CN116536279B - 一种基因工程菌及在制备去氢表雄酮上的应用 - Google Patents

一种基因工程菌及在制备去氢表雄酮上的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116536279B
CN116536279B CN202210103791.5A CN202210103791A CN116536279B CN 116536279 B CN116536279 B CN 116536279B CN 202210103791 A CN202210103791 A CN 202210103791A CN 116536279 B CN116536279 B CN 116536279B
Authority
CN
China
Prior art keywords
genetically engineered
dehydroepiandrosterone
ala
gly
val
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210103791.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116536279A (zh
Inventor
杜美妮
王梦瑶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Xinhai Enzyme Source Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Hangzhou Xinhai Enzyme Source Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hangzhou Xinhai Enzyme Source Biotechnology Co ltd filed Critical Hangzhou Xinhai Enzyme Source Biotechnology Co ltd
Priority to CN202210103791.5A priority Critical patent/CN116536279B/zh
Publication of CN116536279A publication Critical patent/CN116536279A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116536279B publication Critical patent/CN116536279B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/06—Hydroxylating
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01047—Glucose 1-dehydrogenase (1.1.1.47)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/584—Recycling of catalysts

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及去氢表雄酮的制备技术领域，公开了一种基因工程菌和使用该基因工程菌制备去氢表雄酮的方法。该基因工程菌为将含有SW基因片段的第一质粒、含有相连接的HY基因片段和GDH基因片段的第二质粒转入到宿主菌株中，并可表达SW基因、HY基因和GDH基因的重组菌，可同时表达酮还原酶（SW）、水解酶（HY）、葡萄糖脱氢酶（GDH），利用全细胞催化方法实现去氢表雄酮的高效合成。该方法在常温常压下通过一步反应便可获得去氢表雄酮，避免了中间水解产物的累积，同时利用体系自身实现NADH/NAD+的循环再生。该方法底物的底物浓度可达20～300 g/L，转化率为99%以上，产率95%以上，光学纯度大于99%，具有很好的应用开发前景。

Description

一种基因工程菌及在制备去氢表雄酮上的应用
技术领域
本发明涉及去氢表雄酮的制备技术领域，具体涉及一种基因工程菌和使用该基因工程菌制备去氢表雄酮的方法。
背景技术
去氢表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)是哺乳动物中一种重要的内源性类固醇激素，用于治疗女性和男性的各种功能障碍，以及类固醇药物合成的中间体。目前合成DHEA的方法主要有化学法、发酵法以及化学-酶法。
传统的化学合成法多从4-雄烯-3-17-二酮(4-Androsten-4-ol-3,17-dione，4-AD)及其衍生物出发，经乙酰化、缩酮保护、还原、水解反应等步骤合成去氢表雄酮，不仅步骤繁琐、收率低，且环境污染严重。如中国专利CN107698643A的专利文献报道的化学法合成路线如下：此方法以4-AD为底物，通过乙酰化、缩酮、还原“一锅法”反应和水解反应制备去氢表雄酮，最终以88％左右的收率得到目标产物，产品中异构体占1～3％。精制收率为78％左右，纯度大于99％，可以看出为去除异构体的精制过程造成收率降低10％左右。另外，该工艺路线需用到大量的醋酐、二氯甲烷等有毒试剂，产生大量有毒废水，且使用到许多昂贵的催化剂如硼氢化镁、硼氢化钙等，工业化生产成本高。
直接利用微生物发酵转化制备去氢表雄酮的方法虽反应条件温和，对环境友好，但往往发酵反应周期长，底物投料量低且分离纯化困难，难以实现工业化生产。如中国专利CN110656146A的专利文献报道的发酵法的生物转化步骤如下：从植物甾醇出发，经3位羟基保护反应、分枝杆菌(Mycobacterium sp.)B-NRRL 3683生长细胞生物转化、水解、精制等步骤制备去氢表雄酮。该路线反应周期太长(10天左右)、底物投料量低(10g/L左右)且分离纯化步骤繁琐、收率低，生产成本高。
新兴的化学-酶法以4-AD为底物，经化学法异构生成5-AD，再利用酶将3位羰基不对称还原来两步法制备去氢表雄酮，此方法在制备5-AD时需用到大量的叔丁醇钾且杂质难除，酶法制备去氢表雄酮时还需添加昂贵的辅酶NAD和NADP，最终收率不高。如中国专利专利CN106086148A报道了化学-酶法合成法，路线如下：以4-AD为底物出发，依次经过化学方法的双键移位生成5-AD和生物方法的羰基还原制备去氢表雄酮，该方法在制备5-AD时反应条件苛刻，需氮气保护，且用到大量的叔丁醇和叔丁醇钾，5-AD的收率和纯度影响最终去氢表雄酮的纯度和收率。
因此开发合适的去氢表雄酮的制备方法，满足操作简洁、成本低并适合工业化生产的需求是去氢表雄酮制备技术发展的重要内容。
发明内容
针对现有去氢表雄酮的制备方法存在的不足，本发明的目的在于提供一种重组的基因工程菌，可同时表达特定基因，能够在在常温常压下通过一步反应便可获得去氢表雄酮。
本发明提供如下的技术方案：
一种酮还原酶SW，所述酮还原酶SW的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
该酮还原酶SW可以将5-雄烯二酮(5-AD)的3位的酮官能团还原成醇，得到去氢表雄酮，其人工氨基酸序列SEQ ID NO.1如下：
一种编码上述酮还原酶SW的SW基因片段，所述SW基因片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。其人工核苷酸序列SEQ ID NO.4如下：
一种含有上述SW基因片段的基因工程菌，所述基因工程菌为将含有SW基因片段的第一质粒、含有相连接的HY基因片段和GDH基因片段的第二质粒转入到宿主菌株中，并可表达SW基因、HY基因和GDH基因的重组菌株；
HY基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
GDH基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
上述SW基因片段可用于编码酮还原酶SW，HY基因片段可用于编码水解酶HY，GDH基因片段可用于编码葡萄糖脱氢酶GDH，使得重组的基因工程菌株可同时表达酮还原酶(SW)、水解酶(HY)、葡萄糖脱氢酶(GDH)，利用全细胞催化方法实现去氢表雄酮的高效合成，其中各基因片段的核苷酸序列和对应所编码的酶的氨基酸序列如下所示。
水解酶HY的人工氨基酸序列SEQ ID NO.2如下所示：
编码水解酶HY的HY基因片段的人工核苷酸序列SEQ ID NO.5如下所示：
葡萄糖脱氢酶GDH的人工氨基酸序列SEQ ID NO.3如下所示：
编码葡萄糖脱氢酶GDH的人工核苷酸序列SEQ ID NO.6如下所示：
作为本发明的优选，所述第一质粒为pET28a-SW。
作为本发明的优选，所述第二质粒为pETDuet-HY-GDH。
作为本发明的优选，宿主菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。
一种使用上述基因工程菌制备去氢表雄酮的方法，包括以下步骤：
将基因工程菌在培养基中扩大培养，结束后分离、收集湿菌体；
然后以雄烯二酮衍生物Ⅰ为底物与菌体、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、葡萄糖和有机溶剂在水中混合，调节pH值范围为5.5～8，搅拌反应，结束后分离、纯化得到去氢表雄酮；
其中雄烯二酮衍生物Ⅰ的结构式如下：
上述制备方法中发生的反应过程如下：
作为本发明的优选，基因工程菌的扩大培养过程如下：
(1-1)将基因工程菌接种至含50μg/ml卡那霉素、100μg/ml氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养8～10h，再以2％接种量(v/v)接种至含50μg/mL卡那霉素、100μg/mL氨苄霉素的种子培养基中，37℃，200rpm培养获得种子液；
(1-2)将种子液以体积浓度10％的接种量接种至装有发酵培养基的发酵罐中，37℃发酵培养14h后，将已灭菌的终浓度为0.6mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷添加到发酵罐中诱导培养；待培养至OD600达到70～100时放罐、离心分离收集湿菌体；
其中，所述种子培养基和发酵培养基的组成为：蛋白胨15g/L，酵母粉12g/L，NaCl10g/L，甘油15g/L，(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 1.36g/L，K2HPO4·3H2O 2.28g/L，MgSO4·7H2O0.375g/L，溶剂为去离子水。
作为本发明的优选，
底物初始浓度为20～300g/L；
湿菌体的含水量75～80wt％，以湿重计添加量为30～150g/L；
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为0.3～0.5g/L；
葡萄糖的摩尔当量为底物当量的1.0～2.0倍；
反应温度为20～40℃。
作为本发明的优选，步骤(2)中的有机溶剂为甲苯、乙酸乙酯和叔丁醇中的一种或多种；
当有机溶剂为甲苯时，加入的甲苯的体积浓度为3～15％；
当有机溶剂为乙酸乙酯时，加入的乙酸乙酯的体积浓度为10％～30％；
当有机溶剂为叔丁醇时，加入的叔丁醇的体积浓度为10％～30％。
本发明的有益效果如下：
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：在基因工程菌中同时表达酮还原酶(SW)、水解酶(HY)、葡萄糖脱氢酶(GDH)，利用全细胞催化方法实现去氢表雄酮的高效合成。该方法在常温常压下通过一步反应便可获得去氢表雄酮，避免了中间水解产物的累积，同时利用体系自身实现NADH/NAD+的循环再生。该方法的底物浓度可达20～300g/L，转化率为99％以上，产率95％以上，光学纯度大于99％，具有很好的应用开发前景。
附图说明
图1是实施例2的反应液的HPLC图谱。
图2是实施例4的反应液的HPLC图谱。
图3是实施例5的反应液的HPLC图谱。
具体实施方式
下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。
如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。
一种酮还原酶SW，该酮还原酶SW的人工氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
编码该酮还原酶SW的SW基因片段的人工核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
一种基因工程菌，为将含有SW基因片段的第一质粒、含有相连接的HY基因片段和GDH基因片段的第二质粒转入到宿主菌株中，并可表达SW基因、HY基因和GDH基因的重组菌株；pETDuet-HY-GDH/pET28a-SW/BL21(DE3)。
该基因工程菌的制备过程如下：
(a)根据人工核苷酸序列SEQ ID NO.5基因合成HY基因片段，基因两端引入酶切位点NdeI和XhoI，连入pETDuet载体，获得质粒pETDuet-HY；
(b)根据人工核苷酸序列SEQ ID NO.6基因合成GDH基因片段，基因两端引入酶切位点BamHI和NotI，连入质粒pETDuet-HY，获得质粒pETDuet-HY-GDH；然后将质粒pETDuet-HY-GDH转入大肠杆菌BL21(DE3)获得基因工程菌株pETDuet-HY-GDH/BL21(DE3)；
(c)根据人工核苷酸序列SEQ ID NO.4基因合成SW基因片段，基因两端引入酶切位点NdeI和XhoI，连入pET28a载体，获得质粒pET28a-SW；
(d)将质粒pET28a-SW转入大肠杆菌pETDuet-HY-GDH/BL21(DE3)获得双质粒基因工程菌株pETDuet-HY-GDH/pET28a-SW/BL21(DE3)。
实施例1基因工程菌的发酵罐扩大培养
将上述基因工程菌pETDuet-HY-GDH/pET28a-SW/BL21(DE3)接种至50μg/mL卡那霉素、100μg/mL氨苄霉素的LB培养基中，37℃，200rpm培养过夜，再以2％接种量(v/v)接种至含50μg/mL卡那霉素、100μg/mL氨苄霉素的种子培养基中，37℃，200rpm培养，在对数中期时以10％接种量(v/v)接种至含4L发酵培养基的7L发酵罐中，37℃培养14h，加入已灭菌的终浓度为0.6mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导培养20h后放罐，利用蝶式离心机4000rpm离心收集菌体备用，湿菌体含水率为80wt％。
上述种子培养基和发酵培养基终浓度组成为：蛋白胨15g/L，酵母粉12g/L，NaCl10g/L，甘油15g/L，(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 1.36g/L，K2HPO4·3H2O 2.28g/L，MgSO4·7H2O0.375g/L，溶剂为去离子水。
实施例2(制备去氢表雄酮，有机溶剂为甲苯)
反应体系(1L)：将120g实施例1中收集的湿菌体细胞，247g葡萄糖，0.5g烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、100ml甲苯和640mL水以及底物雄性二酮衍生物I混合，底物浓度为300g/L，于30℃、200rpm条件下反应，反应过程中氨水自动调控pH值至6.5，反应8h结束，取样进行HPLC检测，结果如图1所示。从图1中可以看出底物转化率高，去氢表雄酮的产率高，纯度高，经计算，底物转化率为99％，ee值高达99％。反应结束后，旋蒸除去所有甲苯，离心，添加等体积的酸乙酯溶解产物，离心，取有机层，加水结晶即得到去氢表雄酮粗品。粗品用活性炭吸附除蛋白和重结晶来进一步提纯，真空干燥得到纯品约245g，收率93％，产物的HPLC纯度>99％，单杂小于0.5％。
实施例3(制备去氢表雄酮，有机溶剂为甲苯)
反应体系(100mL)：将12g实施例1中收集的湿菌体细胞，6g葡萄糖，0.03g烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、10ml甲苯和64mL水以及底物雄性二酮衍生物I混合，底物浓度为60g/L，于30℃、200rpm条件下反应，反应过程中氨水自动调控pH值至6.5，反应8h，取样进行HPLC检测，转化率为99％，ee值高达99％；反应结束后，旋蒸除去所有乙酸乙酯，离心，添加等体积的丙酮溶解产物，离心，取有机层，加水结晶即得到去氢表雄酮粗品，粗品用活性炭吸附除蛋白和重结晶来进一步提纯、真空干燥得到纯品约4.8g，收率91％，HPLC纯度>99％，单杂小于0.5％。
实施例4(制备去氢表雄酮，有机溶剂为乙酸乙酯)
反应体系(100mL)：将12g实施例1中收集的湿菌体细胞，6g葡萄糖，0.03g烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、20ml乙酸乙酯和64mL水以及底物雄性二酮衍生物I混合，底物浓度为20g/L，于30℃、200rpm条件下反应，反应过程中氨水自动调控pH值至6.5，反应8h，取样进行HPLC检测，结果如图2所示，其中近4.1min处的峰为杂质峰，底物转化率为99％，ee值高达99％；反应结束后，旋蒸除去所有乙酸乙酯，离心，添加等体积的丙酮溶解产物，离心，取有机层，加水结晶即得到去氢表雄酮粗品，粗品用活性炭吸附除蛋白和重结晶来进一步提纯、真空干燥得到纯品约1.53g，收率83％，HPLC纯度>99％，单杂小于0.5％。
实施例5(制备去氢表雄酮，有机溶剂为叔丁醇)
反应体系(100mL)：将12g实施例1中收集的湿菌体细胞，6g葡萄糖，0.03g烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、20ml叔丁醇和64mL水以及底物雄性二酮衍生物I混合，底物浓度为20g/L，于30℃、200rpm条件下反应，反应过程中氨水自动调控pH值至6.5，反应20h，取样进行HPLC检测，结果如图3所示，其中近4.1min和13.8min处的峰为杂质峰，底物转化率为78％，ee值99％。
对比例1(制备去氢表雄酮，不添加有机溶剂)
反应体系(100ml)：12g实施例1中收集的湿菌体细胞、6g葡萄糖、0.03g烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、100mL水，底物浓度为20g/L，于30℃、200rpm条件下反应，反应过程中用氨水自动调控pH值至6.5，反应20h，取样检测，转化率为8％，ee值99％。
从上述实验结果可以看出，采用甲苯和乙酸乙酯相对叔丁醇具有更高的底物转化率，且杂质含量低，其中甲苯在底物浓度相近时，较乙酸乙酯有更高的产物产率。而不添加上述有机溶剂时，底物转化率低。
序列表
<110> 杭州馨海酶源生物科技有限公司
<120> 一种基因工程菌及在制备去氢表雄酮上的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 258
<212> PRT
<213> 酮还原酶(SW)
<400> 1
Met Gly Arg Leu Glu Gly Lys Thr Ala Ile Val Thr Gly Gly Ala Gln
1 5 10 15
Gly Met Gly Ala Ala Thr Val Arg Val Met Val Glu Glu Gly Ala Lys
20 25 30
Val Val Ile Ala Asp Leu Ala Glu Gln Ala Gly Lys Ser Leu Ala Ala
35 40 45
Glu Leu Gly Asp Ala Ala Ser Phe Cys Arg Leu Asp Val Ser Asn Glu
50 55 60
Ser Asp Trp Gln Lys Val Leu Ala His Thr Leu Glu Val His Gly Thr
65 70 75 80
Val Asn Val Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Gln Tyr Phe Val Gly Val
85 90 95
Glu Asp Ile Glu Ala Glu Arg Val Met Arg Leu Phe Ser Ile Asn Val
100 105 110
Leu Gly Ser Met Leu Gly Val Lys Thr Val Ala Pro Ile Met Lys Lys
115 120 125
Ala Gly Ala Gly Val Val Ile Asn Ile Ser Ser Leu Asp Gly Phe Arg
130 135 140
Gly Thr Asn Gly Met Ser Pro Tyr Val Ala Ser Lys Trp Ala Val Arg
145 150 155 160
Gly Leu Thr Lys Ala Gln Ala Leu Glu Leu Gly Pro Val Ile Arg Val
165 170 175
Val Ser Val His Pro Gly Gly Val Asn Thr Pro Met Gly Asn Pro Thr
180 185 190
Gly Asp Thr Gly Glu Ala Leu Asn Ala Pro Tyr Gly Arg Val Pro Leu
195 200 205
Arg Arg Ile Gly Glu Pro Ile Glu Val Ala Arg Val Thr Ala Phe Met
210 215 220
Ala Ser Asp Glu Ala Ser Tyr Val Ser Gly Ser Glu Leu Ala Val Asp
225 230 235 240
Gly Gly Trp Thr Ala Gly His Tyr His Val Gly Leu Pro Gly Gly Pro
245 250 255
Glu Ala
<210> 2
<211> 342
<212> PRT
<213> 水解酶(HY)
<400> 2
Met Lys Leu Leu Ser Leu Thr Gly Val Ala Gly Val Leu Ala Thr Cys
1 5 10 15
Val Ala Ala Thr Pro Leu Val Lys Arg Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro
20 25 30
Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln
35 40 45
Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly
50 55 60
Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu
65 70 75 80
Ser Thr Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe
85 90 95
Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile
100 105 110
Thr Ala Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr
115 120 125
Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro
130 135 140
Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr
145 150 155 160
Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala
165 170 175
Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu
180 185 190
Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr
195 200 205
Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu
210 215 220
Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys Asn Val Gln Ala Gln Ala Val
225 230 235 240
Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln
245 250 255
Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln
260 265 270
Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala
275 280 285
Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala
290 295 300
Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro
305 310 315 320
Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys
325 330 335
Ser Gly Ile Val Thr Pro
340
<210> 3
<211> 261
<212> PRT
<213> 葡萄糖脱氢酶(GDH)
<400> 3
Met Tyr Thr Asp Leu Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr Gly Ala Ser
1 5 10 15
Ser Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Gln Glu Gln Ala
20 25 30
Lys Val Val Val Asn Tyr Tyr Ser Asn Glu Lys Asp Ala Gln Thr Val
35 40 45
Lys Glu Glu Ile Gln Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val Ile Val Gln Gly
50 55 60
Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile Val Gln Thr Ala Val
65 70 75 80
Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Val Met Ile Asn Asn Ala Gly Met Glu
85 90 95
Asn Pro Val Gln Ser His Glu Met Pro Leu Lys Asp Trp Asn Lys Val
100 105 110
Ile Asn Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile
115 120 125
Lys Tyr Tyr Val Glu Asn Asp Ile Gln Gly Asn Val Ile Asn Met Ser
130 135 140
Ser Val His Glu Met Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala
145 150 155 160
Ser Lys Gly Gly Ile Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu Tyr
165 170 175
Ala Pro Lys Arg Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn
180 185 190
Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Val Gln Lys Lys Asp
195 200 205
Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile
210 215 220
Ala Ala Val Ala Val Trp Leu Ala Ser Lys Glu Ser Ser Tyr Val Thr
225 230 235 240
Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Lys Tyr Pro Ser Phe
245 250 255
Gln Ala Gly Arg Gly
260
<210> 4
<211> 774
<212> DNA
<213> 编码基因(SW)
<400> 4
atgggtcgtc tggaaggtaa aaccgctatc gttaccggtg gtgctcaggg tatgggtgct 60
gctaccgttc gtgttatggt tgaagaaggt gctaaagttg ttatcgctga cctggctgaa 120
caggctggta aatctctggc tgctgaactg ggtgacgctg cttctttctg ccgtctggac 180
gtttctaacg aatctgactg gcagaaagtt ctggctcaca ccctggaagt tcacggtacc 240
gttaacgttc tggttaacaa cgctggtatc cagtacttcg ttggtgttga agacatcgaa 300
gctgaacgtg ttatgcgtct gttctctatc aacgttctgg gttctatgct gggtgttaaa 360
accgttgctc cgatcatgaa aaaagctggt gctggtgttg ttatcaacat ctcttctctg 420
gacggtttcc gtggtaccaa cggtatgtct ccgtacgttg cttctaaatg ggctgttcgt 480
ggtctgacca aagctcaggc tctggaactg ggtccggtta tccgtgttgt ttctgttcac 540
ccgggtggtg ttaacacccc gatgggtaac ccgaccggtg acaccggtga agctctgaac 600
gctccgtacg gtcgtgttcc gctgcgtcgt atcggtgaac cgatcgaagt tgctcgtgtt 660
accgctttca tggcttctga cgaagcttct tacgtttctg gttctgaact ggctgttgac 720
ggtggttgga ccgctggtca ctaccacgtt ggtctgccgg gtggtccgga agct 774
<210> 5
<211> 1029
<212> DNA
<213> 编码基因(HY)
<400> 5
atgaagctac tctctctgac cggtgtggct ggtgtgcttg cgacttgcgt tgcagccact 60
cctttggtga agcgtctacc ttccggttcg gaccctgcct tttcgcagcc caagtcggtg 120
ctcgatgcgg gtctgacctg ccagggtgct tcgccatcct cggtctccaa acccatcctt 180
ctcgtccccg gaaccggcac cacaggtcca cagtcgttcg actcgaactg gatccccctc 240
tcaacgcagt tgggttacac accctgctgg atctcacccc cgccgttcat gctcaacgac 300
acccaggtca acacggagta catggtcaac gccatcaccg cgctctacgc tggttcgggc 360
aacaacaagc ttcccgtgct tacctggtcc cagggtggtc tggttgcaca gtggggtctg 420
accttcttcc ccagtatcag gtccaaggtc gatcgactta tggcctttgc gcccgactac 480
aagggcaccg tcctcgccgg ccctctcgat gcactcgcgg ttagtgcacc ctccgtatgg 540
cagcaaacca ccggttcggc actcaccacc gcactccgaa acgcaggtgg tctgacccag 600
atcgtgccca ccaccaacct ctactcggcg accgacgaga tcgttcagcc tcaggtgtcc 660
aactcgccac tcgactcatc ctacctcttc aacggaaaga acgtccaggc acaggccgtg 720
tgtgggccgc tgttcgtcat cgaccatgca ggctcgctca cctcgcagtt ctcctacgtc 780
gtcggtcgat ccgccctgcg ctccaccacg ggccaggctc gtagtgcaga ctatggcatt 840
acggactgca accctcttcc cgccaatgat ctgactcccg agcaaaaggt cgccgcggct 900
gcgctcctgg cgccggcagc tgcagccatc gtggcgggtc caaagcagaa ctgcgagccc 960
gacctcatgc cctacgcccg cccctttgca gtaggcaaaa ggacctgctc cggcatcgtc1020
accccctga 1029
<210> 6
<211> 786
<212> DNA
<213> 编码基因(GDH)
<400> 6
atgtacacgg atttaaaagg aaaagtcgtt gccattacgg gagcttcatc aggattagga 60
aaagcgatgg cgatccgctt cggacaggag caggcgaaag tcgtggttaa ctactatagt 120
aatgaaaaag acgcccaaac cgttaaagaa gagattcaaa aagcgggagg cgaagctgtc 180
atcgttcaag gagacgtcac aaaagaagaa gatgtcaaaa acatcgtgca gaccgcagtg 240
aaggaattcg gcacattgga tgtcatgatc aataacgccg gcatggaaaa tccggttcag 300
tcgcatgaaa tgccgcttaa agactggaac aaagttatca ataccaatct gaccggcgct 360
ttcttaggaa gccgcgaagc cataaaatat tacgtagaga atgatattca aggaaacgtc 420
attaacatgt caagcgtaca tgaaatgatt ccgtggccgc tgtttgtcca ctacgcggcg 480
agtaaaggcg gcatcaaatt gatgacggaa acgctggcgc ttgagtacgc gccgaagcgc 540
atccgtgtta acaatatcgg accgggcgcc atcaatacgc cgatcaacgc ggaaaaattt 600
gccgatcccg ttcagaaaaa agatgtggaa agcatgattc cgatgggata tatcggtgag 660
ccggaagaaa tcgcggctgt cgccgtctgg cttgcttcaa aggaatcaag ctatgtgacc 720
gggattacgc tgtttgctga cgggggaatg accaaatatc cgtctttcca ggcaggccgc 780
ggataa 786

Claims (6)

1. 一种含有编码酮还原酶SW的SW基因片段的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为将含有SW基因片段的第一质粒、含有相连接的HY基因片段和GDH基因片段的第二质粒转入到宿主菌株中，并可表达SW基因、HY基因和GDH基因的重组菌株；
所述SW基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示
所述HY基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述GDH基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述第一质粒为pET28a-SW；
所述第二质粒为pETDuet-HY-GDH。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，宿主菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。
3.一种使用如权利要求1至2任一所述的基因工程菌制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将基因工程菌在培养基中扩大培养，结束后分离、收集湿菌体；
然后以雄烯二酮衍生物Ⅰ为底物与菌体、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、葡萄糖和有机溶剂在水中混合，调节pH值范围为5.5～8，搅拌反应，结束后分离、纯化得到去氢表雄酮；
其中雄烯二酮衍生物Ⅰ的结构式如下：
式I 。
4.根据权利要求3所述的使用基因工程菌制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，基因工程菌的扩大培养过程如下：
（1-1）将基因工程菌接种至含50 μg/ml卡那霉素、100 μg/ml氨苄霉素的LB液体培养基中，37 ℃震荡培养8~10 h，再以2%体积比接种量接种至含50 μg/mL卡那霉素、100 μg/mL氨苄霉素的种子培养基中，37 ℃，200 rpm培养获得种子液；
（1-2）将种子液以体积浓度10%的接种量接种至装有发酵培养基的发酵罐中，37 ℃发酵培养14 h后，将已灭菌的终浓度为0.6 mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷添加到发酵罐中诱导培养；待培养至OD600达到70～100时放罐、离心分离收集湿菌体；
所述种子培养基和发酵培养基的组成为：蛋白胨 15 g/L，酵母粉 12 g/L，NaCl 10 g/L，甘油 15 g/L，(NH4)2SO4 5 g/L，KH2PO4 1.36 g/L，K2HPO4·3H2O 2.28 g/L，MgSO4·7H2O0.375 g/L，溶剂为去离子水。
5.根据权利要求3所述的使用基因工程菌制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，
底物初始浓度为20～300 g/L；
湿菌体含水率为75～80wt%，湿菌体投放量以湿重计为30～150 g/L；
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为0.3～0.5 g/L；
葡萄糖的摩尔当量为底物当量的1.0～2.0倍；
反应温度为20～40 ℃。
6.根据权利要求3所述的使用基因工程菌制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，
所述有机溶剂为甲苯、乙酸乙酯和叔丁醇中的一种或多种；
当有机溶剂为甲苯时，加入的甲苯的体积浓度为3～15%；
当有机溶剂为乙酸乙酯时，加入的乙酸乙酯的体积浓度为10%～30%；
当有机溶剂为叔丁醇时，加入的叔丁醇的体积浓度为10%～30%。
CN202210103791.5A 2022-01-25 2022-01-25 一种基因工程菌及在制备去氢表雄酮上的应用 Active CN116536279B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210103791.5A CN116536279B (zh) 2022-01-25 2022-01-25 一种基因工程菌及在制备去氢表雄酮上的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210103791.5A CN116536279B (zh) 2022-01-25 2022-01-25 一种基因工程菌及在制备去氢表雄酮上的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116536279A CN116536279A (zh) 2023-08-04
CN116536279B true CN116536279B (zh) 2023-11-14

Family

ID=87444108

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210103791.5A Active CN116536279B (zh) 2022-01-25 2022-01-25 一种基因工程菌及在制备去氢表雄酮上的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116536279B (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108410831A (zh) * 2018-03-22 2018-08-17 浙江工业大学 酮酸还原酶、基因、工程菌及在合成手性芳香2-羟酸中的应用
CN109312382A (zh) * 2018-02-08 2019-02-05 邦泰生物工程(深圳)有限公司 一种去氢表雄酮的制备方法及其制备用酶
CN109750051A (zh) * 2017-11-01 2019-05-14 中国科学院天津工业生物技术研究所 3β-羟基甾体脱氢酶制备脱氢表雄酮（DHEA）
CN113493814A (zh) * 2020-04-01 2021-10-12 湖南引航生物科技有限公司 一种去氢表雄酮生物合成方法
CN113528606A (zh) * 2021-07-22 2021-10-22 湖州颐盛生物科技有限公司 一种酶催化制备17β-羟基类固醇的方法
CN113817693A (zh) * 2021-09-24 2021-12-21 杭州馨海酶源生物科技有限公司 一种短链羰基还原酶PpYSDR突变体、编码基因、重组表达载体、基因工程菌及应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1334113A4 (en) * 2000-10-20 2007-08-08 Expression Diagnostics Inc EVALUATION OF LEUCOCYTAIRE EXPRESSION LEVEL
JP2004529630A (ja) * 2001-03-01 2004-09-30 エピゲノミクス アーゲー 診断および治療目的の遺伝子パネルを遺伝子の発現およびメチル化状態に基づいて開発する方法
TW201343623A (zh) * 2012-02-07 2013-11-01 Annikki Gmbh 使氧化還原輔因子經酶催化再生之方法
US11932878B2 (en) * 2016-07-07 2024-03-19 University Of Florida Research Foundation, Inc. Metabolically competent cells, methods of making, and uses thereof
CN111575326A (zh) * 2020-05-14 2020-08-25 复旦大学 一种酶催化的（1s,5r）-双环内酯的合成方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109750051A (zh) * 2017-11-01 2019-05-14 中国科学院天津工业生物技术研究所 3β-羟基甾体脱氢酶制备脱氢表雄酮（DHEA）
CN109312382A (zh) * 2018-02-08 2019-02-05 邦泰生物工程(深圳)有限公司 一种去氢表雄酮的制备方法及其制备用酶
CN108410831A (zh) * 2018-03-22 2018-08-17 浙江工业大学 酮酸还原酶、基因、工程菌及在合成手性芳香2-羟酸中的应用
CN113493814A (zh) * 2020-04-01 2021-10-12 湖南引航生物科技有限公司 一种去氢表雄酮生物合成方法
CN113528606A (zh) * 2021-07-22 2021-10-22 湖州颐盛生物科技有限公司 一种酶催化制备17β-羟基类固醇的方法
CN113817693A (zh) * 2021-09-24 2021-12-21 杭州馨海酶源生物科技有限公司 一种短链羰基还原酶PpYSDR突变体、编码基因、重组表达载体、基因工程菌及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Intracrinology-Revisited and Prostate Cancer;Trevor M. Penning et al.;《J Steroid Biochem Mol Biol.》;第196卷;1-28 *
新型去氢表雄酮C3酯类衍生物的合成及体外抗肿瘤活性评价;刘荣春等;《合成化学》;第29卷(第5期);375-384 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN116536279A (zh) 2023-08-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102652526B1 (ko) 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법 및 그 응용
CN113528472B (zh) 一种细胞色素p450 bm3突变体及其在醋酸群勃龙合成中的应用
CN113337450B (zh) 一种大肠杆菌基因工程菌、构建方法以及全细胞催化生产(r)-香茅醛的方法
CN110564788A (zh) 一种利用亚胺还原酶生产麻黄碱的方法
CN110628841A (zh) 酶催化不对称合成右美沙芬关键中间体的新方法
CN111471736B (zh) 制备c1,2-位脱氢甾体化合物的方法
CN116536279B (zh) 一种基因工程菌及在制备去氢表雄酮上的应用
CN116814572A (zh) 一种羰基还原酶及其突变体及其在制备手性(r)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯中的应用
WO2019123166A1 (en) Nucleotide sequences encoding 3-quinuclidinone reductase and glucose dehydrogenase and soluble expression thereof
CN111254181B (zh) 一种化学酶法制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的方法
CN111254180B (zh) 一种酶法拆分制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的方法
CN111254170B (zh) 一种多酶耦合制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的方法
CN113930457A (zh) 一种双酶偶联合成(s)-香茅醇的方法
CN110835639B (zh) 一种制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸及其衍生物的方法
CN111454922A (zh) 3-甾酮-1,2-脱氢酶及其应用
CN113528475B (zh) 一种羰基还原酶突变体及其在制备甾体激素--睾酮中的应用
CN112645952A (zh) 一种(r)-(+)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的合成方法
CN108796021B (zh) 一种工程菌及其用于制备***的用途
CN115786292B (zh) 一种3β-羟基甾体脱氢酶及其在制备去氢表雄酮中的应用
CN107312787B (zh) 融合蛋白基因、工程菌及其在制备9α-羟基-雄烯二酮中的应用
CN111500549B (zh) 制备c1,2-位脱氢甾体化合物的酶及其应用
CN113493756A (zh) 一种基因工程菌及其应用
CN110643650A (zh) （s）-1-苄基-1，2，3，4，5，6，7，8-八氢异喹啉类化合物的制备方法
CN114480315B (zh) 一种Baeyer-Villiger单加氧酶及其在布立西坦合成中的应用
CN114606220B (zh) 固定化经修饰的7α-羟基甾体脱氢酶及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant