOD-Neo-Plus酶（购自TOYOBO东洋纺公司），按照50μl KOD-PCR体系配制PCR扩增反应液（表4）。

表4、小DNA片段的PCR扩增反应液配制体系

PCR程序1如下：

上述PCR程序1用于扩增δ5 3’，δ5 5’，TEF1p，TPI1p，PGK1p，TKL1t，ADH1t，ENO2t，TDH2t，ble，FBA1p，PDC1p，CYC1t，TPI1t，CrtZ，CrtW，crtE片段。

PCR程序2如下：

上述PCR程序2用于扩增ADH1p，crtYB，crtI片段。

将PCR产物使用1%浓度的琼脂糖凝胶电泳分离，割胶，使用凝胶回收试剂盒（购自Axygen公司）纯化回收片段，并使各片段重溶浓度保持相当，保存备用。

2.3、基因表达模块的构建

以2.1中获得的各小DNA片段为模板，采用Overlap PCR构建各基因表达模块delta53’-ADH1p-ble-TKL1t，TEF1p-CrtE-ADH1t，TPI1p-CrtYB-ENO2t，PGK1p-CrtI-TDH2t，FBA1p-crtZ-TPI1t，PDClp-crtW-CYC1t-delta5 5’。使用高保真KOD-Neo-Plus酶（购自TOYOBO东洋纺公司），按照50μl KOD-PCR体系配制PCR扩增反应液（表5）。

表5、基因表达模块的PCR扩增反应液配制体系

Overlap PCR程序如下：

将Overlap PCR产物使用1%浓度的琼脂糖凝胶电泳，割胶，使用凝胶回收试剂盒（购自Axygen公司）纯化回收片段，保存备用与转化。

2.3、基因表达模块共转化酿酒酵母BY4742

采用乙酸锂转化法将基因表达模块delta53’-ADHlp-ble-TKL1t，TEFlp-CrtE-ADH1t，TPI1p-CrtYB-ENO2t，PGKlp-CrtI-TDH2t，FBA1p-crtZ-TPI1t，PDC1p-crtW-CYC1t-delta5 5’共转化酿酒酵母BY4742。

操作方法如下：挑取单菌落接YPD试管，于30℃，230rpm/min培养过夜，转接新鲜25ml YPD培养基（250ml摇瓶），30℃，230rpm/min振荡培养，待菌液OD₆₀₀达到0.8~1.0时，4℃，4000rpm，5min离心收集菌体，倒掉上清，用冰浴无菌水和100m M LiAc分别洗涤菌体，然后用100mM LiAc重悬菌体至细胞浓度约2×10⁹个/mL，制得转化感受态细胞。取50μl感受态细胞，4℃，13000rpm，30s离心收集菌体弃上清，依次加入240μl 50%的PEG6000，36μl 1M的LiAc，50μl单链鱼精DNA（将预先存放的鱼精DNA沸水煮5min，单链化），24μl无菌ddH₂O和浓缩到10μl左右的质粒DNA，涡旋混匀，然后30℃水浴30min，42℃水浴25min，13000rpm，30s离心收集菌体，用枪头吸出上清，加入1mlYPD，重悬菌体，于30℃，230rpm复苏6h以上，复苏后13000rpm，30s离心，100μl无菌水重悬菌体，涂布含有终浓度为200μg/ml的抗生素Zeocin（购自Invitrogen公司）的YPD固体培养基，于30℃培养3~4天。

2.4、鉴定

挑选颜色较深的克隆菌落，接种于3ml YPD液体培养基试管，30℃，220rpm/min，过夜培养约18h左右，取菌液，使用基因组抽提试剂盒（购自Axygen公司）提取基因组，对如图2中所示L1，L2，L3，L4，L5，L6片段进行PCR验证，结果如图3所示，获得一株PCR验证六条带均明亮的基因型阳性克隆。上述构建方法可以重复，这对于本领域的普通技术人员来说是显而易见的。

实施例3、基因工程菌的发酵及虾青素的检测

3.1、发酵

种子培养方法如下：

从培养平板挑取实施例2中筛选获得的阳性克隆的单菌落，接入25ml YPD培养基（250ml摇瓶），30℃，220rpm/min，培养48h。

发酵培养方法如下：

将种子液按照4%的接种比例接入25ml YPD培养基（250ml摇瓶）中，30℃，220rpm/min，培养72h。

3.2、虾青素的提取

虾青素的提取方法如下：

将发酵液转入已称重的离心管，4℃，4000r/min，5min离心，弃上清，无菌水洗涤一次，弃上清，称重。每克湿菌体，对应加入17.5ml预热至55℃的DMSO，混匀，于55℃水浴12min；再加入25ml丙酮，混匀，于45℃水浴浸提15min，4℃，4000r/min离心10min，取上清。

3.3、虾青素的检测

虾青素的检测方法如下：

将提取样品采用分析型Agilent 1100液相***分析虾青素含量，条件如下：

分析柱：色谱柱Diamonsil C18柱，200mm×4.6mm，5μm

柱温：30℃；

检测波长：472nm；

进样量：5μl；

分析时间：13min；

梯度洗脱条件如表6所示。

表6、梯度洗脱条件

3.4、虾青素的产量测定

经过10批次发酵，通过以上步骤构建的基因工程菌的虾青素产量平均可达602μg/gDCW。

实施例4~7、五种不同启动子和基因组合的基因工程菌的构建、发酵及虾青素的检测

保证抗性基因模块组合不变，其他基因顺序不变，并保证各基因的启动子不同，按照实施例1~2中所述的方法构建另外四种启动子和基因按照不同顺序排列组合的基因工程菌，其中，四种启动子和基因组合的排列顺序如下：B1C2D3E4A5、C1D2E3A4B5、D1E2A3B4C5、E1A2B3C4D5。

将上述四种组合的基因工程菌按照实施例3的方法发酵、提取并测定虾青素的产量，结果如表7所示。

表7、五种组合构建的基因工程菌的虾青素的产量（5批平均值）

Claims

1.一种产虾青素基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

B）将所述基因表达模块共转化至酿酒酵母中。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A）中所述基因表达模块还包括抗性基因、所述抗性基因上游的启动子和所述抗性基因下游的终止子。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤A）中所述构建基因表达模块包括以下步骤：

4.如权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述步骤A）中所述虾青素生产相关的基因为crtE、crtYB、crtI、crtZ和crtW。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述crtE的GenBank登录号为DQ016502.1，所述crtYB的GenBank登录号为AY177204.1，所述crtI的GenBank登录号为AY177424.1，所述crtZ的GenBank登录号为AB181388.1，所述crtW的GenBank登录号为CP001037.1。

6.如权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述步骤A）中所述启动子选自ADH1p、TEF1p、TPI1p、PGK1p、FBA1p和PDC1p。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述启动子来源于酿酒酵母。

8.如权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述步骤A）中所述终止子选自TKL1t、ADH1t、ENO2t、TDH2t、CYC1t和TPI1t。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述终止子来源于酿酒酵母。

10.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述抗性基因为ble基因。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述抗性基因来源于pGAPZαA。