CN110551769B - 一种间苯三酚的生产方法 - Google Patents

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Abstract

间苯三酚作为高价值化合物前体物质，在医疗、材料等领域都有重要的应用前景。由于传统的化学合成方法在成本及环保等方面存在缺陷，本发明采用廉价且环保的乙酸作为碳源，实现间苯三酚的生物合成。本发明首先构建了两条以乙酸为碳源的合成途径，通过发酵验证了该方法的可行性，并确定了表达PhlD、AckA、Pta的途径为间苯三酚生产途径。分别优化M9发酵培养基中乙酸浓度和酵母提取物浓度，提高间苯三酚产量至228mg/L。利用绿色荧光蛋白eGFP证实了利用CRISPR/dCas9进行竞争途径抑制的可行性。随后进行发酵，通过CRISPRi将竞争途径中柠檬酸合酶的表达量降低，提高间苯三酚产量至284mg/L。本发明提出了一种新型的间苯三酚生产方法，该方法对间苯三酚的工业化生产提供了新策略。

Description

一种间苯三酚的生产方法
技术领域
本发明涉及一种间苯三酚的生产方法，属于生物工程技术领域
背景技术：
酚类化合物及其衍生物具有良好的抗氧化活性，在生理及药理方面已有广泛研究。间苯三酚是一种三羟基酚类化合物，是重要的药物中间体，在抗病毒、抗肿瘤、抗炎、止血等多方面都具有良好的药理活性。在生物试剂方面，间苯三酚可被用作染料偶联剂、轮胎增粘剂及偶氮复合油墨等原料。同时，作为合成三氨基三硝基苯(TABA)这一耐热低感度***的前体，其在高含能材料、药物化学和材料科学领域也有重要的应用前景。
间苯三酚的化学合成存在原材料昂贵，分离纯化工艺复杂，副产物对环境污染严重等问题。目前，生物合成法已逐渐取代化学合成，是一种更经济、环保的合成方法。乙酸是第二种最简单的羧酸，许多微生物可以利用乙酸作为细胞生长的替代碳源。有研究表明醋酸盐可以通过生化过程从低成本的底物中产生。例如，一些有机废物在厌氧消化过程中会发酵产生醋酸盐。另外，醋酸盐也是木质纤维素生物质水解或热解的副产品，广泛存在于自然界中。与葡萄糖相比，醋酸盐是一种适合微生物发酵的成本效益碳源。因此，利用乙酸为碳源，实现间苯三酚的生产是一种具有良好前景和高价值的环境友好方法。
发明内容：
本发明构建了两条以乙酸为碳源的间苯三酚合成途径。通过过表达乙酰辅酶A合成酶(Acs或者AckA和Pta)催化乙酸生成丙二酰辅酶A，丙二酰辅酶A再经过间苯三酚合酶(PhlD)催化生成间苯三酚。通过摇瓶发酵实验，首先确定了菌株BL21(DE3)(pET-phlD-ackA-pta)进行间苯三酚生产的可行性，随后进行发酵培养基中乙酸浓度及酵母提取物浓度的优化，将间苯三酚产量提高到228mg/L。为利用CRISPRi技术进一步提高间苯三酚产量，首先利用eGFP验证了CRISPR/dCas9的作用效果，然后进行摇瓶发酵，最终将产量提高到284mg/L。为间苯三酚的生物合成提供了新方法。
按照本发明提供的技术方案，一种间苯三酚的生产方法，采用以下方法步骤：
1.构建乙酸生产间苯三酚途径中所需质粒。寻找以乙酸为碳源生产间苯三酚的酶，利用PCR的方法人工合成相关基因(PhlD、AckA、Pta、Acs)。通过Gibson连接方法将目的基因克隆到pETDuet-1载体上，将连接产物转化至大肠杆菌XL10-Gold感受态细胞中，长出单菌落后提质粒测序验证，构建质粒pET-phlD、pET-phlD-acs和pET-phlD-ackA-pta。
2.发酵确定间苯三酚生产途径。将1中构建好的质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，长出单菌落后接种于5mL液体LB培养基中过夜培养。随后将种子液以1％接种量接种到M9培养基中摇瓶培养。每隔12小时取样，利用HPLC检测产量，选择产量较高的途径作为间苯三酚的生产途径。
3.优化培养基中乙酸浓度。将2中最终确定的途径中的质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，在M9培养基中发酵，优化培养基中的乙酸浓度(0g/L,2g/L,4g/L,6g/L,8g/L,10g/L)，利用HPLC检测最终产量以确定最适合生产间苯三酚的成分比例。
4.采用3中优化的乙酸浓度，继续优化M9培养基中的酵母提取物浓度(0g/L,1g/L,2g/L,3g/L,4g/L,5g/L)，提高间苯三酚产量。
5.构建质粒pze-pferB-egfp与pCS-dCas9-egfp-sgRNA，构建好后共转至大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取单菌落，在LB液体培养基中过夜培养，然后将种子液转接至5mL LB培养基中，通过荧光检测验证CRISPR/dCas9作用效果。
6.构建质粒pCS-dCas9-gltA-sgRNA，将质粒pET-phlD-ackA-pta与pCS-dCas9-gltA-sgRNA共转至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,挑取单菌落过夜培养后接种于M9发酵培养基中，通过dCas9敲低竞争途径中柠檬酸合酶的表达，提高间苯三酚产量。
附图说明
图1间苯三酚生产途径
图2以乙酸为碳源发酵结果
图3优化乙酸浓度的发酵结果
图4优化酵母提取物浓度的发酵结果
图5荧光验证结果
图6CRISPRi发酵结果
具体实施方式
下述实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业突进获取。
以下实施例是对本发明的进一步说明，并不构成对本发明实质内容的限制。
实施例1、乙酸生产间苯三酚途径的确定：
乙酸可通过乙酰-CoA合成酶(Acs或者AckA和Pta)催化生成丙二酰-CoA，丙二酰-CoA再经过间苯三酚合酶(PhlD)催化生成间苯三酚。根据基因合成方法合成目的基因PhlD、Acs、AckA和Pta。将合成的基因片段PhlD与骨架PETDuet-1连接，构建质粒pET-phlD。将片段Acs、AckA和Pta与骨架pET-phlD通过Gibson的方法连接，构建质粒pET-phlD-acs和pET-phlD-ackA-pta。分别将质粒pETDuet-1、pET-phlD、pET-phlD-acs和pET-phlD-ackA-pta转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到菌株BL21(DE3)(pETDuet-1),BL21(DE3)(pET-phlD),BL21(DE3)(pET-phlD-acs)和BL21(DE3)(pET-phlD-ackA-pta)。长出单菌落后接种至LB液体培养基中，37℃培养8h后，接种至M9发酵培养基中，30℃，200rpm发酵。分别在12，24，36，48h取样，测OD600并利用UHPLC检测间苯三酚产量。发酵结果如图2所示，从图中可以看出带有空载体pETDuet-1的菌株无间苯三酚产生。大肠杆菌BL21(DE3)(pET-phlD)、BL21(DE3)(pET-phlD-acs)、BL21(DE3)(pET-phlD-ackA-pta)均可以产生间苯三酚。其中菌株BL21(DE3)(pET-phlD-ackA-pta)产量最高，24小时可达27mg/L。
基因全合成体系为：5×TransStart○R FastPfu Fly Buffer 10μL，dNTP(2.5mM)4μL，引物预混液2μL，TransStart○R FastPfu Fly DNA Polymerase 1μL,蒸馏水35μL，总体积为50μL。扩增条件为95℃变性20秒、55℃退火20秒、72℃延伸20秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。
连接体系：1.5μL PCR扩增产物、1μL pETDuet-1(pET-phlD)载体片段，7.5μLGibson
Figure BDA0002218235580000021
Master Mix(购自NEW ENGLAND BioLabs)，轻轻混合，50℃水浴反应60分钟。
M9培养基组成为：11.28g/L M9、6g/L acetate、2g/L酵母提取物、2g/L MOPS
实施例2、优化M9发酵培养基条件
将质粒pET-phlD-ackA-pta转入大肠杆菌BL21(DE3)中，长出单菌落后接种于5mL液体LB培养基中，过夜培养后以1％接种量转接至含有不同浓度乙酸(0g/L、2g/L、4g/L、6g/L、8g/L、10g/L)的M9发酵培养基中，摇瓶培养。每隔12小时取发酵液，检测产量。发酵结果如图3所示。从图中可以看出24h时在含有2g/L乙酸的培养基中发酵的产量最高，为78.21mg/L。因此2g/L乙酸为间苯三酚生产的最适浓度。在此基础上利用已优化好的2g/L乙酸浓度进行M9培养基中酵母提取物浓度的优化。以大肠杆菌BL21(DE3)(pET-phlD-ackA-pta)为目标菌株，在含有不同浓度酵母提取物(0g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L)的M9培养基中摇瓶培养，发酵产量结果如图4所示，从图中可以看出36h时，在含有5g/L酵母提取物的培养基中发酵，BL21(DE3)(pET-phlD-ackA-pta)可产228mg/L间苯三酚。因此，乙酸生产间苯三酚的酵母提取物最适浓度为5g/L。
乙酸优化M9培养基成分为：11.28g/L M9、0-10g/L acetate、2g/L MOPS、2g/L酵母提取物
酵母提取物优化M9培养基成分：11.28g/L M9、2g/L acetate、2g/L MOPS、0-5g/L酵母提取物。
实施例3、利用CRISPRi提高间苯三酚产量
验证dCas9封闭效果。PCR获得目的片段egfp及egfp-sgRNA，通过Gibson的方法将目的片段分别与骨架pZE、pCS-dCas9连接,构建质粒pZE-pferB-egfp与pCS-dCas9-egfp-sgRNA。构建好后将这两个质粒共转至大肠杆菌BL21(DE3)中，长出单菌落后，接入5mL LB液体培养基中过夜培养。然后将种子液以1％接种量转接到新的5mL液体LB培养基中，加入终浓度为1mM的IPTG及相应抗生素于37℃摇床培养，4小时后检测荧光及OD600数值，此；＝后每隔两小时检测一次。结果如图5所示，培养4小时后，对照组BL21(DE3)(pCS-dCas9+PferB-egfp)的荧光强度/OD600数值为1.4×107，实验组BL21(DE3)(pCS-dCas9-sgRNA+PferB-egfp)的荧光强度/OD600为5×106。相比之下有较明显的下降，说明dCas9有一定的封闭效果，但随着时间的延长，封闭作用没有增强。
通过CRISPR/dCas9提高间苯三酚产量。PCR获得目的片段gltA-sgRNA1、gltA-sgRNA2和骨架pCS-dCas9,通过Gibson连接法将目的片段与骨架相连，构建质粒pCS-dCas9-gltA-sgRNA1、pCS-dCas9-gltA-sgRNA2。将质粒pET-phlD-ackA-pta转化至大肠杆菌BL21(DE3)中作为对照组。将质粒pET-phlD-ackA-pta分别与pCS-dCas9-gltA-sgRNA1、pCS-dCas9-gltA-sgRNA2共转至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中作为实验组，涂板至长出单菌落。挑取单菌落接种至5mL液体LB培养基中过夜培养，第二天将种子液接种到M9发酵培养基中，每隔12h取样，检测发酵结果。结果如图6所示。与只转化质粒pET-phlD-ackA-pta的对照相比，转化了pCS-dCas9-gltA-sgRNA1与pCS-dCas9-gltA-sgRNA2的菌株可以产生更多的间苯三酚。摇瓶培养24h后，菌株BL21(DE3)(pET-phlD-ackA-pta+pCS-dCas9-gltA-sgRNA2)的间苯三酚产量达到284mg/L。

Claims (4)

1.一种利用乙酸为碳源的间苯三酚生产方法，是通过在BL21(DE3)菌株中共表达间苯三酚合酶编码基因phlD,乙酸激酶编码基因ackA和磷酸乙酰转移酶编码基因ptA，并向培养基中添加乙酸作为碳源，优化M9发酵培养基中乙酸浓度与酵母提取物浓度，同时利用CRISPRi技术封闭竞争途径中GltA的表达以实现间苯三酚的生产及产量的提高；其特征在于采用如下步骤：
(1)根据不同途径中间苯三酚产量的差异从而确定以乙酸为碳源的间苯三酚生产途径；
(2)根据间苯三酚生产过程中M9发酵培养基配方，优化其中乙酸浓度与酵母提取物浓度；
(3)构建质粒pZE-pferB-egfp与pCS-dCas9-egfp-sgRNA，通过荧光检测验证CRISPR/dCas9封闭效果；
(4)构建质粒pCS-dCas9-gltA-sgRNA，将质粒pET-phlD-ackA-pta与pCS-dCas9-gltA-sgRNA共转至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，摇瓶发酵，通过dCas9对柠檬酸合酶表达的抑制从而提高间苯三酚产量；优化后的M9培养基组成为：11.28g/L 5×M9、2g/L乙酸、2g/LMOPS、5g/L酵母提取物。
2.如权利要求1所述的一种利用乙酸为碳源的间苯三酚生产方法，其特征在于步骤(1)中，通过比较过表达间苯三酚合酶和乙酰辅酶A合酶的重组菌株，以及过表达间苯三酚合酶、乙酸激酶和磷酸乙酰转移酶的重组菌株在间苯三酚产量方面的差异，确定间苯三酚生产途径是在phlD、ackA和pta编码的间苯三酚合酶、乙酸激酶和磷酸乙酰转移酶催化下完成。
3.如权利要求1所述的一种利用乙酸为碳源的间苯三酚生产方法，其特征在于步骤(3)中，通过Gibson方法将目的片段pferB-egfp连接到骨架pZE上，将目的片段egfp-sgRNA连接到骨架pCS-dCas9上，构建质粒pZE-pferB-egfp、pCS-dCas9-egfp-sgRNA，将两个质粒共转至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，37℃摇床培养后进行荧光检测。
4.如权利要求1所述的一种利用乙酸为碳源的间苯三酚生产方法，其特征在于步骤(4)中，通过CRISPR/dCas9抑制竞争途径中柠檬酸合酶的表达提高间苯三酚产量，利用Gibson连接的方法构建质粒pCS-dCas9-gltA-sgRNA后，将质粒pCS-dCas9-gltA-sgRNA与pET-phlD-ackA-pta共转到大肠杆菌BL21(DE3)中，种子液过夜培养后接种到优化后的M9培养基中，30℃摇瓶发酵，最终产量提高到284mg/L。
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