CN111321087A - 一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用 - Google Patents

一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种产β‑胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌，所述的产β‑胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、两个拷贝的carRP基因和1个拷贝的carB基因、ERG13基因，最后将尿嘧啶和亮氨酸两个营养缺陷型筛选标记回补构建而成，最后通过连续补料发酵，β‑胡萝卜素的产量可以达到4.5g/L。本发明构建的解脂耶氏酵母基因工程菌，其操作简便，性能稳定可靠，能够应用于大规模的商业化生产，所得的β‑胡萝卜素能够被安全的利用，前景良好。

Description

一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体地说，是关于一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用。
背景技术
β-胡萝卜素是通过植物和微生物等合成的天然橙色色素，除了作为维生素A的前体以及在光合作用中发挥重要作用，该化合物具有诸多的生理效应，例如清除自由基，增强免疫应答，增强细胞间隙连接。目前，β-胡萝卜素在食品、水产养殖、化妆品和制药领域等有着广泛的应用：着色剂、食品添加剂、抗氧化剂、抗癌制剂以及预防心脏疾病等。
β-胡萝卜素的生产方法主要有化学合成法、天然提取法和微生物发酵法。但化学合成β-胡萝卜素的路线很复杂，而且收率也不高；从马铃薯、胡萝卜、沙棘和玉米等天然来源中提取β-胡萝卜素受诸多条件的影响，如季节、气候等，而且这些植物来源的β-胡萝卜素含量较少，因此导致天然提取β-胡萝卜素产品成本很高，能量的高消耗及较低的提取效率阻碍了这些方法的实际使用。因此微生物发酵法生产β-胡萝卜素具有明显的优势。特别是随着生物技术的快速发展，利用微生物发酵生产β-胡萝卜素成为目前研究的热点之一。
目前，一般通过外源引入β-胡萝卜素合成相关基因生物发酵法生产β-胡萝卜素。与酿酒酵母相比，在解脂耶氏酵母中进行β-胡萝卜素的生产的报道并不多。但解脂耶氏酵母作为一种油脂酵母可以为类胡萝素提供储存空间，具有广泛利用底物的能力，是公认的安全性菌株，因此亟需开发β-胡萝卜素合成的解脂耶氏酵母基因工程菌。
发明内容
本发明将基因carRP和基因carB转化解脂耶氏酵母能够使其产β-胡萝卜素，在此基础上过表达了基因GGS1基因、基因HMG及基因ERG13，能够极大地提高β-胡萝卜素的产量。最后，将尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型筛选标记进行回补成功获得了产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母生产菌株。因此，本发明的第一个目的是提供一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌。本发明的第二个目的是所述产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌在构建类胡萝卜素的基因工程菌中的应用。本发明的第三个目的是提供一种所述产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法。
为了达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
作为本发明的第一个方面，一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK2，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中构建而成，所述carRP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:55所示；所述carB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:56所示。
根据本发明，敲入carRP基因和carB基因的两组质粒对分别为pHR_XPR2_carRP和pCRISPRyl_XPR2及pHR_D17_carB和pCRISPRyl_D17。
一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK3，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，构建获得解脂耶氏酵母基因工程菌XK2，再敲入GGS1基因构建获得。
根据本发明，所述解脂耶氏酵母基因工程菌XK3是将质粒pHR_A08_GGS1和pCRISPRyl_A08转化解脂耶氏酵母基因工程菌XK2后构建获得。
一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK4，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因和HMG基因构建而成。
根据本发明，所述的解脂耶氏酵母基因工程菌XK4是将质粒pHR_AXP_HMG和pCRISPRyl_AXP转化解脂耶氏酵母基因工程菌XK3后构建获得。
一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK5，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因和1个拷贝的carB基因构建而成。
根据本发明，所述的解脂耶氏酵母基因工程菌XK5，其是将质粒pHR_POX2_carB和pCRISPRyl_POX2依次转化解脂耶氏酵母基因工程菌XK4中构建获得。
一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK6，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因和1个拷贝的carB基因构建而成。
根据本发明，所述的解脂耶氏酵母基因工程菌XK6，其是将质粒pHR_MFE1_carRP和pCRISPRyl_MFE1依次转入解脂耶氏酵母基因工程菌XK5中构建获得。
一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK7，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、两个拷贝的carRP基因和1个拷贝的carB基因构建而成。
根据本发明，所述的解脂耶氏酵母基因工程菌XK7，其是将pHR_POX3_carRP和pCRISPRyl_POX3依次转入解脂耶氏酵母基因工程菌XK6中构建获得。
一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK17，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、两个拷贝的carRP基因和1个拷贝的carB基因、ERG13基因构建而成。
根据本发明，所述的解脂耶氏酵母基因工程菌XK17，其是将质粒pHR_LIP1_ERG13和pCRISPRyl_LIP1转入解脂耶氏酵母基因工程菌XK7中构建获得。
一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK19，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、两个拷贝的carRP基因和1个拷贝的carB基因、ERG13基因，最后将尿嘧啶和亮氨酸两个营养缺陷型筛选标记回补构建而成。
根据本发明，所述的解脂耶氏酵母基因工程菌XK19，其是将线性化pINA1269质粒转入解脂耶氏酵母基因工程菌XK17中回补亮氨酸筛选标记；之后将线性化pINA1312质粒转入已回补亮氨酸筛选标记的解脂耶氏酵母基因工程菌XK17中回补尿嘧啶筛选标记，构建获得。
一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK10，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因、1个拷贝的carB基因和ERG13基因构建而成。
根据本发明，所述的解脂耶氏酵母基因工程菌XK10，其是将质粒pHR_LIP1_ERG13和pCRISPRyl_LIP1转入解脂耶氏酵母基因工程菌XK6中构建获得。
一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK11，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因、1个拷贝的carB基因和ERG10-11099基因构建而成。
根据本发明，所述的解脂耶氏酵母基因工程菌XK11，其是将pHR_E1_ERG10-11099和pCRISPRyl_E1转入解脂耶氏酵母基因工程菌XK6中构建获得。
一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK12，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因、1个拷贝的carB基因和ERG10-08536基因构建而成。
根据本发明，所述的解脂耶氏酵母基因工程菌XK12，其是将pHR_A1_ERG10-08536和pCRISPRyl_A1转入解脂耶氏酵母基因工程菌XK6中构建获得。
一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK13，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因、1个拷贝的carB基因和ERG8基因构建而成。
根据本发明，所述的解脂耶氏酵母基因工程菌XK13，其是将pHR_B1_ERG8和pCRISPRyl_B1转入解脂耶氏酵母基因工程菌XK6中构建获得。
一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK14，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因、1个拷贝的carB基因和ERG19基因构建而成。
根据本发明，所述的解脂耶氏酵母基因工程菌XK14，其是将pHR_A2_ERG19和pCRISPRyl_A2转入解脂耶氏酵母基因工程菌XK6中构建获得。
一种所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK15，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因、1个拷贝的carB基因和IDI基因构建而成。
根据本发明，所述的解脂耶氏酵母基因工程菌XK15，其是将pHR_POX6_IDI和pCRISPRyl_POX6转入解脂耶氏酵母基因工程菌XK6中构建获得。
一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK16，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因、1个拷贝的carB基因和ERG12基因构建而成。
根据本发明，所述的解脂耶氏酵母基因工程菌XK16，其是将pHR_E2_ERG12和pCRISPRyl_E2转入解脂耶氏酵母基因工程菌XK6中构建获得。
一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK8，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因和2个拷贝的carB基因构建而成。
根据本发明，所述的解脂耶氏酵母基因工程菌XK8，其是将pHR_POX4_carB和pCRISPRyl_POX4转入解脂耶氏酵母基因工程菌XK6中构建获得。
根据本发明，所述GGS1基因在NCBI中登录号为GB:NC_006070，HMG基因在NCBI中登录号为GB:NC_006071，ERG13基因在NCBI中登录号为GB:NC_006072.1；ERG10基因在NCBI中登录号分别为NC_006071.1(ERG10-11099)和NC_006068.1(ERG10-08536)；ERG8基因在NCBI中登录号为GB:NC_006071.1；ERG19基因在NCBI中登录号为GB:NC_006072.1；IDI基因在NCBI中登录号为GB:NC_006072.1；ERG12基因在NCBI中登录号为GB:NC_006068.1。
根据本发明，所述尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母为解脂耶氏酵母Po1f；所述carRP基因、carB基因、GGS1基因、HMG基因、ERG13基因、ERG10-11099基因、ERG10-08536基因、ERG8基因、ERG19基因、IDI基因、ERG12基因均采用CRISPR/Cas9操作***敲入解脂耶氏酵母Po1f。
作为本发明的第二个方面，一种用于基因敲入的解脂耶氏酵母基因工程菌的敲入质粒对，所述敲入质粒对为用于在解脂耶氏酵母中进行基因敲入的基于CRISPR/Cas9***的质粒对，所述敲入质粒对为pHR_POX2_hrGFP和pCRISPRyl_POX2，pHR_POX3_hrGFP和pCRISPRyl_POX3，pHR_LIP1_hrGFP和pCRISPRyl_LIP1，pHR_POX4_hrGFP和pCRISPRyl_POX4，pHR_E1_hrGFP和pCRISPRyl_E1，pHR_A1_hrGFP和pCRISPRyl_A1，pHR_B1_hrGFP和pCRISPRyl_B1，pHR_A2_hrGFP和pCRISPRyl_A2，pHR_POX6_hrGFP和pCRISPRyl_POX6，pHR_E2_hrGFP和pCRISPRyl_E2中的至少一对敲入质粒对；
(1)质粒对pHR_POX2_hrGFP和pCRISPRyl_POX2：
质粒对pHR_POX2_hrGFP和pCRISPRyl_POX2可用于基因的敲入，如carB基因的敲入；
所述pCRISPRyl_POX2是使用AvrII限制性内切酶将质粒pCRISPRyl线性化，并与针对POX2位点设计的sgRNA片段无缝克隆连接构建获得，其中，针对POX2位点设计的sgRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述pHR_POX2_hrGFP是以解脂耶氏酵母的基因组为模板，分别使用引物对POX2-LF/POX2-LR和POX2-RF/POX2-RR通过PCR扩增POX2位点sgRNA序列两端各1200bp作为左右同源臂，以质粒pHR_AXP_hrGFP为模板，使用引物对plas-F和plas-R通过PCR扩增得到质粒基本骨架，上述三个片段无缝克隆连接获得质粒pHR_POX2；将质粒pHR_AXP_hrGFP使用限制性内切酶SpeI和AvrII双酶切获得的hrGFP基因表达盒与同样使用限制性内切酶SpeI和AvrII进行双酶切的质粒pHR_POX2连接，获得pHR_POX2_hrGFP；其中，引物POX2-LF、POX2-LR、POX2-RF和POX2-RR的引物序列分别如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQID NO：14所示；引物对plas-F和plas-Rd引物序列分别如SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54所示；
(2)质粒对pHR_POX3_hrGFP和pCRISPRyl_POX3：
质粒对pHR_POX3_hrGFP和pCRISPRyl_POX3可用于基因的敲入，如carRP基因的敲入；
所述pCRISPRyl_POX3是使用AvrII限制性内切酶将质粒pCRISPRyl进行单酶切线性化，与针对POX3位点设计的sgRNA片段无缝克隆连接即可获得，其中，针对POX3位点设计的sgRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述pHR_POX3_hrGFP的构建是以解脂耶氏酵母的基因组为模板，分别使用引物对POX3-LF/POX3-LR和POX3-RF/POX3-RR通过PCR扩增POX3位点sgRNA序列两端各1200bp作为左右同源臂，以质粒pHR_AXP_hrGFP为模板，使用引物对plas-F和plas-R通过PCR扩增得到质粒基本骨架，上述三个片段无缝克隆连接获得质粒pHR_POX3；将质粒pHR_AXP_hrGFP使用限制性内切酶SpeI和AvrII双酶切获得的hrGFP基因表达盒与同样使用限制性内切酶SpeI和AvrII进行双酶切的质粒pHR_POX3连接，获得pHR_POX3_hrGFP；其中，引物POX3-LF、POX3-LR、POX3-RF和POX3-RR的引物序列分别如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示；
(3)pHR_LIP1_hrGFP和pCRISPRyl_LIP1：
质粒对pHR_LIP1_hrGFP和pCRISPRyl_LIP1可用于基因的敲入，如ERG13基因的敲入；
所述pCRISPRyl_LIP1是使用AvrII限制性内切酶将质粒pCRISPRyl进行单酶切线性化，与针对LIP1位点设计的sgRNA片段无缝克隆连接即可获得，其中，针对LIP1位点设计的sgRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
所述pHR_LIP1_hrGFP是以解脂耶氏酵母的基因组为模板，分别使用引物对LIP1-LF/LIP1-LR和LIP1-RF/LIP1-RR通过PCR扩增LIP1位点sgRNA序列两端各1200bp作为左右同源臂，以质粒pHR_AXP_hrGFP为模板，使用引物对plas-F和plas-R通过PCR扩增得到质粒基本骨架，上述三个片段无缝克隆连接获得质粒pHR_LIP1；将质粒pHR_AXP_hrGFP使用限制性内切酶SpeI和AvrII双酶切获得的hrGFP基因表达盒与同样使用限制性内切酶SpeI和AvrII进行双酶切的质粒pHR_LIP1连接，获得pHR_LIP1_hrGFP；其中，引物LIP1-LF、LIP1-LR、LIP1-RF和LIP1-RR的引物序列分别如SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQID NO：30所示；
(4)pHR_POX4_hrGFP和pCRISPRyl_POX4：
质粒对pHR_POX4_hrGFP和pCRISPRyl_POX4可用于基因的敲入，如carB基因的敲入；
所述pCRISPRyl_POX4是使用AvrII限制性内切酶将质粒pCRISPRyl进行单酶切线性化，与针对POX4位点设计的sgRNA片段无缝克隆连接构建获得，针对POX4位点设计的sgRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述pHR_POX4_hrGFP是以解脂耶氏酵母的基因组为模板，分别使用引物对POX4-LF/POX4-LR和POX4-RF/POX4-RR通过PCR扩增POX4位点sgRNA序列两端各1200bp作为左右同源臂，以质粒pHR_AXP_hrGFP为模板，使用引物对plas-F和plas-R通过PCR扩增得到质粒基本骨架，上述三个片段无缝克隆连接获得质粒pHR_POX4；将质粒pHR_AXP_hrGFP使用限制性内切酶SpeI和AvrII双酶切获得的hrGFP基因表达盒与同样使用限制性内切酶SpeI和AvrII进行双酶切的质粒pHR_POX4连接，获得pHR_POX4_hrGFP；其中，引物POX4-LF、POX4-LR、POX4-RF和POX4-RR的引物序列分别如SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQID NO：22所示；
(5)pHR_E1_hrGFP和pCRISPRyl_E1：
质粒对pHR_E1_hrGFP和pCRISPRyl_E1可用于基因的敲入，如ERG10-11099基因的敲入；
所述pCRISPRyl_E1是使用AvrII限制性内切酶将质粒pCRISPRyl进行单酶切线性化，与针对E1位点设计的sgRNA片段无缝克隆连接构建获得，其中，所述针对E1位点设计的sgRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
所述pHR_E1_hrGFP是以解脂耶氏酵母的基因组为模板，分别使用引物对E1-LF/E1-LR和E1-RF/E1-RR通过PCR扩增E1位点sgRNA序列两端各1200bp作为左右同源臂，以质粒pHR_AXP_hrGFP为模板，使用引物对plas-F和plas-R通过PCR扩增得到质粒基本骨架，上述三个片段无缝克隆连接获得质粒pHR_E1；将质粒pHR_AXP_hrGFP使用限制性内切酶SpeI和AvrII双酶切获得的hrGFP基因表达盒与同样使用限制性内切酶SpeI和AvrII进行双酶切的质粒pHR_E1连接，获得pHR_E1_hrGFP；其中，引物E1-LF、E1-LR、E1-RF和E1-RR的引物序列分别如SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34所示；
(6)pHR_A1_hrGFP和pCRISPRyl_A1：
质粒对pHR_A1_hrGFP和pCRISPRyl_A1可用于基因的敲入，如ERG10-08536基因的敲入；
所述pCRISPRyl_A1是使用AvrII限制性内切酶将质粒pCRISPRyl进行单酶切线性化，与针对A1位点设计的sgRNA片段无缝克隆连接构建获得，针对A1位点设计的sgRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；
pHR_A1_hrGFP是以解脂耶氏酵母的基因组为模板，分别使用引物对A1-LF/A1-LR和A1-RF/A1-RR通过PCR扩增A1位点sgRNA序列两端各1200bp作为左右同源臂，以质粒pHR_AXP_hrGFP为模板，使用引物对plas-F和plas-R通过PCR扩增得到质粒基本骨架，上述三个片段无缝克隆连接获得质粒pHR_A1；将质粒pHR_AXP_hrGFP使用限制性内切酶SpeI和AvrII双酶切获得的hrGFP基因表达盒与同样使用限制性内切酶SpeI和AvrII进行双酶切的质粒pHR_A1连接，获得pHR_A1_hrGFP；其中，引物A1-LF、A1-LR、A1-RF、A1-RR的引物序列分别如SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38所示；
(7)pHR_B1_hrGFP和pCRISPRyl_B1：
质粒对pHR_B1_hrGFP和pCRISPRyl_B1可用于基因的敲入，如ERG8基因的敲入；
所述pCRISPRyl_B1是使用AvrII限制性内切酶将质粒pCRISPRyl进行单酶切线性化，与针对B1位点设计的sgRNA片段无缝克隆连接构建获得，针对B1位点设计的sgRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；
所述pHR_B1_hrGFP是以解脂耶氏酵母的基因组为模板，分别使用引物对B1-LF/B1-LR，B1-RF1/B1-RR1和B1-RF2/B1-RR2通过PCR扩增B1位点sgRNA序列两端各1200bp作为左右同源臂，以质粒pHR_AXP_hrGFP为模板，使用引物对plas-F和plas-R通过PCR扩增得到质粒基本骨架，上述四个片段无缝克隆连接获得质粒pHR_B1；将质粒pHR_AXP_hrGFP使用限制性内切酶SpeI和AvrII双酶切获得的hrGFP基因表达盒与同样使用限制性内切酶SpeI和AvrII进行双酶切的质粒pHR_B1连接，获得pHR_B1_hrGFP；其中，引物B1-LF、B1-LR、B1-RF1、B1-RR1、B1-RF2和B1-RR2的引物序列分别如SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44所示；
(8)pHR_A2_hrGFP和pCRISPRyl_A2：
质粒对pHR_A2_hrGFP和pCRISPRyl_A2可用于基因的敲入，如ERG19基因的敲入；
所述pCRISPRyl_A2是使用AvrII限制性内切酶将质粒pCRISPRyl进行单酶切线性化，与针对A2位点设计的sgRNA片段无缝克隆连接构建获得，针对A2位点设计的sgRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；
所述pHR_A2_hrGFP是以解脂耶氏酵母的基因组为模板，分别使用引物对A2-LF/A2-LR和A2-RF/A2-RR通过PCR扩增A2位点sgRNA序列两端各1200bp作为左右同源臂，以质粒pHR_AXP_hrGFP为模板，使用引物对plas-F和plas-R通过PCR扩增得到质粒基本骨架，上述三个片段无缝克隆连接获得质粒pHR_A2；将质粒pHR_AXP_hrGFP使用限制性内切酶SpeI和AvrII双酶切获得的hrGFP基因表达盒与同样使用限制性内切酶SpeI和AvrII进行双酶切的质粒pHR_A2连接，获得pHR_A2_hrGFP；其中，引物A2-LF、A2-LR、A2-RF和A2-RR的引物序列分别如SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48所示；
(9)pHR_POX6_hrGFP和pCRISPRyl_POX6：
质粒对pHR_POX6_hrGFP和pCRISPRyl_POX6可用于基因的敲入，如IDI基因的敲入；
所述pCRISPRyl_POX6是使用AvrII限制性内切酶将质粒pCRISPRyl进行单酶切线性化，与针对POX6位点设计的sgRNA片段无缝克隆连接构建获得，针对POX6位点设计的sgRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
所述pHR_POX6_hrGFP是以解脂耶氏酵母的基因组为模板，分别使用引物对POX6-LF/POX6-LR和POX6-RF/POX6-RR通过PCR扩增POX6位点sgRNA序列两端各1200bp作为左右同源臂，以质粒pHR_AXP_hrGFP为模板，使用引物对plas-F和plas-R通过PCR扩增得到质粒基本骨架，上述三个片段无缝克隆连接获得质粒pHR_POX6；将质粒pHR_AXP_hrGFP使用限制性内切酶SpeI和AvrII双酶切获得的hrGFP基因表达盒与同样使用限制性内切酶SpeI和AvrII进行双酶切的质粒pHR_POX6连接，获得pHR_POX6_hrGFP；其中，引物POX6-LF、POX6-LR、POX6-RF和POX6-RR的引物序列分别如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQID NO：26所示；
(10)pHR_E2_hrGFP和pCRISPRyl_E2：
质粒对pHR_E2_hrGFP和pCRISPRyl_E2可用于基因的敲入，如ERG12基因的敲入；
所述pCRISPRyl_E2是使用AvrII限制性内切酶将质粒pCRISPRyl进行单酶切线性化，与针对E2位点设计的sgRNA片段无缝克隆连接构建获得，针对E2位点设计的sgRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；
所述pHR_E2_hrGFP是以解脂耶氏酵母的基因组为模板，分别使用引物对E2-LF/E2-LR和E2-RF/E2-RR通过PCR扩增E2位点sgRNA序列两端各1200bp作为左右同源臂，以质粒pHR_AXP_hrGFP为模板，使用引物对plas-F和plas-R通过PCR扩增得到质粒基本骨架，上述三个片段无缝克隆连接获得质粒pHR_E2；将质粒pHR_AXP_hrGFP使用限制性内切酶SpeI和AvrII双酶切获得的hrGFP基因表达盒与同样使用限制性内切酶SpeI和AvrII进行双酶切的质粒pHR_E2连接，获得pHR_E2_hrGFP；其中，引物E2-LF、E2-LR、E2-RF和E2-RR的引物序列分别如SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52所示。
根据本发明，所述敲入质粒对是基于CRISPR/Cas9操作***构建获得，质粒pHR_POX2_hrGFP和pCRISPRyl_POX2是在POX2位点进行基因敲入构建了敲入质粒对；质粒pHR_POX3_hrGFP和pCRISPRyl_POX3是在POX3位点进行基因敲入而构建的敲入质粒对；质粒pHR_POX4_hrGFP和pCRISPRyl_POX4是在POX4位点进行基因敲入而构建的敲入质粒对；质粒pHR_POX6_hrGFP和pCRISPRyl_POX6是在POX6位点进行基因敲入而构建的敲入质粒对；质粒pHR_LIP1_hrGFP和pCRISPRyl_LIP1是在LIP1位点进行基因敲入而构建的敲入质粒对；质粒pHR_E1_hrGFP和pCRISPRyl_E1是在E1位点进行基因敲入而构建的敲入质粒对；质粒pHR_A1_hrGFP和pCRISPRyl_A1是在A1位点进行基因敲入而构建的敲入质粒对；质粒pHR_B1_hrGFP和pCRISPRyl_B1是在B1位点进行基因敲入而构建的敲入质粒对；质粒pHR_A2_hrGFP和pCRISPRyl_A2是在A2位点进行基因敲入而构建的敲入质粒对；质粒pHR_E2_hrGFP和pCRISPRyl_E2是在E2位点进行基因敲入而构建的敲入质粒对。
作为本发明的第三个方面，一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK19的构建方法，包括如下步骤：
(1)基于已有的CRISPR/Cas9操作***，分别构建含有carRP基因的敲入质粒对和构建含有carB基因的敲入质粒对，所述carRP基因的敲入质粒对为pHR_XPR2_carRP和pCRISPRyl_XPR2，所述carB基因的敲入质粒对为pHR_D17_carB和pCRISPRyl_D17；
(2)将步骤(1)中所得的质粒pHR_XPR2_carRP和质粒pCRISPRyl_XPR2同时转化入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母，得解脂耶氏酵母XK1；然后再将步骤(1)中所得的质粒pHR_D17_carB和质粒pCRISPRyl_D17同时转入解脂耶氏酵母XK1，获得产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母XK2；
(3)构建质粒对pHR_A08_GGS1和pCRISPRyl_A08及质粒对pHR_AXP_HMG和pCRISPRyl_AXP；将质粒对pHR_A08_GGS1和pCRISPRyl_A08同时转化入步骤(2)所得的解脂耶氏酵母XK2中，获得产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母的XK3，将质粒对pHR_AXP_HMG和pCRISPRyl_AXP同时转化入XK3，获得产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母的XK4；
(4)分别构建质粒对pHR_POX2_carB和pCRISPRyl_POX2、质粒对pHR_MFE1_carRP和pCRISPRyl_MFE1，并将质粒对pHR_POX2_carB和pCRISPRyl_POX2转化入步骤(3)所得的解脂耶氏酵母XK4中，获得产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母的XK5；将质粒对pHR_MFE1_carRP和pCRISPRyl_MFE1转化入解脂耶氏酵母XK5中，获得产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母的XK6；
(5)分别构建质粒对pHR_POX3_carRP和pCRISPRyl_POX3，依次转化入步骤(4)所得的解脂耶氏酵母XK6中，获得产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母的XK7；
(6)构建质粒对pHR_LIP1_ERG13和pCRISPRyl_LIP1，并转入至步骤(5)的解脂耶氏酵母XK7中，获得产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母XK17；
(7)通过使用PmlI和BamHI酶切位点将质粒pINA1269双酶切线性化，将线性化pINA1269质粒转入菌株XK17中回补亮氨酸筛选标记；之后通过使用PmlI和BamHI酶切位点将质粒pINA1312双酶切线性化，将线性化pINA1312质粒转入已回补亮氨酸筛选标记的XK17菌株中回补尿嘧啶筛选标记，获得产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母XK19。
根据本发明，步骤(1)的质粒pHR_XPR2_carRP的构建步骤为：将carRP基因通过酶切位点BssHII和NheI连接到质粒pHR_XPR2_hrGFP，得到质粒pHR_XPR2_carRP；
步骤(1)的质粒pHR_D17_carB的构建步骤为：将carB基因通过酶切位点BssHII和NheI连接到质粒pHR_D17_hrGFP，得到质粒pHR_D17_carB；
步骤(3)的质粒pHR_AXP_HMG的构建步骤为：将HMG基因通过酶切位点BssHII和NheI连接到质粒pHR_AXP_hrGFP，得到质粒pHR_AXP_HMG；
步骤(3)的质粒pHR_A08_GGS1的构建步骤为：将GGS1基因通过酶切位点BssHII和NheI连接到质粒pHR_A08_hrGFP，得到质粒pHR_A08_GGS1；
步骤(4)的质粒pHR_MFE1_carRP的构建步骤为：将carRP基因通过酶切位点BssHII和NheI连接到质粒pHR_MFE1_hrGFP中，得到质粒pHR_MFE1_carRP；
步骤(4)的质粒pHR_POX2_carB的构建步骤为：将carB基因通过酶切位点BssHII和NheI连接到质粒pHR_POX2_hrGFP中，得到质粒pHR_POX2_carB；
步骤(5)的质粒pHR_POX3_carRP的构建步骤为：将carRP基因通过酶切位点BssHII和NheI连接到质粒pHR_POX3_hrGFP中，得到质粒pHR_POX3_carRP；
步骤(6)的质粒pHR_LIP1_ERG13的构建步骤为：将来源于解脂耶氏酵母的ERG13基因通过酶切位点BssHII和NheI连接到质粒pHR_LIP1_hrGFP，得到质粒pHR_LIP1_ERG13。
作为本发明的第四个方面，一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)基于已有的CRISPR/Cas9操作***，分别构建含有carRP基因的敲入质粒对和构建含有carB基因的敲入质粒对，所述carRP基因的敲入质粒对为pHR_XPR2_carRP和pCRISPRyl_XPR2，所述carB基因的敲入质粒对为pHR_D17_carB和pCRISPRyl_D17；
(2)将步骤(1)中所得的质粒pHR_XPR2_carRP和质粒pCRISPRyl_XPR2同时转化入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母，得解脂耶氏酵母XK1；然后再将步骤(1)中所得的质粒pHR_D17_carB和质粒pCRISPRyl_D17同时转入解脂耶氏酵母XK1，获得产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母XK2；
(3)构建质粒对pHR_A08_GGS1和pCRISPRyl_A08及质粒对pHR_AXP_HMG和pCRISPRyl_AXP；将质粒对pHR_A08_GGS1和pCRISPRyl_A08同时转化入步骤(2)所得的解脂耶氏酵母XK2中，获得产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母的XK3，将质粒对pHR_AXP_HMG和pCRISPRyl_AXP同时转化入XK3，获得产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母的XK4；
(4)分别构建质粒对pHR_POX2_carB和pCRISPRyl_POX2、质粒对pHR_MFE1_carRP和pCRISPRyl_MFE1，并将质粒对pHR_POX2_carB和pCRISPRyl_POX2转化入步骤(3)所得的解脂耶氏酵母XK4中，获得产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母的XK5；将质粒对pHR_MFE1_carRP和pCRISPRyl_MFE1转化入解脂耶氏酵母XK5中，获得产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母的XK6；
(5)分别构建质粒对pHR_LIP1_ERG13和pCRISPRyl_LIP1，pHR_E1_ERG10-11099和pCRISPRyl_E1，pHR_A1_ERG10-08536和pCRISPRyl_A1，pHR_B1_ERG8和pCRISPRyl_B1，pHR_A2_ERG19和pCRISPRyl_A2，pHR_POX6_IDI和pCRISPRyl_POX6，pHR_E2_ERG12和pCRISPRyl_E2，分别转化菌株XK6中，获得产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母XK10，XK11，XK12，XK13，XK14，XK15和XK16。
根据本发明，步骤(1)的质粒pHR_XPR2_carRP的构建步骤为：将carRP基因通过酶切位点BssHII和NheI连接到质粒pHR_XPR2_hrGFP，得到质粒pHR_XPR2_carRP；
步骤(1)的质粒pHR_D17_carB的构建步骤为：将carB基因通过酶切位点BssHII和NheI连接到质粒pHR_D17_hrGFP，得到质粒pHR_D17_carB；
步骤(3)的质粒pHR_AXP_HMG的构建步骤为：将HMG基因通过酶切位点BssHII和NheI连接到质粒pHR_AXP_hrGFP，得到质粒pHR_AXP_HMG；
步骤(3)的质粒pHR_A08_GGS1的构建步骤为：将GGS1基因通过酶切位点BssHII和NheI连接到质粒pHR_A08_hrGFP，得到质粒pHR_A08_GGS1；
步骤(4)的质粒pHR_MFE1_carRP的构建步骤为：将carRP基因通过酶切位点BssHII和NheI连接到质粒pHR_MFE1_hrGFP中，得到质粒pHR_MFE1_carRP；
步骤(4)的质粒pHR_POX2_carB的构建步骤为：将carB基因通过酶切位点BssHII和NheI连接到质粒pHR_POX2_hrGFP中，得到质粒pHR_POX2_carB；
步骤(5)的质粒pHR_LIP1_ERG13、pHR_E1_ERG10-11099、pHR_A1_ERG10-08536、pHR_B1_ERG8、pHR_A2_ERG19、pHR_POX6_IDI、pHR_E2_ERG12的构建步骤为：分别将来源于解脂耶氏酵母的ERG13、ERG10-11099、ERG10-08536、ERG8、ERG19、IDI、ERG12基因连接到质粒pHR_LIP1_hrGFP、pHR_E1_hrGFP、pHR_A1_hrGFP、pHR_B1_hrGFP、pHR_A2_hrGFP、pHR_POX6_hrGFP和pHR_E2_hrGFP中，构建获得。
作为本发明的第五个方面，一种上述所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌在制备β-胡萝卜素中的应用。
作为本发明的第六个方面，一种上述所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌在制备类胡萝卜素及其衍生物中的应用。
根据本发明，所述类胡萝卜素为玉米黄质、虾青素、西红花苷、角黄素、海胆酮等。
作为本发明的第七个方面，一种β-胡萝卜素的生产方法，通过发酵生产上述所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌获得β-胡萝卜素。
本发明的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌，其有益效果是其构建方法简便，在未通过回补筛选标记的方式仅导入7个基因获得的解脂耶氏酵母基因工程菌XK7-XK8,XK10-XK16，通过发酵可以高产β-胡萝卜素，具有良好的应用前景。
本发明的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK19，其有益效果：(1)β-胡萝卜素的产量高：本发明的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌能使β-胡萝卜素在5L发酵罐中达到4.5g/L的产量。(2)其构建方法简便，通过CRISPR/Cas9及整合型质粒回补筛选标记的方式仅仅导入8个基因，获得的菌株经过连续传代培养稳定性良好，能够应用于大规模的商业化生产，所得的β-胡萝卜素能够被安全使用，前景良好。
附图说明
图1为引入β-胡萝卜素合成基因后解脂耶氏酵母生成β-胡萝卜素的代谢途径。
图2为菌株XK2，XK3，XK4，XK5，XK6，XK7，XK8，XK10，XK11，XK12，XK13，XK14，XK15，XK16，XK17和XK19摇瓶发酵生产β-胡萝卜素的结果图。
图3为XK19菌株在5L发酵罐中分批补料发酵生产β-胡萝卜素的结果图。
图4为本发明的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。例如，本发明的实施例中的CRISPR/Cas9操作***，其按照Schwartz,C.,Shabbir-Hussain,M.,Frogue,K.,Blenner,M.,Wheeldon,I.2017.Standardized markerless gene integration for pathway engineering inYarrowia lipolytica.ACS Synth Biol,6(3),402-409中记载的制备方法制得。
本申请所用的解脂耶氏酵母自身能够合成GGPP，为此，将来自卷枝毛霉的密码子优化后的两个β-胡萝卜素合成基因——carRP和carB，转化解脂耶氏酵母能够使其产β-胡萝卜素，在此基础上又增加了两个拷贝的carRP基因和一个拷贝的carB基因，过表达了GGS1基因、HMG基因及ERG13基因，能够极大的提高β-胡萝卜素的产量，最后将尿嘧啶和亮氨酸两个营养缺陷型筛选标记回补成功获得了β-胡萝卜素的高产菌株(参见图1)。
本发明所用的试剂和原料均市售可得。
本发明涉及的菌株和质粒来源如下：
1、解脂耶氏酵母Po1f和质粒pINA1269：根据Madzak,C.,Treton,B.,Blanchin-Roland,S.2000.Strong hybrid promoters and integrative expression/secretionvectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in theyeast Yarrowia lipolytica.J Mol Microbiol Biotechnol,2(2),207-216所记载的制备方法制得。
2、质粒pINA1312：参见Nicaud,J.M.,Madzak,C.,van den Broek,P.,Gysler,C.,Duboc,P.,Niederberger,P.,Gaillardin,C.2002.Protein expression and secretionin the yeast Yarrowia lipolytica.FEMS Yeast Res,2(3),371-379所记载的制备方法制得。
3、质粒pCRISPRyl、质粒pCRISPRyl、质粒pHR_XPR2_hrGFP、质粒pHR_D17_hrGFP、质粒pCRISPRyl_XPR2、质粒pCRISPRyl_D17、质粒pHR_AXP_hrGFP、质粒pHR_A08_hrGFP、质粒pCRISPRyl_AXP、质粒pCRISPRyl_A08、质粒pHR_MFE1_hrGFP、质粒pCRISPRyl_MFE1为现有已知质粒，均购自于addgene。
4、质粒pHR_XPR2_carRP：含有来源于卷枝毛霉的基因carRP；质粒pHR_D17_carB：含有来源于卷枝毛霉的基因carB；质粒pHR_A08_GGS1：含有来源于解脂耶氏酵母的基因GGS1；质粒pHR_AXP_HMG：含有来源于于解脂耶氏酵母的基因HMG；质粒pHR_POX2_carB：含有来源于卷枝毛霉的基因carB；质粒pHR_MFE1_carRP：含有来源于卷枝毛霉的基因carRP；质粒pHR_POX3_carRP：含有来源于卷枝毛霉的基因carRP；质粒pHR_POX4_carB：含有来源于卷枝毛霉的基因carB；质粒pHR_LIP1_ERG13：含有来源于解脂耶氏酵母的基因ERG13；质粒pHR_E1_ERG10-11099：含有来源于解脂耶氏酵母的基因ERG10-11099；质粒pHR_A1_ERG10-08536：含有来源于解脂耶氏酵母的基因ERG10-08536；质粒pHR_B1_ERG8：含有来源于解脂耶氏酵母的基因ERG8；质粒pHR_A2_ERG19：含有来源于解脂耶氏酵母的基因ERG19；质粒pHR_POX6_IDI：含有来源于解脂耶氏酵母的基因IDI；质粒pHR_E2_ERG12：含有来源于解脂耶氏酵母的基因ERG12。
5、本发明是根据已有的CRISPR/Cas9操作***，构建十对敲入质粒对，其是将已在Addgene上公布的CRISPR/Cas9操作***的基础上，又开发出十个可用位点，用于基因敲入，所述的十个位点分别为POX2(NCBI上的locus tag为YALI0F10857g)，POX3(NCBI上的locustag为YALI0D24750g)，POX4(NCBI上的locus tag为YALI0E27654g)，POX6(NCBI上的locustag为YALI0E06567g)，LIP1(NCBI上的locus tag为YALI0E10659g)，E1(NCBI上的locus tag为YALI0E27555g)，A1(NCBI上的locus tag为YALI0A11286g)，B1(NCBI上的locus tag为YALI0B09493g)，A2(NCBI上的locus tag为YALI0A04807g)，E2(NCBI上的locus tag为YALI0E35090g)。在这十个位点进行基因敲入，针对每个位点构建了质粒对，分别为pHR_POX2_hrGFP和pCRISPRyl_POX2，pHR_POX3_hrGFP和pCRISPRyl_POX3，pHR_LIP1_hrGFP和pCRISPRyl_LIP1，pHR_POX4_hrGFP和pCRISPRyl_POX4，pHR_E1_hrGFP和pCRISPRyl_E1，pHR_A1_hrGFP和pCRISPRyl_A1，pHR_B1_hrGFP和pCRISPRyl_B1，pHR_A2_hrGFP和pCRISPRyl_A2，pHR_POX6_hrGFP和pCRISPRyl_POX6，pHR_E2_hrGFP和pCRISPRyl_E2。其中，10个位点设计好的sgRNA片段的序列如表1所示；构建上述十对质粒对的引物序列如表2所示。
表1敲入位点的sgRNA的序列
Figure BDA0002388807230000101
Figure BDA0002388807230000111
表2质粒对的引物序列
Figure BDA0002388807230000112
Figure BDA0002388807230000121
本发明涉及的化学名称和基因名称解释如下：
1、GGPP：牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸
2、FPP：法呢基二磷酸
3、IPP：异戊烯基焦磷酸
4、DMAPP：二甲基烯丙基焦磷酸
5、HMG-CoA：3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A
6、carRP：可催化两分子的GGPP生成八氢番茄红素及将番茄红素催化生成β-胡萝卜素的双功能酶基因，在NCBI中登录号为GB:AJ250827.1；
7、carB：可催化八氢番茄红素生成番茄红素的基因，在NCBI中登录号为GB:AJ238028.1；
8、GGS1：可以将FPP催化生成GGPP的基因，在NCBI中登录号为GB:NC_006070；
9、HMG：编码HMG-CoA还原酶，可以将HMG-CoA还原为甲羟戊酸的基因，在NCBI中登录号为GB:NC_006071；
10、ERG13：编码HMG-CoA合成酶，可催化乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A生成HMG-CoA的基因，在NCBI中登录号为GB:NC_006072.1；
11、ERG10：该基因编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶，可催化两分子乙酰辅酶A生成乙酰乙酰辅酶A的基因，该基因有两个同工酶，它们在NCBI中登录号分别为NC_006071.1(ERG10-11099)和NC_006068.1(ERG10-08536)；
12、ERG8：编码二氧磷基MVA激酶，可催化甲羟戊酸-5-磷酸生成甲羟戊酸-5-二磷酸的基因，在NCBI中登录号为GB:NC_006071.1；
13、ERG19：编码MVA焦磷酸脱羧酶，可催化甲羟戊酸-5-二磷酸生成IPP的基因，在NCBI中登录号为GB:NC_006072.1；
14、IDI：编码IPP异构酶，可催化IPP生成DMAPP的基因，在NCBI中登录号为GB:NC_006072.1；
15、ERG12：编码MVA激酶，可催化甲羟戊酸生成甲羟戊酸-5-磷酸的基因，在NCBI中登录号为GB:NC_006068.1。
16、以下实施例中涉及的carRP基因和carB基因，均指优化后的carRP基因和carB基因，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56所示。
以下实施例采用解脂耶氏酵母Po1f作为出发菌株。应当说明，常规的尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)均能够作为出发菌株，用于转化，以进行如下实施例中的试验。
实施例1构建CRISPR/Cas9基因敲入质粒对
针对不同的sgRNA进行的质粒构建都基于所购买的质粒pCRISPRyl，该质粒上有一个酶切位点AvrII，该酶切位点上游含有启动子SCR1’-tRNAGly用于启动sgRNA的表达，将sgRNA的20bp序列***该位点即获得了sgRNA质粒。对质粒pCRISPRyl使用AvrII限制性内切酶进行单酶切之后纯化，获得线性化的质粒pCRISPRyl。将该线性化质粒分别与针对POX2、POX3、POX4、LIP1、E1、A1、B1、A2、POX6、E2位点设计好的sgRNA片段(见表1的SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:10)进行无缝克隆，分别获得载体pCRISPRyl_POX2，pCRISPRyl_POX3，pCRISPRyl_POX4，pCRISPRyl_LIP1，pCRISPRyl_E1，pCRISPRyl_A1，pCRISPRyl_B1，pCRISPRyl_A2，pCRISPRyl_POX6，pCRISPRyl_E2。
(1)质粒pHR_POX2_hrGFP的构建：以解脂耶氏酵母的基因组为模板，分别使用引物对POX2-LF/POX2-LR和POX2-RF/POX2-RR通过PCR扩增POX2位点sgRNA序列两端各1200bp作为左右同源臂，以质粒pHR_AXP_hrGFP为模板，使用引物对plas-F和plas-R通过PCR扩增得到质粒基本骨架，上述三个片段无缝克隆连接获得质粒pHR_POX2；将质粒pHR_AXP_hrGFP使用限制性内切酶SpeI和AvrII双酶切获得的hrGFP基因表达盒与同样使用限制性内切酶SpeI和AvrII进行双酶切的质粒pHR_POX2连接，验证后获得获得pHR_POX2_hrGFP。
(2)质粒pHR_POX3_hrGFP的构建：以解脂耶氏酵母的基因组为模板，分别使用引物对POX3-LF/POX3-LR和POX3-RF/POX3-RR通过PCR扩增POX3位点sgRNA序列两端各1200bp作为左右同源臂，以质粒pHR_AXP_hrGFP为模板，使用引物对plas-F和plas-R通过PCR扩增得到质粒基本骨架，上述三个片段无缝克隆连接获得质粒pHR_POX3；将质粒pHR_AXP_hrGFP使用限制性内切酶SpeI和AvrII双酶切获得的hrGFP基因表达盒与同样使用限制性内切酶SpeI和AvrII进行双酶切的质粒pHR_POX3连接，验证后获得获得pHR_POX3_hrGFP。
(3)质粒pHR_LIP1_hrGFP的构建：以解脂耶氏酵母的基因组为模板，分别使用引物对LIP1-LF/LIP1-LR和LIP1-RF/LIP1-RR通过PCR扩增LIP1位点sgRNA序列两端各1200bp作为左右同源臂，以质粒pHR_AXP_hrGFP为模板，使用引物对plas-F和plas-R通过PCR扩增得到质粒基本骨架，上述三个片段无缝克隆连接获得质粒pHR_LIP1；将质粒pHR_AXP_hrGFP使用限制性内切酶SpeI和AvrII双酶切获得的hrGFP基因表达盒与同样使用限制性内切酶SpeI和AvrII进行双酶切的质粒pHR_LIP1连接，获得pHR_LIP1_hrGFP。
(4)质粒pHR_POX4_hrGFP的构建：以解脂耶氏酵母的基因组为模板，分别使用引物对POX4-LF/POX4-LR和POX4-RF/POX4-RR通过PCR扩增POX4位点sgRNA序列两端各1200bp作为左右同源臂，以质粒pHR_AXP_hrGFP为模板，使用引物对plas-F和plas-R通过PCR扩增得到质粒基本骨架，上述三个片段无缝克隆连接获得质粒pHR_POX4；将质粒pHR_AXP_hrGFP使用限制性内切酶SpeI和AvrII双酶切获得的hrGFP基因表达盒与同样使用限制性内切酶SpeI和AvrII进行双酶切的质粒pHR_POX4连接，获得pHR_POX4_hrGFP。
(5)质粒pHR_E1_hrGFP的构建：以解脂耶氏酵母的基因组为模板，分别使用引物对E1-LF/E1-LR和E1-RF/E1-RR通过PCR扩增E1位点sgRNA序列两端各1200bp作为左右同源臂，以质粒pHR_AXP_hrGFP为模板，使用引物对plas-F和plas-R通过PCR扩增得到质粒基本骨架，上述三个片段无缝克隆连接获得质粒pHR_E1；将质粒pHR_AXP_hrGFP使用限制性内切酶SpeI和AvrII双酶切获得的hrGFP基因表达盒与同样使用限制性内切酶SpeI和AvrII进行双酶切的质粒pHR_E1连接，获得pHR_E1_hrGFP。
(6)质粒pHR_A1_hrGFP的构建：以解脂耶氏酵母的基因组为模板，分别使用引物对A1-LF/A1-LR和A1-RF/A1-RR通过PCR扩增A1位点sgRNA序列两端各1200bp作为左右同源臂，以质粒pHR_AXP_hrGFP为模板，使用引物对plas-F和plas-R通过PCR扩增得到质粒基本骨架，上述三个片段无缝克隆连接获得质粒pHR_A1；将质粒pHR_AXP_hrGFP使用限制性内切酶SpeI和AvrII双酶切获得的hrGFP基因表达盒与同样使用限制性内切酶SpeI和AvrII进行双酶切的质粒pHR_A1连接，获得pHR_A1_hrGFP。
(7)质粒pHR_B1_hrGFP的构建分：以解脂耶氏酵母的基因组为模板，分别使用引物对B1-LF/B1-LR，B1-RF1/B1-RR1和B1-RF2/B1-RR2通过PCR扩增B1位点sgRNA序列两端各1200bp作为左右同源臂，以质粒pHR_AXP_hrGFP为模板，使用引物对plas-F和plas-R通过PCR扩增得到质粒基本骨架，上述四个片段无缝克隆连接获得质粒pHR_B1；将质粒pHR_AXP_hrGFP使用限制性内切酶SpeI和AvrII双酶切获得的hrGFP基因表达盒与同样使用限制性内切酶SpeI和AvrII进行双酶切的质粒pHR_B1连接，获得pHR_B1_hrGFP。
(8)质粒pHR_A2_hrGFP的构建：以解脂耶氏酵母的基因组为模板，分别使用引物对A2-LF/A2-LR和A2-RF/A2-RR通过PCR扩增A2位点sgRNA序列两端各1200bp作为左右同源臂，以质粒pHR_AXP_hrGFP为模板，使用引物对plas-F和plas-R通过PCR扩增得到质粒基本骨架，上述三个片段无缝克隆连接获得质粒pHR_A2；将质粒pHR_AXP_hrGFP使用限制性内切酶SpeI和AvrII双酶切获得的hrGFP基因表达盒与同样使用限制性内切酶SpeI和AvrII进行双酶切的质粒pHR_A2连接，获得pHR_A2_hrGFP。
(9)质粒pHR_POX6_hrGFP的构建：以解脂耶氏酵母的基因组为模板，分别使用引物对POX6-LF/POX6-LR和POX6-RF/POX6-RR通过PCR扩增POX6位点sgRNA序列两端各1200bp作为左右同源臂，以质粒pHR_AXP_hrGFP为模板，使用引物对plas-F和plas-R通过PCR扩增得到质粒基本骨架，上述三个片段无缝克隆连接获得质粒pHR_POX6；将质粒pHR_AXP_hrGFP使用限制性内切酶SpeI和AvrII双酶切获得的hrGFP基因表达盒与同样使用限制性内切酶SpeI和AvrII进行双酶切的质粒pHR_POX6连接，获得pHR_POX6_hrGFP。
(10)质粒pHR_E2_hrGFP的构建：以解脂耶氏酵母的基因组为模板，分别使用引物对E2-LF/E2-LR和E2-RF/E2-RR通过PCR扩增E2位点sgRNA序列两端各1200bp作为左右同源臂，以质粒pHR_AXP_hrGFP为模板，使用引物对plas-F和plas-R通过PCR扩增得到质粒基本骨架，上述三个片段无缝克隆连接获得质粒pHR_E2；将质粒pHR_AXP_hrGFP使用限制性内切酶SpeI和AvrII双酶切获得的hrGFP基因表达盒与同样使用限制性内切酶SpeI和AvrII进行双酶切的质粒pHR_E2连接，获得pHR_E2_hrGFP。
实施例2构建产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌
本发明的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建示意图如图4所示。
(1)基于已有的CRISPR/Cas9操作***，构建两对敲入质粒对，分别为构建含有优化的carRP基因的敲入质粒对和构建含有优化的carB基因的敲入质粒对。
两对敲入质粒对中donor质粒都含有NheI和BssHII的酶切位点。
所述donor质粒还含有启动子和/或终止子序列。更佳地，所述的donor质粒还含有启动子UAS1B8-TEF(136)。
本实施例中的敲入质粒对为本领域常规的重组载体，其中sgRNA质粒中含有亮氨酸筛选标记，donor质粒中含有尿嘧啶筛选标记，其能够转化尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母，两对敲入质粒对分别能够敲入上述优化的carRP基因和carB基因。
具体步骤如下：
分别将来源于卷枝毛霉(Mucor circinelloides)的基因carRP的优化序列(其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)和carB的优化序列(其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)通过酶切位点NheI和BssHII构建到质粒pHR_XPR2_hrGFP和质粒pHR_D17_hrGFP中，得到质粒pHR_XPR2_carRP和pHR_D17_carB。其中，密码子优化过的carRP和carB基因是通过将来源于卷枝毛霉(Mucor circinelloides)的carRP和carB的核苷酸序列进行优化后得到。
(2)将步骤(1)中所得的质粒pHR_XPR2_carRP和质粒pCRISPRyl_XPR2同时转化入解脂耶氏酵母Po1f中，获得菌株XK1，经验证，菌株XK1中敲入carRP基因。其中，转化使用试剂盒Frozen EZ Yeast Transformation IITM(购自Zymo Research)，按照该试剂盒说明书记载的方法进行操作。将菌株XK1中的筛选标记进行回收后，将步骤(1)中所得的质粒pHR_D17_carB和质粒pCRISPRyl_D17同时转入解脂耶氏酵母XK1中，获得菌株XK2，经验证，菌株XK2中敲入carB基因。
(3)将来源于解脂耶氏酵母的HMG基因，GGS1基因通过酶切位点BssHII和NheI分别连接到质粒pHR_AXP_hrGFP和pHR_A08_hrGFP，得到质粒pHR_AXP_HMG和pHR_A08_GGS1。将所得的质粒pHR_A08_GGS1和pCRISPRyl_A08依次转化菌株XK2中获得菌株XK3，将所得的质粒pHR_AXP_HMG和pCRISPRyl_AXP转入菌株XK3中获得菌株XK4，经验证，菌株XK4中敲入HMG基因和GGS1基因。
(4)将carRP基因通过酶切位点BssHII和NheI连接到质粒pHR_MFE1_hrGFP中，得到质粒pHR_MFE1_carRP。将carB基因通过酶切位点BssHII和NheI连接到质粒pHR_POX2_hrGFP中，得到质粒pHR_POX2_carB。将所得的质粒pHR_POX2_carB和pCRISPRyl_POX2依次转化菌株XK4中获得菌株XK5，将所得的质粒pHR_MFE1_carRP和pCRISPRyl_MFE1依次转入菌株XK5中获得菌株XK6，经验证，菌株XK6中敲入carRP基因和carB基因。
(5)将carRP基因和carB基因分别连接到质粒pHR_POX3_hrGFP和pHR_POX4_hrGFP中，得到质粒pHR_POX3_carRP和pHR_POX4_carB。将所得的质粒pHR_POX3_carRP和pCRISPRyl_POX3，pHR_POX4_carB和pCRISPRyl_POX4，分别转化菌株XK6中，获得菌株XK7和XK8，经验证，菌株XK7中敲入carRP基因，菌株XK8中敲入carB基因。
将ERG13，ERG10-11099，ERG10-08536，ERG8，ERG19，IDI，ERG12基因分别连接到质粒pHR_LIP1_hrGFP，pHR_E1_hrGFP，pHR_A1_hrGFP，pHR_B1_hrGFP，pHR_A2_hrGFP，pHR_POX6_hrGFP和pHR_E2_hrGFP中，得到质粒pHR_LIP1_ERG13，pHR_E1_ERG10-11099，pHR_A1_ERG10-08536，pHR_B1_ERG8，pHR_A2_ERG19，pHR_POX6_IDI和pHR_E2_ERG12。将所得的质粒pHR_LIP1_ERG13和pCRISPRyl_LIP1，pHR_E1_ERG10-11099和pCRISPRyl_E1，pHR_A1_ERG10-08536和pCRISPRyl_A1，pHR_B1_ERG8和pCRISPRyl_B1，pHR_A2_ERG19和pCRISPRyl_A2，pHR_POX6_IDI和pCRISPRyl_POX6，pHR_E2_ERG12和pCRISPRyl_E2，分别转化菌株XK6中，获得菌株XK10，XK11，XK12，XK13，XK14，XK15和XK16。经验证，这七个菌株中分别敲入ERG13，ERG10-11099，ERG10-08536，ERG8，ERG19，IDI，ERG12基因。
(6)将上述构建质粒pHR_LIP1_ERG13和pCRISPRyl_LIP1转化菌株XK7中，获得菌株XK17。经验证，菌株XK17中敲入ERG13基因。
(7)通过使用PmlI和BamHI酶切位点将质粒pINA1269双酶切线性化，将线性化pINA1269质粒转入菌株XK17中回补亮氨酸筛选标记；之后通过使用PmlI和BamHI酶切位点将质粒pINA1312双酶切线性化，将线性化pINA1312质粒转入已回补亮氨酸筛选标记的XK17菌株中回补尿嘧啶筛选标记，获得菌株XK19。其中，转化的方法与步骤(2)中转化的方法相同。经验证，菌株XK19中成功的回补了尿嘧啶和亮氨酸筛选标记。应当说明，质粒pINA1269和pINA1312为本领域常规的重组载体，其能够转化尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母，所述的重组载体含有PmlI和BamHI的酶切位点。
实施例3测定菌株产β-胡萝卜素的产量
将菌株解脂耶氏酵母Po1f、实施例2制备的菌株XK2，XK3，XK4，XK5，XK6，XK7，XK8，XK10，XK11，XK12，XK13，XK14，XK15，XK16，XK17和XK19分别接种于2mL YPD培养基(该YPD培养基由2％葡萄糖、2％蛋白胨和1％酵母提取物组成，余量为水，所述百分比为质量百分比)，培养24小时，然后以初始OD600为0.01的接种量接种于新的50mL YPD培养基进行培养。发酵培养4天后，使用DMSO和丙酮进行β-胡萝卜素的提取。
检测的结果参见表3以及图2。
表3不同菌株的β-胡萝卜素的产量
Figure BDA0002388807230000161
表3和图2的结果说明，菌株XK19产β-胡萝卜素的能力大幅度提升，通过对MVA途径中每个基因的过表达，ERG13基因的过表达明显能提高β-胡萝卜素的产量，是该途径除HMG基因外的另一个限速基因。
实施例4XK19菌株连续补料发酵培养
将筛选到的高产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母工程菌株XK19在5L发酵罐中进行连续补料发酵实验，本实验选用的培养基为2×YPD培养基(4％蛋白胨，2％酵母提取物，0.5％葡萄糖)，初始罐体积为2L。从甘油保种管中取出菌液在YPD固体平板上划线，将长起来的单克隆接种到两瓶各含有50mL YPD培养基的摇瓶中(在摇瓶中添加氨苄青霉素抗性和卡那霉素抗性以防染菌)，摇瓶置于30℃恒温摇床中220rpm过夜培养后，将处于指数生长期的细胞接种到发酵罐中。发酵罐的设定温度为30℃，通气量设置为2vvm，溶氧设置为20％，搅拌转速(300-1000rpm)与溶氧偶联，使用3M氢氧化钠或者3M盐酸调节酸碱度使其pH控制在5.5。在发酵6小时之后，将500g/L葡萄糖溶液以12mL/h的速度流加入发酵罐中以维持发酵罐中的低糖浓度。在发酵过程中，每隔12h对发酵液进行取样，同时测定糖浓度，β-胡萝卜素以及菌体的生物量。结果如图3所示，图3为菌株XK19发酵第6.5天的结果。
图3结果显示：在发酵的第6.5天，菌体的生物量为78.9g DCW/L，β-胡萝卜素的产量为4.5g/L和57.5mg/g DCW。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰。这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华东理工大学
<120> 一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用
<141> 2020-02-21
<160> 56
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcatagacat aggccagaag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtactgaatc tgggactggt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gctgtccaag tccatcgcca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agcccccggt cgaaatggcc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gacacaaatg gcaactgggt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtcactaacc cagccgaagt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atacgagatg agtgccaaag 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gatggtattg tcccggtatc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgcaaacaga accgatgcgg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tttactaccc acatctgggg 20
<210> 11
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gttcgaaggt accaaggaag catgcggtac ttctactaac gaaatatgca tgtac 55
<210> 12
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cctagggatc gttgtcagaa gtaagactag ttcttaagat gactgccgat gaggtt 56
<210> 13
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
actagtctta cttctgacaa cgatccctag gcagaagtcg tcgctgatgg tagggg 56
<210> 14
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aacagctatg accatgatta cgccaagctt cccccgttta ttctccctcg gctct 55
<210> 15
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gttcgaaggt accaaggaag catgcggtac caaagtttct cgcatctctt ggata 55
<210> 16
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cctagggatc gttgtcagaa gtaagactag tgatcagacc accgatctgc tgcaga 56
<210> 17
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
actagtctta cttctgacaa cgatccctag gcggccatct tcatggcgta ggtgaa 56
<210> 18
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aacagctatg accatgatta cgccaagctt caaccccaca caaataagct cgggc 55
<210> 19
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gttcgaaggt accaaggaag catgcggtac gtacaatgta caacattttt cggct 55
<210> 20
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cctagggatc gttgtcagaa gtaagactag ttggaaaatt cgcttcacag atcgct 56
<210> 21
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
actagtctta cttctgacaa cgatccctag gaccccgagc ccatgtcttt ccgaaa 56
<210> 22
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aacagctatg accatgatta cgccaagctt tggcgttggc aagctccttg gaccg 55
<210> 23
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gttcgaaggt accaaggaag catgcggtac cttgtctctt ggatacattg cactt 55
<210> 24
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cctagggatc gttgtcagaa gtaagactag tcggtaaacg tgttgaggga ctgttg 56
<210> 25
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
actagtctta cttctgacaa cgatccctag ggagcgaaac cagacttcct tcaacc 56
<210> 26
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
aacagctatg accatgatta cgccaagctt cgcctgtctg cactggtcaa tggtg 55
<210> 27
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gttcgaaggt accaaggaag catgcggtac cttccttgtg tttgtcaccg ccttt 55
<210> 28
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cctagggatc gttgtcagaa gtaagactag tcggaacagc aagataccca aaggca 56
<210> 29
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
actagtctta cttctgacaa cgatccctag gcaattgggg tgcccgagac caatac 56
<210> 30
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
aacagctatg accatgatta cgccaagctt agtgcctgaa atcctggctg ccccc 55
<210> 31
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gttcgaaggt accaaggaag catgcggtac gttacggaaa accatgaatc cggag 55
<210> 32
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cctagggatc gttgtcagaa gtaagactag tattatgaga cacgatccac aggcat 56
<210> 33
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
actagtctta cttctgacaa cgatccctag gatggactca tggaccagga cgtgta 56
<210> 34
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
aacagctatg accatgatta cgccaagctt agagacgaaa ccaatcgccc gtggt 55
<210> 35
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gttcgaaggt accaaggaag catgcggtac tggagtggaa cttggacagt attaa 55
<210> 36
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
cctagggatc gttgtcagaa gtaagactag tcacagcttg tcactttgcg ttgaca 56
<210> 37
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
actagtctta cttctgacaa cgatccctag gcatgtccag tgaagcctcc gagttc 56
<210> 38
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
aacagctatg accatgatta cgccaagctt agttcacttt ggacaccttc tatgg 55
<210> 39
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
ttcgaaggta ccaaggaagc atgcggtacc gaatcacaac ttcctcttga cata 54
<210> 40
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
cctagggatc gttgtcagaa gtaagactag ttccgggaag aggagctcca gccgat 56
<210> 41
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
actagtctta cttctgacaa cgatccctag gaatgaagaa cagaaggtcg gctgga 56
<210> 42
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
tatccatgcg atactcttct tcatacgcgc acgttgct 38
<210> 43
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gcgcgtatga agaagagtat cgcatggata cttgtaga 38
<210> 44
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
aacagctatg accatgatta cgccaagctt gaagggaaga gaggcaaagt aaatg 55
<210> 45
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
gttcgaaggt accaaggaag catgcggtac tgtggtgtca cctcttcaag agctt 55
<210> 46
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
cctagggatc gttgtcagaa gtaagactag taaactcttg cacgctgcgg ccggat 56
<210> 47
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
actagtctta cttctgacaa cgatccctag gatttcatga atggcaagaa gtttcc 56
<210> 48
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
aacagctatg accatgatta cgccaagctt tgtaccaagg taaacggctc gccag 55
<210> 49
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
gttcgaaggt accaaggaag catgcggtac gagaggttgg aggacaggtt gagat 55
<210> 50
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
cctagggatc gttgtcagaa gtaagactag tgcatgcaca aagggacgat cgatca 56
<210> 51
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
actagtctta cttctgacaa cgatccctag gtatcggaaa ctttggtaca gatact 56
<210> 52
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
aacagctatg accatgatta cgccaagctt agataatata taatatattt gaaga 55
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
aagcttggcg taatcatggt c 21
<210> 54
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
gtaccgcatg cttccttgg 19
<210> 55
<211> 1845
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
atgctgctga cctacatgga ggtgcacctg tactacaccc tgcccgtgct gggagtcctg 60
tcttggctgt cccgacccta ctacaccgcc accgacgctc tgaagttcaa gttcctgacc 120
ctggtggcct tcaccaccgc ctctgcttgg gacaactaca tcgtctacca caaggcctgg 180
tcctactgtc ccacctgcgt gaccgctgtc attggttacg tccccctgga ggagtacatg 240
ttcttcatca ttatgaccct gctgaccgtg gccttcacca acctggtcat gcgatggcac 300
ctgcactctt tcttcatccg acccgagacc cccgtgatgc agtccgtgct ggtccgactg 360
gtccccatca ccgccctgct gattaccgcc tacaaggctt ggcacctggc tgtgcctggc 420
aagcctctgt tctacggctc ttgtatcctg tggtacgcct gccccgtcct ggctctgctg 480
tggttcggag ccggagagta catgatgcga cgacccctgg ccgtgctggt ctccattgct 540
ctgcccaccc tgttcctgtg ttgggtggac gtggtcgcca tcggcgctgg aacctgggac 600
atttctctgg ccacctccac cggcaagttc gtggtccctc acctgcctgt cgaggagttc 660
atgttcttcg ctctgattaa caccgtgctg gtcttcggaa cctgtgccat cgaccgaact 720
atggctattc tgcacctgtt caagaacaag tctccctacc agcgacccta ccagcactct 780
aagtccttcc tgcaccagat cctggagatg acctgggctt tctgcctgcc tgaccaggtg 840
ctgcactctg acaccttcca cgacctgtct gtctcctggg acattctgcg aaaggcttct 900
aagtccttct acaccgcctc cgctgtgttc cctggagacg tccgacagga gctgggtgtg 960
ctgtacgcct tctgtcgagc taccgacgac ctgtgcgaca acgagcaggt gcccgtccag 1020
acccgaaagg agcagctgat cctgacccac cagttcgtct ctgacctgtt cggtcagaag 1080
acctccgccc ccaccgctat cgactgggac ttctacaacg accagctgcc cgcctcttgt 1140
atttccgctt tcaagtcctt cacccgactg cgacacgtgc tggaggctgg tgctatcaag 1200
gagctgctgg acggatacaa gtgggacctg gagcgacgat ctattcgaga ccaggaagac 1260
ctgcgatact actccgcctg tgtggcttct tccgtcggag agatgtgcac ccgaatcatt 1320
ctggcccacg ctgacaagcc cgcctctcga cagcagaccc agtggatcat tcagcgagct 1380
cgagagatgg gactggtgct gcagtacacc aacatcgccc gagacattgt caccgactcc 1440
gaggagctgg gtcgatgcta cctgccccag gactggctga ccgagaagga agtggccctg 1500
atccagggcg gactggctcg agagattgga gaggagcgac tgctgtctct gtcccaccga 1560
ctgatctacc aggccgacga gctgatggtg gtcgctaaca agggcattga caagctgccc 1620
tctcactgtc agggtggcgt gcgagccgct tgcaacgtct acgcctctat cggtaccaag 1680
ctgaagtcct acaagcacca ctacccctct cgagcccacg tgggcaactc caagcgagtc 1740
gagatcgctc tgctgtccgt gtacaacctg tacaccgccc ccattgctac ctcttccacc 1800
acccactgcc gacagggcaa gatgcgaaac ctgaacacca tctag 1845
<210> 56
<211> 1740
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
atgtccaaga agcacatcgt catcattggt gctggtgtgg gcggaaccgc taccgctgct 60
cgactggccc gagagggctt caaggtcacc gtggtcgaga agaacgactt cggtggcgga 120
cgatgttccc tgattcacca ccagggccac cgattcgacc agggaccctc tctgtacctg 180
atgcccaagt acttcgagga cgccttcgct gacctggacg agcgaatcca ggaccacctg 240
gagctgctgc gatgcgacaa caactacaag gtccacttcg acgacggaga gtccattcag 300
ctgtcttccg acctgacccg aatgaaggct gagctggacc gagtggaggg tcctctgggt 360
ttcggacgat tcctggactt catgaaggag acccacatcc actacgagtc cggcaccctg 420
attgccctga agaagaactt cgagtctatc tgggacctga tccgaattaa gtacgctccc 480
gagatcttcc gactgcacct gttcggaaag atctacgacc gagcttctaa gtacttcaag 540
accaagaaga tgcgaatggc cttcaccttc cagaccatgt acatgggaat gtccccctac 600
gacgcccccg ctgtgtactc tctgctgcag tacaccgagt tcgccgaggg tatctggtac 660
ccccgaggtg gcttcaacat ggtggtccag aagctggagg ccattgctaa gcagaagtac 720
gacgccgagt tcatctacaa cgcccccgtc gctaagatta acaccgacga cgctaccaag 780
caggtcaccg gtgtgaccct ggagaacggc cacatcattg acgccgacgc tgtggtctgt 840
aacgccgacc tggtgtacgc ttaccacaac ctgctgcctc cctgccgatg gacccagaac 900
accctggcct ccaagaagct gacctcttcc tctatctctt tctactggtc catgtctacc 960
aaggtccccc agctggacgt gcacaacatc ttcctggccg aggcttacca ggagtccttc 1020
gacgagattt tcaaggactt cggcctgccc tccgaggcct ctttctacgt gaacgtcccc 1080
tcccgaattg acccctctgc cgctcccgac ggaaaggact ctgtgatcgt cctggtgccc 1140
attggacaca tgaagtccaa gaccggtgac gcttctaccg agaactaccc cgccatggtc 1200
gacaaggctc gaaagatggt cctggctgtg atcgagcgac gactgggaat gtccaacttc 1260
gccgacctga ttgagcacga gcaggtcaac gaccccgctg tgtggcagtc taagttcaac 1320
ctgtggcgag gatccattct gggtctgtct cacgacgtcc tgcaggtgct gtggttccga 1380
ccctccacca aggactctac cggccgatac gacaacctgt tcttcgtggg agcctccacc 1440
caccctggta ccggagtccc tatcgtgctg gctggttcca agctgacctc tgaccaggtg 1500
gtcaagtctt tcggcaagac ccccaagccc cgaaagattg agatggagaa cacccaggct 1560
cccctggagg agcctgacgc tgagtccacc ttccctgtct ggttctggct gcgagccgct 1620
ttctgggtca tgttcatgtt cttctacttc ttccctcagt ccaacggaca gacccctgcc 1680
tctttcatca acaacctgct gcccgaggtc ttccgagtgc acaactctaa cgtgatctag 1740

Claims (7)

1.一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，
所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中构建而成；或者，
所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因构建而成；或者，
所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因和HMG基因构建而成；或者，
所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因和1个拷贝的carB基因构建而成；或者，
所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因和1个拷贝的carB基因构建而成；或者，
所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、两个拷贝的carRP基因和1个拷贝的carB基因构建而成；或者，
所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、两个拷贝的carRP基因和1个拷贝的carB基因、ERG13基因构建而成；或者，
所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、两个拷贝的carRP基因和1个拷贝的carB基因、ERG13基因，最后将尿嘧啶和亮氨酸两个营养缺陷型筛选标记回补构建而成，或者，
所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因、1个拷贝的carB基因和ERG13基因构建而成；或者，
所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因、1个拷贝的carB基因和ERG10-11099基因构建而成；或者，
所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因、1个拷贝的carB基因和ERG10-08536基因构建而成；或者，
所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因、1个拷贝的carB基因和ERG8基因构建而成；或者，
所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因、1个拷贝的carB基因和ERG19基因构建而成；或者，
所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因、1个拷贝的carB基因和IDI基因构建而成；或者，
所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因、1个拷贝的carB基因和ERG12基因构建而成；
所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因和2个拷贝的carB基因构建而成；
所述carRP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：55所示；所述carB基因的核苷酸序列如SEQID NO:56所示。
2.如权利要求1所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母为解脂耶氏酵母Po1f；所述carRP基因、carB基因、GGS1基因、HMG基因、ERG13基因、ERG10-11099基因、ERG10-08536基因、ERG8基因、ERG19基因、IDI基因、ERG12基因均采用CRISPR/Cas9操作***敲入解脂耶氏酵母Po1f。
3.一种用于基因敲入的解脂耶氏酵母基因工程菌的敲入质粒对，其特征在于，所述敲入质粒对为用于在解脂耶氏酵母中进行基因敲入的基于CRISPR/Cas9***的质粒对，所述敲入质粒对为pHR_POX2_hrGFP和pCRISPRyl_POX2，pHR_POX3_hrGFP和pCRISPRyl_POX3，pHR_LIP1_hrGFP和pCRISPRyl_LIP1，pHR_POX4_hrGFP和pCRISPRyl_POX4，pHR_E1_hrGFP和pCRISPRyl_E1，pHR_A1_hrGFP和pCRISPRyl_A1，pHR_B1_hrGFP和pCRISPRyl_B1，pHR_A2_hrGFP和pCRISPRyl_A2，pHR_POX6_hrGFP和pCRISPRyl_POX6，pHR_E2_hrGFP和pCRISPRyl_E2中的至少一对敲入质粒对；
(1)质粒对pHR_POX2_hrGFP和pCRISPRyl_POX2：
所述pCRISPRyl_POX2是使用AvrII限制性内切酶将质粒pCRISPRyl线性化，并与针对POX2位点设计的sgRNA片段无缝克隆连接构建获得，其中，针对POX2位点设计的sgRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述pHR_POX2_hrGFP是以解脂耶氏酵母的基因组为模板，分别使用引物对POX2-LF/POX2-LR和POX2-RF/POX2-RR通过PCR扩增POX2位点sgRNA序列两端各1200bp作为左右同源臂，以质粒pHR_AXP_hrGFP为模板，使用引物对plas-F和plas-R通过PCR扩增得到质粒基本骨架，上述三个片段无缝克隆连接获得质粒pHR_POX2；将质粒pHR_AXP_hrGFP使用限制性内切酶SpeI和AvrII双酶切获得的hrGFP基因表达盒与同样使用限制性内切酶SpeI和AvrII进行双酶切的质粒pHR_POX2连接，获得pHR_POX2_hrGFP；其中，引物POX2-LF、POX2-LR、POX2-RF和POX2-RR的引物序列分别如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示；引物对plas-F和plas-Rd引物序列分别如SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54所示；
(2)质粒对pHR_POX3_hrGFP和pCRISPRyl_POX3：
所述pCRISPRyl_POX3是使用AvrII限制性内切酶将质粒pCRISPRyl进行单酶切线性化，与针对POX3位点设计的sgRNA片段无缝克隆连接即可获得，其中，针对POX3位点设计的sgRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述pHR_POX3_hrGFP的构建是以解脂耶氏酵母的基因组为模板，分别使用引物对POX3-LF/POX3-LR和POX3-RF/POX3-RR通过PCR扩增POX3位点sgRNA序列两端各1200bp作为左右同源臂，以质粒pHR_AXP_hrGFP为模板，使用引物对plas-F和plas-R通过PCR扩增得到质粒基本骨架，上述三个片段无缝克隆连接获得质粒pHR_POX3；将质粒pHR_AXP_hrGFP使用限制性内切酶SpeI和AvrII双酶切获得的hrGFP基因表达盒与同样使用限制性内切酶SpeI和AvrII进行双酶切的质粒pHR_POX3连接，获得pHR_POX3_hrGFP；其中，引物POX3-LF、POX3-LR、POX3-RF和POX3-RR的引物序列分别如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示；
(3)pHR_LIP1_hrGFP和pCRISPRyl_LIP1：
所述pCRISPRyl_LIP1是使用AvrII限制性内切酶将质粒pCRISPRyl进行单酶切线性化，与针对LIP1位点设计的sgRNA片段无缝克隆连接即可获得，其中，针对LIP1位点设计的sgRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
所述pHR_LIP1_hrGFP是以解脂耶氏酵母的基因组为模板，分别使用引物对LIP1-LF/LIP1-LR和LIP1-RF/LIP1-RR通过PCR扩增LIP1位点sgRNA序列两端各1200bp作为左右同源臂，以质粒pHR_AXP_hrGFP为模板，使用引物对plas-F和plas-R通过PCR扩增得到质粒基本骨架，上述三个片段无缝克隆连接获得质粒pHR_LIP1；将质粒pHR_AXP_hrGFP使用限制性内切酶SpeI和AvrII双酶切获得的hrGFP基因表达盒与同样使用限制性内切酶SpeI和AvrII进行双酶切的质粒pHR_LIP1连接，获得pHR_LIP1_hrGFP；其中，引物LIP1-LF、LIP1-LR、LIP1-RF和LIP1-RR的引物序列分别如SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30所示；
(4)pHR_POX4_hrGFP和pCRISPRyl_POX4：
所述pCRISPRyl_POX4是使用AvrII限制性内切酶将质粒pCRISPRyl进行单酶切线性化，与针对POX4位点设计的sgRNA片段无缝克隆连接构建获得，针对POX4位点设计的sgRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述pHR_POX4_hrGFP是以解脂耶氏酵母的基因组为模板，分别使用引物对POX4-LF/POX4-LR和POX4-RF/POX4-RR通过PCR扩增POX4位点sgRNA序列两端各1200bp作为左右同源臂，以质粒pHR_AXP_hrGFP为模板，使用引物对plas-F和plas-R通过PCR扩增得到质粒基本骨架，上述三个片段无缝克隆连接获得质粒pHR_POX4；将质粒pHR_AXP_hrGFP使用限制性内切酶SpeI和AvrII双酶切获得的hrGFP基因表达盒与同样使用限制性内切酶SpeI和AvrII进行双酶切的质粒pHR_POX4连接，获得pHR_POX4_hrGFP；其中，引物POX4-LF、POX4-LR、POX4-RF和POX4-RR的引物序列分别如SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示；
(5)pHR_E1_hrGFP和pCRISPRyl_E1：
所述pCRISPRyl_E1是使用AvrII限制性内切酶将质粒pCRISPRyl进行单酶切线性化，与针对E1位点设计的sgRNA片段无缝克隆连接构建获得，其中，所述针对E1位点设计的sgRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
所述pHR_E1_hrGFP是以解脂耶氏酵母的基因组为模板，分别使用引物对E1-LF/E1-LR和E1-RF/E1-RR通过PCR扩增E1位点sgRNA序列两端各1200bp作为左右同源臂，以质粒pHR_AXP_hrGFP为模板，使用引物对plas-F和plas-R通过PCR扩增得到质粒基本骨架，上述三个片段无缝克隆连接获得质粒pHR_E1；将质粒pHR_AXP_hrGFP使用限制性内切酶SpeI和AvrII双酶切获得的hrGFP基因表达盒与同样使用限制性内切酶SpeI和AvrII进行双酶切的质粒pHR_E1连接，获得pHR_E1_hrGFP；其中，引物E1-LF、E1-LR、E1-RF和E1-RR的引物序列分别如SEQ IDNO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34所示；
(6)pHR_A1_hrGFP和pCRISPRyl_A1：
所述pCRISPRyl_A1是使用AvrII限制性内切酶将质粒pCRISPRyl进行单酶切线性化，与针对A1位点设计的sgRNA片段无缝克隆连接构建获得，针对A1位点设计的sgRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；
pHR_A1_hrGFP是以解脂耶氏酵母的基因组为模板，分别使用引物对A1-LF/A1-LR和A1-RF/A1-RR通过PCR扩增A1位点sgRNA序列两端各1200bp作为左右同源臂，以质粒pHR_AXP_hrGFP为模板，使用引物对plas-F和plas-R通过PCR扩增得到质粒基本骨架，上述三个片段无缝克隆连接获得质粒pHR_A1；将质粒pHR_AXP_hrGFP使用限制性内切酶SpeI和AvrII双酶切获得的hrGFP基因表达盒与同样使用限制性内切酶SpeI和AvrII进行双酶切的质粒pHR_A1连接，获得pHR_A1_hrGFP；其中，引物A1-LF、A1-LR、A1-RF、A1-RR的引物序列分别如SEQID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38所示；
(7)pHR_B1_hrGFP和pCRISPRyl_B1：
所述pCRISPRyl_B1是使用AvrII限制性内切酶将质粒pCRISPRyl进行单酶切线性化，与针对B1位点设计的sgRNA片段无缝克隆连接构建获得，针对B1位点设计的sgRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；
所述pHR_B1_hrGFP是以解脂耶氏酵母的基因组为模板，分别使用引物对B1-LF/B1-LR，B1-RF1/B1-RR1和B1-RF2/B1-RR2通过PCR扩增B1位点sgRNA序列两端各1200bp作为左右同源臂，以质粒pHR_AXP_hrGFP为模板，使用引物对plas-F和plas-R通过PCR扩增得到质粒基本骨架，上述四个片段无缝克隆连接获得质粒pHR_B1；将质粒pHR_AXP_hrGFP使用限制性内切酶SpeI和AvrII双酶切获得的hrGFP基因表达盒与同样使用限制性内切酶SpeI和AvrII进行双酶切的质粒pHR_B1连接，获得pHR_B1_hrGFP；其中，引物B1-LF、B1-LR、B1-RF1、B1-RR1、B1-RF2和B1-RR2的引物序列分别如SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ IDNO：42、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44所示；
(8)pHR_A2_hrGFP和pCRISPRyl_A2：
所述pCRISPRyl_A2是使用AvrII限制性内切酶将质粒pCRISPRyl进行单酶切线性化，与针对A2位点设计的sgRNA片段无缝克隆连接构建获得，针对A2位点设计的sgRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；
所述pHR_A2_hrGFP是以解脂耶氏酵母的基因组为模板，分别使用引物对A2-LF/A2-LR和A2-RF/A2-RR通过PCR扩增A2位点sgRNA序列两端各1200bp作为左右同源臂，以质粒pHR_AXP_hrGFP为模板，使用引物对plas-F和plas-R通过PCR扩增得到质粒基本骨架，上述三个片段无缝克隆连接获得质粒pHR_A2；将质粒pHR_AXP_hrGFP使用限制性内切酶SpeI和AvrII双酶切获得的hrGFP基因表达盒与同样使用限制性内切酶SpeI和AvrII进行双酶切的质粒pHR_A2连接，获得pHR_A2_hrGFP；其中，引物A2-LF、A2-LR、A2-RF和A2-RR的引物序列分别如SEQ IDNO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48所示；
(9)pHR_POX6_hrGFP和pCRISPRyl_POX6：
所述pCRISPRyl_POX6是使用AvrII限制性内切酶将质粒pCRISPRyl进行单酶切线性化，与针对POX6位点设计的sgRNA片段无缝克隆连接构建获得，针对POX6位点设计的sgRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
所述pHR_POX6_hrGFP是以解脂耶氏酵母的基因组为模板，分别使用引物对POX6-LF/POX6-LR和POX6-RF/POX6-RR通过PCR扩增POX6位点sgRNA序列两端各1200bp作为左右同源臂，以质粒pHR_AXP_hrGFP为模板，使用引物对plas-F和plas-R通过PCR扩增得到质粒基本骨架，上述三个片段无缝克隆连接获得质粒pHR_POX6；将质粒pHR_AXP_hrGFP使用限制性内切酶SpeI和AvrII双酶切获得的hrGFP基因表达盒与同样使用限制性内切酶SpeI和AvrII进行双酶切的质粒pHR_POX6连接，获得pHR_POX6_hrGFP；其中，引物POX6-LF、POX6-LR、POX6-RF和POX6-RR的引物序列分别如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26所示；
(10)pHR_E2_hrGFP和pCRISPRyl_E2：
所述pCRISPRyl_E2是使用AvrII限制性内切酶将质粒pCRISPRyl进行单酶切线性化，与针对E2位点设计的sgRNA片段无缝克隆连接构建获得，针对E2位点设计的sgRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；
所述pHR_E2_hrGFP是以解脂耶氏酵母的基因组为模板，分别使用引物对E2-LF/E2-LR和E2-RF/E2-RR通过PCR扩增E2位点sgRNA序列两端各1200bp作为左右同源臂，以质粒pHR_AXP_hrGFP为模板，使用引物对plas-F和plas-R通过PCR扩增得到质粒基本骨架，上述三个片段无缝克隆连接获得质粒pHR_E2；将质粒pHR_AXP_hrGFP使用限制性内切酶SpeI和AvrII双酶切获得的hrGFP基因表达盒与同样使用限制性内切酶SpeI和AvrII进行双酶切的质粒pHR_E2连接，获得pHR_E2_hrGFP；其中，引物E2-LF、E2-LR、E2-RF和E2-RR的引物序列分别如SEQ IDNO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52所示。
4.一种如权利要求1或2所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌在制备β-胡萝卜素中的应用。
5.一种如权利要求1或2所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌在制备类胡萝卜素及其衍生物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述类胡萝卜素为玉米黄质、虾青素、西红花苷、角黄素或海胆酮。
7.一种β-胡萝卜素的生产方法，其特征在于，通过发酵生产权利要求1或2所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌获得β-胡萝卜素。
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