CN116751731B - 一种大规模质粒生产的发酵工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大规模质粒生产的发酵工艺，涉及微生物发酵技术领域。该发酵工艺采用一种发酵培养基进行，该发酵培养基包括基础培养基和补料培养基；该基础培养基包括胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠、甘油、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、七水硫酸镁和消泡剂；该补料培养基包括胰蛋白胨、酵母粉、甘油、七水硫酸镁、脯氨酸、亮氨酸和消泡剂。本发明基于现有发酵培养基开发了一种新的发酵培养基，利用该培养基进行质粒菌种发酵培养，可以满足高密度发酵的要求，提高质粒的产量，进而提高质粒生产的产能，降低生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，特别是涉及一种大规模质粒生产的发酵工艺。
背景技术
近些年来，随着生物制品的不断发展，DNA质粒产品，包括DNA疫苗、病毒载体等，不断地应用于新的基因疗法。大肠杆菌发酵获取DNA质粒是常用技术。因此大规模发酵生产高纯度和高质量DNA质粒的技术变得愈发重要。然而培养过程中会出现质粒突变或丢失现象，从而影响质粒产量，增加生产成本。质粒突变是指在培养重组菌过程DNA质粒发生突变，失去原有表型特征。质粒丢失主要原因是细胞在***时，由于微生物生长快，质粒在子代细胞中得不到均匀分配，部分子细胞不含质粒。质粒突变与丢失常出现于以下情况，一、数次传代质粒出现突变与丢失；二、在长时间发酵培养过程中。重组基因工程菌大规模发酵DNA质粒，易受培养温度、pH、转速、DO、补料速度及培养基组成等影响。现有发酵工艺未针对慢病毒VSVG/RD114/REV/PMDLG用质粒进行多参数的工艺开发，结果导致质粒产量不高。通过现有DNA质粒发酵工艺生产，仍面临上述DNA质粒产量不够的问题。目前的工艺方法已无法满足经济化和规模化的要求，因此有必要进行新工艺方法的开发及优化。
发明内容
本发明的目的是提供一种大规模质粒生产的发酵工艺，以解决上述现有技术存在的问题，利用本发明提供的发酵培养基进行质粒菌种发酵培养，可以满足高密度发酵的要求，提高质粒的产量；将该发酵培养基与优化的发酵工艺相结合，可以进一步提高质粒的产量，从而可以有效提高质粒生产的产能，降低生产成本。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种大规模质粒生产的发酵培养基，包括基础培养基和补料培养基；
所述基础培养基包括以下各含量的组分：胰蛋白胨8.0-12.0g/L、酵母粉4.0-6.0g/L、氯化钠9.0-11.0g/L、甘油12.0-13.0g/L、磷酸二氢钾1.2-2.0g/L、磷酸氢二钾2.0-2.5g/L、七水硫酸镁0.2-0.3g/L和消泡剂1.5-2.5mL/L；
所述补料培养基包括以下各含量的组分：胰蛋白胨70.0-72.0g/L、酵母粉70.0-72.0g/L、甘油168.0-172.0g/L、七水硫酸镁1.5-2.5g/L、脯氨酸0.6-1.0g/L、亮氨酸0.6-1.0g/L和消泡剂0.8-1.2mL/L。
优选地，所述基础培养基包括胰蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0g/L、氯化钠10.0g/L、甘油12.6g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、磷酸氢二钾2.3g/L、七水硫酸镁0.25g/L和消泡剂2.0mL/L；
所述补料培养基包括胰蛋白胨71.0g/L、酵母粉71.0g/L、甘油170.0g/L、七水硫酸镁1.99g/L、脯氨酸0.83g/L、亮氨酸0.83g/L和消泡剂1.0mL/L。
进一步地，所述消泡剂为Antifoam204。
本发明还提供上述的发酵培养基在大规模质粒生产中的应用。
进一步地，所述大规模质粒生产使用的含有目的质粒的基因工程菌株为大肠杆菌重组菌株，所述目的质粒为含有VSVG、RD114、REV或PMDLG基因的重组质粒。
本发明还提供一种大规模质粒生产的发酵工艺，包括利用上述的发酵培养基对含有目的质粒的基因工程菌株进行发酵培养的步骤。
进一步地，所述基因工程菌株为大肠杆菌重组菌株，所述目的质粒为含有VSVG、RD114、REV或PMDLG基因的重组质粒。
进一步地，所述发酵培养包括：将所述基因工程菌株接种于所述发酵培养基的基础培养基中，培养5h后，按照以下公式所示的补料速率F进行指数补料发酵：
，其中，μ：菌比生长速率，V0：补料开始罐内培养基体积；ρCo：开始补料时罐内菌体质量浓度；Y X/s ：菌体得率；ρsF：补料培养基的总糖质量浓度；ρs：开始补料时段的罐内总糖质量浓度；t：指数补料时间。
进一步地，所述发酵培养的温度控制条件为：0~21h 33℃，21~24h 35℃，24~30h42℃。
进一步地，所述发酵培养的pH为7.0；所述发酵培养在17h后，溶氧控制在30%。
本发明公开了以下技术效果：
本发明基于现有发酵培养基及发酵工艺，针对质粒菌种的发酵工艺进行优化，形成了一种新的发酵培养基及其配套发酵工艺。该发酵培养基包括基础培养基和补料培养基，利用该发酵培养基进行质粒菌种发酵培养，可以满足高密度发酵的要求，提高质粒的产量。同时，本发明进一步还对发酵工艺进行了优化，具体是在前期利用基础发酵培养基发酵一定时间后，利用优化的补料培养基以限制的比生长速率进行指数补料发酵，并优化发酵温度控制参数，以进一步提高质粒的产量。利用本发明的培养基及其配套发酵工艺进行质粒菌种发酵生产，质粒产量可达400~716mg/L，从而可以有效提高质粒生产的产能，降低生产成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中RD114重组菌株0-28h的发酵生长和质粒增长曲线。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
术语说明：
本发明所指大规模质粒生产是指质粒生产中利用1L或1L以上容量的发酵罐进行发酵培养。
以下实施例中使用的四种重组菌株是委托赛奥斯博生物科技（北京）有限公司构建，具体是先合成目的基因序列（VSVG/RD114/REV/PMDLG），再采用质粒全序列合成加环化的克隆方式构建成环状质粒（根据addgene网站上获得表达载体质粒的骨架序列pLenti-EF1a-Backbone(NG)，ID: #27963），再通过化学转化方式将构建的质粒导入Stbl3大肠杆菌宿主菌株，最后鉴定筛选出符合要求的重组基因工程菌。其中VSVG、RD114、REV和PMDLG基因序列分别如SEQ ID NO.1-4所示。
实施例1
对VSVG、RD114、REV和PMDLG的重组菌株，分别进行如下培养操作：
一、菌种复苏
从-80℃冰柜中取出工作菌种，置37ºC水浴中30min完全融化。
二、种子液培养
1、一级种子培养
无菌条件吸取50μL解冻后的工作菌接种于5mL LB培养基（含抗生素）中，置于摇床37℃/200rpm振荡培养17小时，为一级种子液。
2、二级种子培养
无菌条件将一级种子5mL菌液接种于250mL LB培养基（含抗生素）中，置摇床37℃/200rpm振荡培养5小时，无菌取样检测OD600值1.2时停止培养，此为二级种子液。
三、发酵培养
1、基础培养基配方如表1所示：
表1
2、补料培养基（命名为B1）配方如表2所示：
表2
3、发酵罐准备
将DO/pH电极连接发酵控制柜，通电激化2h。用标准液4.01/7.00校准pH电极并将两个电极安装于发酵罐。同时将补料管连接发酵罐包扎并加入6L发酵培养基。高压湿热灭菌121℃/20min，冷却后与发酵柜连接。
4、发酵工艺
（1）接种前发酵罐控制条件：
温度：33℃，pH=7，DO校正100%，通气量5L/min，搅拌200rpm。
（2）将二级种子250mL菌液无菌接种于6L发酵培养基（其中加入终浓度为50μg/mL的kana抗生素）中。
接种后发酵罐自控条件：
温度：0~21h/33℃，21~24h/35℃，24~30h/42℃；
pH值:0~30h/7.0；
DO联动转速：0~30h/DO设置为30%，转速联动范围：200~750rpm；
通气量：设置为5L/min，当17h时DO＜10%时，接通氧气；溶氧控制为30%；
培养5h后，按照补料速率F进行指数补料发酵，直至发酵结束：
注释：
F：补料速率，L/h。
μ：菌比生长速率，h-1，本实施例设定μ为0.693。
V0：补料开始罐内培养基体积，L。
ρCo：开始补料时罐内菌体质量浓度，g/L。
Y X/s ：菌体得率，%。
ρsF：补料培养基的总糖质量浓度，g/L。
ρs：开始补料时段的罐内总糖质量浓度，g/L。
t：指数补料时间，h。
（3）取样检测：
从培养17小时开始，每隔2小时取样一次，测OD600值。
从培养23小时开始，每隔1小时取样一次，测OD600值并检测质粒量。
（4）发酵结束：
发酵培养30小时后结束发酵。
本实施例中，RD114重组菌株0-28h的发酵生长和质粒增长曲线如图1所示。
实施例2
同实施例1，区别仅在于，基础培养基和补料培养基的配方分别如表3和表4所示。
表3
表4
实施例3
同实施例1，区别仅在于，基础培养基和补料培养基的配方分别如表5和表6所示。
表5
表6
对比例1
同实施例1，区别仅在于，将补料培养基替换为表7所示的培养基A。
表7
对比例2
同实施例1，区别仅在于，将补料培养基替换为表8所示的培养基C。
表8
对比例3
同实施例1，区别仅在于，将补料培养基替换为表9所示的培养基D。
表9
对比例4
同实施例1，区别仅在于，将补料培养基替换为表10所示的培养基E。
表10
对比例5
同对比例1，区别仅在于，将发酵工艺中二级种子接种后发酵罐自控条件中的温度控制调整为0~24h/37℃，24~30h/42℃。
对比例6
同对比例1，区别仅在于，将发酵工艺中二级种子接种后发酵罐自控条件中的补料速率调整为以恒定速度5mL/min补料。
实施例1和对比例1-6发酵结束后，分别放罐，离心（4000rpm/20min/4℃）收集菌体，并提取质粒（参考《质粒小提试剂盒》说明书），测定湿菌重、总质粒量、质粒体积比和质粒菌重比，结果见表7。
重组基因工程菌大规模发酵生产DNA质粒，易受培养温度、补料速度及培养基组成等因素的影响，本申请从发酵温度、补料速率以及培养基角度进行了工艺调整和配方优化，本发明使用培养基B作为补料培养基，再结合优化后的发酵工艺（包括对发酵温度和补料速率的调整），有效提升了质粒产量：结合实施例1和对比例1-4的实验数据可以看出，培养基B最适合作为补料培养基；结合实施例1和对比例5可以看出，本发明优化后的温度控制条件相较于现有技术中的0~24h恒温37℃的温度控制条件，质粒产量明显提高；结合实施例1和对比例6可以看出，本发明采用的指数补料工艺相对于现有技术的恒定速率补料，质粒产量同样得到明显提高。
表7
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (5)
1.一种大规模质粒生产的发酵工艺，其特征在于，利用发酵培养基对含有目的质粒的基因工程菌株进行发酵培养；
所述发酵培养基，由基础培养基和补料培养基组成；
所述基础培养基包括以下各含量的组分：胰蛋白胨8.0-12.0g/L、酵母粉4.0-6.0g/L、氯化钠9.0-11.0g/L、甘油12.0-13.0g/L、磷酸二氢钾1.2-2.0g/L、磷酸氢二钾2.0-2.5g/L、七水硫酸镁0.2-0.3g/L和消泡剂1.5-2.5mL/L；
所述补料培养基包括以下各含量的组分：胰蛋白胨70.0-72.0g/L、酵母粉70.0-72.0g/L、甘油168.0-172.0g/L、七水硫酸镁1.5-2.5g/L、脯氨酸0.6-1.0g/L、亮氨酸0.6-1.0g/L和消泡剂0.8-1.2mL/L；
所述发酵培养的步骤如下：将所述基因工程菌株接种于所述发酵培养基的基础培养基中，培养5h后，按照以下公式所示的补料速率F进行指数补料发酵：
；
其中，μ：菌比生长速率，V0：开始补料时罐内培养基体积；ρCo：开始补料时罐内菌体质量浓度；Y X/s：菌体得率；ρsF：补料培养基的总糖质量浓度；ρs：开始补料时段的罐内总糖质量浓度；t：指数补料时间；
所述基因工程菌株为大肠杆菌重组菌株，所述目的质粒为含有VSVG、RD114、REV或PMDLG基因的重组质粒。
2.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，所述基础培养基包括胰蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0g/L、氯化钠10.0g/L、甘油12.6g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、磷酸氢二钾2.3g/L、七水硫酸镁0.25g/L和消泡剂2.0mL/L；
所述补料培养基包括胰蛋白胨71.0g/L、酵母粉71.0g/L、甘油170.0g/L、七水硫酸镁1.99g/L、脯氨酸0.83g/L、亮氨酸0.83g/L和消泡剂1.0mL/L。
3.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，所述消泡剂为Antifoam204。
4.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，所述发酵培养的温度控制条件为：0~21h 33℃，21~24h 35℃，24~30h 42℃。
5.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，所述发酵培养的pH为7.0；所述发酵培养在17h后，溶氧控制在30%。
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