CN109312382A

CN109312382A - 一种去氢表雄酮的制备方法及其制备用酶

Info

Publication number: CN109312382A
Application number: CN201880001977.1A
Authority: CN
Inventors: 傅荣昭; 刘立辉; 陈小春; 曹磊; 刘滔滔
Original assignee: BONTAC BIO-ENGINEERING (SHENZHEN) Co Ltd
Current assignee: BONTAC BIO-ENGINEERING (SHENZHEN) Co Ltd
Priority date: 2018-02-08
Filing date: 2018-02-08
Publication date: 2019-02-05
Also published as: WO2019010971A1

Abstract

本发明提供了一种去氢表雄酮的制备方法，包括：在保护气氛下，向叔丁醇中加入叔丁醇钾，搅拌均匀后加入4‑雄烯二酮得到混合料，将所述混合料滴加至含有抗坏血酸钠的乙酸溶液中反应得到5‑雄烯二酮；将所述5‑雄烯二酮溶于有机溶剂中，并添加酮还原酶、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和氧化还原辅酶得到混合液，控制所述混合液的pH为6.0‑6.3，于22‑26℃下搅拌反应1‑6小时后得到反应液，将所述反应液分离提纯后得到去氢表雄酮，所述酮还原酶和所述葡萄糖脱氢酶由微生物菌株共表达产生并以粗酶液形式添加。该制备方法合成工艺步骤少，操作简单，产率高，成本低，可以广泛适用于工业化规模生产。本发明还提供了一种制备用酶。

Description

一种去氢表雄酮的制备方法及其制备用酶

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种去氢表雄酮的制备方法及其制备用酶。

背景技术

去氢表雄酮(脱氢表雄酮)(dehyroepiandrosterone，DHEA)是一种C19类固醇载体化合物，化学名称为3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮，分子式C₁₉H₂₈O₂。DHEA是人血浆中大量共存在的肾上腺甾体化合物，具有抗炎、抗增殖及抗抑郁等活性，其衍生物在实验中能促进动物免疫应答，而且具有很好的神经保护作用。此外，DHEA还是合成甾体药物的重要中间体。近几年来，DHEA凭借其重要研究价值，已逐渐发展成为最具热门的研究对象之一。

传统的DHEA的合成大多采用化学方法，例如以孕甾双烯醇酮或醋酸妊娠双烯醇酮为原料，经过肟化、重排与水解后得到产物。然而所述合成方法分3步以上化学反应完成，原料价格高昂，并且工艺中使用苯、卤代烷或吡啶等溶剂，对环境伤害较大。此外，传统工艺中的产品纯度低、效率低，后期提纯操作繁琐。

因此，开发一种步骤少、成本低、产率高且绿色环保的DHEA合成方法具有重要意义。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种去氢表雄酮的制备方法及其制备用酶，所述去氢表雄酮的制备方法共涉及二步反应，大大缩少了传统方法制备过程中繁多的合成步骤，同时本发明提供的制备用酶使所述去氢表雄酮的合成工艺具备高收率、低成本且绿色环保的特点。

第一方面，本发明提供了一种去氢表雄酮的制备方法，包括：

(1)在保护气氛下，向叔丁醇中加入叔丁醇钾，搅拌均匀后加入4-雄烯二酮得到混合料，将所述混合料滴加至含有抗坏血酸钠的乙酸溶液中反应得到5-雄烯二酮；

(2)将步骤(1)中所述5-雄烯二酮溶于有机溶剂中，并添加酮还原酶、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和氧化还原辅酶得到混合液，控制所述混合液的pH为6.0-6.3，于22-26℃下搅拌反应1-6小时，得到反应液，将所述反应液分离提纯后得到去氢表雄酮，所述酮还原酶和所述葡萄糖脱氢酶由微生物菌株共表达产生并以粗酶液形式添加，所述酮还原酶的来源于领地伯克霍尔德菌属、红球菌属和鞘氨醇单胞菌属中的一种或多种。

本发明中，所述去氢表雄酮的制备方法的具体工艺路线如下所示：

其中，所述工艺中共包括两步反应，第一步为化学法，第二步为生物酶法，所述4-雄烯二酮(4-Androstene-3,17-dione，4-AD)如所式(Ⅰ)所示，所述5-雄烯二酮(5-Androstene-3,17-dione，5-AD)如式(Ⅱ)所示，所述去氢表雄酮如式(Ⅲ)所示。

可选地，所述步骤(1)中，所述保护气氛是指所述充满氮气或惰性气体的环境下。所述惰性气体包括氦(He)、氖(Ne)、氩(Ar)、氪(Kr)和氙(Xe)中的一种或多种。

可选地，所述步骤(1)中，所述混合料的具体制备过程包括：在室温下向叔丁醇中加入叔丁醇钾，然后升温至55-65℃，搅拌0.3-0.8小时至所述叔丁醇钾完全溶解后，将温度维持在25-30℃下，加入4-雄烯二酮搅拌0.3-0.8小时后，冷却得到所述混合料。本发明中，在加入叔丁醇钾后，将温度控制在55-65℃，可以大大缩短叔丁醇钾的溶解时间，可以将传统3小时以上的溶解时间缩短至0.5小时左右；随后将温度维持在25-30℃下，可以促进所述4-雄烯二酮高效地正向反应，若温度过高容易逆反应生成4-雄烯二酮，若温度过低则该反应过程耗时较长，生产效率低。

可选地，所述步骤(1)中，所述将所述混合料滴加至含有抗坏血酸钠的乙酸溶液中反应得到5-雄烯二酮的过程中，反应温度为25-30℃，反应时间为0.3-0.8小时。进一步优选地，所述反应温度可以为26-30℃，反应时间为0.5-0.8小时。例如，所述反应温度为30℃。

可选地，步骤(1)中，所述4-雄烯二酮和所述叔丁醇钾的摩尔比为1:(0.75-1.2)。进一步可选地，所述4-雄烯二酮和所述叔丁醇钾的摩尔比为1:(0.8-1.2)。

可选地，所述步骤(2)中，所述有机溶剂包括疏水性溶剂。进一步可选地，所述有机溶剂包括乙酸乙酯。本发明步骤(2)中优选的乙酸乙酯溶剂可以有效提高所述去氢表雄酮的产量。

可选地，步骤(1)中，所述4-雄烯二酮、所述乙酸和所述抗坏血酸钠的摩尔比为1：(0.5-1)：(0.04-0.4)。进一步可选地，所述4-雄烯二酮、所述乙酸和所述抗坏血酸钠的摩尔比为1：(0.6-1)：(0.05-0.2)。

可选地，所述步骤(2)中，所述酮还原酶、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和氧化还原辅酶为水溶液或缓冲溶液。进一步可选地，所述缓冲溶液包括磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或其他缓冲溶液，所述缓冲溶液的pH为6.0-7.0。例如所述缓冲溶液为磷酸钠缓冲液。可选地，所述缓冲溶液的浓度为50-120mmol/L。进一步可选地，所述缓冲溶液的浓度为60-100mmol/L。优选的，所述缓冲溶液的浓度为80-120mmol/L。例如，所述缓冲溶液的浓度为60mmol/L，或为70mmol/L，或为90mmol/L，或为100mmol/L，或为120mmol/L。

可选地，所述酮还原酶、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和氧化还原辅酶这四种组分的添加形式可以是将酮还原酶、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和氧化还原辅酶这四种混合后同时添加；或单独添加所述酮还原酶、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和氧化还原辅酶，其中，当单独添加时，所述酮还原酶、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和氧化还原辅酶按顺序依次加入且添加顺序不做限定。所述酮还原酶、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和氧化还原辅酶的添加形式还可以为：取所述酮还原酶、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和氧化还原辅酶中的一种或多种，并与所述酮还原酶、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和氧化还原辅酶中剩下的组分混合后进行添加至所述含有5-雄烯二酮的有机溶剂中。例如，所述酮还原酶、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和氧化还原辅酶中的所述酮还原酶和所述葡萄糖脱氢酶先混合在一起，然后在酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的混合组分中再添加剩下的葡萄糖和氧化还原辅酶这两种组分，得到了含有酮还原酶、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和氧化还原辅酶的混合组分，并将其添加至所述含有5-雄烯二酮的有机溶剂中得到混合液。

可选地，所述步骤(2)中，所述葡萄糖的浓度为0.04-0.12mg/mL。进一步可选地，所述葡萄糖的浓度为0.08-0.1mg/mL。例如，所述葡萄糖在所述缓冲溶液中的浓度为0.1mg/mL，或为0.12mg/mL。

可选地，所述步骤(2)中，所述微生物菌株包括Rosetta(DE3)大肠杆菌和BL21(DE3)大肠杆菌中的一种或两种。进一步可选地，所述微生物菌株包括Rosetta(DE3)大肠杆菌。

可选地，所述步骤(2)中，所述微生物菌株共表达产生所述酮还原酶和所述葡萄糖脱氢酶的具体过程包括：构建一重组表达质粒，将所述重组表达质粒转染至所述微生物菌株内后，在微生物培养液中诱导含有所述重组表达质粒的微生物菌株表达所述酮还原酶和所述葡萄糖脱氢酶，其中所述重组表达质粒包括所述酮还原酶和所述葡萄糖脱氢酶的基因编码序列。所述酮还原酶和所述葡萄糖脱氢酶可以在所述微生物菌株的胞内生成，也可以由所述微生物菌株的胞内生成后在释放在所述微生物培养液中。通过对所述能够表达酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的微生物菌株进行收集、清洗、破胞后收集得到所述粗酶液，所述粗酶液中包含有所述酮还原酶和所述葡萄糖脱氢酶。

本发明中，所述酮还原酶和所述葡萄糖脱氢酶是两个独立的蛋白分子，并通过上述共表达的方式得到，这样操作既可以节省生产成本，又能简化实验过程。所述重组表达质粒可以同时含有所述酮还原酶和所述葡萄糖脱氢酶的基因编码序列，并能够同时表达所述酮还原酶和所述葡萄糖脱氢酶两个蛋白分子。本发明中，以粗酶液的形式参与所述步骤(2)中的反应，例如所述粗酶液可以是由大肠杆菌Rosetta(DE3)诱导表达所述酮还原酶和所述葡萄糖脱氢酶后，对所述大肠杆菌Rosetta(DE3)进行离心收集、清洗后，将菌体悬浮于缓冲溶液中并进行超声破胞后，所述酮还原酶和所述葡萄糖脱氢酶被释放至缓冲溶液中，得到所述粗酶液。本发明通过采用共表达形式得到酮还原酶和葡萄糖脱氢酶粗酶液参与DHEA的制备，不仅精简制备工艺，而且还提高产量，节约成本，绿色环保。进一步地，本发明还可以对所述酮还原酶和葡萄糖脱氢酶提纯并参与合成反应。

可选地，所述酮还原酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQID NO：3所示的核苷酸序列中的任意一种。可选地，所述葡萄糖脱氢酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。本发明优选地具有上述包括如SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列中的任意一种的酮还原酶可以在所述微生物菌株中高效表达，所述粗酶液具有较高浓度的所述酮还原酶。

可选地，所述步骤(2)中，所述酮还原酶、所述葡萄糖脱氢酶和所述4-雄烯二酮的摩尔比为(0.015-0.04)：(0.01-0.04)：1。

所述步骤(2)中，所述氧化还原辅酶包括NAD⁺、NADP⁺、NADH和NADPH中的一种或多种。进一步可选地，所述步骤(2)中，所述氧化还原辅酶包括NAD⁺。可选地，所述步骤(2)中，所述氧化还原辅酶的浓度为0.04-0.4mg/mL。进一步可选地，所述氧化还原辅酶的浓度为0.08-0.2mg/mL。例如，所述氧化还原辅酶在所述缓冲溶液中的浓度为0.1mg/mL，或为0.15mg/mL，或为0.2mg/mL。

其中，所述NAD⁺为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adeninedinucleotide，NAD⁺)，也称为氧化型辅酶Ⅰ；所述NADH为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原态，也称为还原型辅酶Ⅰ；所述NADP⁺为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adeninedinucleotide phosphate，NADP⁺)，也称为氧化型辅酶Ⅱ；所述NADPH为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的还原态，也称为还原型辅酶Ⅱ。在存在氧气(O₂)的条件下，所述氧化还原辅酶，葡萄糖脱氢酶以及葡萄糖之间形成一个辅酶再生体系，该体系是一电子循环体系，在酮还原酶作用下，可以有效使5-雄烯二酮还原生成去氢表雄酮，提高去氢表雄酮的产量。本发明体系中，可以仅仅使用所述NAD⁺、NADP⁺、NADH和NADPH中的NAD⁺就能具有实现循环，且所述去氢表雄酮的具有很高产率。

可选地，所述步骤(2)中分离提纯的过程包括依次进行的过滤、清洗和萃取过程。进一步可选地，所述步骤(2)之后还包括对所述去氢表雄酮进行重结晶。

可选地，所述步骤(2)中分离提纯的具体过程包括：将所述反应液加至硅藻土中过滤得到滤液和滤饼，将滤饼用乙酸乙酯洗涤后得到洗涤液，收集并混合所述洗涤液和所述滤液，得到水相和有机相，对所述水相用乙酸乙酯萃取两或三次后得到萃取液，将所述萃取液与所述有机相混合并经浓缩、过滤、清洗、洗涤干燥后得到去氢表雄酮。

本方面第一方面所提供的去氢表雄酮的制备方法，所述制备方法工艺简单，省时高效、成本低廉、绿色环保，该制备方法可适用于大规模工业化生产；由所述制备方法制得的去氢表雄酮具有极高的产率。

第二方面，本发明提供了一种酮还原酶，所述酮还原酶包括酮还原酶KRED3(简写成KRED3)、酮还原酶KRED4(简写成KRED4)和酮还原酶KRED5(简写成KRED5)中的一种或多种，所述酮还原酶KRED3的基因编码序列包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述酮还原酶KRED4的基因编码序列包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述酮还原酶KRED5的基因编码序列包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

可选地，所述KRED3的基因编码序列还包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列至少95％同源性的核苷酸序列，所述KRED4的基因编码序列还包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列至少95％同源性的核苷酸序列，所述KRED5的基因编码序列还包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列至少95％同源性的核苷酸序列。

其中，所述KRED3的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，所述KRED4的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，所述KRED5的氨基酸序列包括如SEQID NO：7所示的氨基酸序列。可选地，所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

可选地，本发明所述酮还原酶KRED3的基因来源于领地伯克霍尔德菌(Burkholderia territorii)，所述酮还原酶KRED4的基因来源于红球菌属(Rhodococcus)，所述酮还原酶KRED5的基因来源于鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)。所述葡萄糖脱氢酶的基因来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。本发明优选地酮还原酶具有很强的化学选择性和区域选择性，在一定条件下，可以高效地将所述5-雄烯二酮转化为所述去氢表雄酮。

可选地，所述酮还原酶KRED3、KRED4和KRED5中的任意一个蛋白酶的基因片段上还包括His标签。进一步可选地，所述酮还原酶KRED3、KRED4和KRED5中的任意一个蛋白酶的基因片段上还包括8×His标签。所述葡萄糖脱氢酶的基因片段上还包括6×His标签。随着所述His标签的His数目的增加，所述蛋白的结合效率，纯化收率增加；本发明可以通过对所述所述酮还原酶和所述葡萄糖脱氢酶上连接不同His个数的His标签来分别提纯。

本发明第二方面提供的酮还原酶KRED3、KRED4和KRED5为本发明第一方面所述去氢表雄酮的制备方法的制备用酶之一，在所述基因片段的上增设His标签(组氨酸标签)的核苷酸序列，能使表达后的蛋白带上His标签，His标签有利于表达后蛋白的分离纯化，及在实验中的分析和追踪，比如用于免疫印迹实验时的分析。

第三方面，本方面还提供了一种酮还原酶在催化酮或醛转化为手性醇中的应用，所述酮还原酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列中的任意一种。即本发明所述酮还原酶可以高效、有选择性地将醛或酮上的羰基催化还原为手性羟基。

可选地，所述催化酮或醛转化为手性醇中的应用包括催化5-雄烯二酮转化为去氢表雄酮中的应用。本发明优选地酮还原酶具有很强的化学选择性和区域选择性，在一定条件下，可以高效地、有选择性地将所述5-雄烯二酮转化为所述去氢表雄酮。

第四方面，本方面还提供了一种重组质粒，所述重组质粒包括酮还原酶的基因编码序列，所述酮还原酶的基因编码序列包括KRED3的基因编码序列、KRED4的基因编码序列和KRED5的基因编码序列中的一种或多种，所述KRED3的基因编码序列包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述KRED4的基因编码序列包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述KRED5的基因编码序列包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

可选地，所述重组质粒还包括葡萄糖脱氢酶的基因编码序列，所述葡萄糖脱氢酶的基因编码序列与所酮还原酶的基因编码序列之间还***有RBS序列，所述葡萄糖脱氢酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，所述RBS序列包括如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列。可选地，所述重组质粒包括从5’端到3’端顺次连接的酮还原酶的基因编码序列、RBS序列和葡萄糖脱氢酶的基因编码序列。本发明所述RBS序列为核糖体结合位点(ribosome binding site，RBS)序列，可以有效促进两个同源基因(酮还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因)进行独立的转录及翻译。

本发明第四方面所述重组质粒可用于共表达酮还原酶和葡萄糖脱氢酶，该酮还原酶和葡萄糖脱氢酶具有很好的活性，可广泛应用于生物制药、蛋白生产等领域。

第五方面，本发明还提供了一种重组质粒的制备方法，包括：

(1)提供或制备包含酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的基因模板；

(2)制备所述酮还原酶和所述葡萄糖脱氢酶的基因的上游引物和下游引物，扩增所述酮还原酶和所述葡萄糖脱氢酶的基因片段，所述酮还原酶的基因编码序列包括如SEQID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列中的任意一种，所述葡萄糖脱氢酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；

(3)取pET22b(+)载体质粒，将步骤(2)扩增得到的所述酮还原酶和所述葡萄糖脱氢酶基因片段***至所述pET22b(+)载体质粒，纯化回收后进行连接，得到所述重组质粒。

可选地，所述酮还原酶的基因***到pET22b(+)载体质粒中Nde I和EcoR I酶切位点之间。所述酮还原酶的基因***到pET22b(+)载体质粒时，所述酮还原酶的基因编码序列的3’端可加入终止密码子(如TAA)与pET22b(+)载体质粒中EcoRⅠ酶切位点相连。

所述葡萄糖脱氢酶的基因***到pET22b(+)载体质粒中EcoR I和Xho I酶切位点之间。所述葡萄糖脱氢酶的基因***到pET22b(+)载体质粒时，所述葡萄糖脱氢酶的基因编码序列的3’端可加入终止密码子(如TAA)与pET22b(+)载体质粒中Xho I酶切位点相连。

可选地，在所述酮还原酶和所述葡萄糖脱氢酶基因编码序列之间***RBS序列，所述RBS序列包括如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列可选地，所述酮还原酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列中的任意一种，所述葡萄糖脱氢酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。所述酮还原酶和所述葡萄糖脱氢酶基因编码序列在所述pET22b(+)载体质粒的先后顺序可以是所述酮还原酶基因的3’端位于所述葡萄糖脱氢酶基因的5’端之前，或所述酮还原酶基因的5’端位于所述葡萄糖脱氢酶基因的3’端之后。

进一步可选地，所述RBS序列***至所述葡萄糖脱氢酶基因序列的5’端前。所述RBS序列的3’端与所述葡萄糖脱氢酶基因序列的5’端之间还可以设置一段linker，便于所述葡萄糖脱氢酶的翻译识别，有利于酮还原酶和葡萄糖脱氢酶能够在同一载体中分别进行翻译表达。优选地，所述linker的序列可以为“ATATACAT”。

可选地，所述步骤(3)中，所示pET22b(+)载体质粒采用的酶切位点包括Nde I内切酶和Xho I内切酶。

本发明中，所述制备方法可以制备仅含有酮还原酶或葡萄糖脱氢酶的重组质粒，也可以制备同时含有酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的重组质粒。可选地，将所述重组质粒转染至微生物菌株中诱导表达可以获得本发明所述酮还原酶和葡萄糖脱氢酶中的一种或两种。

本发明的有益效果包括以下几个方面：

1、本发明所述去氢表雄酮的制备方法，共包括两步反应，以4-雄烯二酮为初始原料，并采用酮还原酶等生物酶，生产成本低廉，工艺简单，省时高效，反应条件温和，大大提高了产品的收率；

2、本发明所述去氢表雄酮的制备方法，绿色环保，从根源上避免了环境污染问题，进一步降低成本，可以广泛适用于工业化规模生产；

3、由本发明所述的方法制备的去氢表雄酮，纯度高，可在制药领域或生物医学领域中有广泛的应用。

附图说明

图1为本发明一实施例提供的pET22b-KRED3-GDH重组质粒的质粒图谱；

图2为本发明一实施例提供的pET22b-KRED4-GDH重组质粒的质粒图谱；

图3为本发明一实施例提供的pET22b-KRED5-GDH重组质粒的质粒图谱；

图4为本发明一实施例提供的KRED3-GDH粗酶液的凝胶电泳图；

图5为本发明一实施例提供的KRED4-GDH粗酶液的凝胶电泳图；

图6为本发明一实施例提供的KRED5-GDH粗酶液的凝胶电泳图；

图7为本发明一实施例提供的4-雄烯二酮的高效液相色谱图；

图8为本发明一实施例提供的5-雄烯二酮的高效液相色谱图；

图9为本发明一实施例提供的去氢表雄酮标准品的高效液相色谱图；

图10为本发明一实施例提供的去氢表雄酮粗产品的高效液相色谱图。

具体实施方式

以下所述是本发明实施例的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。

若无特别说明，本发明实施例所采用的原料及其它化学试剂皆为市售商品。

本发明实施例提供了一种酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的制备方法，所述酮还原酶和葡萄糖脱氢酶为所述去氢表雄酮的制备方法中的制备用酶，具体的实验步骤包括：

(1)构建pET22b-KRED3/4/5-GDH重组质粒

提供上游引物和下游引物，采用PCR扩增实验得到酮还原酶KRED3、酮还原酶KRED4、酮还原酶KRED5和葡萄糖脱氢酶的基因编码序列。其中，所述酮还原酶KRED3的基因编码序列如SEQ ID NO:1所示，所述酮还原酶KRED4的基因编码序列如SEQ ID NO:2所示，所述酮还原酶KRED5的基因编码序列如SEQ ID NO:3所示，所述葡萄糖脱氢酶的基因编码序列如SEQ ID NO:4所示。所述酮还原酶KRED3对应的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:9所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:10所示。所述酮还原酶KRED3的基因对应的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:9所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:10所示。所述酮还原酶KRED4的基因对应的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:11所示，下游引物的碱基序列如SEQID NO:12所示。所述酮还原酶KRED5的基因对应的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:13所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:14所示。所述葡萄糖脱氢酶的基因对应的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:15所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:16所示。在所述葡萄糖脱氢酶的基因的5’端前***RBS序列，并可通过上下游引物进行将其与***至质粒pET22b(+)中，所述RBS序列如SEQ ID NO:17所示。

通过对应的上游引物和下游引物分别进行PCR扩增体系，配置扩增体系如下：

PCR扩增程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s；60℃退火30s；72℃延伸1min；30个循环后，72℃延伸10min。PCR产物经胶回收试剂盒纯化后，分别利用限制性内切酶Nde I和EcoR I、EcoR I和Xho I进行酶切，酶切后用T4连接酶连接已用Nde I和Xho I酶切处理的质粒pET22b(+)。连接产物转入大肠杆菌DH5α，经过氨苄抗性(Amp⁺)的筛选后挑取菌落送测序，测序成功后即得到酮还原酶和葡萄糖脱氢酶共表达的重组质粒pET22b-KRED3/4/5-GDH(包括pET22b-KRED3-GDH、pET22b-KRED4-GDH或pET22b-KRED5-GDH)。所述重组质粒pET22b-KRED3-GDH的质粒图谱如图1所示；所述重组质粒pET22b-KRED4-GDH的质粒图谱如图2所示；所述重组质粒pET22b-KRED5-GDH的质粒图谱如图3所示。本实施方式中所述DNA模板分别为质粒pET22b-KRED3、pET22b-KRED4、pET22b-KRED5和pET22b-GDH。

(2)表达酮还原酶和葡萄糖脱氢酶

将构建的重组质粒pET22b-KRED3-GDH、pET22b-KRED4-GDH和pET22b-KRED5-GDH中的一种或多种转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中，得到能够表达酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌Rosetta(DE3)。将含有重组质粒pET22b-KRED3-GDH、pET22b-KRED4-GDH或pET22b-KRED5-GDH的大肠杆菌以1％的接种量接种至含有10mL的LB培养基(100μg/mL氨苄青霉素(Amp))的50mL三角瓶中，维持恒定的37℃，200rpm的摇晃速率，过夜培养后，将菌液以1％的接种量转接到含有1L的LB培养基(100μg/mL Amp)的2L三角瓶中，继续37℃恒温培养至培养基中的OD600值达到0.6左右，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导剂(体系终浓度0.5mM)，在37℃条件培养8小时后离心收集菌体。将菌体分别用4倍质量的100mM的磷酸钾缓冲液(pH＝6.5)进行重悬并超声破碎20min，得到KRED3-GDH粗酶液、KRED4-GDH粗酶液或KRED5-GDH粗酶液。所述KRED3-GDH粗酶液中含有酮还原酶KRED3和葡萄糖脱氢酶。所述KRED4-GDH粗酶液中含有酮还原酶KRED4和葡萄糖脱氢酶。所述KRED5-GDH粗酶液中含有酮还原酶KRED5和葡萄糖脱氢酶。

将表达获得的KRED3-GDH粗酶液、KRED4-GDH粗酶液或KRED5-GDH粗酶液分别进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定。图4为所述KRED3-GDH粗酶液的凝胶电泳图，其中泳道M为蛋白Marker(Thermo Scientific PageRuler)，泳道1为菌体破胞后总蛋白，泳道2为菌体破胞后上清液，其中KRED3的分子量约为28kDa，GDH的分子量为26kDa。图5为所述KRED4-GDH粗酶液的凝胶电泳图，其中泳道M为蛋白Marker(Thermo ScientificPageRuler)，泳道1为菌体破胞后上清液，泳道2为菌体破胞后总蛋白，其中KRED4的分子量为29kDa，GDH的分子量为26kDa。图6为所述KRED5-GDH粗酶液的凝胶电泳图，其中泳道M为蛋白Marker(Thermo Scientific PageRuler)，泳道1为菌体破胞后上清液，泳道2为菌体破胞后总蛋白，其中KRED5的分子量为28kDa，GDH的分子量为26kDa。所述酮还原酶KRED3、KRED4和KRED5，以及GDH的分子均于相应蛋白的理论计算值相近。

实施例一

一种去氢表雄酮的制备方法，包括以下步骤：

(1)在氮气保护下，在388mL的叔丁醇中加入82.5g叔丁醇钾，然后升温到60℃，搅拌0.5h至叔丁醇钾完全溶解，降温至30℃，持续氮气保护中加入100g的4-AD，持续搅拌0.5h后，冷却至室温得到混合料。在氮气保护下，在205.3g的26.8％的乙酸水溶液中，加入6.0g抗坏血酸钠，得到含有抗坏血酸钠的乙酸溶液。在氮气保护下，30℃下，将所述混合料在30min内缓慢滴加到含有抗坏血酸钠的乙酸溶液中，维持在温度30℃下续搅拌0.5h，室温冷却，得到含有5-AD的反应液。

(2)将500mL乙酸乙酯加入所述5-AD的反应液中，搅拌均匀，加入400mL1.8g/LKRED3和GDH的粗酶液，300mL 100mmol/L磷酸钠缓冲液(pH6.5)，100g葡萄糖，200mg NAD⁺，于25℃搅拌至完全溶解，加入含有5-AD的反应液，控制pH为6.3，温度26℃，以200rpm的速率搅拌3h，得到酶反应液；将酶反应液加入至硅藻土中搅拌、过滤后收集滤饼，并用乙酸乙酯对滤饼洗涤两次，并将洗涤液和滤液混合，分开水相和有机相，水相用乙酸乙酯萃取两次，萃取液与有机相混合，将有机相减压浓缩后，加入600g水并充分搅拌后过滤，滤饼用120g水洗涤两次，将洗涤后的滤饼真空干燥得DHEA粗产品。将DHEA粗产品转入至干净的容器中，加入234g丙酮溶解后再加200g水，重复上述操作进行重结晶，得到78.02g DHEA最终产物，本实施例中，DHEA的收率为78.02％。

分别对两步反应进行取样检测，检测条件：费罗门Phenyl-Hexyl 250×4.6mm色谱柱，波长UV210nm，流动相为50％乙腈水溶液，流速1.0mL/min，温度25℃。其中，从4-AD的液相色谱图(见图7)和5-AD合成过程中的液相色谱图(见图8)对比发现，4-AD可以高效地转化生产5-AD；将DHEA粗产品的液相色谱图(见图10)与DHEA标准品液相色谱图(见图9)进行比对，粗产品中含有纯度较高的DHEA。

实施例二

一种去氢表雄酮的制备方法，包括以下步骤：

(1)在氮气保护下，在388mL的叔丁醇中加入80.0g叔丁醇钾，然后升温到55℃，搅拌0.8h至叔丁醇钾完全溶解，降温至30℃，持续氮气保护中加入100g的4-AD，持续搅拌0.6h后，冷却至室温得到混合料。在氮气保护下，在200.0g的26.8％的乙酸水溶液中，加入6.0g抗坏血酸钠，得到含有抗坏血酸钠的乙酸溶液。在氮气保护下，30℃下，将所述混合料在30min内缓慢滴加到含有抗坏血酸钠的乙酸溶液中，维持在温度30℃下续搅拌0.5h，室温冷却，得到含有5-AD的反应液。

(2)将500mL乙酸乙酯加入所述5-AD的反应液中，搅拌均匀，加入400mL1.5g/LKRED4和GDH的粗酶液，300mL 80mmol/L磷酸钠缓冲液(pH6.0)，100g葡萄糖，200mg NAD⁺，于25℃搅拌至完全溶解，加入含有5-AD的反应液，控制pH为6.1，温度22℃，以180rpm的速率搅拌5h，得到酶反应液；将酶反应液加入至硅藻土中搅拌、过滤后收集滤饼，并用乙酸乙酯对滤饼洗涤两次，并将洗涤液和滤液混合，分开水相和有机相，水相用乙酸乙酯萃取两次，萃取液与有机相混合，将有机相减压浓缩后，加入600g水并充分搅拌后过滤，滤饼用120g水洗涤两次，将洗涤后的滤饼真空干燥得DHEA粗产品。将DHEA粗产品转入至干净的容器中，加入234g丙酮溶解后再加200g水，重复上述操作进行重结晶，得到75.16g DHEA最终产物，本实施例中，DHEA的收率为75.16％。

实施例三

一种去氢表雄酮的制备方法，包括以下步骤：

(1)在氮气保护下，在400mL的叔丁醇中加入90.0g叔丁醇钾，然后升温到65℃，搅拌0.3h至叔丁醇钾完全溶解，降温至30℃，持续氮气保护中加入100g的4-AD，持续搅拌0.5h后，冷却至室温得到混合料。在氮气保护下，在230g的25％的乙酸水溶液中，加入6.5g抗坏血酸钠，得到含有抗坏血酸钠的乙酸溶液。在氮气保护下，30℃下，将所述混合料在30min内缓慢滴加到含有抗坏血酸钠的乙酸溶液中，维持在温度28℃下续搅拌0.5h，室温冷却，得到含有5-AD的反应液。

(2)将500mL乙酸乙酯加入所述5-AD的反应液中，搅拌均匀，加入400mL2.0g/LKRED5和GDH的粗酶液，300mL 100mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7.0)，100g葡萄糖，180mg NADH，于25℃搅拌至完全溶解，加入含有5-AD的反应液，控制pH为6.2，温度26℃，以220rpm的速率搅拌2h，得到酶反应液；将酶反应液加入至硅藻土中搅拌、过滤后收集滤饼，并用乙酸乙酯对滤饼洗涤两次，并将洗涤液和滤液混合，分开水相和有机相，水相用乙酸乙酯萃取两次，萃取液与有机相混合，将有机相减压浓缩后，加入600g水并充分搅拌后过滤，滤饼用120g水洗涤两次，将洗涤后的滤饼真空干燥得DHEA粗产品。将DHEA粗产品转入至干净的容器中，加入250g丙酮溶解后再加200g水，重复上述操作进行重结晶，得到77.53g DHEA最终产物，本实施例中，DHEA的收率为77.53％。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 邦泰生物工程（深圳）有限公司

<120> 一种去氢表雄酮的制备方法及其制备用酶

<150> PCT/CN2018/075822

<151> 2018-02-08

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 774

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggccgtc tggaaggtaa agttgcaatt gtgaccggtg gtgcacgcgg catgggcgca 60

gcaacctgcc gtctgtttgt ggaagaaggt gcacgcgttg tgattggtga cgtgctggat 120

gcagaaggcg aagcactggc ccgtgaactg ggcgatgccg cacgttttat gcgtctggat 180

gttagtgatg aagcaaattg ggcccgcgtt gccgatgcca ccgttgaaca gtttggccgt 240

attgatgttc tggtgaataa tgccgccgtg ctgacctttg gtgcaattac cgaactgagc 300

aaacgtgatt ttgaacgcgc cgttagtatt aatctggtgg gcacctttgt gggtattcgt 360

accattgcac cgcgcatgat tgcacagaaa cgtggcagca ttgtgaatat tagcagcgtt 420

gatggtctgc gcggtgtgaa tgcactggcc gcctatgtga gcagcaaatg gggtgttcgc 480

ggtctgacca aagttgcagc actggaactg ggtcatcagg gtgttcgtgt taatagcatt 540

catccgggtg gtgtgaatac cgccatgagc aatccgaccg gcgcaccgct ggatgaagtg 600

aataagcatt atacccgcgt gccgctgcag cgcgttggct taccggatga aattgcacgt 660

gcaaccctgt ttctggcaag tgatgaagcg agctattgta atggcgcaga actgagcgtt 720

gatggcggta tggcagcagg tgcatattat ccgggtctgc cgggtgcacc gttt 774

<210> 2

<211> 789

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcacgtc tggaaggtaa agtggcaatt gttaccggcg ccgcccaggg tatgggtgca 60

gctaccgcac gtctgtttgt gcatgaaggc gcccgtgtgg ttctgggtga cgttctggaa 120

gaaaaaggcc gtgccctggc cgccgaactg ggcgacgcag caatttttac cccgctggat 180

gttagtgatg aaagcagctg ggaaagtgca gtggccgtgg ccgttgatcg ttttggtggt 240

ctggatattc tggtgaataa tgcaggtgtt atgcattggg ccccgattga agatctggat 300

gtggcccgca ccgaacgtct gctggatatt aatgttctgg gcaatctgct gggcgccaaa 360

gccgtggttc cgaccatgaa aaaagccggt cgtggtgtga ttgttaatat tagtagtgtg 420

gatggcctgc gcggcgttaa tggtctggca gcctataccg caagtaaatg ggcagtgcgc 480

ggtctgacca aagcactggc atacgaactg ggtccggcag gtattcgcgt gtgtagtgtt 540

catccgggcg gcgttgatac caccctgggt aatccgggtg gcctggtggg cgatgatctg 600

cagagtaaat atgtgggtgt tccgctgcag cgcattggtg aaagtgaaga tattgcccgc 660

gccaccctgt ttgttgccag tgatgaagca agttatatta gcggcgccga actggcagtg 720

gatggcggtt ggagcgccgg tacctattat ccgggtctgc cgggtacccc gccggcatta 780

atgccgaat 789

<210> 3

<211> 786

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgggccgtc tggatggtaa agttgcaatt gtgaccggtg gcgcccaggg tatgggtgca 60

gcaaccgcac gcctgtttgc cgccgaaggt gcccgtgttg ttattggtga cgttattgaa 120

gataaaggcg ccgaagttgc aaccgaaatt ggtgacaatg cccgttttag tcgtctggat 180

gttcgcagcg aagatgattg ggccgccgca gttagcgcag ccgtggaagc ctttggtacc 240

attgatattc tggttaataa cgcagccgtt gttcatttta ccccgattga aatgctggat 300

gcaagtgaag cagaacgtgt gctggcaatt aatgttctgg gcgcaatgct gggcgccaaa 360

catgtgaccc cggttatgac ccgcgccggc catggcgtta ttgttaatat tagcagcgtg 420

gatggcctgc gcggctgtaa tggtctgagt gtttataccg ccagtaaatg ggccgtgcgt 480

ggcctgagca aaacccaggc catggaactg ggtccgcgtg gtattcgcgt gtgtagtatt 540

catccgggcg gtgttaatac ccagatgggt aatccgatgg gtatgaccgg tgacgccctg 600

aataaggatt ataaacgtgt tccgctgcag cgcattggtg aaccggaaga aattgcccgt 660

gcaaccctgt ttattgcaag tgatgaagcc agttatatta gtggtgccga actggccgtt 720

gatggcggct ggagcgccgg ttattatcag ccggtgctgc cgggtgcccc ggaaggttta 780

ggtgca 786

<210> 4

<211> 783

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgtatacag atttaaaaga taaagtagta gttgtaacag gcggatcaaa aggattgggt 60

cgcgcaatgg ccgttcgttt tggtcaagag cagtcaaaag tggttgtaaa ctaccgcagc 120

aatgaagaag aagcgctaga agtaaaaaaa gaaattgaac aagctggcgg ccaagcaatt 180

attgttcgag gcgacgtaac aaaagaggaa gacgttgtga atcttgtaga gacagctgtt 240

aaagagtttg gcacattaga cgttatgatt aacaatgctg gtgttgaaaa cccggttcct 300

tcacatgaat tatcgttaga aaactggaat caagtaatcg atacaaactt aacaggcgcg 360

tttttaggaa gccgcgaagc gattaaatat tttgttgaaa atgatattaa aggaaacgtt 420

attaacatgt ccagcgttca cgagatgatt ccttggccac tatttgttca ctatgcagca 480

agtaaaggcg gtatgaaact aatgacagaa acattggctc ttgaatatgc gccaaaaggt 540

atccgcgtaa ataacattgg accaggcgcg atcgatacgc caatcaacgc tgaaaaattc 600

gcagatccgg aacagcgtgc agacgtagaa agcatgattc caatgggcta catcggcaac 660

ccggaagaaa ttgcatcagt tgcagcattc ttagcatcgt cacaagcaag ctacgtaaca 720

ggtattacac tatttgctga tggcggtatg acaaaatatc cttctttcca aacgggaaga 780

ggc 783

<210> 5

<211> 258

<212> PRT

<213> 领地伯克霍尔德菌(Burkholderia territorii)

<400> 5

Met Gly Arg Leu Glu Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Ala Arg

1 5 10 15

Gly Met Gly Ala Ala Thr Cys Arg Leu Phe Val Glu Glu Gly Ala Arg

20 25 30

Val Val Ile Gly Asp Val Leu Asp Ala Glu Gly Glu Ala Leu Ala Arg

35 40 45

Glu Leu Gly Asp Ala Ala Arg Phe Met Arg Leu Asp Val Ser Asp Glu

50 55 60

Ala Asn Trp Ala Arg Val Ala Asp Ala Thr Val Glu Gln Phe Gly Arg

65 70 75 80

Ile Asp Val Leu Val Asn Asn Ala Ala Val Leu Thr Phe Gly Ala Ile

85 90 95

Thr Glu Leu Ser Lys Arg Asp Phe Glu Arg Ala Val Ser Ile Asn Leu

100 105 110

Val Gly Thr Phe Val Gly Ile Arg Thr Ile Ala Pro Arg Met Ile Ala

115 120 125

Gln Lys Arg Gly Ser Ile Val Asn Ile Ser Ser Val Asp Gly Leu Arg

130 135 140

Gly Val Asn Ala Leu Ala Ala Tyr Val Ser Ser Lys Trp Gly Val Arg

145 150 155 160

Gly Leu Thr Lys Val Ala Ala Leu Glu Leu Gly His Gln Gly Val Arg

165 170 175

Val Asn Ser Ile His Pro Gly Gly Val Asn Thr Ala Met Ser Asn Pro

180 185 190

Thr Gly Ala Pro Leu Asp Glu Val Asn Lys His Tyr Thr Arg Val Pro

195 200 205

Leu Gln Arg Val Gly Leu Pro Asp Glu Ile Ala Arg Ala Thr Leu Phe

210 215 220

Leu Ala Ser Asp Glu Ala Ser Tyr Cys Asn Gly Ala Glu Leu Ser Val

225 230 235 240

Asp Gly Gly Met Ala Ala Gly Ala Tyr Tyr Pro Gly Leu Pro Gly Ala

245 250 255

Pro Phe

<210> 6

<211> 263

<212> PRT

<213> 红球菌属(Rhodococcus)

<400> 6

Met Ala Arg Leu Glu Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Ala Ala Gln

1 5 10 15

Gly Met Gly Ala Ala Thr Ala Arg Leu Phe Val His Glu Gly Ala Arg

20 25 30

Val Val Leu Gly Asp Val Leu Glu Glu Lys Gly Arg Ala Leu Ala Ala

35 40 45

Glu Leu Gly Asp Ala Ala Ile Phe Thr Pro Leu Asp Val Ser Asp Glu

50 55 60

Ser Ser Trp Glu Ser Ala Val Ala Val Ala Val Asp Arg Phe Gly Gly

65 70 75 80

Leu Asp Ile Leu Val Asn Asn Ala Gly Val Met His Trp Ala Pro Ile

85 90 95

Glu Asp Leu Asp Val Ala Arg Thr Glu Arg Leu Leu Asp Ile Asn Val

100 105 110

Leu Gly Asn Leu Leu Gly Ala Lys Ala Val Val Pro Thr Met Lys Lys

115 120 125

Ala Gly Arg Gly Val Ile Val Asn Ile Ser Ser Val Asp Gly Leu Arg

130 135 140

Gly Val Asn Gly Leu Ala Ala Tyr Thr Ala Ser Lys Trp Ala Val Arg

145 150 155 160

Gly Leu Thr Lys Ala Leu Ala Tyr Glu Leu Gly Pro Ala Gly Ile Arg

165 170 175

Val Cys Ser Val His Pro Gly Gly Val Asp Thr Thr Leu Gly Asn Pro

180 185 190

Gly Gly Leu Val Gly Asp Asp Leu Gln Ser Lys Tyr Val Gly Val Pro

195 200 205

Leu Gln Arg Ile Gly Glu Ser Glu Asp Ile Ala Arg Ala Thr Leu Phe

210 215 220

Val Ala Ser Asp Glu Ala Ser Tyr Ile Ser Gly Ala Glu Leu Ala Val

225 230 235 240

Asp Gly Gly Trp Ser Ala Gly Thr Tyr Tyr Pro Gly Leu Pro Gly Thr

245 250 255

Pro Pro Ala Leu Met Pro Asn

260

<210> 7

<211> 262

<212> PRT

<213> 鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)

<400> 7

Met Gly Arg Leu Asp Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Ala Gln

1 5 10 15

Gly Met Gly Ala Ala Thr Ala Arg Leu Phe Ala Ala Glu Gly Ala Arg

20 25 30

Val Val Ile Gly Asp Val Ile Glu Asp Lys Gly Ala Glu Val Ala Thr

35 40 45

Glu Ile Gly Asp Asn Ala Arg Phe Ser Arg Leu Asp Val Arg Ser Glu

50 55 60

Asp Asp Trp Ala Ala Ala Val Ser Ala Ala Val Glu Ala Phe Gly Thr

65 70 75 80

Ile Asp Ile Leu Val Asn Asn Ala Ala Val Val His Phe Thr Pro Ile

85 90 95

Glu Met Leu Asp Ala Ser Glu Ala Glu Arg Val Leu Ala Ile Asn Val

100 105 110

Leu Gly Ala Met Leu Gly Ala Lys His Val Thr Pro Val Met Thr Arg

115 120 125

Ala Gly His Gly Val Ile Val Asn Ile Ser Ser Val Asp Gly Leu Arg

130 135 140

Gly Cys Asn Gly Leu Ser Val Tyr Thr Ala Ser Lys Trp Ala Val Arg

145 150 155 160

Gly Leu Ser Lys Thr Gln Ala Met Glu Leu Gly Pro Arg Gly Ile Arg

165 170 175

Val Cys Ser Ile His Pro Gly Gly Val Asn Thr Gln Met Gly Asn Pro

180 185 190

Met Gly Met Thr Gly Asp Ala Leu Asn Lys Asp Tyr Lys Arg Val Pro

195 200 205

Leu Gln Arg Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile Ala Arg Ala Thr Leu Phe

210 215 220

Ile Ala Ser Asp Glu Ala Ser Tyr Ile Ser Gly Ala Glu Leu Ala Val

225 230 235 240

Asp Gly Gly Trp Ser Ala Gly Tyr Tyr Gln Pro Val Leu Pro Gly Ala

245 250 255

Pro Glu Gly Leu Gly Ala

260

<210> 8

<211> 261

<212> PRT

<213> 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)

<400> 8

Met Tyr Thr Asp Leu Lys Asp Lys Val Val Val Val Thr Gly Gly Ser

1 5 10 15

Lys Gly Leu Gly Arg Ala Met Ala Val Arg Phe Gly Gln Glu Gln Ser

20 25 30

Lys Val Val Val Asn Tyr Arg Ser Asn Glu Glu Glu Ala Leu Glu Val

35 40 45

Lys Lys Glu Ile Glu Gln Ala Gly Gly Gln Ala Ile Ile Val Arg Gly

50 55 60

Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Val Asn Leu Val Glu Thr Ala Val

65 70 75 80

Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Val Met Ile Asn Asn Ala Gly Val Glu

85 90 95

Asn Pro Val Pro Ser His Glu Leu Ser Leu Glu Asn Trp Asn Gln Val

100 105 110

Ile Asp Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile

115 120 125

Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile Asn Met Ser

130 135 140

Ser Val His Glu Met Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala

145 150 155 160

Ser Lys Gly Gly Met Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu Tyr

165 170 175

Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asp

180 185 190

Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Glu Gln Arg Ala Asp

195 200 205

Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Asn Pro Glu Glu Ile

210 215 220

Ala Ser Val Ala Ala Phe Leu Ala Ser Ser Gln Ala Ser Tyr Val Thr

225 230 235 240

Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Lys Tyr Pro Ser Phe

245 250 255

Gln Thr Gly Arg Gly

260

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgccatatga tgggccgtct ggaaggt 27

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccggaattct taatgatgat ggtgatgat 29

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgccatatga tggcacgtct ggaaggt 27

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccggaattct taatgatgat ggtgatgat 29

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgccatatga tgggccgtct ggatggt 27

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ccggaattct taatgatgat ggtgatgat 29

<210> 15

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ccggaattca aggagatata catatgatgt atacagattt aaaag 45

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ccgctcgagt tagcctcttc ccgtttgg 28

<210> 17

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aaggag 6

Claims

1.一种去氢表雄酮的制备方法，其特征在于，包括：

2.如权利要求1所述的去氢表雄酮的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述混合料的具体制备过程包括：在室温下向叔丁醇中加入叔丁醇钾，然后升温至55-65℃，搅拌0.3-0.8小时至所述叔丁醇钾完全溶解后，将温度维持在25-30℃下，加入4-雄烯二酮搅拌0.3-0.8小时后，冷却得到所述混合料。

3.如权利要求1所述的去氢表雄酮的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述将所述混合料滴加至含有抗坏血酸钠的乙酸溶液中反应得到5-雄烯二酮的过程中，反应温度为25-30℃，反应时间为0.3-0.8小时。

4.如权利要求1所述的去氢表雄酮的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述微生物菌株包括Rosetta大肠杆菌和BL21大肠杆菌中的一种或两种。

5.如权利要求1所述的去氢表雄酮的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述微生物菌株共表达产生所述酮还原酶和所述葡萄糖脱氢酶的具体过程包括：构建一重组表达质粒，将所述重组表达质粒转染至所述微生物菌株内后，在微生物培养液中诱导含有所述重组表达质粒的微生物菌株表达所述酮还原酶和所述葡萄糖脱氢酶，其中所述重组表达质粒包括所述酮还原酶和所述葡萄糖脱氢酶的基因编码序列。

6.如权利要求1或5所述的去氢表雄酮的制备方法，其特征在于，所述酮还原酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列中的任意一种；所述葡萄糖脱氢酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

7.如权利要求1所述的去氢表雄酮的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述氧化还原辅酶包括NAD⁺、NADP⁺、NADH和NADPH中的一种或多种。

8.一种酮还原酶，其特征在于，所述酮还原酶包括酮还原酶KRED3、酮还原酶KRED4和酮还原酶KRED5中的一种或多种，所述酮还原酶KRED3的基因编码序列包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述酮还原酶KRED4的基因编码序列包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述酮还原酶KRED5的基因编码序列包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

9.一种酮还原酶在催化酮或醛转化为手性醇中的应用，其特征在于，所述酮还原酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列中的任意一种。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述催化酮或醛转化为手性醇中的应用包括催化5-雄烯二酮转化为去氢表雄酮中的应用。

11.一种重组质粒，其中，所述重组质粒包括酮还原酶的基因编码序列，所述酮还原酶的基因编码序列包括酮还原酶KRED3的基因编码序列、酮还原酶KRED4的基因编码序列和酮还原酶KRED5的基因编码序列中的一种或多种，所述酮还原酶KRED3的基因编码序列包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述酮还原酶KRED4的基因编码序列包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述酮还原酶KRED5的基因编码序列包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

12.如权利要求11所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒还包括葡萄糖脱氢酶的基因编码序列，所述葡萄糖脱氢酶的基因编码序列与所酮还原酶的基因编码序列之间还***有RBS序列，所述葡萄糖脱氢酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，所述RBS序列包括如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列。

13.一种重组质粒的制备方法，其特征在于，包括：

(1)提供或制备包含酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的基因模板；

(2)制备所述酮还原酶和所述葡萄糖脱氢酶的基因的上游引物和下游引物，扩增所述酮还原酶和所述葡萄糖脱氢酶的基因片段，所述酮还原酶的基因编码序列包括如SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列中的任意一种，所述葡萄糖脱氢酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；

14.如权利要求13所述的重组质粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，在所述酮还原酶和所述葡萄糖脱氢酶基因编码序列之间***RBS序列，所述RBS序列包括如SEQ IDNO：17所示的核苷酸序列。