CN106086148A - 一种化学‑酶法制备去氢表雄酮的方法 - Google Patents

一种化学‑酶法制备去氢表雄酮的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种化学‑酶法制备去氢表雄酮的方法，以4‑雄烯二酮为初始底物，依次进行化学法和生物法两步制得去氢表雄酮，在制备过程中，对两步反应过程进行了优化，在化学法制备5‑雄烯二酮的过程中，将反应液加入到了混合有抗坏血酸钠和醋酸的水溶液中，使反应条件更为温和，同时在第二步生物法制备去氢表雄酮过程中，采用了酮还原酶作为催化剂，使得制备所得的产物的收率和纯度更高，同时在整个反应过程中辅酶和叔丁醇钾等原料的用量更低，具有较高的实用价值。

Description

一种化学-酶法制备去氢表雄酮的方法
技术领域
本发明涉及制药领域，具体涉及一种化学-酶法制备去氢表雄酮的方法。
背景技术
去氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone，DHEA)结构如式1所示，是人体肾上腺皮质分泌的甾体化合物，具有延缓衰老，抵御疾病等作用，也是合成其他甾体药物的前体。
目前已经公开的制备去氢表雄酮的方法中，较多的为发酵法和化学法。添加前体至微生物发酵液中进行生物转化的发酵法如专利CN 201210316197等报道，耗时较长，产物含量小于1g/L，存在分离提取等问题。以其他甾体化合物为起始化学法如专利CN102212099、102603841、102603839等报道，多利用保护、水解、氢化和肟化等步骤，收率低且环境问题严重。
以常见的4-雄烯二酮(4-AD)为初始底物，依次经过化学方法的双键移位反应生成5-雄烯二酮(5-AD)和生物方法的羰基还原反应可以制备去氢表雄酮，是目前报道的步骤最少，收率较高的方法。文献Tetrahedron Letters，1962，15：669-672,等报道了利用叔丁醇钾实现4-AD的双键移位反应；专利WO 2014188353报道了化学法双键移位及后续的酶法还原反应。
在报道4-AD生成5-AD反应中，5-AD的纯度是影响下一步反应的主要问题，因为其杂质很难除去，而且普遍存在着叔丁醇钾用量较高，产物5-AD收率低的问题，如专利WO2014188353中的叔丁醇钾用量为底物的5倍当量，产物收率只有83％，考虑到产物去氢表雄酮的成本中底物约占80％，因此存在较大的应用困难。另外值得注意的是，该专利的第二步生物合成同时使用了NAD和NADP作为辅酶，有机溶剂用量高，收率为70％，同样存在实用性问题。
发明内容
本发明的目的是提供克服现有技术的不足，提供一种化学-酶法制备去氢表雄酮的方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种化学-酶法制备去氢表雄酮的方法，包括如下步骤：
1)以4-雄烯二酮为底物，在温度为20～40℃、氮气保护下，以叔丁醇为溶剂，在叔丁醇钾的作用下反应1～12h，而后将该反应液加入到混合有抗坏血酸钠、醋酸的水溶液中，HPLC检测反应进程，当转化率达90～99％时，反应结束，得到5-雄烯二酮，其中，叔丁醇钾与4-雄烯二酮的投料质量比为2～0.5:1；
2)将步骤1)得到的5-雄烯二酮与溶剂、水相缓冲溶液构成反应体系，加入生物催化剂、六水氯化镁、辅酶和辅酶再生***，在25～40℃的温度条件下进行反应，控制整个反应过程的pH在6.0～7.5，HPLC检测反应进程，当转化率达90-99％时，反应结束，得到产物去氢表雄酮，其中，所述的溶剂为2-甲基四氢呋喃，所述的生物催化剂为酮还原酶，所述的辅酶再生***为葡萄糖和葡萄糖脱氢酶，所述的葡萄糖：生物催化剂:葡萄糖脱氢酶：5-雄烯二酮的投料质量比为：0.8～1.2:0.008～0.016:0.004～0.008:1。
优选地，步骤2)中所述的水相缓冲溶液为pH为6.5的磷酸盐缓冲溶液。
优选地，所述的辅酶为NAD，其与5-雄烯二酮的投料质量比为：0.003～0.005:1。
优选地，所述的葡萄糖脱氢酶为购自苏州汉酶生物技术有限公司生产的牌号为EW002的葡萄糖脱氢酶。
优选地，所述的酮还原酶的基因序列与序列1～26中的任一序列具有至少90％的同源性。
进一步优选地，所述的酮还原酶是在非致病微生物中的表达产物。
更进一步优选地，所述的非致病微生物为大肠杆菌。
优选地，具体实施过程如下：
1)以4-雄烯二酮为底物，在温度为20～40℃、氮气保护下，以叔丁醇为溶剂，在叔丁醇钾的作用下反应1～12h，而后将该反应液加入到混合有抗坏血酸钠、醋酸的水溶液中，HPLC检测反应进程，当转化率达90～99％时，反应结束，将混合液过滤，得到白色固体，水洗、旋干即得5-雄烯二酮产品；
2)将步骤1)得到的5-雄烯二酮溶解于2-甲基四氢呋喃中，加入所述的水相缓冲溶液，搅拌后加入所述的葡萄糖、六水氯化镁、酮还原酶、葡萄糖脱氢酶、辅酶，在25～40℃的温度条件下进行反应，控制反应体系的pH在6.0～7.5，HPLC检测反应进程，当转化率达90-99％时，反应结束，调节反应体系的pH＜2，加入乙酸乙酯和活性炭搅拌1～12h，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤三次，合并滤液和洗涤液，旋蒸除去有机溶剂，水相加入乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯，浓缩，室温下缓慢加入正庚烷，过夜析晶，过滤、干燥得到去氢表雄酮产品，母液蒸干后得到去氢表雄酮固体产品。
由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：本发明的化学-酶法制备去氢表雄酮的方法，与现有路线相比，通过对第一步化学法和第二步生物法的改进，采用更温和的反应条件和更加优良的催化剂，使的本发明的制备方法实现了产物收率高、纯度高的目的，同时辅酶和叔丁醇钾等原料的用量更低，具有较高的实用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为常规实验中的条件。
实施例1制备5-AD
25℃下，向叔丁醇(80mL)通入氮气15min，在通气条件下加入叔丁醇钾(6.0g，3.0eq)，后密封反应器，进行氮气置换并搅拌半小时。在氮气保护下加入底物(5.0g，1.0eq)，35℃反应5小时。取3.5g抗坏血酸钠、5.7g醋酸、200mL水，搅拌15分钟，将上述反应液倒入，氮气保护下搅拌半小时，HPLC检测转化率96.5％。将混合液过滤，得白色固体，水洗，旋干后得到白色固体4.8g，HPLC检测纯度95.5％，收率91.7％。
实施例2制备去氢表雄酮
将上述4.8g产品溶解于25mL 2-甲基四氢呋喃中，加入25mL 100mM pH6.5的磷酸盐缓冲溶液开始搅拌，依次加入5g葡萄糖，80mg六水氯化镁，60mg酮还原酶(由序列26在大肠杆菌中表达获得)，30mg葡萄糖脱氢酶(来自苏州汉酶生物技术有限公司，编号为EW002)，20mg NAD，25℃下开始反应，并用40％氢氧化钠控制pH 6.5。6小时后取样检测，转化率99％，用盐酸调节pH<2，加入30mL乙酸乙酯和2g活性炭搅拌1小时，过滤，滤饼用15mL乙酸乙酯洗涤三次，合并滤液和洗涤液，旋蒸除去有机溶剂，水相加入40mL乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯，浓缩至20mL体积，至室温下缓慢加入40mL正庚烷，过夜析晶，过滤，干燥，得3.5g产品，纯度>99％，含量>99％，母液蒸干后，得到1.4g固体，经过重新回收套用，多批后处理收率为85％。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种化学-酶法制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）以4-雄烯二酮为底物，在温度为20~40℃、氮气保护下，以叔丁醇为溶剂，在叔丁醇钾的作用下反应1~12h，而后将该反应液加入到混合有抗坏血酸钠、醋酸的水溶液中，HPLC检测反应进程，当转化率达90~99%时，反应结束，得到5-雄烯二酮，其中，叔丁醇钾与4-雄烯二酮的投料质量比为2~0.5:1；
2）将步骤1）得到的5-雄烯二酮与溶剂、水相缓冲溶液构成反应体系，加入生物催化剂、六水氯化镁、辅酶和辅酶再生***，在25~40℃的温度条件下进行反应，控制整个反应过程的pH在6.0~7.5，HPLC检测反应进程，当转化率达90-99%时，反应结束，得到产物去氢表雄酮，其中，所述的溶剂为2-甲基四氢呋喃，所述的生物催化剂为酮还原酶，所述的辅酶再生***为葡萄糖和葡萄糖脱氢酶，所述的葡萄糖：生物催化剂:葡萄糖脱氢酶：5-雄烯二酮的投料质量比为：0.8~1.2:0.008~0.016:0.004~0.008:1。
2.根据权利要求1所述的化学-酶法制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，步骤2）中所述的水相缓冲溶液为pH为6.5的磷酸盐缓冲溶液。
3.根据权利要求1所述的化学-酶法制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，所述的辅酶为NAD，其与5-雄烯二酮的投料质量比为：0.003~0.005:1。
4.根据权利要求1所述的化学-酶法制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，所述的葡萄糖脱氢酶为购自苏州汉酶生物技术有限公司生产的牌号为EW002的葡萄糖脱氢酶。
5.根据权利要求1所述的化学-酶法制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，所述的酮还原酶的基因序列与序列1~26中的任一序列具有至少90%的同源性。
6.根据权利要求5所述的化学-酶法制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，所述的酮还原酶是在非致病微生物中的表达产物。
7.根据权利要求6所述的化学-酶法制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，所述的非致病微生物为大肠杆菌。
8.根据权利要求1所述的化学-酶法制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，具体实施过程如下：
1）以4-雄烯二酮为底物，在温度为20~40℃、氮气保护下，以叔丁醇为溶剂，在叔丁醇钾的作用下反应1~12h，而后将该反应液加入到混合有抗坏血酸钠、醋酸的水溶液中，HPLC检测反应进程，当转化率达90-99%时，反应结束，将混合液过滤，得到白色固体，水洗、旋干即得5-雄烯二酮产品；
2）将步骤1）得到的5-雄烯二酮溶解于2-甲基四氢呋喃中，加入所述的水相缓冲溶液，搅拌后加入所述的葡萄糖、六水氯化镁、酮还原酶、葡萄糖脱氢酶、辅酶，在25~40℃的温度条件下进行反应，控制反应体系的pH在6.0~7.5，HPLC检测反应进程，当转化率达90~99%时，反应结束，调节反应体系的pH＜2，加入乙酸乙酯和活性炭搅拌1~12h，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤三次，合并滤液和洗涤液，旋蒸除去有机溶剂，水相加入乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯，浓缩，室温下缓慢加入正庚烷，过夜析晶，过滤、干燥得到去氢表雄酮产品，母液蒸干后得到去氢表雄酮固体产品。
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