CN113493814B - 一种去氢表雄酮生物合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种去氢表雄酮的生物制备方法，其以廉价易得的甾体雄烯二酮酯化物出发通过一步生物酶催化反应，最终能以高达94％的收率得到目标产物。此过程没有中间体A的累积，因此不会产生由于中间体A不稳定而产生的氧化性杂质，因此反应的收率比较高，产品质量比较好。

Description

一种去氢表雄酮生物合成方法
技术领域
本发明属于生物制药和生物化工技术领域，具体涉及一种去氢表雄酮的生物制备方法。
背景技术
去氢表雄酮(DHEA)是一个有重要的生物活性及多种生理功能的物质。其对于保持正常的生理机能、延长寿命等都发挥着重要的作用。人体DHEA的分泌在25-30岁达到高峰，随后逐年下降。大量的临床实验证实，人体的DHEA水平高有利于人类的健康。此化合物的应用非常广泛，作为性激素前体，具有抗衰老及蛋白同化作用。主要功能有：1.改善性功能,提高***；2.调节免疫***功能,提高肌体免疫力；3.增强体能,改善情绪和睡眠,提高记忆力；4.延缓衰老,保持青春活力；5辅助治疗疾病，目前已经应用于治疗***性红斑狼疮，抗过敏/哮喘等。
目前生产去氢表雄酮的方法主要是化学法：但是此类方法一般都存在步骤比较长，反应条件比较苛刻，对环境不友好等缺点。比如：
中国专利申请号201110085711.X，公开号102212099A的专利文献报道路线如下：
Figure BDA0002435569790000011
此方法以醋酸妊娠双烯醇酮为原料经过肟化反应，贝克曼重排反应，水解反应等三步化学反应最终以70％左右的总收率得到目标产物去氢表雄酮。该工艺路线需要使用大量的易制毒试剂醋酐和丙酮，并且会产生大量的废水，对环境非常不友好。另外，此路线的总收率只有70％，原子经济性较差。
中国专利申请号201210038094.2，公开号102603841A的专利文献报道路线如下：
Figure BDA0002435569790000021
此方法以甾体雄烯二酮为原料经过酯化反应，缩酮反应(保护羰基)，还原反应，水解反应(脱保护)等四步化学反应最终以80％左右的总收率得到目标产物去氢表雄酮。此方法，需要对底物进行保护，脱保护两步反应，非常不经济。
生物工作者对此化合物的制备也做了一些尝试，中国专利CN105695551B中，以甾体雄烯二酮为起始原料通过在叔丁醇钾作用下双键移位，得到中间体A。再利用酮还原酶对中间体A的3-位酮羰基选择性不对称还原，反应式如下：
Figure BDA0002435569790000022
此方法虽然跟传统的化学法相比有了很大的改进，但是还存在一些缺陷。比如：需要用到两个当量的易制爆化学品叔丁醇钾；中简体A的稳定性很差，容易转变为雄烯二酮并且会产生多种氧化性杂质(Development of a Chemoenzymatic Process forDehydroepiandrosterone Acetate Synthesis,Org.Process Res.Dev.2016,20,1520-1528)从而导致反应的收率较低，产品的质量较差。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种简单易行的合成去氢表雄酮的生物方法。该方法操作简单，条件温和，对环境友好，并且大幅度降低了生产的成本，适合大规模的工业化生产。
本发明去氢表雄酮的结构是如下：
Figure BDA0002435569790000031
本发明的特征是：以廉价易得甾体雄烯二酮酯化物出发通过一步生物酶催化反应，最终能以高达94％的收率得到目标产物。此过程没有中间体A的累积，因此不会产生由于中间体A不稳定而产生的氧化性杂质，因此反应的收率比较高，产品质量比较好。
本发明的反应式如下：
Figure BDA0002435569790000032
反应历程如下：
Figure BDA0002435569790000033
本发明的原料甾体雄烯二酮酯化物在水解酶作用下，酯基被水解，形成烯醇结构，该结构和中间体A存在反应平衡，但是由于反应体系中同时存在针对中间体A的选择性酮还原酶，中间体A迅速被还原成DHEA，因此烯醇和中间体A的反应平衡被打破，不断快速地向中间体A转换，且体系中中间体A的量非常少，最大程度上减少和避免了中间体A的累积。
本发明提供一种去氢表雄酮的合成方法，其特征在于，将甾体雄烯二酮酯化物和水解酶、酮还原酶一起溶于溶剂中，制备得到去氢表雄酮；
进一步的，添加烟酰胺腺嘌呤双核苷酸作为辅酶；
进一步的，添加葡萄糖和葡萄糖脱氢酶或者异丙醇和醇脱氢酶或者甲酸和甲酸脱氢酶实现辅酶的再生；
进一步的，所述溶剂为叔丁醇和磷酸缓冲液；
进一步的，所述方法的pH值为6-8，反应过程中通过添加碱维持pH值稳定；
进一步的，所述甾体雄烯二酮酯化物为甾体雄烯二酮乙酸酯；
需要指出的是，所述的酮还原酶为选择性酮还原酶，其可以选择性地不对称还原底物的3位酮羰基，所述酮还原酶是已知的，可以采用CN105695551B所述的酮还原酶，也可以采用如下文所述的酮还原酶，均能实现选择性地不对称还原的效果；所述用于辅酶再生的葡萄糖脱氢酶可以采用CN105695551B所述的酶，也可以采用如下文所述的葡萄糖脱氢酶酶，均能实现辅酶再生的效果。用于辅酶再生的体系,不局限于葡萄糖-葡萄糖脱氢酶体系，异丙醇-异丙醇脱氢酶以及甲酸-甲酸脱氢酶体系均适用(Biocatalysis andBiotransformation,2004,22(2),89-96；Adv Biochem Eng Biotechnol.,2010,120,195-242.)。水解酶的选择同样是已知的，可通过市场自由获得，在此不做限定，只要能够高效地水解甾体雄烯二酮酯化物即可。
附图说明：
为了更清楚地说明本发明具体实施方式中的技术方案，下面将对具体实施方式中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图得到其他的附图
图1为甾体雄烯二酮乙酸酯的高效液相色谱图；
图2为双键移位中间体A的高效液相色谱图；
图3为去氢表雄酮(DHEA)的高效液相色谱图；
图4为反应过程中混合物的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1：
雄烯二酮乙酸酯的高效液相色谱检测
雄烯二酮乙酸酯来源：以雄烯二酮为原料制备
参照文献：中国医药化学杂志，第5期，23卷，368-371
高效液相色谱分析方法：
Figure BDA0002435569790000051
获得的高效液相色谱图如图1所示。
实施例2：
双键移位中间体A的高效液相色谱检测
双键移位中间体A的来源：以雄烯二酮为原料制备
参照文献：中国专利:CN105695551B
高效液相色谱分析方法：
Figure BDA0002435569790000061
获得的高效液相色谱图如图2所示。
实施例3：
去氢表雄酮(DHEA)的高效液相色谱检测
去氢表雄酮(DHEA)的来源：采购自上海阿拉丁生化科技有限公司
高效液相色谱分析方法：
Figure BDA0002435569790000062
获得的高效液相色谱图如图3所示。
实施例4：
本发明DHEA的合成
在3升反应瓶中加入100mM磷酸缓冲液(pH＝6.5)1500克，在搅拌下加入300克葡萄糖、300毫升叔丁醇，搅拌均匀。在搅拌下依次加入底物雄烯二酮酯化物400克，400毫克烟酰胺腺嘌呤双核苷酸，4克酮还原酶酶粉(购自苏州引航生物科技有限公司，商品编号为YH2046)和4克葡萄糖脱氢酶酶粉(购自苏州引航生物科技有限公司，商品编号为YH1901)，4克水解酶酶粉(购自苏州引航生物科技有限公司，商品编号为YH1203)控制反应温度30-35摄氏度，开始搅拌反应，在反应过程中用6M的NaOH调节体系的PH保持在6.2-6.9。反应20小时后取样HPLC检测，转化率99％以上。反应完全，减压蒸馏除去叔丁醇，过滤，滤饼用水洗涤，得粗品DHEA。粗品DHEA通过甲醇与水的混合溶剂结晶得到纯品DHEA 330克，收率94％。产品纯度达到99.7％，含量99.6％。
实施例5
本发明方法反应过程中混合物高效液相色谱检测。
按照实施例4的方法，反应时间调整为7小时，之后取样HPLC检测，色谱分析方法为：
Figure BDA0002435569790000071
获得的高效液相色谱图如图4所示。
从图4分析得出，此反应过程没有中间体A的累积，因此不会产生由于中间体A不稳定而产生的氧化性杂质。
实施例6：本发明DHEA的合成
在3升反应瓶中加入100mM磷酸缓冲液(pH＝6.5)1500克，在搅拌下加入300克葡萄糖、300毫升叔丁醇，搅拌均匀。在搅拌下依次加入底物雄烯二酮酯化物400克，400毫克烟酰胺腺嘌呤双核苷酸，4克酮还原酶酶粉(购自苏州引航生物科技有限公司，商品编号为YH2046)和4克葡萄糖脱氢酶酶粉(购自苏州引航生物科技有限公司，商品编号为YH1901)，10克水解酶酶粉(购自山东隆大生物工程有限公司，商品名称:中性脂肪酶)控制反应温度30-35摄氏度，开始搅拌反应，在反应过程中用6M的NaOH调节体系的PH保持在6.2-6.9。20小时后取样HPLC检测，转化率97％。反应完全，减压蒸馏除去叔丁醇，过滤，滤饼用水洗涤，得粗品DHEA。粗品DHEA通过甲醇与水的混合溶剂结晶得到纯品DHEA，收率88％。产品纯度达到99.6％，含量99.6％。
实施例7：DHEA的合成
在3升反应瓶中加入100mM磷酸缓冲液(pH＝6.5)1500克，在搅拌下加入300克葡萄糖、300毫升叔丁醇，搅拌均匀。在搅拌下依次加入底物雄烯二酮酯化物400克，400毫克烟酰胺腺嘌呤双核苷酸，4克酮还原酶酶粉(购自苏州引航生物科技有限公司，商品编号为YH2046)和4克葡萄糖脱氢酶酶粉(购自苏州引航生物科技有限公司，商品编号为YH1901)，8克水解酶酶粉(购自夏盛实业集团有限公司，商品名称:脂肪酶)控制反应温度30-35摄氏度，开始搅拌反应，在反应过程中用6M的NaOH调节体系的PH保持在6.2-6.9。20小时后取样HPLC检测，转化率99％以上。反应完全，减压蒸馏除去叔丁醇，过滤，滤饼用水洗涤，得粗品DHEA。粗品DHEA通过甲醇与水的混合溶剂结晶得到纯品DHEA，收率90％。产品纯度达到99.5％，含量99.3％。
实施例8：DHEA的合成
在3升反应瓶中加入100mM磷酸缓冲液(pH＝6.5)1500克，在搅拌下加入300克葡萄糖、300毫升叔丁醇，搅拌均匀。在搅拌下依次加入底物雄烯二酮酯化物400克，400毫克烟酰胺腺嘌呤双核苷酸，4克酮还原酶酶粉(购自苏州引航生物科技有限公司，商品编号为YH2046)和4克葡萄糖脱氢酶酶粉(购自苏州引航生物科技有限公司，商品编号为YH1901)，5克水解酶酶粉(购自诺维信，商品编号:06-3140)控制反应温度30-35摄氏度，开始搅拌反应，在反应过程中用6M的NaOH调节体系的PH保持在6.2-6.9。20小时后取样HPLC检测，转化率99％以上。反应完全，减压蒸馏除去叔丁醇，过滤，滤饼用水洗涤，得粗品DHEA。粗品DHEA通过甲醇与水的混合溶剂结晶得到纯品，收率96％。产品纯度达到99.8％，含量99.5％。
实施例9：DHEA的合成
在3升反应瓶中加入100mM磷酸缓冲液(pH＝6.5)1500克，在搅拌下加入300克葡萄糖、300毫升叔丁醇，搅拌均匀。在搅拌下依次加入底物雄烯二酮酯化物400克，400毫克烟酰胺腺嘌呤双核苷酸，4克酮还原酶酶粉(购自苏州引航生物科技有限公司，商品编号为YH2046)和4克葡萄糖脱氢酶酶粉(购自苏州引航生物科技有限公司，商品编号为YH1901)，4克水解酶酶粉(购自天野酶制剂(江苏)有限公司，商品名称:Lipase PS“Amano”IM)控制反应温度30-35摄氏度，开始搅拌反应，在反应过程中用6M的NaOH调节体系的PH保持在6.2-6.9。20小时后取样HPLC检测，转化率99％以上。反应完全，减压蒸馏除去叔丁醇，过滤，滤饼用水洗涤，得粗品DHEA。粗品DHEA通过甲醇与水的混合溶剂结晶得到纯品DHEA,收率92％。产品纯度达到99.6％，含量99.4％。

Claims (6)

1.一种去氢表雄酮的合成方法，其特征在于，将甾体雄烯二酮酯化物和水解酶、酮还原酶一起溶于溶剂中，制备得到去氢表雄酮，所述酮还原酶为选择性酮还原酶，其可以选择性地不对称还原中间体A的3位酮羰基，所述中间体A的结构为
Figure FDF0000019692830000011
2.如权利要求1所述的合成方法，其特征在于，添加烟酰胺腺嘌呤双核苷酸作为辅酶。
3.如权利要求2所述的合成方法，其特征在于，添加葡萄糖和葡萄糖脱氢酶或者异丙醇和醇脱氢酶或者甲酸和甲酸脱氢酶实现所述辅酶的再生。
4.如权利要求1-3任一项所述的合成方法，其特征在于，所述溶剂为叔丁醇和磷酸缓冲液。
5.如权利要求4所述的合成方法，其特征在于，所述合成方法的pH值为6-8，反应过程中通过添加碱维持pH值稳定。
6.如权利要求1-3任一项所述的合成方法，其特征在于，所述甾体雄烯二酮酯化物为甾体雄烯二酮乙酸酯。
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