CN112899210B - 增强正调控蛋白基因表达以提高井冈霉素发酵水平的方法 - Google Patents

增强正调控蛋白基因表达以提高井冈霉素发酵水平的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112899210B
CN112899210B CN202110250673.2A CN202110250673A CN112899210B CN 112899210 B CN112899210 B CN 112899210B CN 202110250673 A CN202110250673 A CN 202110250673A CN 112899210 B CN112899210 B CN 112899210B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
shjg
validamycin
plasmid
gene fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110250673.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112899210A (zh
Inventor
白林泉
俞钰典
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Jiaotong University
Original Assignee
Shanghai Jiaotong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Jiaotong University filed Critical Shanghai Jiaotong University
Priority to CN202110250673.2A priority Critical patent/CN112899210B/zh
Publication of CN112899210A publication Critical patent/CN112899210A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112899210B publication Critical patent/CN112899210B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/46—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical bound to a cyclohexyl radical, e.g. kasugamycin

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种增强正调控蛋白基因表达以提高井冈霉素发酵水平的方法。通过在吸水链霉菌中，利用强启动子kasOp*分别增强表达正调控蛋白基因SHJG_1109、SHJG_1617、SHJG_5241和SHJG_6272，得到井冈霉素高产突变菌株。增强正调控蛋白基因的表达，可以促进井冈霉素生物合成基因的表达，最终明显提高井冈霉素产量。与出发菌株相比，本发明所得到的高产菌株发酵产量分别提高了56％、18％、55％、8％，实验室摇瓶发酵水平分别达到6.69g/L、5.05g/L、6.64g/L、4.64g/L。

Description

增强正调控蛋白基因表达以提高井冈霉素发酵水平的方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种增强正调控蛋白基因表达以提高井冈霉素发酵水平的方法；具体涉及通过在吸水链霉菌中增强表达正调控蛋白基因SHJG_1109、SHJG_1617、SHJG_5241和SHJG_6272，提高井冈霉素生物合成基因转录水平，从而可提高井冈霉素产量。
背景技术
井冈霉素(又称有效霉素)是一种C7N氨基糖苷类抗生素，主要作为抗真菌药物来防治水稻与其它作物的纹枯病害，在我国以及整个东南亚水稻产区都得到广泛的应用。由于井冈霉素具有高效能、低毒性、无残留等优点，已成为一种理想的生物农药。同时，井冈霉素及其衍生物可作为临床上治疗2型糖尿病的良药——伏格列波糖和阿卡波糖的前体，具有很高的经济附加值。
吸水链霉菌井冈变种5008是我国产井冈霉素的主要菌种，并且在发酵生产中表现出极其显著的温度调控现象。吸水链霉菌5008的正常生长温度为30℃，但是实验中的发酵温度为37℃，工业生产温度甚至高达42℃。相比其正常生长温度，井冈霉素在37℃条件下的产量提高了几十倍。同时，高温发酵能够降低杂菌的污染，减少罐体降温所消耗的能源。井冈霉素的生物合成受温度调控的现象非常特别，目前其它抗生素的生物合成受温度调控的报道甚少。
在本发明研究中，通过大量创造性劳动挖掘到与井冈霉素温敏启动子控调相关的基因SHJG_1109、SHJG_1617、SHJG_5241和SHJG_6272，增强表达这些调控蛋白基因，可以提高井冈霉素生物合成基因转录水平，从而可提高井冈霉素产量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种增强正调控蛋白基因以提高井冈霉素发酵水平的方法。通过在吸水链霉菌5008中增强表达正调控蛋白基因SHJG_1109、SHJG_1617、SHJG_5241和SHJG_6272，可以提高井冈霉素生物合成基因转录水平，从而可提高井冈霉素产量。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明涉及一种提高井冈霉素发酵水平的方法，在吸水链霉菌中增强表达井冈霉素生物合成基因簇转录控调相关的正调控蛋白基因，获得井冈霉素高产菌株，发酵获得井冈霉素。
作为本发明的一个实施方案，所述正调控蛋白基因为正调控蛋白基因SHJG_1109、正调控蛋白基因SHJG_1617、正调控蛋白基因SHJG_5241或正调控蛋白基因SHJG_6272，其序列依次如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。
作为本发明的一个实施方案，所述吸水链霉菌包括吸水链霉菌井冈变种Streptomyces hygroscopicus var.jinggangensis 5008。
作为本发明的一个实施方案，在吸水链霉菌中增强表达正调控蛋白基因具体包括如下步骤：
S1，设计并构建用于增强表达正调控蛋白基因SHJG_1109的整合型质粒I；
S2，设计并构建用于增强表达正调控蛋白基因SHJG_1617的整合型质粒II；
S3，设计并构建用于增强表达正调控蛋白基因SHJG_5241的整合型质粒Ш；
S4，设计并构建用于增强表达正调控蛋白基因SHJG_6272的整合型质粒IV；
S5，通过接合转移将整合型质粒I、II、Ш、IV分别导入受体菌株中，然后对突变株进行硫链丝菌素抗性验证，并提取基因组通过PCR产物片段大小的差异，筛选得到基因表达突变株。
作为本发明的一个实施方案，所述整合型质粒I的具体构建方法是，通过PCR扩增的方式分别从吸水链霉菌5008基因组中获取573bp的SHJG_1109基因片段以及pDR3-K*质粒中获取126bp的强启动子kasOp*基因片段，在载体pPM927的EcoRI位点***126bp的kasOp*基因片段和573bp的SHJG_1109基因片段。
作为本发明的一个实施方案，使用引物GBSHJG_1109-F/R，通过PCR扩增得到SHJG_1109基因。
作为本发明的一个实施方案，使用引物kasOp-F/R,通过PCR扩增得到kasOp*基因。
作为本发明的一个实施方案，所述整合型质粒II的具体构建方法是，通过PCR扩增的方式从吸水链霉菌5008基因组中获取495bp的SHJG_1617基因片段以及pDR3-K*质粒中获取126bp的强启动子kasOp*基因片段，在载体pPM927的EcoRI位点***126bp的kasOp*基因片段和495bp的SHJG_1617基因片段。
所述kasOp*基因序列如SEQ ID NO.5所示。
作为本发明的一个实施方案，使用引物GBSHJG_1617-F/R，通过PCR扩增得到SHJG_1617基因。
作为本发明的一个实施方案，所述整合型质粒Ш的具体构建方法是，通过PCR扩增的方式从吸水链霉菌5008基因组中获取588bp的SHJG_5241基因片段以及pDR3-K*质粒中获取126bp的强启动子kasOp*基因片段，在载体pPM927的EcoRI位点***126bp的kasOp*基因片段和588bp的SHJG_5241基因片段。
作为本发明的一个实施方案，使用引物GBSHJG_5241-F/R，通过PCR扩增得到SHJG_5241基因片段。
作为本发明的一个实施方案，所述整合型质粒IV的具体构建方法是，通过PCR扩增的方式从吸水链霉菌5008基因组中获取642bp的SHJG_6272基因片段以及pDR3-K*质粒中获取126bp的强启动子kasOp*基因片段，在载体pPM927的EcoRI位点***126bp的kasOp*基因片段和642bp的SHJG_6272基因片段。
作为本发明的一个实施方案，使用引物GBSHJG_6272-F/R，通过PCR扩增得到SHJG_6272基因。
作为本发明的一个实施方案，受体菌株为吸水链霉菌井冈变种Streptomyceshygroscopicus var.jinggangensis 5008。所述基因增强表达突变株依次记为基因强化表达突变株YYD-01、YYD-02、YYD-03、YYD-04。
作为本发明的一个实施方案，所述发酵包含下列步骤：将井冈霉素高产菌株在固体培养基上活化，然后将活化后的孢子接种在种子培养基中于28-32℃、200-240rpm的转速下培养40-48小时；按照10％的接种量转接至发酵培养基中于35-39℃、200-240rpm的转速下培养96小时后收取发酵液。作为一个具体实施例，将井冈霉素高产菌株在固体培养基上活化，然后将活化后的孢子接种在种子培养基中于28-32℃、220-240rpm的转速下培养40-48小时；按照10％的接种量转接至发酵培养基中于35-39℃、220-240rpm的转速下培养96小时后收取发酵液。作为具体对比示例，将空载体整合菌株与基因增强表达突变株在固体培养基上活化，然后将活化后的孢子接种在种子培养基中于28-32℃、200-240rpm的转速下培养40-48小时；按照10％的接种量转接至发酵培养基中于35-39℃、200-240rpm的转速下分别培养96小时后收取发酵液。
作为本发明的一个实施方案，所述固体培养基含有质量体积比为1-3％的黄豆饼粉、1-3％的甘露醇、1.6％-2％的琼脂粉。作为具体示例，所述固体培养基含有质量体积比为1-3％的黄豆饼粉、1-3％的甘露醇、1.6-2％的琼脂粉。
作为本发明的一个实施方案，所述种子培养基含有质量体积比为2％-5％的胰酪大豆胨、10％-15％的蔗糖和0.5％-1％的酵母提取物。作为具体示例，所述种子培养基含有质量体积比为3-5％的胰酪大豆胨、7-11％的蔗糖和0.3-1％的酵母提取物。
作为本发明的一个实施方案，所述发酵培养基含有质量体积比为0.06％-0.08％的磷酸二氢钾、0.1％-0.15％的氯化钠、0.05％-0.08％的碳酸钙、0.4％-0.6％的大米粉和0.09％-0.12％的花生粉。作为具体示例，所述发酵培养基含有质量体积比为0.05-0.1％的磷酸二氢钾、0.1-0.2％的氯化钠、0.03-0.1％的碳酸钙、0.2-0.5％的大米粉和0.05-0.1％的花生粉。
本发明还涉及一种高产井冈霉素的吸水链霉菌，在吸水链霉菌中增强表达井冈霉素生物合成基因簇转录控调相关的正调控蛋白基因，获得井冈霉素高产菌株；所述正调控蛋白基因为基因SHJG_1109、基因SHJG_1617、基因SHJG_5241或基因SHJG_6272，其序列依次如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。
本发明还涉及一种用于增强表达井冈霉素生物合成基因簇转录控调相关的正调控蛋白基因的整合型质粒载体，所述载体包含正调控蛋白基因为基因SHJG_1109、基因SHJG_1617、基因SHJG_5241或基因SHJG_6272；其序列依次如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)通过在吸水链霉菌中分别增强表达正调控蛋白基因SHJG_1109、SHJG_1617、SHJG_5241或SHJG_6272，可以提高井冈霉素生物合成基因转录水平，从而可提高井冈霉素产量；
2)本发明中通过在吸水链霉菌中增强表达正调控基因SHJG_1109、SHJG_1617、SHJG_5241或SHJG_6272，得到高产菌株；与出发菌株相比，本发明所得到的高产菌株YYD-01、YYD-02、YYD-03和YYD-04发酵产量分别提高了56％、18％、55％、8％，实验室摇瓶发酵水平分别达到6.69g/L、5.05g/L、6.64g/L、4.64g/L。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为增强表达基因SHJG_1109的质粒构建示意图；
图2为增强表达基因SHJG_1617的质粒构建示意图；
图3为增强表达基因SHJG_5241的质粒构建示意图；
图4为增强表达基因SHJG_6272的质粒构建示意图；
图5为调控蛋白基因增强表达突变株与空载体整合菌株井冈霉素发酵产量示意图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，并给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件或制造厂商的建议条件。
本发明所涉及的质粒pDR3-K*已经在SCI数据库文献《Xinjuan Ning,XinranWang,Yuanting Wu,Qianjin Kang*and Linquan Bai*:Identification and engineeringof post-PKS modification bottlenecks for ansamitocin P-3titer improvement inActinosynnema pretiosum subsp.pretiosum ATCC 31280.Biotechnology Journal2017,12,1700484》中记载。
本发明所涉及的质粒pPM927已经在SCI数据库文献《Smokvina Tamara,MazodierPhilippe,Boccard Frédéric,et al.Construction of a series of pSAM2-basedintegrative vectors for use in actinomycetes.Gene,1990,94(1):53-59》中公开。
本发明所涉及菌株吸水链霉菌井冈变种Streptomyces hygroscopicusvar.jinggangensis5008保藏编号为CGMCC NO.4.1026。
实施例
本实施例为获取正调控基因SHJG_1109、SHJG_1617、SHJG_5241和SHJG_6272增强表达突变株YYD-01、YYD-02、YYD-03、YYD-04的具体过程。具体操作步骤如下：
步骤二：质粒pLQ1651的构建
以吸水链霉菌5008的基因组DNA为模板，使用引物GBSHJG_1109-F/R，通过PCR扩增得到SHJG_1109基因,通过基因测序确认目标基因的正确性；以pDR3-K*质粒为模板，使用kasOp-F/R,通过PCR扩增得到kasOp*基因,通过基因测序确认目标基因的正确性。在载体pPM927的EcoRI位点***酶切后的扩增片段得到质粒PLQ1651。在37℃水浴条件下，采用EcoRI限制性内切酶进行酶切处理可以观察到700bp左右的目标条带，表明质粒构建正确。
步骤三：质粒pLQ1652的构建
以吸水链霉菌5008的基因组DNA为模板，使用引物GBSHJG_1617-F/R，通过PCR扩增得到SHJG_1617基因,通过基因测序确认目标基因的正确性；以pDR3-K*质粒为模板，使用kasOp-F/R,通过PCR扩增得到kasOp*基因,通过基因测序确认目标基因的正确性。在载体pPM927的EcoRI位点***酶切后的扩增片段得到质粒PLQ1652。在37℃水浴条件下，采用EcoRI限制性内切酶进行酶切处理，可以观察到600bp左右的目标条带，表明质粒构建正确。
步骤四：质粒pLQ1653的构建
以吸水链霉菌5008的基因组DNA为模板，使用引物GBSHJG_5241-F/R，通过PCR扩增得到SHJG_5241基因,通过基因测序确认目标基因的正确性；以pDR3-K*质粒为模板，使用kasOp-F/R,通过PCR扩增得到kasOp*基因,通过基因测序确认目标基因的正确性。在载体pPM927的EcoRI位点***酶切后的扩增片段得到质粒PLQ1653。在37℃水浴条件下，采用EcoRI限制性内切酶进行酶切处理，可以观察到700bp左右的目标条带，表明质粒构建正确。
步骤五：质粒pLQ1654的构建
以吸水链霉菌5008的基因组DNA为模板，使用引物GBSHJG_6272-F/R，通过PCR扩增得到SHJG_6272基因,通过基因测序确认目标基因的正确性；以pDR3-K*质粒为模板，使用kasOp-F/R,通过PCR扩增得到kasOp*基因,通过基因测序确认目标基因的正确性。在载体pPM927的EcoRI位点***酶切后的扩增片段得到质粒PLQ1654。在37℃水浴条件下，采用EcoRI限制性内切酶进行酶切处理可以观察到800bp左右的目标条带，表明质粒构建正确。
图1示意了在pPM927中***强启动子kasOp*和目标基因SHJG_1109的过程。具体操作如下：将已构建完成的基因增强表达的质粒pLQ1651转化进入宿主E.coli ET12567(含有pUZ8002质粒)中。取E.coli ET12567于含有30μg/mL安普霉素、50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的LB中37℃过夜培养，用相同的培养基，将过夜培养物按1％的比例转接一次并培养4-5小时至OD600达到0.6-0.8，然后用新鲜的LB溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素。与此同时制备出发菌株5008的新鲜孢子，用新鲜LB溶液漂洗2～3次后，与之前制备的宿主菌E.coli ET12567分别稀释10倍后混合(孢子和宿主菌的比例约为1:1)均匀后涂布于SFM平板，待平板吹干后转移至30℃培养箱培养36小时后取出平板，分别取50mg/mL硫链丝菌素和50mg/mL甲氧苄啶两种抗生素的储存液40μL加入1mL无菌水中，混匀后覆盖在SFM平板上，将平板晾干后转移至30℃培养箱中继续培养。一般3-5天后可见平板上有单菌落接合子长出，将接合子挑出扩大培养，提取基因组，采用kasOp-F和GBSHJG_1109-R为引物，通过PCR和抗性验证的方法验证接合子正确的基因过表达突变株，记为YYD-01。
图2示意了在pPM927中***强启动子kasOp*和目标基因SHJG_1617的过程。具体操作如下：将已构建完成的基因增强表达的质粒pLQ1652转化进入宿主E.coli ET12567(含有pUZ8002质粒)中。取E.coli ET12567于含有30μg/mL安普霉素、50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的LB中37℃过夜培养，用相同的培养基，将过夜培养物按1％的比例转接一次并培养4-5小时至OD600达到0.6-0.8，然后用新鲜的LB溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素。与此同时制备出发菌株5008的新鲜孢子，用新鲜LB溶液漂洗2～3次后，与之前制备的宿主菌E.coli ET12567分别稀释10倍后混合(孢子和宿主菌的比例约为1:1)均匀后涂布于SFM平板，待平板吹干后转移至30℃培养箱培养36小时后取出平板，分别取50mg/mL硫链丝菌素和50mg/mL甲氧苄啶两种抗生素的储存液40μL加入1mL无菌水中，混匀后覆盖在SFM平板上，将平板晾干后转移至30℃培养箱中继续培养。一般3-5天后可见平板上有单菌落接合子长出，将接合子挑出扩大培养，提取基因组，采用kasOp-F和GBSHJG_1617-R为引物，通过PCR和抗性验证的方法验证接合子正确的基因过表达突变株，记为YYD-02。
图3示意了在pPM927中***强启动子kasOp*和目标基因SHJG_5241的过程。具体操作如下：将已构建完成的基因增强表达的质粒pLQ1653转化进入宿主E.coli ET12567(含有pUZ8002质粒)中。取E.coli ET12567于含有30μg/mL安普霉素、50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的LB中37℃过夜培养，用相同的培养基，将过夜培养物按1％的比例转接一次并培养4-5小时至OD600达到0.6-0.8，然后用新鲜的LB溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素。与此同时制备出发菌株5008的新鲜孢子，用新鲜LB溶液漂洗2～3次后，与之前制备的宿主菌E.coli ET12567分别稀释10倍后混合(孢子和宿主菌的比例约为1:1)均匀后涂布于SFM平板，待平板吹干后转移至30℃培养箱培养36小时后取出平板，分别取50mg/mL硫链丝菌素和50mg/mL甲氧苄啶两种抗生素的储存液40μL加入1mL无菌水中混匀，后覆盖在SFM平板上，将平板晾干后转移至30℃培养箱中继续培养。一般3-5天后可见平板上有单菌落接合子长出，将接合子挑出扩大培养，提取基因组，采用kasOp-F和GBSHJG_5241-R为引物，通过PCR和抗性验证的方法验证接合子正确的基因过表达突变株，记为YYD-03。
图4示意了在pPM927中***强启动子kasOp*和目标基因SHJG_6272的过程。具体操作如下：将已构建完成的基因增强表达的质粒pLQ1654转化进入宿主E.coli ET12567(含有pUZ8002质粒)中。取E.coli ET12567于含有30μg/mL安普霉素、50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的LB中37℃过夜培养，用相同的培养基，将过夜培养物按1％的比例转接一次并培养4-5小时至OD600达到0.6-0.8，然后用新鲜的LB溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素。与此同时制备出发菌株5008的新鲜孢子，用新鲜LB溶液漂洗2～3次后，与之前制备的宿主菌E.coli ET12567分别稀释10倍后混合(孢子和宿主菌的比例约为1:1)均匀后涂布于SFM平板，待平板吹干后转移至30℃培养箱培养36小时后取出平板，分别取50mg/mL硫链丝菌素和50mg/mL甲氧苄啶两种抗生素的储存液40μL加入1mL无菌水中，混匀后覆盖在SFM平板上，将平板晾干后转移至30℃培养箱中继续培养。一般3-5天后可见平板上有单菌落接合子长出，将接合子挑出扩大培养，提取基因组，采用kasOp-F和GBSHJG_6272-R为引物，通过PCR和抗性验证的方法验证接合子正确的基因过表达突变株，记为YYD-04。
上述步骤一、二、三中所用到的引物序列如表1所示：
表1
引物名称 碱基序列
GB-SHJG_1109-F tgggggagttatgaccgatggaacgcttcg SEQ ID NO.6
GB-SHJG_1109-R-EcoRI CCGGAATTCtcacgggcggaccatgagac SEQ ID NO.7
GB-SHJG_1617-F tgggggagtttcatggtgttctcctccgag SEQ ID NO.8
GB-SHJG_1617-R-EcoRI CCGGAATTCatgaacaagggttcaccgggcccca SEQ ID NO.9
GB-SHJG_5241-F tgggggagttatgaccacggccaagcgcg SEQ ID NO.10
GB-SHJG_5241-R-EcoRI CCGGAATTCtcagtcctggcgcagcccc SEQ ID NO.11
GB-SHJG_6272-F tgggggagtttcagtggtgctcgctgccgt SEQ ID NO.12
GB-SHJG_6272-R-EcoRI CCGGAATTCgtgacagccatcgagcaaac SEQ ID NO.13
kasOp-F-EcoRI CCGGAATTCtgttcacattcgaacggtct SEQ ID NO.14
kasOp-R GACGTCACCTCTTCAACTCAG SEQ ID NO.15
步骤四，利用HPLC检测井冈霉素的发酵产量
使用Agilent公司的ZORBAX NH2柱进行色谱分析，采用DAD紫外检测器测定210nm下的色谱吸收峰，流动相流速为0.8mL/min；流动相A：98％磷酸盐，流动相B：2％甲醇。柱温：室温。
图5为增强表达正调控蛋白基因SHJG_1109、SHJG_1617、SHJG_5241和SHJG_6272后井冈霉素发酵水平检测结果。结果表明增强表达这些基因之后，井冈霉素发酵水平有明显的提高，和空载体整合菌株相比，本发明所得到的高产菌株YYD-01、YYD-02、YYD-03和YYD-04的发酵产量分别提高了56％、18％、55％、8％，实验室摇瓶发酵水平分别达到6.69g/L、5.05g/L、6.64g/L、4.64g/L。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 增强正调控蛋白基因表达以提高井冈霉素发酵水平的方法
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 573
<212> DNA
<213> 吸水链霉菌5008 (Streptomyces hygroscopicus var. jinggangensis5008)
<400> 1
atgaccgatg gaacgcttcg gccgctgcgg gctgacgcac ggcggaacag ggagaagatc 60
cttacggccg ccgtacgcgt cttcacggcg gaggggctgg atgcgcacct ggaacgcatc 120
gccaaggagg caggcgtggg cagcgcgacc ctgtatcgca acttccccac ccgggaggcc 180
ctgatcgagg cggtctaccg caacgaggtg gcccagctgt gcgatgccgc ccccgccctg 240
cttgcgcaga agccgccggc cgaggccctg cgcgcgtgga cccgcctctt cctggactac 300
gtcaccgcca agtacggcat gatcgacgcc ctgcgcgcca tcgccgcgac gggaggcaat 360
ccttatggtc acagccggga aatgatccag gccgccatca cctcactcat ggaggcttgc 420
atggccgccg gggtgatccg caccgatatc cagcccaccg acatcggcgc cgccctggaa 480
ggcatcgccc tcacctcggc gggtgctgaa caccgacagc aagcggagcg cctgctcgac 540
ctcaccctgg acggtctcat ggtccgcccg tga 573
<210> 2
<211> 495
<212> DNA
<213> 吸水链霉菌5008(Streptomyces hygroscopicus var. jinggangensis5008)
<400> 2
tcatggtgtt ctcctccgag tgctctggtc gttcggtacg gatggagcga gaggtacgtc 60
gagcagggcc gtcagctcgt cggtgaacgc gcgcgtccgc ggggcgtcga ggccaccgag 120
cggctccagc agctgctgga gcagtccctg gaccaccgcg atggcctgcc gcgtgacagc 180
ctgtccttgc tcggtgaggg cgagctgtac ggcgcgcggg tcgcgggggt cgcgggtgcg 240
ctcgatcaga ccggccgact ccaggacgcg cgccagcttc gagacataca gcgcctccag 300
accggtgtgg tcggcgagcc ggcgctggct gggccgctcg ccagcgcgct gcatgccgtg 360
cagcgacgcg accaatacgt actgcgcgtg ggtgagaccc agcggagcca ccgcgcggtc 420
gaccgcgacg cgccacttgt tggcgagccg ccataccagg aagccgggcg tggggcccgg 480
tgaacccttg ttcat 495
<210> 3
<211> 588
<212> DNA
<213> 吸水链霉菌5008(Streptomyces hygroscopicus var. jinggangensis5008)
<400> 3
atgaccacgg ccaagcgcga cacctacacc cccgagacgc tgctctccgt cgccgtccgc 60
gtcttcaacg agcgcggcta cgacggcacc tccatggagc acctgtccaa ggcggccggc 120
atctccaagt cgtcgatata ccaccacgtc agcggcaagg aggagctgct gcgccgggcc 180
gtcagccgcg ccctggacgg cctgttcgcc atcctggagg aggagcacgc gcgcgcgggg 240
cgcccggccg gacggctgga gcacgtcgtg cgccgcatgg tcgaggtgct catagccgag 300
ctgccctatg tgacgctgct gctgcgcgtg cgcggcaaca ccgagaccga gcgctgggcg 360
ctggaacggc gccgcgactt cgaccaccgg gtcgccgagc tgctgaaggc cgcggcggcc 420
gacggggacg tacgcggtga cgtggaggtc cgtctggcca cccggctggt cttcgggatg 480
atcaactcga tcgtggagtg gtaccggccg gacgcgcgcg gcgcgagcgg ccaggaggtg 540
gccgacgccg tcgtccggct ggtcttctcg gggctgcgcc aggactga 588
<210> 4
<211> 642
<212> DNA
<213> 吸水链霉菌5008(Streptomyces hygroscopicus var. jinggangensis5008)
<400> 4
tcagtggtgc tcgctgccgt gcagcgggaa accggcgatg ccgcgccagg ccagcgaggt 60
cagcagctgc accgcctggt cgcgcggcac gctgcggtcg ctgtgcagcc aggagcgggc 120
gaccacctgg gcgagcccgc cgagaccgga ggcgagcagc atcgactccg cgcgcgagag 180
gccggtgtcc tcggcgatga cgtcgcagat cgcctcggcg cactcgttgg tgaccttgtc 240
cacgcgctcg cgcaccgcgg gctcgttcgt caggtccgac tcgaagacca ggcggaaggc 300
gccgccgtcg tcctccacgt aggcgaagta ggcgtccatc gtcgcccgga cgcgctgctt 360
gttgtcggtc gtcgacgcca gtgcgccgcg caccgcctgg atcagcgact cgcagtgctg 420
gtccaggagg gcgaggtaga ggtcgagctt gccggggaag tgctggtaga gcaccggctt 480
gctcacgccg gcccgctcgg cgatgtcgtc catcgccgcc gcgtggtagc cctgcgcgac 540
gaaaacctcc tgagcggcgc ccagcaactg gttccgccgg gctcggcgcg gcagccgggt 600
gccccgtggg cgcgccgcct cagtttgctc gatggctgtc ac 642
<210> 5
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgttcacatt cgaacggtct ctgctttgac aacatgctgt gcggtgttgt aaagtcgtgg 60
ccaggagaat acgacagcgt gcaggactgg gggagttact agtatctgag ttgaagaggt 120
gacgtc 126
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgggggagtt atgaccgatg gaacgcttcg 30
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccggaattct cacgggcgga ccatgagac 29
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgggggagtt tcatggtgtt ctcctccgag 30
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccggaattca tgaacaaggg ttcaccgggc ccca 34
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgggggagtt atgaccacgg ccaagcgcg 29
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccggaattct cagtcctggc gcagcccc 28
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgggggagtt tcagtggtgc tcgctgccgt 30
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccggaattcg tgacagccat cgagcaaac 29
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ccggaattct gttcacattc gaacggtct 29
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gacgtcacct cttcaactca g 21

Claims (8)

1.一种提高井冈霉素发酵水平的方法，其特征在于，在吸水链霉菌中增强表达井冈霉素生物合成基因簇转录控调相关的正调控蛋白基因，获得井冈霉素高产菌株，发酵获得井冈霉素；所述正调控蛋白基因为基因SHJG_1109、基因SHJG_1617、基因SHJG_5241或基因SHJG_6272，其序列依次如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；所述吸水链霉菌为吸水链霉菌井冈变种（Streptomyces hygroscopicus var. jinggangensis）5008，保藏编号为CGMCC NO. 4.1026。
2.如权利要求1所述的提高井冈霉素发酵水平的方法，其特征在于，在吸水链霉菌中增强表达正调控蛋白基因具体包括如下步骤：
S1，设计并构建用于增强表达基因SHJG_1109的整合型质粒I；
S2，设计并构建用于增强表达基因SHJG_1617的整合型质粒II；
S3，设计并构建用于增强表达基因SHJG_5241的整合型质粒Ш；
S4，设计并构建用于增强表达基因SHJG_6272的整合型质粒IV；
S5，通过接合转移将整合型质粒I 、II、Ш、IV分别导入受体菌株中，然后对突变株进行硫链丝菌素抗性验证，并提取基因组通过PCR产物片段大小的差异，筛选得到基因表达突变株。
3.如权利要求2所述的提高井冈霉素发酵水平的方法，其特征在于，所述整合型质粒I的具体构建方法是，通过PCR扩增的方式分别从吸水链霉菌5008基因组中获取573 bp的SHJG_1109基因片段以及pDR3-K*质粒中获取126 bp的强启动子kasOp*基因片段，在载体pPM927的EcoRI位点***126 bp的kasOp* 基因片段和573 bp的SHJG_1109基因片段。
4.如权利要求2所述的提高井冈霉素发酵水平的方法，其特征在于，所述整合型质粒II的具体构建方法是，通过PCR扩增的方式从吸水链霉菌5008基因组中获取495 bp的SHJG_ 1617基因片段以及pDR3-K*质粒中获取126 bp的强启动子kasOp*基因片段，在载体pPM927的EcoRI位点***126 bp的kasOp* 基因片段和495 bp的SHJG_1617基因片段。
5.如权利要求2所述的提高井冈霉素发酵水平的方法，其特征在于，所述整合型质粒Ш的具体构建方法是，通过PCR扩增的方式从吸水链霉菌5008基因组中获取588 bp的SHJG_ 5241基因片段以及pDR3-K*质粒中获取126 bp的强启动子kasOp*基因片段，在载体pPM927的EcoRI位点***126 bp的kasOp* 基因片段和588 bp的SHJG_5241基因片段。
6.如权利要求2所述的提高井冈霉素发酵水平的方法，其特征在于，所述整合型质粒IV的具体构建方法是，通过PCR扩增的方式从吸水链霉菌5008基因组中获取642 bp的SHJG_ 6272基因片段以及pDR3-K*质粒中获取126 bp的强启动子kasOp*基因片段，在载体pPM927的EcoRI位点***126 bp的kasOp* 基因片段和642 bp的SHJG_6272基因片段。
7.如权利要求1所述的提高井冈霉素发酵水平的方法，其特征在于，所述发酵包含下列步骤：将井冈霉素高产菌株在固体培养基上活化，然后将活化后的孢子接种在种子培养基中于28-32°C、200-240 rpm的转速下培养40-48小时；按照10%的接种量转接至发酵培养基中于35-39°C、200-240 rpm的转速下培养96小时后收取发酵液。
8.一种高产井冈霉素的吸水链霉菌，其特征在于，在吸水链霉菌中增强表达井冈霉素生物合成基因簇转录控调相关的正调控蛋白基因，获得井冈霉素高产菌株；所述正调控蛋白基因为基因SHJG_1109、基因SHJG_1617、基因SHJG_5241或基因SHJG_6272，其序列依次如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；所述吸水链霉菌为吸水链霉菌井冈变种（Streptomyces hygroscopicus var. jinggangensis）5008，保藏编号为CGMCCNO. 4.1026。
CN202110250673.2A 2021-03-08 2021-03-08 增强正调控蛋白基因表达以提高井冈霉素发酵水平的方法 Active CN112899210B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110250673.2A CN112899210B (zh) 2021-03-08 2021-03-08 增强正调控蛋白基因表达以提高井冈霉素发酵水平的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110250673.2A CN112899210B (zh) 2021-03-08 2021-03-08 增强正调控蛋白基因表达以提高井冈霉素发酵水平的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112899210A CN112899210A (zh) 2021-06-04
CN112899210B true CN112899210B (zh) 2022-07-26

Family

ID=76107099

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110250673.2A Active CN112899210B (zh) 2021-03-08 2021-03-08 增强正调控蛋白基因表达以提高井冈霉素发酵水平的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112899210B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113444724B (zh) * 2021-05-10 2023-03-17 西南大学 一种启动子及重组载体和用途
CN114540397B (zh) * 2022-03-07 2024-02-27 上海交通大学 增强调控蛋白表达以提高谷氨酰胺转氨酶发酵水平的方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8101732B2 (en) * 2008-09-17 2012-01-24 State Of Oregon Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of Oregon State University Methods of producing validamycin A analogs and uses thereof
CN103740789B (zh) * 2014-01-09 2016-02-10 上海交通大学 提高井冈霉素发酵水平的方法
CN103937856B (zh) * 2014-04-21 2016-06-08 浙江大学 一种提高井冈霉素产量的发酵方法
CN106434795B (zh) * 2016-09-19 2020-02-18 浙江大学 一种通过pH冲击来提高井冈霉素产量的方法
CN107245471A (zh) * 2017-06-29 2017-10-13 浙江工业大学 一种重组吸水链霉菌及其在提高井冈霉素a产量中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112899210A (zh) 2021-06-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112899210B (zh) 增强正调控蛋白基因表达以提高井冈霉素发酵水平的方法
CN113930347A (zh) 一种能够合成褪黑素的绿色木霉工程菌及其构建方法与应用
CN111621454B (zh) 基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及ε-聚赖氨酸的生产方法和应用
CN111607608B (zh) 基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及提高ε-聚赖氨酸产量的方法和应用
CN112226437A (zh) 梯度调控芽胞杆菌启动子启动效率的序列组合及应用
CN111471633A (zh) 一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及提高ε-聚赖氨酸产量的方法
CN113801834B (zh) 一种基因工程高产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌及其构建方法和应用
CN115927234A (zh) amt基因、突变株M107在表达固氮菌嗜铁素中的应用
CN115948402A (zh) 产5-氨基乙酰丙酸的重组希瓦氏菌及其应用
CN105907778B (zh) 褐黄孢链霉菌重组表达质粒及工程菌与应用
CN114317307A (zh) 一种可提高虾青素生物合成产量的基因工程菌及其构建方法与应用
CN105316383B (zh) 一种通过基因阻断提高链霉菌的土霉素产量的方法
CN112592878B (zh) 增强正调控蛋白基因表达以提高阿卡波糖发酵水平的方法
CN117363552B (zh) 生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株及其构建方法
CN101892228B (zh) 一种高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性产腈水合酶工程菌及应用
CN113980982B (zh) 增强安丝菌素体内靶标蛋白基因表达的高产安丝菌素方法
CN112522174B (zh) 一种敲除负调控蛋白基因以提高阿卡波糖发酵水平的方法
CN113604413B (zh) 一种重组菌株及制备方法与应用
CN114806992B (zh) 一种rsh过表达基因工程淀粉酶产色链霉菌及提高丰加霉素发酵产量的方法
CN107955800B (zh) 一种生产子囊霉素fk520的基因工程菌及其制备方法
CN118240899A (zh) 增强rok家族己糖激酶基因表达以提高阿卡波糖发酵水平的方法
CN114761564B (zh) 生产脱环氧埃坡霉素b的重组菌及其用途
CN103849591B (zh) 一种泰乐菌素产生菌、遗传改造方法及其应用
CN118240896A (zh) 增强细胞壁合成蛋白基因表达以提高阿卡波糖发酵水平的方法
CN108456689A (zh) 提高安丝菌素p-3生物合成产量的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant