CN116426398A - 一种解脂耶氏酵母工程菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种解脂耶氏酵母工程菌及其应用，属于生物技术领域；保藏编号为CCTCC NO：M 2023294的解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378是在解脂耶氏酵母基因组上多拷贝重组整合表达八氢番茄红素合酶、番茄红素环化酶、八氢番茄红素去饱和酶、二酰基甘油酰基转移酶和血红蛋白的基因簇，敲除菌株基因组上甘油‑3‑磷酸脱氢酶基因GUT2，再重组整合经定向进化改造的表达β‑胡萝卜素酮化酶和β‑胡萝卜素羟化酶的突变基因簇得到以葡萄糖为底物高效生物合成虾青素的解脂耶氏酵母工程菌；本发明构建的解脂耶氏酵母工程菌通过葡萄糖反馈补料发酵生产虾青素，产量可以达到3775.4mg/L，生产工艺简单，可应用于大规模生产。

Description

一种解脂耶氏酵母工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种解脂耶氏酵母工程菌及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
虾青素是自然界中抗氧化活性最强的脂溶性类胡萝卜素化合物，通常存在于各种海洋细菌、藻类和水生动物中。虾青素能够保护细胞、脂质和膜脂蛋白免受氧化损伤；虾青素还具有抗衰老、抗炎、抗癌、抑制幽门螺旋杆菌感染、激活免疫应答、改善记忆力等特性，已经被广泛的应用于食品、药品、保健品、化妆品和饲料等领域，其全球年需求量已经达到250吨，销售额接近4.5亿美元，到2025年有望达到25亿美元，具有极高的经济与应用价值。
目前，市场上所使用的虾青素大部分是通过化学合成或者从藻类中提取获得。化学合成虾青素由于其立体异构体的缘故，无法被人体吸收利用，只能用于动物和水产养殖着色。虽然有多种生物富含虾青素，直接提取普遍存在生产效率低、不具有经济优势。现有技术中常用改造雨生红球藻进行虾青素的生产，但是因培养期长，提取过程复杂，不适于工业生产。
近年来，利用合成生物学方法通过工程化改造微生物底盘细胞，并加载目标优化的异源产物合成路径构建人工细胞工厂从而获得虾青素，已经引起国际研究者的普遍关注，并逐渐发展为替代化学合成和天然提取的有效方法。现有文献和专利中通过引入虾青素的异源途径实现了虾青素在微生物中的合成，宿主主要为大肠杆菌、酿酒酵母、红法夫酵母等，但这些工程菌仍然存在虾青素产量较低的问题。另外，大肠杆菌存在内毒素引起的安全性问题，不足以应用于工业化生产。
解脂耶氏酵母含有丰富的合成类胡萝卜素化合物前体原料乙酰辅酶A，且其细胞内积累有大量的脂质且不产生内毒素，这些特性使解脂耶氏酵母成为生物合成虾青素的优良底盘菌。因此，开发高产虾青素的解脂耶氏酵母工程菌具有重要的应用价值。目前，已有一些专利和文献通过在解脂耶氏酵母中引入异源途径基因实现了虾青素的从头合成，主要是过量表达代谢途径中的相关基因，但是外源基因引入对细胞生长造成代谢负担、增加对氧需求、菌株易变丝状形态、产物反馈抑制等问题，造成解脂耶氏酵母工程菌产量较低。解决解脂耶氏酵母工程菌发酵生产过程中虾青素和代谢中间产物累积抑制菌株代谢和生长的难题，对提高虾青素生产效率具有重要意义的。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378，该工程菌株能够用于以葡萄糖为底物高效合成虾青素，合成的虾青素产量高、纯度高。
本发明的技术方案如下：
本发明的目的之一在于提供一种解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378，保藏编号为CCTCCNO：M 2023294的解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378，本发明的解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378的保藏信息如下：
菌种名称：解脂耶氏酵母
拉丁名：Yarrowia lipolytica
菌株编号：ZMX1378
保藏机构：中国典型培养物保藏中心
保藏机构简称：CCTCC
地址：中国武汉武汉大学
保藏日期：2023年3月13日；
其中，所述解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378基因组整合了
CrtYB-CrtI-DAG1-VHb基因簇和BsCrtW-PaCrtZ突变基因簇。
进一步的，所述解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378基因组过表达CrtYB基因和CrtI基因，CrtYB基因和CrtI基因来源于红法夫酵母Xanthophyllomyces dendrorhous，CrtYB基因表达八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶，如SEQ ID NO.1所示，CrtI基因表达八氢番茄红素去饱和酶，如SEQ ID NO.2所示。
进一步的，所述解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378基因组过表达DAG1基因，DAG1基因来源于解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica，表达二酰基甘油酰基转移酶，如SEQ ID NO.3所示。
进一步的，所述解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378基因组过表达VHb基因，VHb基因来源于透明颤菌Vitreoscilla，表达血红蛋白如SEQ ID NO.4所示。
进一步的，所述解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378基因组过表达BsCrtW突变基因，BsCrtW突变基因来源于海洋短波单孢菌Brevundimonas sp.，表达β-胡萝卜素酮化酶，如SEQ ID NO.5所示，其第12位的A突变成C，241位的G突变成A，485位的G突变成T。
进一步的，所述解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378基因组过表达PaCrtZ突变基因，PaCrtZ突变基因来源于菠萝泛菌Pantoea ananatis，表达β-胡萝卜素羟化酶，如SEQ IDNO.6所示，其第147位的A突变成C，392位的G突变成A。
进一步的，所述解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378基因组上敲除甘油-3-磷酸脱氢酶GUT2位点。
本发明的目的之二在于提供一种生物合成虾青素的解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378的构建方法，包括如下步骤：
(1)将CrtYB-CrtI-DAG1-VHb基因簇通过多拷贝质粒pINA1312导入解脂耶氏酵母基盘菌株，筛选得到合成虾青素前体β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母工程菌ZM072；
(2)经过基因重组方式敲除ZM072基因组上的甘油-3-磷酸脱氢酶GUT2基因，得到解脂耶氏酵母工程菌ZM072(△GUT2)；
(3)对BsCrtW-PaCrtZ基因簇进行协同定向进化改造，将BsCrtW-PaCrtZ基因簇的突变库基因通过单拷贝质粒pINA1269导入所述解脂耶氏酵母菌株ZM072(△GUT2)，经高通量筛选得到高效合成虾青素的解脂耶氏酵母工程菌ZMX1378。
其中，所述解脂耶氏酵母基盘菌可为解脂耶氏酵母ATCC MAY-2613。
本发明的目的之三在于将所述的解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378以葡萄糖为底物合成虾青素。
本发明的目的之四在于提供一种解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378以葡萄糖为底物合成虾青素的方法，培养解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378，获得种子液；再将种子液接种到发酵培养基中，进行葡萄糖反馈补料发酵，发酵过程的pH控制在5.6-6.0，发酵过程的温度为28-30℃，发酵时间优选96-128h；葡萄糖反馈补料控制其浓度在0.2-2g/L，通过葡萄糖反馈补料发酵获得虾青素。
相较于现有技术，本发明的有益效果在于：
(1)本发明在解脂耶氏酵母基盘菌中引入虾青素合成代谢关键酶基因CrtYB、CrtI的基础上，利用体外定向改造技术，将虾青素合成代谢途径上的关键基因簇BsCrtW-PaCrtZ当做一个整体同时进行定向改造突变，优化外源引入关键基因BsCrtW和PaCrtZ的表达水平和酶活比例，优化虾青素代谢流降低菌株代谢负担，经高通量筛选获得高产虾青素优良菌种ZMX1378，有效提高虾青素的合成效率；
(2)本发明在解脂耶氏酵母工程菌中引入优选虾青素合成模块基因的基础上，引入透明颤菌血红蛋白VHb基因，提高菌株的氧利用率和虾青素合成代谢关键酶的表达效率，降低能耗和生产成本；
(3)本发明在解脂耶氏酵母工程菌中引入虾青素优选合成模块基因和血红蛋白基因的基础上，过表达解脂耶氏酵母二酰基甘油酰基转移酶DAG1基因，敲除了工程菌基因组上调控脂质体降解的甘油-3-磷酸脱氢酶GUT2基因，提高工程菌的脂质含量，增加虾青素的储存空间，从而提高工程菌虾青素生产能力。
(4)利用本发明提供的解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378可以用于发酵生产虾青素，其发酵液中虾青素的产量在30吨发酵规模达到3237.2mg/L，具有很高的产业化应用价值。
附图说明
图1为实施例2中重组质粒pINA1312-CrtYB-CrtI-DAG1-VHb结构示意图；
图2为实施例4重组质粒pINA1269-BsCrtW-PaCrtZ结构示意图；
图3为实施例5中50L发酵罐解脂耶氏酵母ZMX001和ZMX1378葡萄糖反馈补料发酵产虾青素曲线图；
图4为实施例6中30T发酵罐解脂耶氏酵母ZMX1378葡萄糖反馈补料发酵产虾青素曲线图。
具体实施方式
下面结合较佳实施例对本发明做进一步的说明，在本发明中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值；对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下属实施例中，“密码子优化”指利用偏爱密码子并避免利用率低或稀有的密码子而所进行的基因的重新设计。每种生物都表现出某种程度的密码子利用差异或偏爱，那些最频繁利用的即为偏爱密码子。
下述实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配置等，主要参考《分子克隆实验指南》(第三版)进行。PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。
下述实施例中的全基因合成、引物合成及测序由南京诺唯赞生物科技股份有限公司完成。
下述实施例中YPD斜面培养基包括20g/L蛋白胨，10.0g/L酵母浸粉，20.0g/L葡萄糖，20g/L琼脂；
种子培养基包括20g/L蛋白胨，10.0g/L酵母浸粉，20.0g/L葡萄糖；
发酵培养基包括20g/L的葡萄糖，10g/L的(NH4)2SO4，5g/L KH2PO4，5g/L MgSO4，10ml/L维生素，10ml/L微量金属盐；其中，微量金属盐溶液的成分为：5g/L ZnSO4，0.3g/LMnCl2，0.3g/L CuSO4，0.5g/L CoCl2，0.5g/L Na2MoO4，2g/L CaCl2，2g/L FeSO4；其中，维生素溶液的成分为：0.1g/L生物素，2g/L泛酸钙，2g/L烟酸，20g/L肌醇，2g/L盐酸硫胺素，0.5g/L磷酸吡哆醛，0.1g/L对氨基苯甲酸。
本申请中解脂耶氏酵母基盘菌(ATCC编号MAY-2613，购自ATCC)，质粒pCRISPRy1(购自Addgene公司)，大肠杆菌JM109大肠杆菌DH5α(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)，质粒pINA1269根据(Madzak C,Tréton B,Blanchin-Roland S.Strong hybridpromoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutiveexpression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica.J MolMicrobiol Biotechnol.2000Apr；2(2):207-16)论文所记载的制备方法制得，质粒pINA1312根据(Nicaud JM,Madzak C,van den Broek P,Gysler C,Duboc P,NiederbergerP,Gaillardin C.Protein expression and secretion in the yeast Yarrowialipolytica.FEMS Yeast Res.2002Aug；2(3):371-9)论文所记载的制备方法制得。
实施例1合成虾青素前体β-胡萝卜素解脂耶氏酵母工程菌ZM072的构建
1、重组质粒pINA1312-CrtYB-CrtI-DAG1-VHb的构建：
(1)基因元件和引物的合成：人工合成根据NCBI上提供的来自红法夫酵母八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶编码基因CrtYB的核苷酸序列和八氢番茄红素去饱和酶编码基因CrtI的核苷酸序列，来自解脂耶氏酵母二酰基甘油酰基转移酶编码基因DAG1的核苷酸序列，来自透明颤菌血红蛋白编码基因VHb的核苷酸序列，经过密码子优化得到的基因序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示，将合成基因分别连入pUC19质粒载体骨架，得到pUC19-CrtYB、pUC19-CrtI、pUC19-DAG1、pUC19-VHb质粒，实施例1所用引物如表1所示；
表1实施例1所用引物序列
Figure SMS_1
Figure SMS_2
(2)重组质粒pINA1312-CrtYB-CrtI-DAG1-VHb的构建：
构建八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶编码基因CrtYB表达模块，使用PmeI-CYB-up和KpnI-CYB-down为引物，pUC19-CrtYB为模板，扩增含有Pme I酶切位点、CrtYB和Kpn I酶切位点的PCR片段；使用Pml I和Kpn I对pINA1312质粒进行双酶切，将所述携带有Pme I平端位点和Kpn I酶切位点的PCR片段进行酶连接，转入大肠杆菌筛选得到正确连接的阳性克隆，得到pINA1312-hp4d-CrtYB-xpr2t质粒，再以PmlI-CYB-up和CYBI-down为引物扩增获得hp4d-CrtYB-xpr2t片段；
构建八氢番茄红素去饱和酶编码基因CrtI表达模块，使用PmeI-CI-up和KpnI-CI-down为引物，pUC19-CrtI为模板，扩增含有Pme I酶切位点、CrtI和Kpn I酶切位点的PCR片段；使用Pml I和Kpn I对pINA1312质粒进行双酶切，将所述携带有Pme I平端位点和Kpn I酶切位点的PCR片段进行酶连接，转入大肠杆菌筛选得到正确连接的阳性克隆，得到pINA1312-hp4d-CrtI-xpr2t质粒，再以CYBI-up和IDAG-down为引物扩增获得hp4d-CrtI-xpr2t片段；
构建二酰基甘油酰基转移酶编码基因DAG1表达模块，使用PmeI-DAG-up和KpnI-DAG-down为引物，pUC19-DAG1为模板，扩增含有Pme I酶切位点、DAG1和Kpn I酶切位点的PCR片段；使用Pml I和Kpn I对pINA1312质粒进行双酶切，将所述携带有Pme I平端位点和Kpn I酶切位点的PCR片段进行酶连接，转入大肠杆菌筛选得到正确连接的阳性克隆，得到
pINA1312-hp4d-DAG1-xpr2t质粒，再以IDAG-up和DVHB-down为引物扩增获得hp4d-DAG1-xpr2t片段；
构建血红蛋白编码基因VHb表达模块，使用PmeI-VHb-up和KpnI-VHb-down为引物，pUC19-VHb为模板，扩增含有Pme I酶切位点、VHb和Kpn I酶切位点的PCR片段；使用Pml I和Kpn I对pINA1312质粒进行双酶切，将所述携带有Pme I平端位点和Kpn I酶切位点的PCR片段进行酶连接，转入大肠杆菌筛选得到正确连接的阳性克隆，得到pINA1312-hp4d-VHb-xpr2t质粒，再以DVHB-up和BamHI-VHb-down为引物扩增获得hp4d-VHb-xpr2t片段；
以构建的含有同源片段的hp4d-CrtYB-xpr2t、hp4d-CrtI-xpr2t、hp4d-DAG1-xpr2t和hp4d-VHb-xpr2t片段进行回收，将质粒pINA1312用pml I进行酶切并纯化回收，再通过吉布森连接Gibson assembly(诺唯赞ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit)技术将上述表达模块整合到pINA1312质粒，得到pINA1312-CrtYB-CrtI-DAG1-VHb重组质粒；
2、合成虾青素前体β-胡萝卜素解脂耶氏酵母工程菌ZM072的构建和摇瓶筛选
(1)产β-胡萝卜素解脂耶氏酵母工程菌ZM072的构建
采用解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica ATCC MYA-2613作为宿主菌即基盘菌，对上一步得到的pINA1312-CrtYB-CrtI-DAG1-VHb重组质粒用Not I酶切，得到携带hp4d-CrtYB-xpr2t、hp4d-CrtI-xpr2t、hp4d-DAG1-xpr2t和hp4d-VHb-xpr2t这4个表达盒的线性质粒载体，通过醋酸锂法将携带这4个表达盒的线性载体整合至解脂耶氏酵母MYA-2613中的Zeta位点；其中，醋酸锂转化方法为：出发解脂耶氏酵母在2mL YPD液体培养基中培养18h后取200μL加入新鲜的YPD液体培养基中，培养4-5小时，6000rpm常温下离心5min收集菌体，用灭菌的ddH2O重悬菌体后再次离心收集菌体，弃去上清；然后将1mL 100mM的4℃预冷的醋酸锂加入离心后的菌体，室温下静置处理5min后，6000rpm常温下离心收集菌体，解脂耶氏酵母感受态细胞制备完成；转化混合体系包括240μL PEG(50％W/v)、36μL 1.0M醋酸锂溶液、10μL鲑鱼精ss-DNA、线性化的载体整合片段分别加入等量约400ng，无菌水补齐至360μL，将上述各项顺序加入感受态细胞中，涡旋震荡1min，30℃水浴30min，42℃水30min，然后6000rpm离心5min，去上清之后加入1mL的YPD液体培养基，30℃200rpm培养2h复苏菌体，然后6000rpm离心5min，弃上清后用无菌水洗2次菌体，最后用100μL的无菌水重悬，在SD固体培养基中进行涂布筛选，筛选条件为30℃，培养48h，通过目测法初步挑选出平板上微红或红色的转化子单菌落，分别接种到含有4mL，YPD液体培养基的试管中，在30℃、220rpm/min下活化培养24h，用甘油冷冻管保藏活化菌液于-80℃，并利用一部分菌液提取所需的基因组；其次，以提取的酵母基因组为模板，进行PmlI-CYB-up和BamHI-VHb-down引物进行PCR验证，验证为阳性的转化子菌株即是成功构建的异源合成β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母工程系列菌株；
(2)产β-胡萝卜素解脂耶氏酵母工程菌ZM072的摇瓶筛选
摇瓶发酵筛选：YPD斜面培养基用于解脂耶氏酵母工程菌株的培养和发酵，从YPD平板上挑取300株颜色较深且为阳性的工程菌，分别接种至10mL的YPD液体培养基中进行种子液的活化，随后转接活化的种子液至250mL摇瓶装载30mL的YPD液体培养基，于30℃摇床，220rpm条件下振荡培养4天后进行β-胡萝卜素的检测；
检测方法：通过离心收集培养的解脂耶氏酵母细胞并重悬于0.7mL DMSO中，然后加入等体积丙酮，55℃温育10min，再在45℃温育15min，最后将样品以12000×g离心5分钟；使用配备有450nm可变波长检测器的岛津LC-20AT高效液相色谱仪和使用的XDBC18柱(Eclipse，USA)分析含有β-胡萝卜素的上清液，流动相为甲醇，乙腈和二氯甲烷(42:42:16)，流速为1.0mL/min，柱温为30℃；
对挑取的300株颜色较深的阳性菌株使用前所述的发酵方式进行培养后，β-胡萝卜素产量较高的5株菌种ZM011、ZM025、ZM072、ZM111、ZM211和对照菌MYA-2613检测结果参见表2；
表2产β-胡萝卜素解脂耶氏酵母工程菌筛选结果
菌株名称 MYA-2613 ZM011 ZM025 ZM072 ZM111 ZM211
β-胡萝卜素产(mg/L) 0 52.3 62.1 78.5 72.6 70.3
综上所述，筛选出脂耶氏酵母工程菌ZM072。
实施例2解脂耶氏酵母工程菌ZM072基因组上甘油-3-磷酸脱氢酶GUT2基因的敲除
1、构建靶向基因GUT2基因敲除质粒pCRISPRy1-GUT2
为进一步提高解脂耶氏酵母工程菌ZM072油脂的累积水平，选用并构建了用于靶向剪切基因组上编码甘油-3-磷酸脱氢酶的GUT2基因(GB登录号:YALI0B13970g)；使用质粒pCRISPRy1(购自Addgene公司)，参考论文(Schwartz CM,Hussain MS,Blenner M,WheeldonI.Synthetic RNA Polymerase III Promoters Facilitate High-Efficiency CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in Yarrowia lipolytica.ACS Synth Biol.2016Apr15；5(4):356-9.)的方法描述，构建pCRISPRy1-GUT2质粒，所用的sgRNA为GCUGGAGUUCGGGCUGCUCU；将pCRISPRyl质粒转入大肠杆菌DH5α感受态中，并将转化子转接含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基，过夜培养，使用axygen质粒抽提试剂盒进行pCRISPRyl质粒抽提；pCRISPRyl质粒经AvrII单酶切后，进行凝胶电泳纯化回收，用作载体；使用合成的DNA寡核苷酸单链引物，经退火获得60bp的双链DNA；将上述胶回收的酶切后pCRISPRyl载体DNA和60bp双链DNA进行Gibson组装(Gibson DG,Young L,Chuang RY,Venter JC,Hutchison CA 3rd,Smith HO.Enzymatic assembly of DNA molecules up to severalhundred kilobases.Nat Methods.2009May；6(5):343-5)，得到用于GUT2中断失活操作的pCRISPRy1-GUT2质粒；
2、CRISPR/Cas9***中sgRNA的转录表达
本实施例中使用的单链向导sgRNA以表达载体形式存在，作为RNA转录模板的双链DNA及N20序列如下表3所示；
表3CRISPR/Cas9***所用引物序列
Figure SMS_3
3、质粒pCRISPRy1-GUT2转化解脂耶氏酵母ZM072及筛选
将解脂耶氏酵母ZM072菌种在YPD固体培养基上划线，30℃培养2天，挑单菌落转接装有4mL YPD液体培养基的试管，30℃，220rpm过夜培养，转接装有25mL YPD液体培养基的250mL摇瓶，30℃，220rpm培养4～6h，培养至OD600为0.8～1.0，菌液用于制备转化感受态；感受态的制作和转化，使用Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit进行，严格参考其使用说明书，转化产物涂布SC-leu(葡萄糖20g/L，YNB基本氮源1.7g/L，亮氨酸和尿嘧啶各50mg/L)，30℃培养4天，使用验证引物GUT2-up、GUT2-down进行单克隆转化子菌落PCR筛选，获得解脂耶氏酵母工程菌ZM072(ΔGUT2)。
实施例3异源合成虾青素的解脂耶氏酵母工程菌ZMX001的构建和摇瓶筛选
1、重组质粒pINA1269-BsCrtW-PaCrtZ的构建
基因元件的合成：人工合成根据NCBI上提供的海洋β-胡萝卜素酮化酶编码基因BsCrtW的核苷酸序列和来自菠萝泛菌β-胡萝卜素羟化酶编码基因
PaCrtZ的核苷酸序列，经密码子优化后得到的基因序列如SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6所示，将合成基因分别连入pUC19质粒载体骨架，得到pUC19-BsCrtW和pUC19-PaCrtZ质粒，所用引物如表4所示；
表4实施例4所用引物序列
Figure SMS_4
重组质粒pINA1269-BsCrtW-PaCrtZ的构建：构建β-胡萝卜素酮化酶编码基因BsCrtW表达模块，使用PmeI-HCW-up和KpnI-HCW-down为引物，pUC19-CrtYB为模板，扩增含有Pme I酶切位点、BsCrtW和KpnⅠ酶切位点的PCR片段；使用Pml I和Kpn I对pINA1296质粒进行双酶切，将所述携带有Pme I平端位点和Kpn I酶切位点的PCR片段进行酶连接，转入大肠杆菌筛选得到正确连接的阳性克隆，得到pINA1269-hp4d-BsCrtW-xpr2t质粒，再以PmlI-HCW-up和CWZ-down为引物扩增获得hp4d-BsCrtW-xpr2t片段；
构建β-胡萝卜素羟化酶编码基因PaCrtZ表达模块，使用PmeI-CZ-up和KpnI-CZ-down为引物，pUC19-PaCrtZ为模板，扩增含有Pme I酶切位点、PaCrtZ和Kpn I酶切位点的PCR片段；使用Pml I和Kpn I对pINA1269质粒进行双酶切，将所述携带有Pme I平端位点和Kpn I酶切位点的PCR片段进行酶连接，转入大肠杆菌筛选得到正确连接的阳性克隆，得到pINA1269-hp4d-PaCrtZ-xpr2t质粒，再以CWZ-up和BamHI-PaCrtZ-down为引物扩增获得hp4d-PaCrtZ-xpr2t片段；
以构建的含有同源片段的hp4d-BsCrtW-xpr2t和hp4d-PaCrtZ-xpr2t片段进行回收，将质粒pINA1269用pm l I进行酶切并纯化回收，再通过吉布森连接Gibson assembly(诺唯赞ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit)技术将上述表达模块整合到pINA1269质粒，得到pINA1269-BsCrtW-PaCrtZ；
2、产虾青素解脂耶氏酵母工程菌的构建和摇瓶验证
异源合成虾青素的解脂耶氏酵母工程菌ZMX001的构建：
采用经过实施例3获得的解脂耶氏酵母工程菌ZM072(ΔGUT2)作为宿主菌，对上一步得到的pINA1269-BsCrtW-PaCrtZ重组质粒用Not I酶切，得到携带hp4d-BsCrtW-xpr2t和hp4d-PaCrtZ-xpr2t这2个表达盒的线性质粒载体，通过上述醋酸锂法将携带这2个表达盒的线性载体整合至解脂耶氏酵母工程菌ZM072(ΔGUT2)中，在培养基中进行涂布筛选，筛选条件为30℃，培养48h，通过目测法初步挑选出平板上红色的转化子单菌落，分别接种到含有4mL YPD液体培养基的试管中，在30℃、220rpm/min下活化培养24h，用甘油冷冻管保藏活化菌液于-80℃，并利用一部分菌液提取所需的基因组，其次，以提取的酵母基因组为模板，以pmlI-HCW-up和BamHI-PaCrtZ-down为引物进行PCR验证实验，验证为阳性的转化子菌株即是成功构建的异源合成虾青素的解脂耶氏酵母工程菌ZMX001；
解脂耶氏酵母工程菌ZMX001摇瓶验证：
摇瓶发酵：对于摇瓶单次发酵，先从平板上挑取ZMX001菌株单克隆，接种至10mL的YPD液体培养基中进行种子液的活化，随后转接活化的种子液至250mL摇瓶装载30mL的YPD液体培养基，于30℃摇床，220rpm条件下振荡培养4天后进行虾青素的检测；
检测方法：通过离心收集培养的解脂耶氏酵母工程菌ZMX001细胞并重悬于0.7mLDMSO中，然后加入等体积丙酮，55℃温育10min，再在45℃温育15min，最后将样品以12000×g离心5min；检测器为紫外检测器，为Waters公司的Waters2489 UV/Vis Detector(WatersCorp.,USA)，虾青素的测定选用的色谱柱C18的色谱柱，具体型号为BDS HYPERSIL C18(150mm×4.6mm,5μm,Thermo)，测定波长为470nm，流速为1mL/min，柱温设置为25℃，使用前使用流动相A纯甲醇冲洗半个小时柱子，检测虾青素产量使用的流动相为溶剂B：乙腈:水(9:1)；溶剂C：甲醇:异丙醇(3:2)，设置测定条件，具体条件为：0-15min，0-90％B；15-30min，90％B；30-35min，90-0％B；35-55min 0％B，对ZMX001菌株使用前所述的发酵方式进行培养，最终检测到53.2mg/L的虾青素产量。
实施例4高产虾青素的解脂耶氏酵母工程菌ZMX1378构建和验证
1、BsCrtW-PaCrtZ基因簇易错PCR改造
以质粒pINA1269-BsCrtW-PaCrtZ为模板，通过改变镁离子浓度和dNTP浓度，使用进行易错PCR对hp4d-BsCrtW-xpr2t-hp4d-PaCrtZ-xpr2t串联基因进行随机突变，PCR产物即为基因簇hp4d-BsCrtW-xpr2t-hp4d-PaCrtZ-xpr2的突变库；
易错PCR体系(100μL)：dATP，dCTP，dTTP，dGTP浓度均为80mM/mL，MgCl2的浓度为40mM/mL，上下游引物(下划线所示序列为酶切识别位点)的浓度均为10μmol/L；PCR程序为：98℃预变性2min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，反应35个循环；最后72℃延伸10min；
2、BsCrtW-PaCrtZ基因簇DNA改组
以上述易错PCR的扩增产物为DNA改组的模板，以pfu为DNA聚合酶，BsCrtW-up和PaCrtZ-down为引物，按以下操作进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物即为DNA改组后的hp4d-BsCrtW-xpr2t-hp4d-PaCrtZ-xpr2突变体库：
PCR程序：
94℃1min，53℃3min；72℃,20s，10个循环；
94℃1min，55℃3min 20s；72℃,20s，20个循环；
94℃1min，54℃3min35s；72℃,20s，40个循环；
72℃保温20min使延伸完全。
PCR体系为：dNTP浓度均为80mM/mL，上下游引物浓度均为10μmol/L，易错PCR产物终浓度200ng；
3、合成虾青素解脂耶氏酵母突变体库的构建
将DNA改组后的hp4d-BsCrtW-xpr2t-hp4d-PaCrtZ-xpr2突变体库用限制性内切酶Pml I和BamH I双酶切消化后，与用相同内切酶消化的pINA1269-BsCrtW-PaCrtZ质粒进行连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109，进行扩大培养，得到含有pINA1269-BsCrtW-PaCrtZ突变体的大肠杆菌JM109菌库，再从大肠杆菌JM109菌库中提取突变质粒库；上一步得到的pINA1269-BsCrtW-PaCrtZ突变质粒库用Not I酶切，得到携带hp4d-BsCrtW-xpr2t和hp4d-PaCrtZ-xpr2t这2个串联表达盒的线性突变质粒库，通过上述醋酸锂法将携带这2个表达盒的线性载体突变库整合至解脂耶氏酵母工程菌ZM072(ΔGUT2)中，在培养基中进行涂布，培养条件为30℃，培养48h，获得合成虾青素的解脂耶氏酵母突变库菌株；
4、筛选高产虾青素解脂耶氏酵母工程菌ZMX1378
通过目测法初步挑选出平板上颜色较深的含有pINA1269-BsCrtW-PaCrtZ突变体的解脂耶氏酵母工程菌的单克隆至YPD培养基的96孔板内，30℃，150rpm培养72h，后进行虾青素的检测，从近万个突变株中筛选获得一株在96孔板虾青素产量达1.2mg/L的菌株，将其命名为解脂耶氏酵母ZMX1378；
5、解脂耶氏酵母工程菌ZMX1378摇瓶验证
从平板上挑取ZMX1378菌株单克隆，接种至10mL的YPD液体培养基中进行种子液的活化，随后转接活化的种子液至250mL摇瓶装载30mL的YPD液体培养基，于30℃摇床，220rpm条件下振荡培养4天后进行虾青素的检测。通过离心收集培养的解脂耶氏酵母工程菌ZMX1378细胞并重悬于0.7mL DMSO中，然后加入等体积丙酮，55℃温育10min，再在45℃温育15min，最后将样品以12000×g离心5min；按上述检测方法，最终检测到102.2mg/L的虾青素产量；
6、解脂耶氏酵母ZMX1378的hp4d-BsCrtW-xpr2t-hp4d-PaCrtZ-xpr2突变基因测序
以高产虾青素解脂耶氏酵母ZMX1378的基因组为模板，通过引物BsCrtW-up和PaCrtZ-down，送于上海生工生物工程有限公司进行测序，结果表明hp4d-BsCrtW-xpr2t-hp4d-PaCrtZ-xpr2基因簇上共发生5处基因突变，BsCrtW基因序列上第12位的A突变成C，241位的G突变成A，485位的G突变成T；PaCrtZ基因序列上第147位的A突变成C，392位的G突变成A。
实施例6解脂耶氏酵母ZMX001和ZMX1378的50L发酵生产虾青素
1、解脂耶氏酵母ZMX001和ZMX1378一级种子液培养
(1)将解脂耶氏酵母ZMX001和ZMX1378单克隆分别接种于YPD斜面培养基，30℃(实际应用中30℃±1℃均可)培养48h(实际应用中48h±2h均可)；
(2)将步骤(1)制备的解脂耶氏酵母ZMX001和ZMX1378斜面，分别用10mL无菌水重悬，然后以1％(体积百分比)(实际应用中1％±0.5％均可)的接种量接种到装有一级种子摇瓶YPD液体培养基的种子摇瓶(5L种子摇瓶装液量为1L)中，30℃(实际应用中30℃±1℃均可)培养24h(实际应用中24h±2h均可)，得到一级种子培养液；
2、解脂耶氏酵母ZMX001和ZMX1378二级种子液培养
将上述方法制备的一级种子培养液以5％(体积百分比)(实际应用中5％±1％均可)的移种量接入装有2L二级种子YPD液体培养基的5L发酵罐中，30℃(实际应用中30℃±1℃均可)培养22h(实际应用中22h±2h均可)，溶氧浓度可为40％(实际应用中40％-80％均可)，得到OD600约为2(实际应用中2±0.5均可)的二级种子培养液；
3、解脂耶氏酵母ZMX001和ZMX1378葡萄糖反馈补料发酵产虾青素
将上述方法制备的二级种子培养液以10％(体积百分比)(实际应用中10％±2％均可)的移种量接入装有18L发酵培养基的50L发酵罐中，30℃±2℃培养72-96h，发酵过程的pH控制在5.6-6.0，溶氧浓度可为10-20％，发酵过程中的葡萄糖含量低于2g/L时，向发酵罐自动补加600g/L的葡萄糖水溶液，使得发酵体系的葡萄糖含量保持在0.2-2g/L之间；
4、得到的发酵液虾青素含量检测
分别离心收集培养的解脂耶氏酵母工程菌ZMX001和ZMX1378细胞并重悬于0.7mLDMSO中，然后加入等体积丙酮，55℃温育10min，再在45℃温育15min，最后将样品以12000×g离心5分钟，检测器为紫外检测器，为Waters公司的Waters2489 UV/Vis Detector(WatersCorp.,USA)，虾青素的测定选用的色谱柱C18的色谱柱，具体型号为BDS HYPERSIL C18(150mm×4.6mm,5μm,Thermo)，测定波长为470nm，流速为1mL/min，柱温设置为25℃，使用前使用流动相A纯甲醇冲洗半个小时柱子，检测虾青素产量使用的流动相为溶剂B：乙腈:水(9:1)；溶剂C：甲醇:异丙醇(3:2)，设置测定条件，具体条件为：0-15min，0-90％B；15-30min，90％B；30-35min，90-0％B；35-55min 0％B；解脂耶氏酵母工程菌ZMX001和ZMX1378发酵过程曲线如图3所示，解脂耶氏酵母工程菌ZMX1378发酵液的虾青素最高浓度为3775.4mg/L，对照菌株ZMX001发酵液的虾青素浓度为732.7mg/L，解脂耶氏酵母工程菌ZMX1378虾青素产量在提高约415.2％。
实施例5解脂耶氏酵母工程菌ZMX1378的30吨发酵罐生产虾青素
1、解脂耶氏酵母工程菌ZMX1378一级种子液培养
(1)挑取5-10个解脂耶氏酵母工程菌ZMX1378单克隆分别接种于100mL YPD斜面培养基的茄型瓶，30℃(实际应用中30℃±1℃均可)培养48h(实际应用中48h±2h均可)；
(2)将步骤(1)制备的5个解脂耶氏酵母工程菌ZMX1378茄型瓶，分别用20mL无菌水重悬，然后以1％(体积百分比)(实际应用中1％±0.5％均可)的接种量接种到5个装有1L的一级种子摇瓶YPD液体培养基的5L种子摇瓶(5L种子摇瓶装液量为1L)中，30℃(实际应用中30℃±1℃均可)培养24h(实际应用中24h±2h均可)，得到一级种子培养液；
2、解脂耶氏酵母工程菌ZMX1378二级种子液培养
将上述步骤中制备的5L一级种子液以5％(体积百分比)(实际应用中5％±1％均可)的移种量接入装有100L二级种子YPD液体培养基的200L发酵罐中，30℃(实际应用中30℃±3℃均可)培养24h(实际应用中24h±2h均可)，溶氧浓度可为40％(实际应用中40％-80％均可)，得到OD600约为2(实际应用中2±0.5均可)的二级种子培养液；
3、解脂耶氏酵母工程菌ZMX1378三级种子液培养
将上述步骤中制备的100L二级种子液以10％(体积百分比)(实际应用中5％±1％均可)的移种量接入装有1000L三级种子YPD液体培养基的2T发酵罐中，30℃(实际应用中30℃±3℃均可)培养24h(实际应用中24h±2h均可)，溶氧浓度可为40％(实际应用中40％-80％均可)，得到OD600约为3(实际应用中3±0.5均可)的三级种子液；
4、解脂耶氏酵母工程菌ZMX1378在30T发酵罐葡萄糖反馈补料发酵产莽草酸
将上述步骤制备的三级种子培养液以10％(体积百分比)(实际应用中15％±2％均可)的移种量接入装有10T发酵培养基的30T发酵罐中，30℃±2℃培养72-96h，发酵过程的pH控制在5.6-6.0，溶氧浓度可为10-30％，发酵过程中的葡萄糖含量低于2g/L时，由发酵罐自动补加600g/L的葡萄糖水溶液，使得发酵体系的葡萄糖含量保持在0.2-2g/L之间；
5、解脂耶氏酵母工程菌ZMX1378在30T发酵罐产虾青素含量检测
解脂耶氏酵母工程菌ZMX1378在30T发酵罐发酵生产虾青素过程曲线如图4所示，按上述虾青素检测方法进行发酵液虾青素的检测，结果表明ZMX1378在30T发酵罐的发酵液虾青素的浓度为3237.2mg/L；目前，国内尚无利用解脂耶氏酵母工程菌以葡萄糖为碳源大规模发酵生产虾青素酸的相关报道，大部分仅停留在实验室阶段，离工业化应用尚有较大差距，本发明解脂耶氏酵母工程菌ZMX1378具备很高的规模化应用价值。
以上所述实施例均为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本专利的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本专利的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378，其特征在于：保藏编号为CCTCCNO：M 2023294的解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378；所述解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378基因组整合了CrtYB-CrtI-DAG1-VHb基因簇和BsCrtW-PaCrtZ突变基因簇。
2.如权利要求1所述的解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378，其特征在于：所述解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378基因组过表达CrtYB基因和CrtI基因，CrtYB基因和CrtI基因来源于红法夫酵母Xanthophyllomyces dendrorhous，CrtYB基因如SEQ ID NO.1所示，CrtI基因如SEQ IDNO.2所示。
3.如权利要求1所述的解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378，其特征在于：所述解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378基因组过表达DAG1基因，DAG1基因来源于解脂耶氏酵母Yarrowialipolytica，如SEQ ID NO.3所示。
4.如权利要求1所述的解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378，其特征在于：所述解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378基因组过表达VHb基因，VHb基因来源于透明颤菌Vitreoscilla，如SEQ IDNO.4所示。
5.如权利要求1所述的解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378，其特征在于：所述解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378基因组过表达BsCrtW突变基因，BsCrtW突变基因来源于海洋短波单孢菌Brevundimonas sp.，如SEQ ID NO.5所示，其第12位的A突变成C，241位的G突变成A，485位的G突变成T。
6.如权利要求2所述的生物合成虾青素的解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378，其特征在于：所述解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378基因组过表达PaCrtZ突变基因，PaCrtZ突变基因菠萝泛菌Pantoea ananatis，如SEQ ID NO.6所示，其第147位的A突变成C，392位的G突变成A。
7.如权利要求1所述的解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378，其特征在于：所述解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378基因组上敲除甘油-3-磷酸脱氢酶GUT2基因位点。
8.一种如权利要求1所述的解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378的构建方法，其特征在于：将所述CrtYB-CrtI-DAG1-VHb基因簇通过多拷贝质粒pINA1312导入解脂耶氏酵母基盘菌株，得到解脂耶氏酵母工程菌ZM072，再将经DNA改组后的BsCrtW-PaCrtZ突变基因簇通过单拷贝质粒pINA1269导入所述已整合CrtYB-CrtI-DAG1-VHb基因簇且敲除GUT2基因的解脂耶氏酵母菌株，经高通量筛选得到高效合成虾青素的解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378。
9.如权利要求1所述的解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378以葡萄糖为底物高效合成虾青素。
10.一种解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378以葡萄糖为底物合成虾青素的方法，其特征在于：培养如权利要求1所述的解脂耶氏酵母工程菌ZMW1378，获得种子液；再将种子液接种到发酵培养基中，进行葡萄糖反馈补料发酵，发酵过程的pH控制在5.6-6.0，发酵过程的温度为28-30℃，发酵时间优选96-128h；葡萄糖反馈补料控制其浓度在0.2-2g/L，通过葡萄糖反馈补料发酵获得虾青素。
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