CN118256529A - 一种生产角黄素重组菌及其构建方法与应用 - Google Patents

一种生产角黄素重组菌及其构建方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN118256529A
CN118256529A CN202410263102.6A CN202410263102A CN118256529A CN 118256529 A CN118256529 A CN 118256529A CN 202410263102 A CN202410263102 A CN 202410263102A CN 118256529 A CN118256529 A CN 118256529A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
canthaxanthin
coa
plasmid
catalyzes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202410263102.6A
Other languages
English (en)
Inventor
***
植灵玲
黄世阳
凌文龙
吴世林
陈冰
邓展鑫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Wisdom Bio Technology Co ltd
Original Assignee
Guangzhou Wisdom Bio Technology Co ltd
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Wisdom Bio Technology Co ltd filed Critical Guangzhou Wisdom Bio Technology Co ltd
Publication of CN118256529A publication Critical patent/CN118256529A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生产角黄素重组菌及其构建方法与应用。本发明提供了一种重组名称为解脂耶氏酵母CYL05E10，分类命名为Yarrowia lipolytica，于2023年10月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，武汉大学)，保藏号为CCTCC M 20232020。该菌株可以用于角黄素生产，且具有较高产量。本发明发现，通过重构乙酰辅酶A合成途径减少了代谢过程中碳损失，同时优化了还原力供给；结合细胞骨架蛋白CipB构建包涵体底物通道增加了甲羟戊酸含量，最终可以提高角黄素产量。

Description

一种生产角黄素重组菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生产角黄素重组菌及其构建方法与应用。
背景技术
角黄素(canthaxanthin)是一种含酮基的橙红色类胡萝卜素。角黄素天然存在于细菌、藻类和真菌中，另外像火烈鸟羽毛、锦鲤的皮肤以及甲壳类水生动物外壳也是靠角黄素作色。角黄素作为饲料添加剂广泛应用于肉鸡和蛋鸡的作色。近来，角黄素在促进健康方面的作用也开始被关注，角黄素还具有自由基清除和抗氧化能力，有研究显示角黄素含量丰富的低密度脂蛋白具有保护胆固醇避免被氧化的潜在作用。
目前商业化的角黄素绝大部分通过化学合成生产，主要由石油衍生物如丙酮、乙炔等合成，能耗成本较高，需要复杂的纯化流程并且会产生相当大的污染物，这些使化学合成角黄素可能并不是安全、可持续的理想生产模式。通过微生物细胞工厂利用可再生的糖作为原料生物法生产角黄素具有原料可再生、反应条件温和、污染小等优势，有替代化学合成的潜在优势。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种核酸分子。
本发明第二方面的目的，在于提供一种表达***，含有本发明第一方面的核酸分子。
本发明第三方面的目的，在于提供一种细胞，含有本发明第二方面的表达***。
本发明第四方面的目的，在于提供一种重组酵母菌。
本发明第五方面的目的，在于提供一种生产角黄素的方法。
为了实现本发明上述的目的，本发明采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种核酸分子，包含以下基因或片段的核酸序列的至少一种：
(Ⅰ)乙酰辅酶A合成途径相关基因；
(Ⅱ)甲羟戊酸合成途径相关基因；
(Ⅲ)角黄素合成途径相关基因；
(Ⅳ)敲除或敲低磷酸果糖激酶的相关片段。
优选地，所述乙酰辅酶A合成途径相关基因包括以下基因的至少一种：
(1)催化果糖6磷酸或木酮糖5磷酸生成乙酰磷酸的基因PK；
(2)催化乙酰磷酸生成乙酰辅酶A的基因PTA；
(3)催化苹果酸氧化脱羧生产丙酮酸和NAPDH的基因MAE；
(4)催化柠檬酸裂解成乙酰辅酶A和草酰乙酸的基因ACL。
优选地，所述乙酰辅酶A合成途径相关基因为来源于肠膜明串珠菌的PK、来源于克氏梭菌的PTA、来源于卷枝毛霉的MAE、和来源于小鼠的ACL中的至少一种。
优选地，所述乙酰辅酶A合成途径相关基因为来源于肠膜明串珠菌的PK、来源于克氏梭菌的PTA、来源于卷枝毛霉的MAE、和来源于小鼠的ACL。
进一步优选地，所述乙酰辅酶A合成途径相关基因为来源于肠膜明串珠菌的PK(AY804190.1)、来源于克氏梭菌的PTA(CP110856.1)、来源于卷枝毛霉的MAE(DQ975377.1)、和来源于小鼠的ACL(BC056378.1)。
优选地，所述乙酰辅酶A合成途径相关基因经过密码子优化。
优选地，所述甲羟戊酸合成途径相关基因包括以下基因的至少一种：
(1)催化乙酰辅酶A缩合成乙酰乙酰辅酶A的基因AtoB；
(2)催化乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A缩合成HMG-CoA的基因HMGS；
(3)催化HMG-CoA还原为甲羟戊酸的基因HMGR。
优选地，所述甲羟戊酸合成途径相关基因为来源于大肠杆菌的AtoB、来源于酿酒酵母的HMGR、和来源于解脂耶氏酵母的HMGS中的至少一种。
优选地，所述甲羟戊酸合成途径相关基因为来源于大肠杆菌的AtoB、来源于酿酒酵母的HMGR、和来源于解脂耶氏酵母的HMGS。
进一步优选地，所述甲羟戊酸合成途径相关基因为来源于大肠杆菌的AtoB(CP001509.3)、来源于酿酒酵母的HMGR(CP028452.1)、和来源于解脂耶氏酵母的HMGS(CP028459.1)。
优选地，所述甲羟戊酸合成途径相关基因经过密码子优化。
优选地，所述甲羟戊酸合成途径相关基因通过支架蛋白相连接。
优选地，所述支架蛋白为CipB。
优选地，所述支架蛋白为来源于发光光杆菌(Photorhabdus luminescens)的CipB基因(U89925.1)。
优选地，所述CipB经过密码子优化。
优选地，所述角黄素合成相关基因包括以下基因的至少一种：
(1)催化两分子双香叶基焦磷酸生成八氢番茄红素以及催化番茄红素环化生成β-胡萝卜素的基因CarRP；
(2)催化八氢番茄红素脱氢生成番茄红素的基因CarB；
(3)催化β胡萝卜素转化为角黄素的基因Crtw。
优选地，所述角黄素合成相关基因为来源于卷枝毛霉的CarRP、来源于卷枝毛霉的CarB、和来源于雨生红球藻的Crtw中的至少一种。
优选地，所述角黄素合成相关基因为来源于卷枝毛霉的CarRP、来源于卷枝毛霉的CarB、和来源于雨生红球藻的Crtw。
进一步优选地，所述角黄素合成相关基因为来源于卷枝毛霉的CarRP(KJ999718.1)、来源于卷枝毛霉的CarB(KJ999717.1)、和来源于雨生红球藻的Crtw(D45881.1)。
优选地，所述敲除或敲低磷酸果糖激酶的相关片段包括以下片段的至少一种：
(1)敲除磷酸果糖激酶的CRISPR-Cas载体；
(2)敲除磷酸果糖激酶的同源重组载体；
(3)敲除磷酸果糖激酶的Cre/loxp***；
(4)敲低磷酸果糖激酶的RNA。
优选地，所述敲低磷酸果糖激酶的RNA包括shRNA、siRNA中的至少一种。
优选地，所述片段为敲除磷酸果糖激酶的相关片段。
优选地，所述敲除磷酸果糖激酶的相关片段为敲除磷酸果糖激酶的同源重组载体。
优选地，所述同源重组载体包括磷酸果糖激酶基因启动子上游片段和终止子下游片段。
进一步优选地，所述同源重组载体包括解脂耶氏酵母Polf磷酸果糖激酶基因启动子上游片段和终止子下游片段。
优选地，根据本发明第一个方面所述的核酸分子，所述为了确保个基因可以在表达***或者重组细胞中高效表达，在每个基因的上游连接有启动子序列；所选用的启动子序列包括但不限于：pTEF、pEXP、pFBA和pGPD。
更优选地，在每个基因的下游增加终止子序列。
本发明的第二个方面，提供一种表达***，包含有本发明第一个方面所述的核酸分子。
优选地，将本发明第一个方面的核酸分子拆解成若干组别，分别***不同的表达载体中。
更优选地，为了确保个基因可以在表达***或者重组细胞中高效表达，在每个基因的上游添加启动子序列，下游增加终止子序列；所选用的启动子序列包括但不限于：pTEF、pEXP、pFBA和pGPD。
在本发明的一个实施例中，将所述核酸分子的基因拆解成5个组别，分别***于5个不同的表达载体中。
具体地，质粒pCAN1以pUC19为模板，包含CarRP、CarB和CrtW基因。
具体地，质粒pCAN2以pUC19为模板，包含AtoB、HMGS和HMGR基因
进一步地，所述pCAN2的AtoB、HMGS和HMGR基因分别与CipB基因融合表达。
进一步地，所述CipB基因位于AtoB、HMGS和HMGR基因的N端前。
更进一步地，CipB基因分别置于AtoB酶基因、HMGS酶基因和HMGR酶基因起始秘密子ATG上游，中间没有碱基间隔。
具体地，质粒pCAN3以pUC19为模板，包含MAE和ACL基因。
具体地，质粒pCAN4以pUC19为模板，包含PK和PTA基因。
具体的，PFK敲除载体以pUC19为模板，包含通过同源重组敲除磷酸果糖激酶基因的序列片段；更具体的，包含解脂耶氏酵母Polf磷酸果糖激酶基因启动子上游片段和终止子下游片段。
更进一步的，所述的质粒pCAN1、质粒pCAN2、质粒pCAN3、质粒pCAN4分别都含有URA3尿嘧啶缺陷筛选基因。
本领域技术人员可以理解，采用其他的分组方式同样可以实现本发明的目的。
本发明的第三个方面，提供一种细胞，包含有本发明第一个方面所述的核酸分子或第二个方面所述的表达***。
进一步地，所述核酸分子***于所述细胞的基因组中。
优选地，所述细胞为酵母细胞。
更优选地，所述细胞为解脂耶氏酵母。
在本发明的一个实施例中，所述重组菌的构建方法为：将质粒pCAN1、质粒pCAN2、质粒pCAN3、质粒pCAN4、和PFK敲除载体转化至解脂耶氏酵母基因组。
更具体地，所述重组菌的基因转化顺序是按照质粒pCAN1、质粒pCAN2、质粒pCAN3、质粒pCAN4、和PFK敲除载体依次转化所得到的的菌。
更进一步地，包括以下步骤：
S1.将线性化的质粒pCAN1导入尿嘧啶合成缺陷的解脂耶氏酵母菌株Polf，筛选角黄素产量最高的菌株完成第一轮菌株重组迭代；
S2.通过5-FOA筛选使第一代产角黄素的重组菌恢复筛选标记，然后再次导入线性化的质粒pCAN2，筛选角黄素产量最高的菌株完成第二轮菌株重组迭代；
S3.按照S2中相同的方法依次导入线性化的质粒pCAN1、质粒pCAN2、质粒pCAN3、质粒pCAN4、和PFK敲除载体完成第三、第四、和第五轮重组迭代得到了整合了质粒pCAN1、质粒pCAN2、质粒pCAN3、质粒pCAN4、和PFK敲除载体的重组菌。
本发明的第四个方面，提供一种重组菌，名称为解脂耶氏酵母CYL05E10(Yarrowialipolytica CYL05E10)，分类命名为Yarrowia lipolytica，于2023年10月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，武汉大学)，保藏号为CCTCCM20232020。
本发明的第五个方面，提供一种生产角黄素的方法，通过培养本发明第三个方面的细胞，提取角黄素；或，通过发酵本发明第四个方面的重组菌，提取角黄素。
优选地，重组菌的发酵方法包括以下步骤：
1)一级种子液的培养；
2)二级种子液的扩增；
3)接种发酵。
优选地，所述步骤1)具体为将固体平板上的重组菌株单菌落接种到含有5-15mL液体培养基的培养容器中，25-35℃、摇床转速180-260rpm，培养16-30小时，得到一级种子液。
优选地，所述步骤2)具体为将步骤1)中的种子液按1-10％(wt)接种量转接至含有150-250mL液体培养基的培养容器中，25-35℃、摇床转速180-260rpm，培养4-12小时至OD大于10，得到二级种子液。
优选地，所述步骤3)具体为将二级种子液按5-15％(wt)接种量转接至含有1-3L发酵培养基的发酵罐中发酵。
优选地，所述液体培养基包括YPD培养基。
优选地，所述发酵培养基包含20-40g/L酵母提取物、40-80g/L蛋白胨和150-250g/L葡萄糖，其余为水。
优选地，所述发酵为温度25-35℃、搅拌速度300-800rpm、通气量3-5L/min、pH6.8和溶氧25％以上的条件下培养。
优选地，所述发酵需要进行补料操作。
优选地，所述补料操作包括开始发酵后48h一次性补40-60g葡萄糖每L发酵液；72小时后，每小时向发酵罐补加10mL 600g/L的葡萄糖溶液。
优选地，所述发酵共进行240小时以上。
本发明的有益效果是：
本发明提供一种核酸分子，通过重构乙酰辅酶A合成途径和提高甲羟戊酸中间体生产两个方面优化角黄素的生产产量。在乙酰辅酶A合成途径上，通过重构乙酰辅酶A合成途径可以减少了代谢过程中碳损失，同时优化了还原力供给。在甲羟戊酸途径上，结合细胞骨架蛋白CipB构建包涵体底物通道领域增加了甲羟戊酸含量，最终提高了角黄素产量。
本发明提供了一种重组酵母菌，名称为解脂耶氏酵母CYL05E10(Yarrowialipolytica CYL05E10)，分类命名为Yarrowia lipolytica CYL05E10，于2023年10月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，武汉大学)，保藏号为CCTCC M20232020。该菌株可以用于角黄素生产，且具有较高产量。
附图说明
图1为表达CarRP、CarB和CrtW的质粒pCAN1的示意图。
图2为CipB基因同AtoB、HMGS和HMGR三个基因融合表达的质粒pCAN2的示意图。
图3为表达MAE和ACL基因的质粒pCAN3的示意图。
图4为表达PK和PTA基因的质粒pCAN4的示意图。
图5为敲除PFK的DNA片段的示意图。
图6为表达AtoB、HMGS和HMGR三个基因的质粒pCAN6的示意图。
图7为不同菌株生产角黄素的含量检测结果。
图8为解脂耶氏酵母代谢途径示意图。
图9为构建底物包涵体通道对甲羟戊酸表达的影响结果。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
本发明所涉及解脂耶氏酵母菌株为Polf(ATCC编号MAY-2613；基因型MATA ura3-302leu2-270 xpr-322axp2-deltaNU49 XPR2::SUC2,购自ATCC)，解脂耶氏酵母菌为本领域常见菌株，其他来源的解脂耶氏酵母菌也可以实现本发明的效果；所用限制性内切酶购自ThermoFisher公司，质粒提取及胶回收所用试剂、PCR及无缝克隆所用试剂、分子克隆用大肠杆菌(DH5α)均购自南京诺唯赞生物科技有限公司，酿酒酵母、解脂耶氏和大肠杆菌基因组DNA提取所用试剂购自Qiagen公司。
实施例1基因选择与载体构建
本发明通过重构乙酰辅酶A合成途径和提高甲羟戊酸中间体生产两个方面优化角黄素的生产产量。在乙酰辅酶A合成途径上，通过重构乙酰辅酶A合成途径可以减少了代谢过程中碳损失，同时优化了还原力供给。在甲羟戊酸途径上，结合细胞骨架蛋白CipB构建包涵体底物通道领域增加了甲羟戊酸含量，最终提高了角黄素产量。
首先生产角黄素需要使工程菌能够表达角黄素前体β胡萝卜素，发明人的团队在早先的研究中发现，经摇瓶培养比较β-胡萝卜素产量，来源于卷枝毛霉的CarB和CarRP比来源于三孢布拉霉(Blakeslea trispora)的CarB和CarRA催化效率更高，因此选用来源于卷枝毛霉(Rhizomucor circinelloides)的CarB和CarRP。在β胡萝卜素转化为角黄素的步骤中，来源于雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)的CrtW基因效果更好。
乙酰辅酶A合成途径相关基因优选为来源于卷枝毛霉的MAE基因(DQ975377.1)、来源于小鼠的ACL基因(BC056378.1)、来源于肠膜明串珠菌的PK基因(AY804190.1)、和来源于克氏梭菌的PTA基因(CP110856.1)。
甲羟戊酸合成相关途径基因优选为来自大肠杆菌菌(E.coil)的AtoB基因(NCBI号)、来源酿酒酵母(S.cerevisiae)的HMGR基因、来源于解脂耶氏酵母的HMGS基因。此外，通过来源于发光光杆菌(Photorhabdus luminescens)的CipB基因(U89925.1)将AtoB、HMGR、和HMGS连接起来形成底物包涵体通道，能够提高甲羟戊酸的含量。
上述相关基因以及载体所需的引物如表1所示。
表1引物序列相关信息
1、质粒构建
为了确保个基因可以在载体或者重组细胞中高效表达，在每个基因的上游添加启动子序列，下游增加终止子序列。选用的启动子序列包括但不限于：pTEF、pEXP、pGPD；终止子序列包括但不限于：tCYC1、tXPR2、tICL。
1)质粒pCAN1的构建
用Qiagen公司的Blood&Cell Culture DNA Mini Kit提取酿酒酵母CEN.PK2-1C、解脂耶氏酵母Polf和大肠杆菌BL21(DE3)基因组DNA。
用引物loxP-URA3-F/loxP-URA3-R(如SEQ ID NO.1、2所示)以解脂耶氏酵母Polf基因组DNA为模板PCR扩增URA3基因，再以该PCR产物为模板，用引物pUC19-URA3-F和pUC19-URA3-R(如SEQ ID NO.3、4所示)扩增URA3基因片段；质粒pUC19用内切酶NdeⅠ和KpnⅠ双酶切，再用无缝克隆(诺唯赞ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit)将URA3基因片段克隆到pUC19的NdeⅠ和KpnⅠ之间构建质粒pUC19URA3。
分别用引物pTEF-F/R(如SEQ ID NO.5、6所示)、pEXP-F/R(如SEQ ID NO.7、8所示)、pGPD-F/R(如SEQ ID NO.9、10所示)、tXPR2-F/R(如SEQ ID NO.11、12所示)、和tICL-F/R(如SEQ ID NO.13、14所示)以解脂耶氏酵母Polf基因组DNA为模板扩增pTEF、pEXP、pGPD、tXPR2、和tICL片段；用引物tCYC1-F/R(如SEQ ID NO.15、16所示)以酵母CEN.PK2-1C基因组DNA为模板扩增tCYC1片段。
来源于卷枝毛霉(Rhizomucor circinelloides)的CarRP和CarB以及来源于雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)的CrtW基因由南京金斯瑞科技有限公司经密码子优化合成，以上三个基因序列分别如SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.47所示。分别用引物CarRP-F/R(如SEQ ID NO.17、18所示)、CarB-F/CarB-R(如SEQ ID NO.19、20所示)和CrtW-F/CrtW-R(如SEQ ID NO.21、22所示)以上述密码子优化后的基因为模板扩增CarRP、CarB和CrtW片段；
用OE-PCR(诺唯赞Green Taq Mix)将启动子、基因和终止子拼接成pTEF-CarRP-tCYC1、pEXP-CarB-tXPR2和pGPD-CrtW-tICL三个表达框，将质粒pUC19URA3用BamHⅠ和HindⅢ双酶切纯化回收，再用无缝组装(诺唯赞ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit)将酶切质粒骨架和三个表达框组装构建质粒pCAN1。质粒pCAN1结构如图1所示。
2)质粒pCAN2的构建
来源于发光光杆菌(Photorhabdus luminescens)的CipB基因(U89925.1)、来源酿酒酵母(S.cerevisiae)的HMGR基因和来源于大肠杆菌(E.coil)的AtoB基因为南京金斯瑞科技有限公司经密码子优化后基因合成，HMGS基因以解脂耶氏酵母Polf基因组DNA为模板扩增得到，来源于解脂耶氏酵母W29的HMGS(CP028459.1:3780129-3781469)。分别使用引物CipB-F1/CipB-R(如SEQ ID NO.23、26所示)、CipB-F2/CipB-R(如SEQ ID NO.24、26所示)、CipB-F3/CipB-R(如SEQ ID NO.25、26所示)以合成的CipB基因(如SEQ ID NO.48所示)为模板扩增CipB片段，得到CipB-1、CipB-2、和CipB-3。使用引物HMGR-F/R(如SEQ ID NO.27、28所示)以合成的HMGR基因(如SEQ ID NO.49所示)为模板扩增HMGR片段。使用引物HMGS-F/R(如SEQ ID NO.29、30所示)以解脂耶氏酵母Polf基因组DNA为模板扩增得到HMGS基因片段(CP028459.1:3780129-3781469)。使用引物AtoB-F/R(如SEQ ID NO.31、32所示)以合成的AtoB基因(如SEQ ID NO.50所示)为模板扩增AtoB片段。
用OE-PCR将启动子、CipB、基因和终止子拼接成pTEF-CipB-HMGR-tCYC1、pEXP-CipB-HMGS-tXPR2和pGPD-CipB-AtoB-tICL三个表达框，其中CipB-F1/CipB-R合成得到的CipB与HMGR相连接，CipB-F2/CipB-R合成得到的CipB与HMGS相连接，CipB-F3/CipB-R合成得到的CipB与AtoB相连接。
将质粒pUC19URA3用BamHⅠ和HindⅢ双酶切纯化回收，再用无缝组装(诺唯赞ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit)将酶切质粒骨架和三个表达框组装构建质粒pCAN2。质粒pCAN2结构如图2所示。
3)质粒pCAN3的构建
来源于卷枝毛霉的MAE基因和来源于小鼠的ACL基因为南京金斯瑞科技有限公司经密码子优化后基因合成，分别用引物MAE-F/R(如SEQ ID NO.33、34所示)和ACL-F/R(如SEQ ID NO.35、36所示)以合成的基因(MAE和ACL的序列如SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52所示)为模板扩增MAE和ACL片段。
用OE-PCR将启动子、基因和终止子拼接成pTEF-MAE-tCYC1和pEXP-ACL-tXPR2两个个表达框，将质粒pUC19URA3用BamHⅠ和HindⅢ双酶切纯化回收，再用无缝组装(诺唯赞ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit)将酶切质粒骨架和两个表达框组装构建质粒pCAN3。质粒pCAN3结构如图3所示。
4)质粒pCAN4的构建
来源于肠膜明串珠菌的PK基因和来源于克氏梭菌的PTA基因为南京金斯瑞科技有限公司经密码子优化后基因合成，分别用引物PK-F/PK-R(如SEQ ID NO.37、38所示)和PTA-F/R(如SEQ ID NO.39、40所示)以合成的基因(PK和PTA的序列如SEQ ID NO.53和SEQ IDNO.54所示)为模板扩增PK和PTA片段。
用OE-PCR将启动子、基因和终止子拼接成pTEF-PK-tCYC1和pGPD-PTA-tICL两个表达框，将质粒pUC19URA3用BamHⅠ和HindⅢ双酶切纯化回收，再用无缝组装(诺唯赞ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit)将酶切质粒骨架和两个表达框组装构建质粒pCAN4。质粒pCAN4结构如图4所示。
5)PFK同源敲除片段的构建
分别用引物PFK-P-F/PFK-P-R(如SEQ ID NO.41、42所示)和PFK-T-F/PFK-T-R(如SEQ ID NO.43、44所示)以解脂耶氏酵母Polf基因组DNA为模板扩增PFK基因(YALI0_D16357g)启动子和终止子部分各1000bp长片段，其中，PFK基因启动子碱基序列为NC_006070.1:2026715-2027714、PFK基因终止子部分碱基序列为NC_006070.1:2030172-2031171，再用OE-PCR(诺唯赞Green Taq Mix)将PFK基因启动子、URA3基因和PFK基因终止子三部分依次拼接成整体DNA片段PFK(P)-URA3-PFK(T)，结构如图5所示。
使用PCR产物拼接的DNA片段敲除PFK基因，利用的是DNA片段所包括的PFK基因启动子和终止子部分和目标基因启动子和终止子序列相同从而发生同源重组替代目标基因，而用于替代的DNA片段不含有PFK基因的CDS区，从而敲除目标基因。
实施例2高产角黄素整合菌株的构建
重组工程菌是依次序将质粒pCAN1、质粒pCAN2、质粒pCAN3、质粒pCAN4、和DNA片段PFK(P)-URA3-PFK(T)转化至解脂耶氏酵母基因组，得到，包括以下步骤：
S1.将线性化的质粒pCAN1导入尿嘧啶合成缺陷的解脂耶氏酵母菌株Polf，筛选角黄素产量最高的菌株完成第一轮菌株重组迭代；
S2.通过5-FOA筛选使第一代产角黄素的重组菌恢复筛选标记，然后再次导入线性化的质粒pCAN2，筛选角黄素产量最高的菌株完成第二轮菌株重组迭代；
S3.按照S2中相同的方法依次导入线性化的质粒pCAN1、质粒pCAN2、质粒pCAN3、质粒pCAN4、和DNA片段PFK(P)-URA3-PFK(T)完成第三、第四、和第五轮重组迭代得到了整合了质粒pCAN1、质粒pCAN2、质粒pCAN3、质粒pCAN4、和DNA片段PFK(P)-URA3-PFK(T)的重组菌。
具体为：将质粒pCAN1用NotⅠ酶过夜切再琼脂糖凝胶电泳回收不含有大肠杆菌复制子和氨苄抗性基因的片段，接下来用醋酸锂法将线性化的pCAN1转化解脂耶氏酵母Polf菌并涂布SD-URA缺陷培养基，2-3天后挑取橙红色120个转化子分别接入10ml液体YPD60培养基(w/v:1％酵母粉，2％蛋白胨，6％葡萄糖)，200rpm、30℃培养72小时，检测角黄素产量，获得产量最高的CYL01。将菌株CYL01在10mL YPD培养基(w/v:1％酵母粉，2％蛋白胨，2％葡萄糖)中培养过夜后，涂布于YPD+5-FOA(100mg/L)平板，28℃培养72小时挑取单菌落，获得URA3缺失菌株CYL01-ΔURA3。
将质粒pCAN2用NotⅠ酶过夜切再琼脂糖凝胶电泳回收不含有大肠杆菌复制子和氨苄抗性基因的片段，接下来用醋酸锂法将线性化的pCAN2转化CYL01-ΔURA3菌株并涂布SD-URA缺陷培养基，2-3天后挑取红色120个转化子分别接入10ml液体YPD60培养基，按质量分数计，YPD60培养基，200rpm、30℃培养72小时，检测角黄素产量，获得产量最高的菌株CYL02。将菌株CYL02在10mL YPD培养基中培养过夜后，涂布于YPD+5-FOA(100mg/L)平板，28℃培养72小时挑取单菌落，获得URA3缺失菌株CYL02-ΔURA3。
将质粒pCAN3用NotⅠ酶切1小时并琼脂糖凝胶电泳回收不含有大肠杆菌复制子和氨苄抗性基因的片段，接下来用醋酸锂法将线性化的pCAN3转化菌株CYL02-ΔURA3,涂布SD-URA缺陷培养基，2-3天后挑取深红颜色最深的120个转化子分别接入10ml液体YPD60培养基，200rpm、30℃培养72小时，检测角黄素产量，获得产量最高的菌株CYL03。将菌株CYL03在10mL YPD培养基中培养过夜后，涂布于YPD+5-FOA(100mg/L)平板，28℃培养72小时挑取单菌落，获得URA3缺失菌株CYL03-ΔURA3。
将质粒pCAN4用NotⅠ酶切1小时并琼脂糖凝胶电泳回收不含有大肠杆菌复制子和氨苄抗性基因的片段，接下来用醋酸锂法将线性化的pCAN4转化菌株CYL03-ΔURA3,涂布SD-URA缺陷培养基，2-3天后挑取深红颜色最深的120个转化子分别接入10ml液体YPD60培养基，200rpm、30℃培养72小时，检测角黄素产量，获得产量最高的菌株CYL04。将菌株CYL04在10mL YPD培养基中培养过夜后，涂布于YPD+5-FOA(100mg/L)平板，28℃培养72小时挑取单菌落，获得URA3缺失菌株CYL04-ΔURA3。
将DNA片段PFK(P)-URA3-PFK(T)转入菌株CYL04-ΔURA3中，涂布SD-URA缺陷培养基，2-3天后挑取深红颜色最深的120个转化子分别接入10ml液体YPD60培养基，200rpm、30℃培养72小时，检测角黄素产量，获得产量最高的菌株CYL05E10。菌株CYL05E10(Yarrowialipolytica CYL05E10)，分类命名为Yarrowia lipolytica CYL05E10，于2023年10月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，武汉大学)，保藏号为CCTCC M 20232020。
对比例1一种生产角黄素的重组菌CYL06
1)pCAN6质粒的构建
pCAN6质粒含有HMGR、HMGS和AtoB三个基因，构建过程与pCAN2质粒的构建过程相似，区别在于，pCAN6中HMGS、HMGR、AtoB不与CipB连接。
具体为：使用引物HMGR-F/R(如SEQ ID NO.27、28所示)以合成的HMGR基因(如SEQID NO.49所示)为模板扩增HMGR片段。使用引物HMGS-F/R(如SEQ ID NO.29、30所示)以解脂耶氏酵母Polf基因组DNA为模板扩增得到HMGS基因片段(CP028459.1:3780129-3781469)。使用引物AtoB-F/R(如SEQ ID NO.31、32所示)以合成的AtoB基因(如SEQ ID NO.50所示)为模板扩增AtoB片段。将质粒pUC19URA3用BamHⅠ和HindⅢ双酶切纯化回收，再用无缝组装(诺唯赞ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit)将酶切质粒骨架和三个基因组装构建质粒pCAN6。质粒pCAN6结构如图6所示。
2)重组菌CYL06的构建
重组工程菌CYL06是依次序将质粒pCAN1、质粒pCAN6、质粒pCAN3、质粒pCAN4、和DNA片段PFK(P)-URA3-PFK(T)转化至解脂耶氏酵母基因组，得到，具体步骤同实施例2(与实施例2相比，不转入质粒pCAN2，URA3的中间筛选操作相同)。最终得到重组菌CYL06。
对比例2一种生产角黄素的重组菌CYL07
重组工程菌CYL07是依次序将质粒pCAN1和质粒pCAN6转化至解脂耶氏酵母基因组，得到，具体步骤同实施例2(与实施例2相比，不转入质粒pCAN2、pCAN3、pCAN4和DNA片段PFK(P)-URA3-PFK(T)，URA3的中间筛选操作相同)。最终得到重组菌CYL07。
对比例3构建底物包涵体的重组菌CYL-CipB
向解脂耶氏酵母Polf转入质粒pCAN6，经过URA3筛选得到重组菌CYL(具体操作同实施例2)。
向解脂耶氏酵母Polf转入质粒pCAN2，经过URA3筛选得到重组菌CYL-CipB(具体操作同实施例2)。
效果实施例1上罐发酵生产角黄素
1、高密度发酵
将上述实施例中的基因工程菌在发酵罐中进行高密度发酵，方法如下：
1)一级种子液的培养：将固体YPD平板上的重组菌株单菌落接种到含有10mlYPD液体培养基的50ml锥形瓶中，30℃、摇床转速220rpm，培养24小时；
2)二级种子液的培养：将一级种子液按1％(wt)接种量转接到含有100mlYPD液体培养基的300ml锥形瓶中，30℃、摇床转速220rpm，培养8小时细胞OD600达到10，得到二级种子液；
3)将二级种子液按10％(wt)接种量转接至含有2L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵，初始培养基组成为30g/L酵母提取物、60g/L蛋白胨和100g/L葡萄糖，发酵温度30℃、通气量4L/min、pH6.8和溶氧25％以上的条件下培养，搅拌速度为：0-12小时300rpm、13-24小时450rpm、25-48小时600rpm、49-72小时800rpm、73-96小时700rpm、97-168小时600rpmrpm。培养48小时后一次补100g葡糖糖，72小时开始，每小时补充10mL 600g/L葡萄糖溶液。
2、角黄素测定
收集上述发酵进行角黄素测定，方法如下：
1)取1mL菌液离心去上清，沉淀重悬于0.7mL DMSO中；
2)55℃孵育10min以后添加等体积丙酮0.7mL；
3)50℃孵育15min，12000rpm离心5min。
4)上清转移至一个新EP管，HPLC在470nm检测角黄素产量。
将角黄素标准品(0.05g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.8g/L、1.6g/L)溶于丙酮中，HPLC在470nm检测角黄素产量制作标准曲线。
实施例1-7的角黄素产量如图7所示。可以看出，CYL05与CYL04相比，敲除磷酸果糖激酶(PFK)基因能够显著提高角黄素产量。CYL02与CYL07相比，通过CipB构建底物包涵体通道来表达HMGR、HMGS、AtoB对角黄素产量的提高优于普通表达HMGR、HMGS、AtoB。CYL05与YCL06相比，也表明了通过CipB构建底物包涵体通道来表达HMGR、HMGS、AtoB对角黄素产量的提高优于普通表达HMGR、HMGS、AtoB。同时构建底物包涵体通道和敲除PFK的菌株具有最高的角黄素产量。
图8显示了解脂耶氏酵母的代谢途径，敲除PFK基因可以迫使碳流量只能走磷酸戊糖途径，从而合成更多的乙酰辅酶A，进而提高了角黄素的产量。
效果实施例2甲羟戊酸合成测定
将对比例3中的工程菌CYL与CYL-CipB接种至发酵罐中，发酵过程同效果实施例1，发酵培养72小时后检测甲羟戊酸含量。
取摇瓶发酵液1ml、12000g离心2分钟，上清过0.22um滤膜后上HPLC测甲羟戊酸，离子交换柱(HPX-87H；Bio-Rad Labs)、示差折光率检测器(Shimadzu RID-10A)、5mM H2SO4为流动相、0.6ml/min、柱温为65℃。
结果如图9所示，连接CipB基因的工程菌CYL-CipB的甲羟戊酸含量明显提高，表明CipB可以提高代谢中间产物甲羟戊酸的合成。

Claims (10)

1.一种核酸分子，包含以下基因或片段的核酸序列的至少一种：
(Ⅰ)乙酰辅酶A合成途径相关基因；
(Ⅱ)甲羟戊酸合成途径相关基因；
(Ⅲ)角黄素合成途径相关基因；
(Ⅳ)敲除或敲低磷酸果糖激酶的相关片段。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，
所述乙酰辅酶A合成途径相关基因包括以下基因的至少一种：
(1)催化果糖6磷酸或木酮糖5磷酸生成乙酰磷酸的基因PK；
(2)催化乙酰磷酸生成乙酰辅酶A的基因PTA；
(3)催化苹果酸氧化脱羧生产丙酮酸和NAPDH的基因MAE；
(4)催化柠檬酸裂解成乙酰辅酶A和草酰乙酸的基因ACL。
3.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，
所述甲羟戊酸合成途径相关基因包括以下基因的至少一种：
(1)催化乙酰辅酶A缩合成乙酰乙酰辅酶A的基因AtoB；
(2)催化乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A缩合成HMG-CoA的基因HMGS；
(3)催化HMG-CoA还原为甲羟戊酸的基因HMGR；
优选地，所述甲羟戊酸合成途径相关基因通过支架蛋白相连接；
优选地，所述支架蛋白为CipB。
4.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，
所述角黄素合成相关基因包括以下基因的至少一种：
(1)催化两分子双香叶基焦磷酸生成八氢番茄红素以及催化番茄红素环化生成β-胡萝卜素的基因CarRP；
(2)催化八氢番茄红素脱氢生成番茄红素的基因CarB；
(3)催化β胡萝卜素转化为角黄素的基因Crtw。
5.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，
所述敲除或敲低磷酸果糖激酶的相关片段包括以下片段的至少一种：
(1)敲除磷酸果糖激酶的CRISPR-Cas载体；
(2)敲除磷酸果糖激酶的同源重组载体；
(3)敲除磷酸果糖激酶的Cre/loxp***；
(4)敲低磷酸果糖激酶的RNA；
优选地，所述敲低磷酸果糖激酶的RNA包括shRNA、siRNA中的至少一种。
6.一种表达***，包含有权利要求1至5任一项所述的核酸分子。
7.一种细胞，包含有权利要求1至5任一项所述的核酸分子或权利要求6所述的表达***；所述核酸分子优选***于所述细胞的基因组中。
8.根据权利要求6所述的细胞，其特征在于，
所述细胞为酵母细胞，优选为解脂耶氏酵母。
9.一种重组酵母菌，名称为解脂耶氏酵母CYL05E10(Yarrowia lipolyticaCYL05E10)，分类命名为Yarrowia lipolytica，于2023年10月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，武汉大学)，保藏号为CCTCC M 20232020。
10.一种生产角黄素的方法，通过培养权利要求7或8所述的细胞，提取角黄素；或，通过发酵权利要求9所述的重组工程菌，提取角黄素。
CN202410263102.6A 2024-03-07 一种生产角黄素重组菌及其构建方法与应用 Pending CN118256529A (zh)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN118256529A true CN118256529A (zh) 2024-06-28

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8846369B2 (en) Cyanobacterium sp. host cell and vector for production of chemical compounds in cyanobacterial cultures
CN114480240B (zh) 一种产岩藻糖基乳糖的基因工程菌及生产方法
CN112831427B (zh) 一株高产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母及其应用
Huang et al. High-copy genome integration of 2, 3-butanediol biosynthesis pathway in Saccharomyces cerevisiae via in vivo DNA assembly and replicative CRISPR-Cas9 mediated delta integration
CN116064345A (zh) 高效生产岩藻糖基乳糖的无抗基因工程菌及其应用
CN108641992B (zh) 高温产核黄素的工程菌及其构建方法与应用
CN114874959A (zh) 一种利用葡萄糖从头发酵生产l-茶氨酸的基因工程菌、方法及应用
CN114262702A (zh) 麦角硫因合成基因在谷氨酸棒杆菌中重建麦角硫因代谢途径中的应用及其方法
CN114107078A (zh) 一种高产瓦伦烯基因工程菌及其构建方法与应用
CN112481178B (zh) 氨基双去甲氧基姜黄素高产菌株构建及其发酵优化方法
CN114317307B (zh) 一种可提高虾青素生物合成产量的基因工程菌及其构建方法与应用
CN111154705B (zh) 热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌工程菌及其构建方法及应用
KR102473375B1 (ko) 재조합 미생물, 그 제조방법 및 보효소 q10의 생산에 있어서 그의 사용
CN117229934A (zh) 一种合成类胡萝卜素的基因工程菌及其构建方法和应用
CN115058374B (zh) 一种利用丙酮酸合成乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用
CN112961815B (zh) 一种高产四氢嘧啶的基因工程菌及其应用
CN118256529A (zh) 一种生产角黄素重组菌及其构建方法与应用
CN113136382B (zh) 基于CRISPRi调控的利用谷氨酸棒状杆菌合成乙醛酸的方法
EP2508597A1 (en) Production of butanol by fermentation in Arxula sp.
CN109370969B (zh) 一种重组克雷伯氏杆菌在制备1，3-丙二醇中的应用
CN111304138A (zh) 一种生产β-胡萝卜素的重组大肠杆菌及构建方法与应用
CN116426398B (zh) 一种解脂耶氏酵母工程菌及其应用
KR101476047B1 (ko) 신규의 갈락토스 고대사균 및 이를 이용한 바이오매스 대사방법
CN115125180B (zh) 一种利用双途径产乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用
CN114874961B (zh) 一种利用乙醛合成乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication