CN111500549A

CN111500549A - 制备c1,2-位脱氢甾体化合物的酶及其应用

Info

Publication number: CN111500549A
Application number: CN202010323258.0A
Authority: CN
Inventors: 苏正定; 宋士奎; 成细瑶; 王宏伟; 黄永棋
Original assignee: Hubei University of Technology
Current assignee: Hubei University of Technology
Priority date: 2020-04-22
Filing date: 2020-04-22
Publication date: 2020-08-07
Anticipated expiration: 2040-04-22
Also published as: CN111500549B

Abstract

本发明提供了制备C1,2‑位脱氢甾体化合物的酶及其应用。制备C1,2‑位脱氢甾体化合物的酶的氨基酸序列为SEQ ID.3。酶的N端或C端可以结合有麦芽糖结合蛋白(MBP)。本发明通过对酶进行改造，获得了高活力的酶。另外，通过形成可溶性MBP/KstD融合蛋白,增强KstD蛋白的溶解性，从而解决酶的溶解性问题。

Description

制备C1,2-位脱氢甾体化合物的酶及其应用

技术领域

本发明涉及生化领域，具体地，涉及制备C1,2-位脱氢甾体化合物的酶及其应用。

背景技术

甾体激素药物是临床上一类重要的药物，其抗炎活性尤为显著，甾体药物被广泛用于预防和治疗各种疾病。此外，甾体母核结构的变化可导致更有效的类固醇药物。例如，当通过Δ1-脱氢将不饱和度引入醋酸氢化可的松(HA)的1，2-位时，产物醋酸***龙(PA)的抗炎活性提高三到四倍。然而，由于甾体结构的复杂性，传统的化学方法难以专门修饰甾体中间体，化学方法存在转化率低，副产物多，环境污染等缺陷。因此，酶促转化由于其温和的反应条件，高效率和特异性(区域选择性和立体选择性)而引起了广泛关注。如今，已证明酶转化技术是一种生产新型类固醇药物和活性药物成分的新型、高效且经济的方法。

3-酮类固醇-Δ1-脱氢酶(KstD)催化雄烯二酮(4-AD)的C1，2位脱氢反应生成1，4-雄烯二酮(ADD)(如图1所示)。从4-AD转化而来的 ADD是合成高端甾体药物的重要前体，例如避孕药、***和孕激素。尽管化学脱氢工艺已用于甾体制药行业，与激素合成的多步化学合成相比，酶法工艺效率高，不产生副产物积累，产物纯度高，因此，通过异源表达 KstD，开发“绿色”高效酶促方法制备甾体中间体目前已开始引人关注。耻垢分枝杆菌mc²155的MsKstD1可以在3小时内以6g/L的浓度使氢化可的松的收率达到90％。新分枝杆菌DSM1381的KstD2可以使30g/L4-AD 几乎完全转化。但是上述底物浓度低和低转化率限制了KstD酶工艺的工业化的应用。

KstD酶促反应属于氧化还原反应，3-甾酮-1，2-脱氢酶(KstD)是一种黄素蛋白依赖型的脱氢酶，在催化反应过程中以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD) 为辅因子，可以催化3-甾酮类固醇母核A环1，2位的碳碳单键(C-C)脱氢变成碳碳双键(C＝C)。工业化再生辅酶FAD的成本非常高，需要开发高效和低廉电子受体或者开放高效和低廉的辅酶再生***，这是限制KstD 酶工艺的工业化的应用的一个关键技术。

KstD是诱导酶，也是一种膜蛋白。尽管对其进行异源表达的例子很多，但由于膜蛋白本身的难溶解性，多以包涵体的形式存在，是其工业化应用上亟待解决一个技术难题。

不同微生物来源的KstD酶对甾体底物的专一性不同，因为不同KstD 的蛋白氨基酸序列存在着差异性，决定它们的构象上在局部区域存在差异性，筛选或设计底物专一性的KstD酶，或者筛选一种多大多数底物通用的 KstD酶也是甾体酶工艺工业化的关键需求技术。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种制备C1,2-位脱氢甾体化合物的酶，所述酶的氨基酸序列为SEQ ID.3。

在上述酶中，其中，所述酶的N端或C端结合有麦芽糖结合蛋白(MBP)。

本发明还提供了表达上述酶的基因序列，所述基因序列为SEQ ID.4。

本发明还提供了一种表达载体，其中，所述表达载体用于表达上述酶。

本发明还提供了一种表达***，其中，所述表达***包含上述基因序列。

本发明还提供了上述酶在制备C1,2-位脱氢甾体化合物中的应用。

本发明通过对KstD211进行序列改造，优化设计，获得高活力KstD725 突变体。KstD725突变体氨基酸序列为SEQIDNO.3.编码KstD725突变体氨基酸序列的DNA序列经过大肠杆菌偏爱密码子优化设计，适用于大肠杆菌高效表达，一种DNA序列为SEQID.4。

本发明通过对分枝杆菌HGMS2的KstD211酶进行改造，获得一种可溶性KstD融合酶；在KstD211的N端-或C-融合MBP蛋白，形成可溶性MBP/KstD融合蛋白,增强KstD蛋白的溶解性，从而解决酶的溶解性问题。 MBP可以放置在KstD的N-端或者C-端，均不改变KstD725活性。

通过利用重组大肠杆菌高效表达的KstD融合酶，采用高密度发酵制备融合KstD融合酶，酶比活达到31.6U/mg。通过优化KstD融合酶反应电子受体种类和用量，对辅酶进行低成本高效再生循环，建立了融合酶转化雄烯二酮(4-AD)生成1，4-雄烯二酮(ADD)工艺。在本发明的摇瓶工艺中，以10g/L 4-AD为原料，KstD融合酶转化4-AD，转化率在98％以上。通过放大并优化KstD融合酶催化体系，在15L反应釜中，以80g/L 4-AD 为原料，转化率在97％以上，精制后纯度可达99.5％以上。在15吨反应釜中，实现了4-AD到ADD的大规模的高效转化，底物浓度高达80～100g L^-1, 转化率达到98％，且产物单一，无其他杂质产生。本发明的酶法转化具有高效性、专一性、温和性等独特的优势。本发明的融合酶同样适用于高效转化生产其他具有高价值的甾体药物中间体。

附图说明

图1示出了3-酮类固醇-Δ1-脱氢酶催化4-AD脱氢生成ADD。

图2示出了SDS-PAGE电泳图以分析比较可溶性KstD酶的表达。非融合KstD表达：1、2是诱导10h的上清和沉淀；3、4是诱导20h的上清和沉淀。融合蛋白表达MBP-KstD：5、6是诱导10h的上清和沉淀；7、8 是诱导20h的上清和沉淀。

图3示出了分批补料发酵重组大肠杆菌及诱导表达的过程曲线，其中，▼--▼：OD600nm；★--★：溶氧；●--●：温度；◆--◆：pH；■--■：转速。

图4示出了高密度发酵制备KstD酶的SDS-PAGE图。M：蛋白Marker； 1:粗酶液上清-10h；2：粗酶液沉淀-10h；3：粗酶液上清-12h；4：粗酶液沉淀-12h；5：粗酶液上清-20h；6：粗酶液沉淀-20h。

图5示出了TLC(薄层色谱)分析重组KstD酶转化4-AD生成ADD 反应。1：反应6小时；2：反应20小时。

图6示出了TLC分析重组KstD酶转化4-AD生成ADD反应。1:4-AD 标品；2、3、4、5分别代表酶反应6h、12h、18h、24小时产物。

图7示出了HPLC分析重组KstD酶转化4-AD生成ADD反应。a)4-AD 标样HPLC分析图；b)ADD标样HPLC分析图；c)KstD催化反应液HPLC 分析图。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

本发明对4-AD工业生产菌种分枝杆菌HGMS2进行了全基因组测序 (GenbankID:CP031414.1)，从HGMS2菌种中鉴定出唯一的KstD酶基因，命名为KstD211(SEQIDNO.1)和氨基酸序列(SEQIDNO.2)。

本发明对分枝杆菌HGMS2的KstD酶基因进行了克隆、表达、酶结构分析和改造。本发明构建了大肠杆菌的表达载体，把克隆出的KstD的基因通过pRSV表达载体后导入大肠杆菌，进行诱导表达，并表征了其酶特异性和选择性。

前人的研究表明，重组KstD在大肠杆菌表达***中的最高活性仅为 6U/mg。通过比较KstD211与其他分枝杆菌KstD的氨基酸序列，本发明对 KstD211进行序列改造，优化设计，获得高活力KstD725突变体。KstD725 突变体氨基酸序列为SEQIDNO.3.编码KstD725突变体氨基酸序列的DNA 序列经过大肠杆菌偏爱密码子优化设计，适用于大肠杆菌高效表达，一种 DNA序列为SEQID.4。

KstD属于膜结合酶蛋白，溶解性低。前人的研究表明，红球菌SQ1 获得的KstD基因在大肠杆菌表达***中可以表达，但KstD的溶解度较低，只有一小部分是可溶且有活性的，主要以包涵体的形式存在。为克服膜蛋白溶解性低的难题，本发明采用融合表达的策略，在KstD的N端-或C- 融合MBP蛋白(麦芽糖结合蛋白)，形成可溶性MBP/KstD融合蛋白，在表达过程中会增强KstD蛋白的溶解性，从而解决酶的溶解性问题。MBP 可以放置在KstD725的N-端或者C-端，均不改变KstD725活性。这也是大规模酶促反应所必需的。然后再对其进行过表达。

本发明利用重组大肠杆菌高效表达的MBP/KstD融合蛋白，采用高密度发酵制备融合KstD酶，经纯化后酶比活达到31.6U/mg。

本发明通过优化电子受体比例，低成本高效再生辅酶***，利用 MBP/KstD725融合酶体外酶转化法在摇瓶中，以10g/L4-AD为原料，实现了转化率在98％以上。

本发明通过放大并优化MBP/KstD725融合酶催化体系，在15L反应釜中，以80g/L4-AD为原料，转化率在97％以上，精制后纯度可达99.5％以上。

本发明利用MBP/KstD725融合酶体外酶转化法，在15吨反应釜中实现了4-AD到ADD的大规模的高效转化，底物浓度高达80～100gL^-1，转化率达到98％，且产物单一，无其他杂质产生。本发明的酶法转化具有高效性、专一性、温和性等独特的优势。本发明的MBP/KstD725融合酶同样适用于高效转化生产其他具有高价值的甾体药物中间体，为甾体药物工业的发展指明了一个新方向，本发明的酶转化工艺已达到工业化生产要求。本发明利用融合表达的形式以增加KstD的溶解性以及表达的稳定性。在 KstD的N端连接一个可溶性的蛋白MBP即MBP-KstD。

因此，本研究为甾体药物C1,2脱氢的生物合成提供了一种经济、环保的方法和技术工艺。

下面结合具体的实施例进行说明，以更好地理解本发明。

实施例一、重组KstD融合酶质粒的构建和摇瓶表达

将含有重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)细胞在含35μg/ml卡那霉素的LB培养基中培养，并在37℃以200rpm旋转。当OD600nm达到0.8 时，加入0.4mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(终浓度)，培养温度降至20℃，继续培养18-20小时。通过SDS-PAGE胶发现，可溶性的目标酶蛋白表达量明显增多(如图2所示)。

实施例二、高密度发酵制备KstD融合酶

为了获得具有大量酶的高密度细胞培养物，优化高密度培养基，在15L 发酵罐中培养细胞，并进行了一些修饰，例如替换了葡萄糖通过甘油、酵母粉作为氮源，由乳糖等诱导。发酵开始时，将发酵罐的温度控制在37℃，以使细胞迅速生长。在分批补料阶段，将溶解氧控制在10％至30％之间，将pH控制在6.2至7.8之间。在诱导阶段之前，将细胞培养温度降至20℃并保持一段时间，然后加入乳糖母液直至终浓度达到0.4mM，诱导时间为 18h-20h。诱导蛋白质表达。发酵后，于4℃离心收集大肠杆菌细胞，重悬于50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，利用高压均质机对悬浮液进行破碎，破碎条件：5℃以下、1200bar，进行3个循环即可得到粗酶液。对粗酶液在4℃和6000r/min下离心20分钟后，去除细胞碎片等固体杂质。此时，酶液作为酶催化反应用，低温暂时保存。

通过优化高密度发酵配方，本发明在15L的发酵罐中采取分批补料的发酵方式对重组大肠杆菌进行高密度发酵。装液量为10L培养基，对其进行121℃高温灭菌，30min。待温度降至37℃，以5％接种量进行接种，开始发酵。整个发酵过程中温度、溶氧和pH的变化如图3所示。由图3可知，在接种后的5h溶氧降至最低，此后溶氧回升的同时，开始补料。补料过程中维持溶氧在一定的波动范围(20％-30％)。发酵至16h开始降低温度，低温下补加诱导液。诱导阶段期间，补料速度相应的降低，保持菌体的较低生长速度，以确保蛋白的正常表达。在整个发酵过程中发现pH的波动并不大，从发酵初始的7.2一直到发酵结束后的6.7，中途并未补酸或碱来调节pH。这可能是由于补料控制恰当的原因，没有因为补料过多，菌体产酸而造成的pH降低，也没有因为补料过少，致使菌体自溶，pH随之升高。

实施例三、KstD融合酶活

取适量的2.3离心的上清液，Mbp-KstD2在30℃下用Nano Drop 2000 分光光度计(Thermo Scientific)在600纳米(ξ600纳米＝18.7×103 cm-1M-1)上使用吩嗪硫酸甲酯(PMS)和2,6-二氯苯酚-苯二酚(DCPIP) 测定。反应混合物(1ml)由50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)，150mM PMS，8mM DCPIP，适当浓度的上清液或细胞提取物和100mM AD甲醇组成。活性表示为每毫克蛋白质的单位；1U被定义为减少1μmolmin-1 DCPIP。在没有4-雄烯酮-3，17-二酮(AD)的反应混合物中未检测到活性。将剩余的上清液进行SDS-PAGE电泳分析，SDS-PAGE使用8％的分离胶和5％的浓缩胶，鉴定蛋白是否表达正确。发酵罐中蛋白表达如图4所示。

实施例四、摇瓶KstD融合酶转化4-AD反应工艺

把雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)粉末投入至50mM ofTris-HCl buffer(pH 8.0)中，配成10％的浓度，用匀浆机对其进行乳化2h(防止大量气泡产生，可加入少量的消泡剂)，使AD颗粒变小，均匀分散于缓冲液中，制备成底物乳化液。按前面所述的酶催化反应来进行酶活测试。取高密度发酵的菌体用Tris-HCl缓冲液(Ph＝8.0)进行重悬，利用高压均质机进行破碎，获得粗酶液。酶催化体积为100ml，按1％投料量进行反应。量取50ml粗酶液装入250ml的摇瓶内，再加入25ml 4AD(约1g)乳化液和25ml Tris-HCl 缓冲液，加入1％电子受体甲萘醌，置于摇床中，于30℃、200rpm震荡反应。分别在反应6h和20时取样，用乙酸乙酯萃取，离心，用毛细管蘸取上清的乙酸乙酯进行点板。把硅胶板置于展开剂(V石油醚/V乙酸乙酯＝5:3) 中，待溶剂爬升至硅胶板的三分之二后，拿出并吹干溶剂。然后硅胶板置于254nm紫外光照下，结果如图5所示。在100mL反应体系中，以1％的底物浓度(即投料量1g)，在250mL摇瓶中做酶催化反应，在20h已转化至96％以上。

实施例五、中试KstD融合酶转化4-AD反应工艺

继续放大实验进行公斤级底物的酶转化测试，在15L的反应釜中进行实验。总反应体积为10L，同样按1％底物浓度(即投料量1Kg)。反应条件和摇瓶的一样。分别在反应6h、12h、18h、24h时取样，用乙酸乙酯萃取，离心，用毛细管蘸取上清的乙酸乙酯进行点板。把硅胶板置于展开剂(V石油醚/V乙酸乙酯＝5:3)中，待溶剂爬升至硅胶板的三分之二后，拿出并吹干溶剂。然后硅胶板置于254nm紫外光照下，结果如图6所示。

实施例六、大规模KstD融合酶转化4-AD反应工艺

继续放大实验进行吨级底物的酶转化测试，在15吨的反应釜中进行实验。总反应体积为10吨，同样按10％底物浓度(即投料量1吨)。反应条件和摇瓶的一样。在反应6h、12h、18h、24h时取样，用乙酸乙酯萃取，离心，用毛细管蘸取上清的乙酸乙酯进行TLC点板检测反应进程，进一步进行HPLC检测，证实转化率达到97％以上方可进行精制工艺。如图7所示，反应20～24小时后，转化率达到97以上，停止反应。

本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本申请的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。

序列表

<110> 湖北工业大学

<120> 制备C1,2-位脱氢甾体化合物的酶及其应用

<130> HP200013LZ

<141> 2020-04-22

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1692

<212> DNA

<213> 分枝杆菌HGMS2()

<400> 1

atgactgaac aggactacag tgtctttgac gtagtggtgg tagggagcgg tgctgccggc 60

atggtcgccg ccctcaccgc cgctcaccag ggactctcga cagtagtcgt tgagaaggct 120

ccgcactatg gcggttccac ggcgcgatcc ggcggcggcg tgtggattcc gaacaacgag 180

gttctgcagc gtgacggggt caaggacacc cccgccgagg cacgcaaata cctgcacgcc 240

atcatcggcg atgtggtgcc ggccgagaag atcgacacct acctggaccg cagtccggag 300

atgttgtcgt tcgtgctgaa gaactcgccg ctgaagctgt gctgggttcc cggctactcc 360

gactactacc cggagacgcc gggcggtaag gccaccggcc gcttggtcga gcccaagccg 420

ttcaatgcca agaagctcgg tcccgacgag aagggcctcg aaccgccgta cggcaaggtg 480

ccgctgaaca tggtggtgct gcaacaggac tatgtccggc tcaaccagct caagcgtcac 540

ccgcgcggcg tgctgcgcag catcaaggtg ggtgtgcggt cggtgtgggc caacgccacc 600

ggcaagaacc tggtcggtat gggccgggcg ctgatcgcgc cgctgcgcat cggcctgcag 660

aaggccgggg tgccggtgct gttgaacacc gcgctgaccg acctgtacct cgaggacggg 720

gtggtgcgcg gaatctacgt tcgcgaggcc ggcgcccccg agtctgccga gccgaagctg 780

atccgagccc gcaagggcgt gatcctcggt tccggtggct tcgagcacaa ccaggagatg 840

cgcaccaagt atcagcgcca gcccatcacc accgagtgga ccgtcggcgc agtggccaac 900

accggtgacg gcatcgtggc ggccgaaaag ctcggtgcgg cattggagct catggaggac 960

gcgtggtggg gaccgaccgt cccgctggtg ggcgccccgt ggttcgccct ctccgagcgg 1020

aactcccccg ggtcgatcat cgtcaacatg aacggcaagc ggttcatgaa cgaatcgatg 1080

ccctatgtgg aggcctgcca ccacatgtac ggcggtcagt acggccaagg tgccgggcct 1140

ggcgagaacg tcccggcatg gatggtcttc gaccagcagt accgtgatcg ctatatcttc 1200

gcgggattgc agcccggaca acgcatcccg aagaaatgga tggaatcggg cgtcatcgtc 1260

aaggccgaca gcgtggccga gctcgccgag aagaccggtc ttgcccccga cgcgctgacg 1320

gccaccatcg aacggttcaa cggtttcgca cgttccggcg tggacgagga cttccaccgt 1380

ggcgagagcg cctacgaccg ctactacggt gatccgacca acaagccgaa cccgaacctc 1440

ggcgagatca agaacggtcc gttctacgcc gcgaagatgg tacccggcga cctgggcacc 1500

aagggtggca tccgcaccga cgtgcacggc cgtgcgttgc gcgacgacaa ctcggtgatc 1560

gaaggcctct atgcggcagg caatgtcagc tcaccggtga tggggcacac ctatcccggc 1620

ccgggtggca caatcggccc cgccatgacg ttcggctacc tcgccgcgtt gcatctcgct 1680

ggaaaggcct ga 1692

<210> 2

<211> 563

<212> PRT

<213> 分枝杆菌HGMS2()

<400> 2

Met Thr Glu Gln Asp Tyr Ser Val Phe Asp Val Val Val Val Gly Ser

1 5 10 15

Gly Ala Ala Gly Met Val Ala Ala Leu Thr Ala Ala His Gln Gly Leu

20 25 30

Ser Thr Val Val Val Glu Lys Ala Pro His Tyr Gly Gly Ser Thr Ala

35 40 45

Arg Ser Gly Gly Gly Val Trp Ile Pro Asn Asn Glu Val Leu Gln Arg

50 55 60

Asp Gly Val Lys Asp Thr Pro Ala Glu Ala Arg Lys Tyr Leu His Ala

65 70 75 80

Ile Ile Gly Asp Val Val Pro Ala Glu Lys Ile Asp Thr Tyr Leu Asp

85 90 95

Arg Ser Pro Glu Met Leu Ser Phe Val Leu Lys Asn Ser Pro Leu Lys

100 105 110

Leu Cys Trp Val Pro Gly Tyr Ser Asp Tyr Tyr Pro Glu Thr Pro Gly

115 120 125

Gly Lys Ala Thr Gly Arg Leu Val Glu Pro Lys Pro Phe Asn Ala Lys

130 135 140

Lys Leu Gly Pro Asp Glu Lys Gly Leu Glu Pro Pro Tyr Gly Lys Val

145 150 155 160

Pro Leu Asn Met Val Val Leu Gln Gln Asp Tyr Val Arg Leu Asn Gln

165 170 175

Leu Lys Arg His Pro Arg Gly Val Leu Arg Ser Ile Lys Val Gly Val

180 185 190

Arg Ser Val Trp Ala Asn Ala Thr Gly Lys Asn Leu Val Gly Met Gly

195 200 205

Arg Ala Leu Ile Ala Pro Leu Arg Ile Gly Leu Gln Lys Ala Gly Val

210 215 220

Pro Val Leu Leu Asn Thr Ala Leu Thr Asp Leu Tyr Leu Glu Asp Gly

225 230 235 240

Val Val Arg Gly Ile Tyr Val Arg Glu Ala Gly Ala Pro Glu Ser Ala

245 250 255

Glu Pro Lys Leu Ile Arg Ala Arg Lys Gly Val Ile Leu Gly Ser Gly

260 265 270

Gly Phe Glu His Asn Gln Glu Met Arg Thr Lys Tyr Gln Arg Gln Pro

275 280 285

Ile Thr Thr Glu Trp Thr Val Gly Ala Val Ala Asn Thr Gly Asp Gly

290 295 300

Ile Val Ala Ala Glu Lys Leu Gly Ala Ala Leu Glu Leu Met Glu Asp

305 310 315 320

Ala Trp Trp Gly Pro Thr Val Pro Leu Val Gly Ala Pro Trp Phe Ala

325 330 335

Leu Ser Glu Arg Asn Ser Pro Gly Ser Ile Ile Val Asn Met Asn Gly

340 345 350

Lys Arg Phe Met Asn Glu Ser Met Pro Tyr Val Glu Ala Cys His His

355 360 365

Met Tyr Gly Gly Gln Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Pro Gly Glu Asn Val

370 375 380

Pro Ala Trp Met Val Phe Asp Gln Gln Tyr Arg Asp Arg Tyr Ile Phe

385 390 395 400

Ala Gly Leu Gln Pro Gly Gln Arg Ile Pro Lys Lys Trp Met Glu Ser

405 410 415

Gly Val Ile Val Lys Ala Asp Ser Val Ala Glu Leu Ala Glu Lys Thr

420 425 430

Gly Leu Ala Pro Asp Ala Leu Thr Ala Thr Ile Glu Arg Phe Asn Gly

435 440 445

Phe Ala Arg Ser Gly Val Asp Glu Asp Phe His Arg Gly Glu Ser Ala

450 455 460

Tyr Asp Arg Tyr Tyr Gly Asp Pro Thr Asn Lys Pro Asn Pro Asn Leu

465 470 475 480

Gly Glu Ile Lys Asn Gly Pro Phe Tyr Ala Ala Lys Met Val Pro Gly

485 490 495

Asp Leu Gly Thr Lys Gly Gly Ile Arg Thr Asp Val His Gly Arg Ala

500 505 510

Leu Arg Asp Asp Asn Ser Val Ile Glu Gly Leu Tyr Ala Ala Gly Asn

515 520 525

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Ile Gly Pro Ala Met Thr Phe Gly Tyr Leu Ala Ala Leu His Leu Ala

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Gly Lys Ala

<210> 3

<211> 515

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 3

Met Thr Glu Gln Asp Tyr Ser Val Phe Asp Val Val Val Val Gly Ser

1 5 10 15

Gly Ala Ala Gly Met Val Ala Ala Leu Thr Ala Ala His Gln Gly Leu

20 25 30

Ser Thr Val Val Val Glu Lys Ala Pro His Tyr Gly Gly Ser Thr Ala

35 40 45

Arg Ser Gly Gly Gly Val Trp Ile Pro Asn Asn Glu Val Leu Gln Arg

50 55 60

Asp Gly Val Lys Asp Thr Pro Ala Glu Ala Arg Lys Tyr Leu His Ala

65 70 75 80

Ile Ile Gly Asp Val Val Pro Ala Glu Lys Ile Asp Thr Tyr Leu Asp

85 90 95

Arg Ser Pro Glu Met Leu Ser Phe Val Leu Lys Asn Ser Pro Leu Lys

100 105 110

Leu Cys Trp Val Pro Gly Tyr Ser Asp Tyr Tyr Pro Glu Thr Pro Gly

115 120 125

Gly Lys Ala Thr Gly Arg Ser Val Glu Pro Lys Pro Phe Asn Ala Lys

130 135 140

Lys Leu Gly Pro Asp Glu Lys Gly Leu Glu Pro Pro Tyr Gly Lys Val

145 150 155 160

Val Trp Ala Asn Ala Thr Gly Lys Asn Leu Val Gly Met Gly Arg Ala

165 170 175

Leu Ile Ala Pro Leu Arg Ile Gly Leu Gln Lys Ala Gly Val Pro Val

180 185 190

Leu Leu Asn Thr Ala Leu Thr Asp Leu Tyr Leu Glu Asp Gly Val Val

195 200 205

Arg Gly Ile Tyr Val Arg Glu Ala Gly Ala Pro Lys Leu Ile Arg Ala

210 215 220

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225 230 235 240

Met Arg Thr Lys Tyr Gln Arg Gln Pro Ile Thr Thr Glu Trp Thr Val

245 250 255

Gly Ala Val Ala Asn Thr Gly Asp Gly Ile Val Ala Ala Glu Lys Leu

260 265 270

Gly Ala Ala Leu Glu Leu Met Glu Asp Ala Trp Trp Gly Pro Thr Val

275 280 285

Pro Leu Val Gly Ala Pro Trp Phe Ala Leu Ser Glu Gly Ser Ile Ile

290 295 300

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325 330 335

Pro Ala Trp Met Val Phe Asp Gln Gln Tyr Arg Asp Arg Tyr Ile Phe

340 345 350

Ala Gly Leu Gln Pro Gly Gln Arg Ile Pro Lys Lys Trp Met Glu Ser

355 360 365

Gly Val Ile Val Lys Ala Asp Ser Val Ala Glu Leu Ala Glu Lys Thr

370 375 380

Gly Leu Ala Pro Asp Ala Leu Thr Ala Thr Ile Glu Arg Phe Asn Gly

385 390 395 400

Phe Ala Arg Ser Gly Val Asp Glu Asp Phe His Arg Gly Glu Ser Ala

405 410 415

Tyr Asp Arg Tyr Tyr Gly Asp Pro Thr Asn Lys Pro Asn Pro Asn Leu

420 425 430

Gly Glu Ile Lys Asn Gly Pro Phe Tyr Ala Ala Lys Met Val Pro Gly

435 440 445

Asp Leu Gly Thr Lys Gly Gly Ile Arg Thr Asp Val His Gly Arg Ala

450 455 460

Leu Arg Asp Asp Asn Ser Val Ile Glu Gly Leu Tyr Ala Ala Gly Asn

465 470 475 480

Val Ser Ser Pro Val Met Gly His Thr Tyr Pro Gly Pro Gly Gly Thr

485 490 495

Ile Gly Pro Ala Met Thr Phe Gly Tyr Leu Ala Ala Leu His Leu Ala

500 505 510

Gly Lys Ala

515

<210> 4

<211> 1548

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

atgaccgaac aggattactc ggttttcgac gtcgtggtcg tcggatctgg agcggcgggc 60

atggtggcag cgctgacggc tgcgcaccag gggttatcta cagtggtagt cgagaaagca 120

cctcactatg gcggttcgac cgcgcgttca ggtggggggg tatggatacc gaacaacgag 180

gtattacagc gggacggtgt gaaagatacg cctgctgagg cccgtaaata tttgcatgcc 240

atcattggcg atgttgttcc agcagaaaag atagatacgt atctggatcg cagtccagag 300

atgttgtctt ttgtactgaa aaactcgccg ttaaaactgt gctgggtccc cgggtacagt 360

gactattatc ctgaaacacc gggtggtaaa gctactggtc gcagcgtgga gccgaaaccc 420

ttcaatgcca aaaagttagg gccggatgag aaaggcttgg aacctccata cgggaaagtc 480

gtatgggcga atgctactgg caaaaattta gtcggcatgg gccgtgcgtt gattgctcct 540

ttacgtatag ggctgcagaa agcaggagta cccgtccttc ttaacactgc attaacagat 600

ttatatcttg aagacggcgt cgttcgtggc atctatgttc gggaagctgg agcgcctaag 660

ctgatacgtg cgcgcaaggg cgttatcctg ggcagtggcg gtttcgagca caaccaggaa 720

atgcggacca aataccagcg gcaacccatc accacagaat ggacggtcgg cgccgtagct 780

aacacgggag atggtattgt tgccgcggag aagttaggag ctgcgcttga gttgatggaa 840

gatgcgtggt ggggtcccac agtacctctg gtgggcgcac cgtggttcgc tctttctgag 900

ggtagtatca ttgttaatat gaacggaaag agatttatga acgaatctat gccttatagc 960

gaagcatgtc atcacatgta cggtggacag tatggtcagg agaatgttcc cgcttggatg 1020

gtttttgatc agcagtaccg ggaccggtac atatttgctg ggctgcaacc cgggcaacgg 1080

ataccgaaga agtggatgga gagtggggtg atcgtgaagg ccgattccgt tgctgagtta 1140

gccgaaaaga ccggtctggc cccggacgcc ttaacggcca cgatcgaacg cttcaatggt 1200

ttcgcaagaa gcggagtgga cgaggatttt cacagaggcg aatctgctta tgatcgctac 1260

tatggagatc caacgaataa acccaaccct aatctgggcg aaatcaaaaa tggaccattc 1320

tatgcggcta aaatggtgcc aggtgacctt gggaccaagg gcggaattag aacagatgtt 1380

catggaagag cactgcgcga cgacaacagc gtaatcgagg gattatacgc tgcagggaac 1440

gtcagctcac cggtgatggg acacacgtat ccgggaccag gaggcacgat aggacccgca 1500

atgacgtttg gctacttagc cgctctgcac ttagctggca aggcctga 1548

Claims

1.一种制备C1,2-位脱氢甾体化合物的酶，所述酶的氨基酸序列为SEQ ID.3。

2.根据权利要求1所述的酶，其中，所述酶的N端或C端结合有麦芽糖结合蛋白(MBP)。

3.一种表达根据权利要求1所述的酶的基因序列，所述基因序列为SEQ ID.4。

4.一种表达载体，其中，所述表达载体用于表达根据权利要求1或2所述的酶。

5.一种表达***，其中，所述表达***包含根据权利要求3所述的基因序列。

6.根据权利要求1或2所述的酶在制备C1,2-位脱氢甾体化合物中的应用。