CN109154621B - 肾脏病的预后预测方法及*** - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供从血液试样基于D型和L型的氨基酸量，在对象中预测肾脏病的预后的方法、以及判定预后预测的分析***。为了预测肾脏病的预后，通过使用选自D‑丝氨酸、D‑天冬酰胺、D‑脯氨酸、D‑丙氨酸、D‑亮氨酸、D‑赖氨酸、D‑别‑异亮氨酸、L‑谷氨酸、L‑丙氨酸、L‑色氨酸、L‑天冬酰胺、和L‑天冬酰胺中的至少1种氨基酸，来达到本发明的目的。

Description

肾脏病的预后预测方法及***

技术领域

本发明涉及基于血液试样中的D型和/或L型的氨基酸量来预测肾脏病的预后的方法、以及针对肾脏病的预后预测***。

背景技术

肾脏是以通过滤过来自血液的废物、多余的水分，作为尿而排出，来维持体液的恒常性作为主要作用的脏器。肾脏因为免疫***的异常、对药物的过敏、高血压、糖尿病、出血、急剧的血压降低、感染症、伴随烫伤的脱水等因素而受到损伤，肾功能降低。在因为肾损伤而肾功能显著降低的情况下称为肾衰竭，根据肾功能降低的进行速度的不同，大致区分为急性肾衰竭(AKI)和慢性肾衰竭(CKD)。

急性肾衰竭(AKI)是指作为到发病为止的期间为数小时至数周的肾衰竭。急性肾衰竭是因为缺血、药剂、内毒素休克等原因而肾功能急剧降低的状态。患有急性肾衰竭的患者中，观察到作为体内代谢产物的尿素氮、肌酸酐的血中浓度上升、电解质代谢的异常和酸中毒等症状，一般而言通过血清肌酸酐值的急剧上升而诊断为急性肾衰竭。急性肾衰竭由于通过治疗而期待恢复，因此期望开发出可以判别更早期的急性肾衰竭的诊断标志物。然而，作为诊断标志物一般使用的血清中肌酸酐浓度根据年龄、性别、肌肉量和服用的药物等条件而变动，因此不能说是特异性的诊断标志物(非专利文献1)，此外报导了中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)、白介素-18(IL-18)、肾损伤分子(KIM-1)、肝脂肪酸结合蛋白质(FABPs)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C等蛋白质、和高香草酸硫酸、三甲基胺-N-氧化物等代谢低分子化合物等，但期待开发出可以更早更准确地检测病态的诊断标志物。

慢性肾衰竭(CKD)是指因为各种肾损伤而有由肾小球滤过量表示的肾功能的降低，或暗示肾脏的损伤的症状慢性(3个月以上)持续的肾衰竭。慢性肾衰竭是相当于日本成人人口的约13％的1,330万人罹患的疾病，由于达到末期肾衰竭(ESKD)的风险高，因此威胁国民健康。没有对慢性肾衰竭有效的治疗法，如果慢性肾衰竭进行而肾功能降低进展，则有***的危险，需要人工透析、肾移植，在医疗经济上成为大负担(非专利文献2)。慢性肾衰竭由于在没有自觉症状的状态下病情进展，因此为了早期发现慢性肾衰竭和抑制进展，需要采用肾衰竭的早期诊断标志物进行的诊断。然而，可以作为从比由肾小球滤过量表示的肾功能的变化发生的更早时期准确反映出肾损伤进展的诊断标志物而令人满意的现在还不存在。

肾脏病的预后预测、风险的预测通过由作为肾脏病的标志物的肌酸酐、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C值算出的推定肾小球滤过量(eGFR)来进行，但需要开发出更加提高其精度的预后预测标志物(非专利文献7:New england Jounral)。

明确了以往认为在哺乳类生物体中不存在的D-氨基酸在各种组织中存在，并预测承担某些生理功能。此外示出，血清中的D-氨基酸中，D- 丝氨酸、D-丙氨酸、D-脯氨酸、D-丝氨酸、D-谷氨酸、D-天冬氨酸的浓度能够作为肾衰竭的诊断标志物起作用(非专利文献3、非专利文献4、非专利文献5、非专利文献6)。进一步，公开了选自D-丝氨酸、D-苏氨酸、D- 丙氨酸、D-天冬酰胺、别D-苏氨酸、D-谷氨酰胺、D-脯氨酸和D-苯丙氨酸中的1种或2种以上氨基酸可以作为肾脏病的病态指标值(专利文献1)。然而，关于将D-氨基酸使用于慢性肾损伤的预后预测，还未获得认识。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2013/140785号

非专利文献

非专利文献1:Slocum，J.L.等人，Transl Res.159：277(2012)

非专利文献2:KDIGO 2012Clinical Practice Guideline for the Evaluationand Management of Chronic Kidney Disease，Kidney International Supplements 1(2013)

非专利文献3:Fukushima，T.等人，Biol.Pharm.Bull.18： 1130(1995)

非专利文献4:Nagata.Y Viva Origino Vol.18(No.2)(1990) 第 15 回学術講演会講演要旨集

非专利文献5:Ishida等人，北里医学23：51～62(1993)

非专利文献6:Yong Huang等人，Biol.Pharm.Bull.21： (2)156-162(1998)

非专利文献7:Shlipak MG等人，Cystatin C versus creatinine indetermining risk based on kidney function.N Engl J Med.2013Sep 5； 369(10)：932-43.

发明内容

发明所要解决的课题

期望开发出对与肾小球滤过量和血清中肌酸酐浓度等现有的肾脏病的预后预测标志物不同的肾脏病的预后预测标志物进行鉴定并分析的技术、以及由此准确地判定肾脏病的预后的技术。

用于解决课题的手段

本发明人等对包含慢性肾衰竭患者的群组的血液试样中的手性氨基酸总体(profile)进行了解析，结果发现可以通过若干手性氨基酸来以高精度预测患者的预后，完成了本发明。

因此，本发明涉及一种预后预测方法，是对象中的肾脏病的预后预测方法，其包含下述工序：

测定对象的血液试样中的手性氨基酸的量的工序；和

基于上述手性氨基酸量来确定上述对象中的肾脏病的预后的工序。

在进一步其它方案中，涉及可以实施本发明的预后预测方法的试样分析***。这样的试样分析***包含存储部、输入部、分析测定部、数据处理部、和输出部，可以分析血液试样，输出预后的信息。

在进一步其它方案中，也涉及能够安装到本发明的试样分析***的程序和存储该程序的存储介质。

发明的效果

可以提供能够预测肾脏病的预后的、基于对象的血液试样中的手性氨基酸量的预后预测标志物。

附图说明

图1表示在包含108名肾脏病患者的群组中，将基线时的L-天冬酰胺的量(a)、D-天冬酰胺的量(b)、和D-天冬酰胺/L-天冬酰胺(c)分成3分位，将该预后供于Kaplan-Meier解析的结果。

图2表示在包含108名肾脏病患者的群组中，将基线时的L-丝氨酸的量(a)、D-丝氨酸的量(b)、和D-丝氨酸/L-丝氨酸(c)分成3分位，将该预后供于Kaplan-Meier解析的结果。

图3表示在包含108名肾脏病患者的群组中，将基线时的L-丙氨酸的量(a)、D-丙氨酸的量(b)、和D-丙氨酸/L-丙氨酸(c)分成3分位，将该预后供于Kaplan-Meier解析的结果。

图4表示在包含108名肾脏病患者的群组中，将基线时的L-脯氨酸的量(a)、D-脯氨酸的量(b)、和D-脯氨酸/L-脯氨酸(c)分成3分位，将该预后供于Kaplan-Meier解析的结果。

图5表示在包含108名肾脏病患者的群组中，将基线时的L-异亮氨酸的量(a)和D-别-异亮氨酸的量(b)分成3分位，将该预后供于Kaplan-Meier 解析的结果。

图6表示在包含108名肾脏病患者的群组中，将基线时的L-亮氨酸的量(a)和D-亮氨酸的量(b)分成3分位，将该预后供于Kaplan-Meier解析的结果。

图7表示在包含108名肾脏病患者的群组中，将基线时的L-赖氨酸的量(a)和D-赖氨酸的量(b)分成3分位，将该预后供于Kaplan-Meier解析的结果。

图8表示在包含108名肾脏病患者的群组中，将基线时的L-天冬氨酸的量(a)和D-天冬氨酸的量(b)分成3分位，将该预后供于Kaplan-Meier解析的结果。

图9表示在包含108名肾脏病患者的群组中，将基线时的L-谷氨酸的量(a)和D-谷氨酸的量(b)分成3分位，将该预后供于Kaplan-Meier解析的结果。

图10表示在包含108名肾脏病患者的群组中，将基线时的L-色氨酸的量分成3分位，将该预后供于Kaplan-Meier解析的结果。

图11表示在包含108名肾脏病患者的群组中，将基线时的L-精氨酸的量(a)、D-精氨酸的量(b)、和D-精氨酸/L-精氨酸(c)的量分成3分位，将该预后供于Kaplan-Meier解析的结果。

图12表示分成包含具有20ml/min/1.73m²以上的eGFR的42名肾脏病患者的群组，在该群组中，将基线时的D-天冬酰胺的量(a)和D-脯氨酸的量(b)分成2分位，将该预后供于Kaplan-Meier解析的结果。

图13表示分成包含具有20ml/min/1.73m²以下的eGFR的66名肾脏病患者的群组，在该群组中，将基线时的D-丝氨酸的量分成2分位，将该预后供于Kaplan-Meier解析的结果。

图14是本发明的预后预测分析***的结构图。

图15是表示用于确定肾脏病的预后的动作的例子的流程图。

图16A是表示推定肾小球滤过量(eGFR)与(1)L-Asn值、(2)D-Asn值、和(3)D/L-Asn值的相关的图。

图16B是表示推定肾小球滤过量(eGFR)与(1)L-Ser值、(2)D-Ser值、和(3)D/L-Ser值的相关的图。

图16C是表示推定肾小球滤过量(eGFR)与(1)L-Asp值、(2)D-Asp值、和(3)D/L-Asp值的相关的图。

图16D是表示推定肾小球滤过量(eGFR)与(1)L-Ala值、(2)D-Ala值、和(3)D/L-Ala值的相关的图。

图16E是表示推定肾小球滤过量(eGFR)与(1)L-Ile值、和(2)D-allo-Ile 值的相关的图。

图16F是表示推定肾小球滤过量(eGFR)与(1)L-Phe值、(2)D-Phe值、和(3)D/L-Phe值的相关的图。

图16G是表示推定肾小球滤过量(eGFR)与(1)L-Lys值、(2)D-Lys值、和(3)D/L-Lys值的相关的图。

图16H是表示推定肾小球滤过量(eGFR)与(1)L-Thr值、和 (2)D-allo-Thr值的相关的图。

图16I是表示推定肾小球滤过量(eGFR)与(1)L-Pro值、(2)D-Pro值、和(3)D/L-Pro值的相关的图。

图16J是表示推定肾小球滤过量(eGFR)与(1)L-Leu值、(2)D-Leu值、和(3)D/L-Leu值的相关的图。

图16K是表示推定肾小球滤过量(eGFR)与(1)L-Trp值的相关的图。

图16L是表示推定肾小球滤过量(eGFR)与(1)L-Tyr值的相关的图。

具体实施方式

本发明涉及的肾脏病的预后预测方法包含下述工序：测定对象的血液试样中的至少1种手性氨基酸的量的工序；和将上述手性氨基酸的测定量与上述对象的预后进行关联的工序。

测定手性氨基酸的量的工序可以仅测定目标的手性氨基酸，也可以与其它手性氨基酸统一测定。手性氨基酸也能够成为肾脏病以外的标志物，因此从一次性解析多个疾病的观点考虑，优选对血液试样中的20种构成蛋白质的氨基酸，统一测定D型和L型。在测定手性氨基酸的量的工序之前，可以进行取得血液试样的工序、将取得的血液试样进行处理的工序。

所谓将手性氨基酸的测定量与上述对象的预后进行关联的工序，只要使用手性氨基酸的测定量将其与对象的预后进行关联，就可以使用任意的方法。可以仅由手性氨基酸的测定量进行关联，也可以使用将手性氨基酸的测定量用任意的变数、常数进行了加工的指标值来进行关联。本发明中，所谓指标值，可以为氨基酸的测定量，也可以基于测定量来计算，例如可以为与对应的异构体(即，如果是D型则为L型，如果是L型则为D型) 的浓度比、比例等。作为变数，除了对应的异构体的量以外，可以利用年龄、体重、性别、BMI、eGFR等能够影响手性氨基酸量的任意变数。

与对象的预后进行关联的工序，在特定的手性氨基酸量超过截止值的情况下可以与肾脏病的预后不良关联，在特定的手性氨基酸量不超过截止值的情况下可以与肾脏病的预后良好关联。关于在高值侧或低值侧的哪侧超过截止值，可以根据所使用的手性氨基酸在患有肾脏病的情况下增加还是减少来适当选择。例如，在D-氨基酸的情况下，由于在肾脏病患者中增加，因此在属于高值群的情况下，与肾脏病的预后不良关联，在属于低值群的情况下，与肾脏病的预后良好关联。与对象的预后进行关联的工序中，为了确定是否属于高值群，可以包含与预先确定的截止值进行比较的工序，进一步也可以包含基于比较结果来判定预后的判定工序。

所谓预后，在患病的情况下，是指针对该疾病的走向经过的医学上的前景，但在本发明中，关于未患病、或未判明患病的对象，也可以针对肾脏病的走向经过来预测前景。因此，本说明书中所谓对象，包含肾脏病的患者、还未被诊断为肾脏病的对象、和健康人。这样的对象中，可以包含患有肾脏病以外的疾病的患者。

肾脏病的预后的预测也可以称为对将来的肾脏病的风险分类或分层化。作为通过预后预测而预测的预后不良，没有特别限定，可举出例如肾脏转归、即末期肾脏病(ESKD)和死亡。死亡中可以包含全死因，更优选为与肾脏病相关的死因。所谓末期肾脏病(ESKD)，是慢性肾脏病的末期状态，是需要肾替代疗法，例如透析、肾移植的状态。本发明的预后预测与现在的患病状态无关，可以确定将来的对象进行肾替代疗法的必要性、死亡。预测预后的时刻可以为任意的时刻，可以根据所使用的群组及其调查期间来任意地选择。作为预测预后的时刻，可以从例如三个月前、半年前、1 年前、2年前、3年前、4年前、5年前、6年前和10年前中任意选择。

预后预测具体而言可以将血液试样中的至少1种手性氨基酸的量分类成2或其以上的群，根据该分类来预测预后。由本发明人等发现，如果血液中的手性氨基酸中，D-氨基酸的量变为高值，则肾脏病的预后变差，因此在属于高值群的情况下，可以与预后变得不良关联，由此进行预后预测或预后判定。因此，预后预测方法可以通过不是医师的医疗辅助者等来进行，分析机构等也可以进行。因此，本发明的预后预测方法也称为诊断的预备方法或辅助方法。

高值群的界限可以通过将群组进行解析，进行统计处理来任意地确定。统计处理的方法只要使用本领域技术人员周知的方法即可，可使用例如 Kaplan-Meier解析、cox比例风险模型等。根据群组的种类，规定界限的截止值不同，作为一例，将本申请实施例中使用的群组通过Kaplan-Meier 解析，作为截止值，在D-丝氨酸时可以使用5.6μmol/L，在D-天冬酰胺时可以使用0.7μmol/L，在D-脯氨酸时可以使用4.7μmol/L，在D-丙氨酸时可以使用5.2μmol/L，在D-亮氨酸时可以使用0.5μmol/L，在D-赖氨酸时可以使用0.6μmol/L，在D-别-异亮氨酸时可以使用0.1μmol/L，在L-谷氨酸时可以使用65.0μmol/L，在L-丙氨酸时可以使用460μmol/L，在L-色氨酸时可以使用42.4μmol/L，在L-天冬酰胺时可以使用67.2μmol/L，在L- 天冬氨酸时可以使用32μmol/L。此外，在达到肾脏转归(需要肾替代疗法的末期肾脏病和全死因的死亡)的对象中，观察到D-别-异亮氨酸、D-亮氨酸、和D-Lys，另一方面，在未达到肾脏转归的对象中，几乎观察不到，因此关于这些手性氨基酸，如果以检测灵敏度以上存在，则可以判定为预后不良。在对象的血中D-氨基酸浓度高于它们的截止值的情况下，将来对象陷于末期肾脏病(ESKD)、或死亡的可能性高，可以判定为预后不良。然而，并不意图将所使用的截止值限定于上述截止值。

在本发明中，所谓特定的手性氨基酸，是指构成蛋白质的氨基酸的D 型或L型。D型与L型由于体内的动态、代谢不同，因此能够通过判别D 型与L型来以高精度进行预后预测。作为构成蛋白质的氨基酸，可举出丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、和缬氨酸(Val)。其中，从能够以更高精度进行预后预测的观点考虑，优选为D-丝氨酸 (D-Ser)、D-天冬酰胺(D-Asn)、D-丙氨酸(D-Ala)、D-脯氨酸(D-Pro)、D-亮氨酸(D-Leu)、D-赖氨酸(D-Lys)、D-别-异亮氨酸(D-allo-Ile)、L-谷氨酸 (L-Glu)、L-丙氨酸(L-Ala)、L-色氨酸(L-trp)、L-天冬酰胺(L-Asn)、和L-天冬氨酸(L-Asp)。进一步从能够以更高精度进行预后预测的观点考虑，更优选为D-丝氨酸(D-Ser)、D-天冬酰胺(D-Asn)、D-丙氨酸(D-Ala)、D-脯氨酸(D-Pro)、D-亮氨酸(D-Leu)、D-赖氨酸(D-Lys)、D-别-异亮氨酸 (D-allo-Ile)。进一步从能够以更高精度进行预后预测的观点考虑，进一步更优选为D-丝氨酸(D-Ser)。

试样中的手性氨基酸量的测定可以使用本领域技术人员周知的任何方法来实施。例如，通过预先用邻苯二甲醛(OPA)、N-叔丁基氧基羰基-L-半胱氨酸(Boc-L-Cys)等修饰试剂立体异构特异性地将D-和L-氨基酸衍生物化，然后，使用ODS-80TsQA那样的分析柱将100mM的乙酸盐缓冲液 (pH6.0)与乙腈的混合液进行梯度洗脱而分离的方法，可以用于氨基酸的 D-型和L-型的同时测定。此外，预先用4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并

二唑 (NBD-F)那样的荧光试剂将D-和L-氨基酸衍生物化，然后，使用 ODS-80TsQA、Mightysil RP-18GP等那样的分析柱立体异构非特异性地将各氨基酸分离后，使用Pirkle型手性固定相柱(例如Sumichiral OA-2500S 或R)进行光学拆分的方法可以用于构成蛋白质的氨基酸的微量测定(浜濑健司和财津洁，分析化学，53卷，677-690(2004))。本说明书中的光学拆分柱系是指至少使用光学拆分柱的分离分析系，有时包含采用光学拆分柱以外的分析柱进行的分离分析。更具体而言，通过使用光学异构体的分析方法，可以测定试样中的D-/L-氨基酸浓度，上述光学异构体的分析方法的特征在于，包含下述步骤：将包含具有光学异构体的成分的试样，与作为流动相的第一液体一起，通过作为固定相的第一柱填充剂，而将上述试样的上述成分分离的步骤；将上述试样的上述成分各自在多回路(Multiloop)单元中单独保持的步骤；将在上述多回路单元中单独保持的上述试样的上述成分各自，与作为流动相的第二液体一起，通过流路而供给到作为固定相的具有光学活性中心的第二柱填充剂，将上述试样的成分各自所包含的上述光学异构体进行拆分的步骤；和检测上述试样的成分各自所包含的上述光学异构体的步骤(日本专利第4291628号)。替代地，通过使用判别氨基酸的光学异构体的单克隆抗体例如与D-亮氨酸、D-天冬氨酸等特异性地结合的单克隆抗体的免疫学方法，可以定量D-氨基酸(日本特开2009-184981 号)。

本发明中，可以将基于血液试样中的单独1种手性氨基酸的指标值用于预后预测，也可以与基于可以用于预后预测的其它1种以上的手性氨基酸量的指标值组合而用于预后预测。此外，本发明的预后预测方法可以进一步包含测定与肾脏病有关的变数的工序，可以将基于手性氨基酸量的指标值与这样的变数组合，与预后进行关联。作为这样的变数，可举出糖尿病的病史、年龄、性别、血红蛋白水平、平均血压、心血管事件的病史、和有无使用抗高血压药，进一步也可举出已知的肾脏病诊断或预后预测标志物。作为这样的已知的肾脏病诊断或预后预测标志物，可举出eGFR、血中肌酸酐浓度、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、尿蛋白质水平等。将这些变数加以考虑时，可以基于统计分析的通用办法来实施。例如在STATA统计软件version 11(STATA Corporation,College Station,TX,USA)中，可以在多变量cox回归分析中，作为变数而加以考虑。

在通过本发明的预后预测方法来预测或判定预后的情况下，进一步根据该预后而进行治疗。不限定于以下治疗，在例如预测或判定为预后不良的情况下，需要进一步进行生活习惯的改善、饮食指导、血压管理、血糖值管理、脂质管理等治疗。作为生活习惯的改善，推荐例如禁烟、用于降低BMI值的运动。作为饮食指导，以高血压的改善作为目的，推荐盐分摄取的降低。作为血压管理，以高血压的改善作为目的，推荐ACE抑制剂、 ARB的施与。作为血糖值管理，以HbA1c的降低作为目的，推荐胰岛素施与。作为脂质管理，以LDL胆固醇的降低作为目的，推荐高脂血症药的施与。这些治疗方案基于手性氨基酸量，在接受医师问诊后确定。因此，本发明的其它方案中，涉及肾脏病的治疗方法，其包含：实施本发明的预后预测方法，进一步进行肾脏病的治疗。

肾损伤的判定基于血液试样中的至少1种手性氨基酸的量来进行。

由本发明人等发现血液中的选自D-天冬酰胺、D-丝氨酸、D-天冬氨酸、 D-别-苏氨酸、D-丙氨酸、D-脯氨酸、D-亮氨酸、L-组氨酸、L-丝氨酸、 L-天冬氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-赖氨酸、和L-酪氨酸中的至少1种手性氨基酸的量与eGFR值相关(图4A-L)，因此使用这些手性氨基酸量，可以判别肾损伤。更具体而言，肾损伤可以通过将血液试样中的至少1种手性氨基酸的量应用到预先分类的2或其以上的群来判定肾损伤，在进一步方案中可以判定肾损伤的严重度。

用于判定肾损伤的界限也同样地可以通过对群组进行解析，进行统计处理来任意地确定。统计处理的方法只要使用本领域技术人员周知的方法即可，可以使用例如ROC解析、t检验等，也可以使用健康人群或患者群的平均值、中心值、X百分比值。这里X可以选择任意的数值，可以适当使用3、5、10、15、20、30、40、60、70、80、85、90、95、97。截止值可以为1个，也可以根据疾病的严重度而分类病态。作为肾损伤的判定所使用的手性氨基酸，可举出D-天冬酰胺、D-丝氨酸、D-天冬氨酸、D-别- 苏氨酸、D-丙氨酸、D-脯氨酸、D-亮氨酸、L-组氨酸、L-丝氨酸、L-天冬氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-赖氨酸、和L-酪氨酸，各自的截止值可以进行群组解析来任意地确定。在对象的血中D- 氨基酸浓度高于截止值的情况下，可以判定为肾损伤。

在本发明的进一步方案中，本发明涉及基于血液试样中的至少1种手性氨基酸的量来确定eGFR值的方法。该方法中，包含下述工序：测定血液试样中的至少1种手性氨基酸的量的工序；和基于该至少1种手性氨基酸的测定值来确定eGFR值的工序。在一方案中，基于手性氨基酸的测定值来确定eGFR值的工序可以基于预先确定的回归曲线来确定。在进一步其它方案中，基于手性氨基酸的测定值来确定eGFR值的工序只要预先将群组根据手性氨基酸的量分成多个群，将该群与eGFR值或其范围预先关联，并将测定值分类到该群即可。作为这样的手性氨基酸，可以使用选自 D-天冬酰胺、D-丝氨酸、D-天冬氨酸、D-别-苏氨酸、D-丙氨酸、D-脯氨酸、D-亮氨酸、L-组氨酸、L-丝氨酸、L-天冬氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-赖氨酸、和L-酪氨酸中的至少1种氨基酸。

本发明的试样分析***和程序以实施发明的预后预测方法的方式构成。图14是本发明的试样分析***的结构图。这样的试样分析***10包含存储部11、输入部12、分析测定部13、数据处理部14、和输出部15，可以分析血液的试样，输出预后信息。更具体而言，在本发明的试样分析***10中，

存储部11存储从输入部12输入的用于判别肾脏病的预后的、基于血中手性氨基酸量的指标值的截止值与预后信息，

分析测定部13将上述对象的血液试样中的构成蛋白质的氨基酸中的至少1种手性氨基酸分离并进行定量，

数据处理部14通过基于上述至少1种手性氨基酸的测定量来计算指标值，并将该指标值与存储在存储部11的截止值进行比较，来确定对象的肾脏病的预后信息，

输出部15可以输出关于对象的肾脏病的预后的病态信息。

存储部11具有RAM、ROM、闪速存储器等存储器装置、硬磁盘驱动器等固定磁盘装置、或软磁盘、光磁盘等可移动的存储装置等。存储部除了存储通过分析测定部测定的数据、从输入部输入的数据和指示、通过数据处理部进行的演算处理结果等以外，还存储信息处理装置的各种处理所使用的计算机程序、数据库等。计算机程序可以经由例如CD-ROM、DVD-ROM等计算机可读取的记录介质、因特网而安装。计算机程序使用公知的安装程序等而安装于存储部。

输入部12为接口等，也包含键盘、鼠标等操作部。由此，输入部可以输入通过分析测定部13测定的数据、通过数据处理部14进行的演算处理的指示等。此外，关于输入部12，例如在分析测定部13位于外部的情况下，与操作部分开，可以包含可以将测定的数据等经由网络、存储介质而输入的接口部。

分析测定部13进行血液试样中的手性氨基酸的量的测定工序。因此，分析测定部13具有能够进行手性氨基酸的分离和测定的结构。氨基酸可以 1个个分析，但也可以对一部分或全部种类的氨基酸统一分析。分析测定部13并不意图限定于以下结构，但例如可以为具备试样导入部、光学拆分柱、检测部的高效液相色谱***(HPLC)。分析测定部13可以与试样分析***分开构成，可以将测定的数据等使用网络、存储介质经由输入部12 输入。

数据处理部14以通过由测定的手性氨基酸的测定量来计算指标值，将所得的指标值与存储在存储部11的截止值进行比较，来判别肾脏病的预后的方式构成。数据处理部14按照存储在存储部的程序，对通过分析测定部 13测定并存储在存储部11的数据，执行各种演算处理。演算处理通过数据处理部所包含的CPU来进行。该CPU可以包含控制分析测定部13、输入部12、存储部11、和输出部15的功能模块，进行各种控制。这些各部可以由各自独立的集成电路、微处理器、固件等构成。

输出部15以输出作为通过数据处理部进行演算处理的结果的病态指标值和/或病态信息的方式构成。输出部15可以为直接表示演算处理的结果的液晶显示器等显示装置、打印机等输出机构，也可以为用于向外部存储装置的输出或经由网络而输出的接口部。

图15是表示采用本发明的程序的用于确定预后的动作的例子的流程图，图15是表示采用本发明的程序的用于确定预后信息的动作的例子的流程图。

具体而言，本发明的程序是使包含输入部、输出部、数据处理部、存储部的信息处理装置确定预后信息的程序。本发明的程序包含用于使上述信息处理装置执行以下动作的指令：

使从输入部输入的至少1种手性氨基酸的预先确定的指标值的截止值与预后信息存储；

使从输入部输入的至少1种手性氨基酸的量的测定值存储在存储部，

在数据处理部中，基于存储在存储部的测定值来计算指标值，并使该指标值与存储在存储部的截止值进行比较，来确定预后信息；

使预后信息存储在存储部，以及

使存储的预后信息输出到输出部。

本发明的程序可以存储在存储介质，也可以经由因特网或LAN等电信线路而提供。

在本发明的进一步方案中，本发明也涉及执行本发明的确定eGFR值的方法的eGFR值的确定***。该***包含存储部、输入部、数据处理部、和输出部，可以进行以下动作：

从输入部输入用于判定eGFR值的血中手性氨基酸中的至少1种氨基酸的量与eGFR值的回归曲线或截止值，存储在存储部，

从输入部输入对象的血液试样中的手性氨基酸中的至少1种氨基酸的量的测定值，存储在存储部，

数据处理部基于存储的上述氨基酸的量的测定值、与上述回归曲线或截止值，来确定对象的eGFR值；

将eGFR值输出到输出部。

信息处理装置在具备分析测定部的情况下，代替从输入部输入至少1 种手性氨基酸的量的值，分析测定部可以包含用于使信息处理装置执行从血液试样分离出手性氨基酸并测定，使测定值存储在存储部的指令。

在本说明书中提及的全部文献的整体通过引用而并入到本说明书中。

以下说明的本发明的实施例仅以例示作为目的，不限定本发明的技术范围。本发明的技术范围仅仅受权利要求的记载限定。以不超出本发明的宗旨作为条件，可以进行本发明的变更，例如本发明的构成要件的追加、删除和替换。

实施例

组和样品的分析

本发明人等在2005年8月～2009年1月，从りんくう综合医疗中心(Rinku GeneralMedical Centre)的第一肾脏内科，将未接受透析的患有 CKD 3期、4期和5期的118名连续患者登记到前瞻性调查。在一晚的禁食后，从患者取得基线血液试样，装入到塑料制管而调制血浆。先除去只能取得不充分的血液试样的患者。

本试验是被りんくう综合医疗中心的伦理委员会承认的试验，而且基于赫尔辛基宣言来进行。

基线的包含基准设为年龄小于90岁，没有关于恶性肿瘤的并发症，和没有对感染症的感染。除去只能获得不完全的基线数据的患者(n＝2)或只能取得不充分的量的血浆试样的患者(n＝4)、和在登记后1月以内开始肾替代疗法的患者(n＝4)。本试验被りんくう综合医疗中心的设施内伦理委员会和大阪综合医疗中心承认，而且对全部患者，关于参加本试验，获得了记录式的知情同意。肾功能基于针对日本人新开发的等式使用推定肾小球滤过量(eGFR)，由在本医院最初接受诊断时的基线数据评价。

式如下所述：

[数学式1]

eGFR＝194×血清肌酸酐(SCr)^-1.094×年龄^-0.287

{式中，年龄的单位是年，SCr的单位是mg/dL，以及肾小球滤过量 (GFR)的单位是mL/min/1.73m²体表面}。

对于女性患者，对数学式的计算值乘以校正系数0.739。

通过该设施内的酶方法计测血清肌酸酐。在基线确定时回收随机的尿试样(10ml)，测定了尿蛋白和肌酸酐的比率。基线中的其它变数为年龄、性别、按照国际疾病分类第10版(ICD10)的规则E10～E14定义的糖尿病、收缩期血压、扩张期血压、血红蛋白、和肾素-血管紧张素系抑制剂、β阻断剂、和钙阻断剂的使用。患者的基线特征如下所述：

[表1]

表1患者的基线特征

特征	全部集合(n＝108)
		年龄(yr)	63.5±10.9
男性的比例(％)	75.0
		eGFR(mL/min/1.73m<sup>2</sup>)	21.0±12.4
平均血压(mmHg)	95.1±12.9
		收缩期血压	139.1±21.7
扩张期血压	73.2±11.7
		血红蛋白(g/dL)	11.0±1.9
尿蛋白(g/gCre)	2.8±3.8
		疾病的起源(％)
糖尿病	30.6
		慢性肾小球肾炎	23.1
良性肾小球硬化	35.2
		其它	10.2
ACEi和/或ARB的使用率(％)	68.8
		β-阻断剂的使用率(％)	32.4
钙阻断剂的使用率(％)	67.6

数值作为平均±SD或％而表示。

eGFR：推定肾小球滤过率；ACEi：血管紧张素转化酶抑制剂；ARB：血管紧张素受体阻断剂

在本试验中作为“肾脏转归(kidney outcome)”而定义的最初的终点设为需要肾替代疗法的末期肾脏病(ESKD)、与全部死因死亡的合计。患者在门诊受到通常的随访护理。将数据在2011年末作为源文件而回收。将基线和随访数据从医院的医疗记录和出院概要、门诊记录、与初诊和透析护理医师的会面、和死亡诊断书回收。终点由至少2名医师确认。患者的随访可以正确利用。原因是，(i)本设施为大阪府的南部的中央医院，而且该地方没有其它中央医院，和(ii)与初诊和透析护理的医师的地域合作关系良好。

样品调制

来自人血浆的样品调制按照Journal of Chromatography.B, Analyticaltechnologies in the biomedical and life sciences 966,187-192 (2014)的记载改变而进行。如果简洁记载，则将20倍量的甲醇加入到血浆中，然后将一定量(由甲醇匀浆获得的10μl的上清液)取到褐色管中，然后进行了NBD衍生化(将0.5μl的血浆用于反应)。将溶液在减压下干燥，加入20μl的200mM硼酸钠缓冲液(pH8.0)和5μl的荧光标记试剂(加有40mM的4-氟-7-硝基2,1,3-苯并

二唑(NBD-F)的无水MeCN)，接下来在60℃下加热2分钟。加入0.1％TFA水溶液(75μl)，然后将2μl的反应混合液供于 2D-HPLC。

采用2D-HPLC的氨基酸对映体的测定

将氨基酸的对映体，如J Chromatogr A 1217,1056-1062(2010)、或Journal ofchromatography.B,Analytical technologies in the biomedical and life sciences877,2506-2512(2009)所记载的那样，使用micro 2D-HPLC 平台来定量。如果简洁记载，则将氨基酸的NBD-衍生物，使用反相柱(单片式ODS柱，0.53mmi.d.×100mm；资生堂)，使用包含MeCN、THF和 TFA的水性流动相进行梯度溶出。为了将D型和L型分离并进行测定，使用多回路阀自动回收目标氨基酸的级分，然后供于对映选择性柱 (KSAACSP-001S或SumichiraloA-3200，1.5mmi.e.×250mm；自填充，从资生堂和Sumika Chemical Analysis Service取得材料))。在具有4种立体异构体(L型、D型、L-别型、D-别型)的Ile、Thr的计测时，将L型和D型、与非对映异构体(L-别型和D别型)通过第一维的反相模式进行分离 (这些非对映异构体通过反相模式被分离)。接下来将该对映体(L与D、L- 别与D-别)通过对映选择性柱以二维分离。流动相为包含柠檬酸或甲酸的 MeOH-MeCN的混合溶液，然后在470nm下激发NBD-氨基酸的荧光，在 530nm下检测。通过荧光检测取得全部定量数据。使用HPLC-MS/MS，确认实际的生物的基质中的D-氨基酸的存在。

统计处理

连续变数作为中心值和范围、或作为四分位范围(IQR)而表示。不连续的数据作为计数和比(％)而提供。代谢物作为中心值(四分位)而表示。相关使用斯皮尔曼等级回归分析来评价。通过制作多个Cox比例风险模型，以基线的特性进行调节，来评价代谢物的诊断作用。使用时序检验，通过中心值而评价了被分层化的生存分布的同等性。由P＜0.05定义统计学显著性差异。使用STATA统计软件version 11(STATA Corporation,CollegeStation,TX,USA)进行统计分析。

结果

群组的氨基酸代谢物组图谱

本发明人等对由CKD患者构成的长期群组进行了手性氨基酸代谢物组绘图。由随访期间的中心值为4.3年(四分位范围，2.4～5.5年)的108名参加者生成数据。没有停止了随访的患者。将基线的特征示于表1中。这些患者中，58名开始肾替代疗法，而且15名死亡，其中4名在开始肾替代疗法前死亡。关于该群组，使用2维HPLC法进行了手性氨基酸代谢物组绘图。该***不伴随来自内源性物质的重大干扰，能够以手性选择性，以约1fmol～100pmol的范围检测构成蛋白质的氨基酸的对映体。实验间的相对标准偏差(n＝4)为1.10～8.19％。考虑分析人血浆样品时的再现性，使用若干样品进行二次分析，而且几乎获得了相同结果。通过对映选择性 2D-HPLC分析，在CKD患者的血浆中观察到了若干D型氨基酸。D-Ser、 D-Ala、D-Pro、和D-Asn在多数患者中检测到(89～100％)，D-Asp、D-Lys、 D-allo-Thr、D-Glu、D-Arg和D-His在10～40％的患者中检测到，而且 D-Leu、D-Phe、和D-allo-Ile零星检测到(在小于10％的患者中检测到)。作为注释，该群组中检测到的allo-Thr仅包含D-allo-Thr。生物体中，α碳的变换主要发生，D-别体由L-Thr和L-Ile产生。其结果，D-别体比上述二种氨基酸的D型多。

手性氨基酸与临床参数的相关

本发明人等对临床参数与手性氨基酸之间的基线的相关进行了评价。 D-Ser、D-Pro、和D-Asn的水平与推定肾小球滤过量(eGFR)显示出强的反相关性。另一方面，D-Ala、D-Asp、和D-allo-Thr显示出弱的相关性。要特别写出的是，L-Ser的水平与eGFR显示正的相关，因此D/L-Ser与 eGFR进一步显示强的相关(图16A-L)。

肾脏转归与手性氨基酸的相关

通过Kaplan-Meier曲线分析，显示出以高水平具有大量检测到的 D-Ser、D-Ala、D-Pro、和D-Asn的所有种类的患者与其它群的患者相比，更高频繁地达到肾脏转归(需要肾代替疗法的末期肾脏病和全死因的死亡)(图1～图4)。在将患者根据肾功能区分的情况下，肾脏转归的分离在具有20ml/min/1.73m²的eGFR的患者的D-Ala和D-Pro中可见(图3和图4)，同样的结果在D-Ser和D-Asn中也可见(图2和图1)。未怎么检测到的D- 氨基酸(D-Lys、D-Leu、和D-allo-Ile)的若干、以及若干L-氨基酸(L-Asp、 L-Glu、L-Ala、L-Trp、和L-Lys)也分离了肾脏的预后(图5～图13)。

本发明人等进行多变量(multiple)cox回归分析，评价了大量检测到的 D氨基酸与肾脏转归的相关。不调节测定量而使用的cox分析中，D-Asn、 D-Ser、D-Ala、D-Pro的属于最高三分位的患者与属于最低三分位的患者相比，关于肾脏转归，具有3.05-5.68倍高的风险比(表2，未调节模型)。 D-Ser和D-Asn的属于最高三分位的患者与属于最低三分位的患者相比，关于以肾功能、尿蛋白质水平调节后的肾脏转归，具有2.7～3.7倍高的调节风险比(表2，模型1)。这些发现在以对D-氨基酸的水平带来少许影响的年龄、糖尿病的有无等共存疾病进一步调节的情况下也相同(表2模型2)。因此，这些D-氨基酸与CKD患者中的肾脏病的进展相关。

[表2]

表2 D-氨基酸的关于肾脏转归的风险的cox回归分析

数值作为风险比(95％C1)记载。

Claims (7)

1.一种预后预测分析***，是包含存储部、输入部、数据处理部、和输出部的、关于由伴有肾功能降低的肾替代疗法和死亡组成的肾脏转归的预后预测分析***，在所述预后预测分析***中，

从输入部输入用于判别肾脏病的预后的、基于血中手性氨基酸量的指标值的截止值与预后信息，存储在存储部，

从输入部输入未接受透析的有CKD的对象的血中手性氨基酸量的测定量，存储在存储部，

数据处理部基于存储的手性氨基酸的测定量来计算指标值，并将指标值与存储的截止值进行比较，来确定所述对象的预后信息；

将预后信息输出到输出部，

所述血中手性氨基酸为选自D-丝氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-丙氨酸、D-亮氨酸、D-赖氨酸、D-别-异亮氨酸中的至少1种D-氨基酸。

2.根据权利要求1所述的预后预测分析***，其进一步包含分析测定部，该分析测定部从对象的血液试样分离出血中手性氨基酸并进行定量来确定测定量，代替输入部或经由输入部而输入测定量。

3.根据权利要求1或2所述的预后预测分析***，所述截止值通过Kaplan-Meier曲线分析而预先确定。

4.根据权利要求1或2所述的预后预测分析***，所述截止值在D-丝氨酸时为5.6μmol/L，在D-天冬酰胺时为0.7μmol/L，在D-脯氨酸时为4.7μmol/L，在D-丙氨酸时为5.2μmol/L，在D-亮氨酸时为0.5μmol/L，在D-赖氨酸时为0.6μmol/L，在D-别-异亮氨酸时为0.1μmol/L。

5.根据权利要求1或2所述的预后预测分析***，从所述输入部进一步输入所述氨基酸的对应的异构体的量的测定量，所述指标值为所述氨基酸的量与对应的异构体的量的比。

6.根据权利要求1或2所述的预后预测分析***，所述指标值通过cox比例风险分析来调节。

7.根据权利要求6所述的预后预测分析***，所述指标值进一步通过选自eGFR、尿蛋白水平、糖尿病、年龄、性别、血红蛋白水平、平均血压、心血管事件的病史、和有无高血压药物治疗中的1个以上的变数来调节。

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