CN108601752A - 用于治疗mtap缺失型癌症的mat2a抑制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于预测用MAT2A抑制剂治疗癌症患者的有效性的诊断和预后方法。提供用于预测肿瘤细胞生长对于由MAT2A抑制剂抑制的敏感性的方法,其包括评估所述肿瘤细胞是否缺失MTAP基因,由此MTAP缺失的细胞对由MAT2A抑制剂的抑制敏感。
Description
发明领域
本发明涉及用于治疗和诊断癌症患者的方法。具体地,本发明涉及用于确定哪些患者会受益于用甲硫氨酸腺苷转移酶(MAT2A)的治疗的方法。
发明背景
致癌性功能获得突变及其相应的分子途径的鉴定和表征已刺激了许多靶向疗法的发展,所述靶向疗法为具有相应突变的癌症患者提供了实质性益处。这包括由功能获得点突变驱动的癌症选择性药物(诸如突变EGFR非小细胞肺癌中的厄洛替尼和吉非替尼(Lynch&Haber,NEJM2004和Pao&Varmus PNAS 2004))、基因组扩增(诸如HER2-扩增性乳腺癌中的曲妥珠单抗(Slamon和Norton NEJM 2001)),或致癌基因融合(诸如BCR-ABL阳性慢性髓性白血病中的伊马替尼(Druker&Sawyers NEJM 2001))。在每种情况下,该疗法直接抑制致癌突变蛋白、废除其功能。肿瘤抑制基因中的功能丧失突变非常普遍,并且在癌症的分子发病机制中同样重要,但鲜有基于肿瘤抑制基因功能丧失突变来选择性针对癌症的疗法实例(Morris&Chan Cancer 2015)。可以通过简单的观察(不能为了治疗益处而直接抑制突变蛋白)来解释这种不一致。由纯合子缺失失活的肿瘤抑制基因对于靶向疗法是最有问题的,因为残余蛋白的缺乏避免了会直接激活、稳定或修复缺陷肿瘤抑制基因的治疗策略。
甲硫氨酸腺苷转移酶(MAT)(也称为S-腺苷甲硫氨酸合成酶)是催化由甲硫氨酸和ATP合成S-腺苷甲硫氨酸(SAM或AdoMet)的细胞酶,并被认为是甲硫氨酸循环的限速步骤。SAM是多胺生物合成中的丙氨基供体,并且是用于DNA甲基化的主要甲基供体,并且其参与基因转录和细胞增殖以及次级代谢产物的生成。
两个基因(MAT1A和MAT2A)编码两种不同的催化性MAT异形体。第三个基因MAT2B编码MAT2A调节亚基。MATlA特异表达于成人肝脏中,而MAT2A广泛分布。由于MAT异形体在催化动力学和调节性质方面不同,所以表达MAT1A的细胞具有比表达MAT2A的细胞高得多的SAM水平。已经发现MAT2A启动子的低甲基化和组蛋白乙酰化导致MAT2A表达的上调。
在肝细胞癌(HCC)中,发生MAT的下调和MAT2A的上调,其被称为MAT1A:MAT2A转换。伴随着MAT2B上调的转换导致较低的SAM含量,这为肝癌细胞提供了生长优势。由于MAT2A在促进肝癌细胞生长中起着至关重要的作用,因此它是抗肿瘤疗法的靶点。最近的研究表明,通过使用小干扰RNA进行的沉默基本上抑制了肝癌细胞的生长并诱导细胞凋亡。
甲硫腺苷磷酸化酶(MTAP)是在所有正常组织中发现的酶,该酶催化甲硫腺苷(MTA)转化为腺嘌呤和5-甲基硫代核糖-1-磷酸。腺嘌呤被补救以产生腺苷一磷酸,并且5-甲基硫代核糖-1-磷酸被转化为甲硫氨酸和甲酸盐。由于这种补救途径,当嘌呤的从头合成被阻断时,MTA可以例如使用诸如L-阿拉诺新的抗代谢药而被用作替代性嘌呤源。
许多人和鼠恶性细胞缺乏MTAP活性。MTAP缺陷不仅存在于组织培养细胞中,而且该缺陷也存在于原发性白血病、胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、非小细胞肺癌(NSLC)、膀胱癌、星形细胞瘤、骨肉瘤、头颈癌、粘液性软骨肉瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、软组织肉瘤、非霍奇金淋巴瘤和间皮瘤中。编码人MTAP的基因定位于人染色体9p上的区域9p21。该区域还含有肿瘤抑制基因p16INK4A(也称为CDKN2A)和p15INK4B。这些基因编码p16和p15,它们分别是周期蛋白D-依赖性激酶cdk4和cdk6的抑制剂。
作为另外的选择,p16INK4A转录物可以是剪接成编码p14ARF的转录物的ARF。p14ARF结合至MDM2并阻止p53的降解(Pomerantz等人(1998)Cell 92:713-723)。9p21染色体区域是受关注的,因为它在多种癌症(包括白血病、NSLC、胰腺癌、胶质瘤、黑色素瘤和间皮瘤)中经常是纯合缺失的。缺失通常会使一个以上的基因失活。例如,Cairns等人((1995)Nat.Gen.11:210--212)报道了在研究了500多个原发性肿瘤后,在这些肿瘤中鉴定的几乎所有缺失都涉及含有MTAP、p14ARF和Pl6INK4A的170kb区域。Carson等人(WO 99/67634)报道了肿瘤发展阶段与编码MTAP的基因和编码p16的基因的纯合性丧失之间存在相关性。例如,据报道,MTAP基因而不是p16INK4A的缺失在发育的早期阶段表明癌症,而据报道,编码p16和MTAP的基因的缺失表明癌症处于肿瘤生成的更晚期阶段。Garcia-Castellano等人报道在一些骨肉瘤患者中,MTAP基因在诊断时存在,但在稍后的时间点缺失(Garcia-Castellano等人,同上)。
发明概述
本发明提供治疗个体中癌症的方法,其中所述癌症特征在于MTAP表达降低或缺失或者MTAP基因的缺失或者MTAP蛋白功能降低,所述方法包括向所述个体给药治疗有效量的MAT2A抑制剂。
本发明提供测定是否能够通过使肿瘤细胞与MAT2A抑制剂接触来抑制所述肿瘤细胞的存活或增殖的方法,所述方法包括测定所述肿瘤细胞中MTAP的状态,其中MTAP表达的降低或缺失或者MTAP基因的缺失或者MTAP蛋白水平或功能的降低表明所述肿瘤细胞的存活或增殖能够被MAT2A抑制剂抑制。
在另一方面中,本发明提供表征肿瘤细胞的方法,其包括测量所述肿瘤细胞中MTAP基因表达水平、MTAP基因的存在与否或者存在的MTAP蛋白水平,其中相对于参比细胞,MTAP表达的降低或缺失或者所述MTAP基因的缺失或者MTAP蛋白水平或功能的降低表明所述肿瘤细胞的存活或增殖能够被MAT2A抑制剂抑制。
在另一方面中,本发明提供测定肿瘤对MAT2A抑制反应性的方法,其包括在所述肿瘤的样品中测定MTAP基因的表达水平降低、MTAP基因的缺失或者MTAP蛋白水平或功能的降低,其中MTAP基因的表达水平降低、MTAP基因的缺失或者MTAP蛋白水平或功能的降低表明所述肿瘤对MAT2A抑制剂有反应。
在另一方面中,本发明提供药盒,其包含用于测量肿瘤样品中MTAP基因的表达水平、MTAP基因的缺失或者MTAP蛋白的水平或功能的降低的试剂,所述药盒还包含给药治疗有效量的MAT2A抑制剂的说明书。
附图简述
图1A-F.功能基因组学筛选鉴定MTAP丧失的合成致死基因。描绘紧邻包含p16/INK4A/p14/ARF基因的CDKN2A基因组区域的含有MTAP基因的染色体9和9p21.3区域的示意图。(B)描绘结肠癌HCT116 MTAP wt和MTAP-/-同基因细胞系对中shRNA消除筛选的示意图。(C)免疫印迹分析证明HCT116 MTAP-/-细胞中缺乏MTAP蛋白表达。(D)HCT116 MTAP-/-与MTAPwt细胞中的基因评分。基因评分计算为在细胞培养期结束时与引入细胞之前HCT116MTAP-/-细胞与HCCT116 MTAP wt细胞中靶向该基因的8种shRNA中的每一种的丰度的SUMlog2倍变化。(E)在MTAP缺陷型HCT116细胞中评分为差异性消除的前10名基因。在随后的研究中论述的基因以绿色(MAT2A)、红色(PRMT5)和品红色(RIOK1)突出显示。(F)筛选中HCT116 MTAP-/-与HCT116 wt细胞中单个MAT2A、PRMT5和RIOK1 shRNA的丰度的变化。单个shRNA以绿色(MAT2A)、红色(PRMT5)或品红色(RIOK1)突出显示。文库中的其余shRNAs显示为灰色菱形。
图2A-F.PRMT5在基因消融时的MTAP缺失型细胞中是选择性必需的,但不是药理学靶向的。对稳定表达PRMT5shRNA和p-LVX空载体对照(EV)的HCT116 MTAP-/-和HCT116 MTAPwt细胞中的指定蛋白质进行免疫印迹分析。(B)PRMT5在体外MTAP缺失型细胞中是选择性必需的。有或没有PRMT5 wt或R368A突变体挽救的PRMT5敲低(+dox)时的HCT116 wt和HCT116MTAP-/-细胞的生长百分比与10天软琼脂集落生长测定中的无敲低(无dox)对照。用结晶紫对细胞集落染色,然后用Li-Cor定量(平均值±SD,n=3)。(C)对稳定表达PRMT5 shRNA和shRNA抗性PRMT5 wt cDNA或PRMT5 R368A催化死亡突变体cDNA的HCT116 MTAP-/-和HCT116MTAP wt细胞中的指定蛋白质进行免疫印迹分析。(D)对稳定表达PRMT5 shRNA和p-LVX空载体对照(EV),或PRMT5 shRNA和shRNA抗性PRMT5 wt cDNA或PRMT5 R368A催化死亡的突变体cDNA的HCT116 MTAP-/-和HCT116 MTAP wt细胞中的对称二甲基精氨酸标记进行免疫印迹分析。(E)从在HCT116 MTAP wt与HCT116 MTAP-/-细胞中的20μM最高剂量滴定的EPZ015666的剂量反应分析。用EPZ015666处理细胞5天,测量它们对化合物的反应,作为处理细胞与未处理对照的倍数增长(平均值±SD,n=3)。(F)用指定剂量的EPZ015666处理5天的HCT116同基因对中PRMT5依赖性二甲基精氨酸标记的免疫印迹分析。将表达PRMT5shRNA的HCT116 wt和HCT116 MTAP-/-细胞用作对照,并用多西环素诱导PRMT5敲低6天。Dox表示在细胞收集和免疫印迹分析之前,加入多西环素(200ng/ml)6天以诱导PRMT5 shRNA表达。
图3A-D.MTA蓄积MTAP缺陷型癌症。甲硫氨酸回收和补救途径的示意图。MTAP是甲硫氨酸补救途径中的酶,其将甲基硫腺苷(MTA)(多胺生物合成的副产物)从脱羧S-腺苷甲硫氨酸(dcSAM)和腐胺转化回甲硫氨酸和腺嘌呤。MTAP缺失导致抑制甲基转移酶的活性的其底物MTA的蓄积,介导SAM的一碳甲基(CH3)转移的酶。SAM由MAT2A在细胞中产生。产生S-腺苷高半胱氨酸(SAH)作为甲基转移反应的副产物,并通过高半胱氨酸的再甲基化将其再循环回到甲硫氨酸。或者,将高半胱氨酸转化为半胱氨酸并引导至转硫途径而产生谷胱甘肽。(B)使用HCT116同基因对中的未靶向LC-MS进行细胞内代谢物水平分析。瀑布图显示了HCT116 MTAP-/-细胞中平均倍数变化(FC)的log2与HCT116 wt对照与代谢物ID的对比。还显示了HCT116 MTAP-/-细胞中的平均倍数变化(FC)的log2的火山图与HCT116 wt对照与每种代谢物的log10p值的对比。MTA和dcSAM以红色突出显示。(C)HCT116同基因细胞系中细胞内MTA水平的定量测量(平均值±SD,n=3)。(D)一组249种不同肿瘤来源的癌细胞系中的培养基MTA水平。
图4A-E.MTA在体外和体内抑制PRMT5活性。(A)一组N-甲基转移酶的MTA敏感性。在10和100μM浓度的MTA存在下,使用体外测定法测试一组小分子、DNA以及赖氨酸和精氨酸N-甲基转移酶。(B)体外测定中MTA抑制PRMT5复合物活性的剂量响应曲线。(C)在所有测试的甲基转移酶中,PRMT5对MTA的抑制最敏感。显示MTA Ki值的瀑布图,并且PRMT5数据点以红色突出显示。(D)MTAP缺失降低了细胞中PRMT5的基础活性。在一组MTAP wt和MTAP缺失的各种肿瘤来源的癌细胞系中的指定蛋白质的免疫印迹分析。包括HCT116 wt和HCT116 MTAP-/-细胞系作为参考。使用Li-Cor软件量化H4R3me2s标记的水平,将其归一化至组蛋白H4的总水平,并且在条形图上报告平均值±SEM。使用双尾不成对t检验计算p值。(E)使用5-甲硫腺苷过渡态类似物抑制剂(MTAPi)的MTAP药理学抑制导致HCT116 wt细胞中对称二甲基精氨酸标记的减少。用250或500nM的MTAP抑制剂处理3天的HCT116 MTAP-/-细胞和HCT116 MTAPwt细胞中的指示蛋白质的免疫印迹分析。
图5A-J.MAT2A在MTAP缺失型HCT116细胞中是选择性必需的。对稳定表达非靶向shRNA(shNT)、MAT2A shRNA、MAT2A shRNA和shRNA抗性MAT2A wt cDNA(+Resc),或MAT2AshRNA和MTAP cDNA(+MTAP)的HCT116 MTAP-/-和HCT116 MTAP wt细胞中的指定蛋白质进行免疫印迹分析。Dox表示在细胞收集和分析之前,加入多西环素(200ng/ml)7天以诱导MAT2AshRNA表达。(B)体外MAT2A敲低导致HCT116 wt和HCT116 MTAP-/-细胞中的相等SAM消除。使用靶向LC-MS分析在表达有(+dox)和没有(-dox)MAT2A敲低的诱导型shMAT2A的HCT116同基因对中测量SAM水平。(C)MAT2A在体外MTAP缺陷型HCT116细胞中是选择性必需的。有或没有MAT2A wt(+Resc)或MTAP(+MTAP)挽救的MAT2A敲低(+dox)时的HCT116 wt和HCT116 MTAP-/-细胞的生长百分比与4天和6天体外生长测定(平均值±SD,n=5)中测量的无敲低(-dox)对照。在铺板进行生长测定之前,将细胞用200ng/ml dox预处理4天。(D)对稳定表达MAT2AshRNA的HCT116 MTAP wt和HCT116 MTAP-/-异种移植物中的指定蛋白质进行免疫印迹分析。Dox表示将多西环素(2,000mg/kg)添加到小鼠食物中以诱导MAT2A shRNA表达。(E)体内MAT2A敲低导致HCT116 wt和HCT116 MTAP-/-异种移植物中的相等SAM消除。使用靶向LC-MS分析在由表达有(dox)或没有(无dox)MAT2A敲低的诱导型shMAT2A的HCT116同基因对形成的异种移植物中测量SAM水平。(F)MAT2A在体内MTAP缺陷型HCT116细胞中是选择性必需的。在shMAT2A HCT116同基因对细胞系的皮下异种移植物中体内消融MAT2A时的肿瘤生长的动力学。一旦肿瘤直径达到200-300mm3(平均值±SEM,n=5-6)就开始进行多西环素治疗。(G)MAT2A敲低时的体内MTAP缺陷型HCT116细胞的生长由MAT2A wt cDNA挽救。稳定表达shNT、shMAT2A或shMAT2A和发卡式抗性MAT2A cDNA的HCT116 MTAP-/-细胞系的皮下异种移植物中的体内消融MAT2A时的肿瘤生长的动力学。一旦肿瘤直径达到200-300mm3(平均值±SEM,n=5-6)就开始进行多西环素治疗。(H)对稳定表达shNT、shMAT2A或shMAT2A和发卡式抗性MAT2A cDNA的HCT116 MTAP-/-异种移植物中的指定蛋白质进行免疫印迹分析。Dox表示将多西环素(2,000mg/kg)添加到小鼠食物中以诱导MAT2A shRNA表达。(I)MAT2A在体外MTAP减少型MCF7细胞中是必需的。在有或没有MAT2A wt(+Resc)挽救的MAT2A敲低(+dox)时的MCF7细胞的生长百分比与在7天体外生长测定中测量的无敲低(-dox)对照(平均值±SD,n=5)。(J)对稳定表达非靶向shRNA(shNT)、MAT2A shRNA、MAT2A shRNA和shRNA抗性MAT2A wtcDNA(+Resc)的指定蛋白质的免疫印迹分析。Dox表示在细胞收集和分析之前,加入多西环素(200ng/ml)7天以诱导MAT2A shRNA表达。
图6A-C.MAT2A消融选择性地抑制MTAP缺失型细胞中的PRMT5活性。MAT2A的基因消融时的PRMT活性降低。对在稳定表达非靶向shRNA(shNT)、MAT2A shRNA、MAT2A shRNA和shRNA抗性MAT2Awt cDNA(+Resc),或MAT2A shRNA和MTAP cDNA(+MTAP)的HCT116同基因细胞系中进行指定蛋白质的免疫印迹分析。Dox表示在细胞收集和分析之前,加入多西环素(200ng/ml)7天以诱导MAT2A shRNA表达。(B)PRMT5对SAM的亲和力最低。对所有甲基转移酶绘制SAM Km值(μM),分析它们对MTA抑制的敏感性。(C)示意图描绘了由于MTA蓄积导致的MTAP缺陷诱导的代谢易损性的集合和在PRMT5时的MAT2A消融时的SAM的水平降低,导致在MTAP减少型SAM缺乏的环境中的PRMT5功能降低。
图7A-D.多个PRMT5共复合物在MTAP缺失型细胞中容易损坏。对稳定表达RIOK1shRNA、RIOK1 shRNA和空载体对照(EV)、RIOK1 shRNA和shRNA抗性RIOK1 wt cDNA(wtRIOK1)或RIOK1 K208R/D324N催化死亡的突变体cDNA的HCT116 MTAP-/-和HCT116 MTAP wt细胞中的指定蛋白质的免疫印迹分析。Dox表示在细胞收集和分析之前,加入多西环素(200ng/ml)6天以诱导PRMT5shRNA表达。(B)RIOK1在体外MTAP缺失型细胞中是选择性必需的。有或没有RIOK1 wt或RIOK1 K208R/D324N突变体(RIOK1mut)挽救的RIOK1敲低(dox)时的HCT116 wt和HCT116 MTAP-/-细胞的生长百分比与10天软琼脂集落生长测定中的无敲低(无dox)对照。用结晶紫对细胞集落染色,然后用Li-Cor定量(平均值±SD,n=3)。(C)另外的PRMT5结合配偶体在MTAP缺失型细胞中是选择性必需的。用非靶向siRNA(NT)或siRNA靶向PRMT5、RIOK1、pICln、MEP50、COPR5或标准化为NT对照的SMRACA4转染时的HCT116 wt和HCT116 MTAP-/-细胞的生长百分比,如在用siRNA库进行两轮转染后的4天生长测定中测量的(平均值±SD,n=5)。(D)使用siRNA库对PRMT5和PRMT5结合配偶体敲低的qPCR确认。相对于在非靶向(NT)siRNA库转染的细胞中检测到的mRNA水平计算的敲低效率。
图8A-B.(A)用MAT2A抑制剂AGI-512处理的MTAP缺失型和MTAP野生型HCT116细胞的生长抑制百分比。(B)用MAT2A抑制剂AGI-673处理的MTAP缺失型和dMTAP野生型HCT116细胞的生长抑制百分比。
图9.在HCT116 MTAP-/-和MTAP wt细胞中的PRMT5、MTAP和β-肌动蛋白质以及SDMA标记的免疫印迹分析。
图10.Mat2a敲低对体内原位MCF7模型的影响。
图11 A-D.PRMT5是MTAP缺失型癌症的选择性易损性。
图12.MAT2A消除减少了MTAP缺失型细胞中的PRMT5甲基标记。
发明详述
染色体9p21(Chr9p21)在所有人类癌症的约15%中是纯合缺失的(BerhoukimMeyerson nature 2010),包括许多不同的肿瘤类型,并且频率范围高达>50%的多形性胶质母细胞瘤中观察到的缺失频率(Parsons和Kinsler,Science 2008)。9p21基因座包括CDKN2a基因,其编码p14-ARF和p16-INK4a(图1A)。两种蛋白质都具有肿瘤抑制作用,已知p14-ARF可稳定化p53(Kamijo&Sherr Cell 1997和Zhang&Yarbough Cell 1998),并且通过CDK4/6细胞周期激酶的负调节证明p16-INK4a是关键的细胞周期调节因子和有效的肿瘤抑制因子(Serrano&Beach Nature 1993)。虽然Chr9p21缺失是在30多年前首次发现的(Chilcote NEJM 1985),但CDKN2A丧失的分子靶向疗法已被证明是难以捉摸的,并且可能有必要鉴定具有Chr9p21缺失的目标肿瘤的其它供选择方法。
值得注意的是,Chr9p21缺失通常涉及邻近CDKN2A的基因的共缺失(图1A)。这些共缺失的基因中最重要的是MTAP,其位于与CDKN2a相邻的Chr9p21上(图1A)。MTAP基因在100kb的CDKN2A内,并且在80-90%具有CDKN2A缺失的肿瘤中发现MTAP的纯合缺失(Illie&Ladanyi Clin Canc Res 1993和Zhang&Savarese Canc Genet Cytogenet 1996)。MTAP编码甲硫腺苷磷酸化酶,其为甲硫氨酸补救途径中的关键酶。MTAP代谢多胺合成的副产物(甲硫腺苷),这导致MTA中甲硫氨酸和腺嘌呤的最终再生(Zappia&Cartena-Farrina Adv ExpMed Biol 1988)。因此,MTAP存在于甲硫氨酸代谢、多胺生物合成和核苷酸代谢的交叉点-各个代谢途径在癌细胞的增殖代谢中均是重要的。事实上,已报道由于肿瘤摄取循环腺嘌呤并逃避嘌呤生物合成敏感性(Rueffii-Brasse和Wickramasinghe JCI 2011),尽管这种代谢易损性在体内消失,但是MTAP缺失会对嘌呤生物合成抑制剂产生敏感性(Li和BertinoOncol Res 2004)。我们试图询问MTAP缺失是否会在Chr9p21缺失的癌症中产生其他可靶向的附带易损性。
为了筛选在癌症中MTAP丧失时出现的易损性,shRNA消除(depletion)筛选用于仅在MTAP状态下变化的同基因癌细胞系对。尽管MTAP编码代谢酶,但我们假设MTAP丧失可能会在生物学途径中产生超出代谢的附带易损性。代谢和非代谢途径之间的这种相互干扰的先例包括观察到由功能获得突变体IDH1/2蛋白质产生的代谢产物2-羟基戊二酸可抑制α-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族的成员(Xu&Xiong Cancer Cell 2011,Rohle&MellinghoffScience 2013)。类似的机制也与具有琥珀酸脱氢酶(SDH)或延胡索酸水合酶(FH)突变的肿瘤有关,其中这些酶的底物蓄积到高水平(Selak和Gottlieb,Cancer Cell 2005和Issacs和Neckers,Cancer Cell 2005)。因此,癌症代谢组中的畸变可以影响非代谢途径。为了检验MTAP缺失会在代谢和非代谢途径中产生附带易损性的假设,使用由靶向代谢组的3000+基因的shRNA发卡以及另外的3000多个额外的非代谢基因组成的shRNA文库。
通过该筛选和随后的研究鉴定了在癌症中MTAP丧失后变得易受损的信号轴。该信号轴的中心是精氨酸甲基转移酶PRMT5。使用代谢组学和生物化学方法,发现MTA(MTAP酶反应的底物)在MTAP缺失型癌症中蓄积。MTA抑制PRMT5酶活性并导致MTAP缺失型癌症中基础PRMT5甲基化减少。该易损性扩展到PRMT5的上游和下游。我们展示产生PRMT5底物S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的代谢酶甲硫氨酸-腺苷转移酶-2A(MAT2A)在MTAP缺失型癌症中也是选择性必需的,包括激酶RIOK1的多种不同的PRMT5结合配偶体也是如此。
在HCT116 MTAP wt/MTAP-/-同基因对中的shRNA消除筛选。
为了鉴定其丧失将导致选择性杀死MTAP缺陷型细胞的基因,在HCT116结肠癌细胞系和HCT116细胞(所述HCT116细胞经基因修饰以缺失MTAP基因的外显子6的(图1B))的同基因克隆中进行基于shRNA的消除筛选。该缺失导致MTAP蛋白质表达的完全丧失(图1C)。为了提供潜在的合成致死相互作用的广覆盖,我们构建了一个涵盖完整代谢组(3,067个基因)、线粒体蛋白质组(Pagliarini和Mootha Cell 2008)、表观基因组(Arrowsmith和ShapiraNature Reviews Drug Discovery 2012)、蛋白激酶组(http://www.uniprot.org/)和1500多个代表不同生物途径的其他基因的文库。用含有每个基因8个shRNA的shRNA文库转导HCT116 MTAP-/-和HCT116 wt细胞,并将敲低细胞库传代用于12个细胞***。在培养结束时,我们通过深度测序测量各shRNA条码的相对丰度,并计算与未转导的文库DNA相比的各shRNA的成倍消除。然后,我们根据HCT116 MTAP-/-与HCT116 wt细胞中靶向基因的8种shRNA中每种的丰度的log2成倍变化的差异来计算每种基因的MTAP选择性得分(图1D)。
该分析表明,虽然大多数基因以及shRNA对照在HCT116 MTAP-/-和HCT116 MTAP wt细胞中具有相似的评分(图1D),但是MTAP缺陷型细胞中的基因子集被选择性地消除(图1D-E)。筛选中最高命中的是MAT2A,其编码代谢酶甲硫氨酸腺苷转移酶II,α(图1D-F)。MAT2A通过甲硫氨酸的腺苷化催化甲基、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的通用生物供体的合成。筛选中第二个最优评分基因是蛋白质精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)(图1D-F),它是多蛋白质甲基转移酶复合物的催化亚基,其包含与专性结合配偶体WD45/MEP50(WD重复结构域45)/甲基转移酶复合体蛋白质50)复合的PRMT5和其他支架蛋白质(Meister等人,2001;Pesiridis等人,2009)。PRMT5属于精氨酸甲基转移酶的II型PRMT亚家族,并催化靶蛋白中的对称二甲基精氨酸的形成。有趣的是,第六高评分基因RIOK1编码含有Rio结构域的蛋白质,该蛋白质是将PRMT5引向PRMT5底物子集的选择性甲基化的PRMT5的结合配偶体(Guderian等人,2011)。这些数据表明,MAT2A和PRMT5催化的反应对于维持MTAP缺陷型细胞的活力至关重要。尽管所有三个强调的命中都代表了治疗和生物学上有意义的靶点,但我们最初将注意力集中在PRMT5上,因为目前正在努力将该酶用于治疗人类癌症(Chan Penebre Nature Chem Bio2015)。
PRMT5在基因消融后的MTAP缺失型细胞中是选择性必需的,但不是药理学靶向的。
为了进一步研究细胞中的MTAP缺陷与PRMT5功能之间的关系,我们生成了稳定表达靶向PRMT5的诱导型shRNA的HCT116 MTAP-/-和HCT116 wt细胞系。我们通过测量PRMT5蛋白的水平证实PRMT5被有效地敲低。与我们的基因组筛选结果一致,使用多西环素诱导型shRNA的PRMT5敲低导致具有MTAP缺失的细胞中比MTAP WT细胞中更完全的生长减少(图2B)。在MTAP缺失型细胞中表达shPRMT5抗性PRMT5 cDNA在内源性PRMT5敲低后挽救了生长抑制,而催化死亡的R368A PRMT5突变体(Pollack等,1999)cDNA的表达则没有这样(图2B-C)。因此,我们的shRNA的抗增殖作用是由于PRMT5消除而不是由于脱靶的shRNA效应。R386A-突变体PRMT5缺乏挽救表明PRMT5酶活性在MTAP-/-细胞中是必需的。有趣的是,MTAP-/-和WT细胞中PRMT5蛋白水平的等效降低导致MTAP-/-细胞系中对称二甲基精氨酸标记水平的更大降低,并且被PRMT5而不是R368A突变体cDNA挽救(图2D)。这些发现为我们的筛选结果提供了验证,并进一步表明PRMT5催化功能对于维持MTAP缺陷型细胞的生长至关重要。
接下来,我们想要使用药理学工具询问MTAP缺陷型细胞中的PRMT5功能。最近开发了PRMT5的强效和选择性抑制剂EPZ015666(Chan-Penebre等人,2015)。我们使用EPZ015666化合物并在HCT116同基因对中进行剂量反应分析(图2E)。然而,与PRMT5的基因靶向不同,PRMT5的药理学靶向后的生长抑制对MTAP缺陷型基因背景没有选择性(图2E)。考虑到PRMT5的催化死亡突变体没有挽救HCT116 MTAP-/-细胞中的生长表型,这一发现是出乎意料的,这表明PRMT5的催化功能丧失是选择性抑制这些细胞生长所必需的(图2A)。有趣的是,与PRMT5功能的基因消融不同,在具有EPZ015666的MTAP-/-和wt HCT116细胞中实现了相同程度的PRMT5活性抑制,这可通过总细胞裂解物中PRMT5依赖性二甲基精氨酸标记的水平的降低来证明(图2F)。基因和药理学PRMT5消融对MTAP缺陷型细胞生长的影响之间的这种令人惊讶的差异使我们进一步询问PRMT5和MTAP背后的基本生物学和代谢。
MTAP缺陷导致代谢状态改变。
为了解释PRMT5基因与药理学靶向对HCT116同基因对生长影响的差异,我们希望进一步建立我们对MTAP和PRMT5合成致死率的机理理解。MTAP是甲硫氨酸补救途径中的酶,其将多胺生物合成的副产物甲硫腺苷(MTA)转化回甲硫氨酸和腺嘌呤(图3A)。由于MTAP是哺乳动物细胞中已知唯一催化MTA降解的酶,我们假设MTAP缺陷会导致MTA蓄积。我们首先在更广泛的、无靶向的基于LC-MS的HCT116 MTAP同基因对中细胞内代谢物水平的代谢组学评估的背景下检验了该假设(图3B)。该分析显示,在检测到的237种注释代谢物中,与HCT116 wt对照相比,MTA显示出HCT116 MTAP-/-细胞的最大增幅。有趣的是,脱羧的S-腺苷甲硫氨酸(dcSAM)(多胺生物合成途径中MTA上游的代谢产物)显示出第二大增幅。这两种代谢物在HCT116 MTAP-/-细胞中的富集具有高度统计学意义(图3B)。使用HCT116同基因对中MTA水平的定量测量进一步证实了MTA的升高(图3C)。此外,包含249个不同肿瘤起源细胞系的大型癌细胞系组的筛选在内源性MTAP缺失的细胞培养基中显示出非常一致的MTA蓄积(图3D)。
MTA在体外和体内抑制PRMT5活性。
已报道MTA抑制蛋白质甲基转移酶的活性(Enouf等人,1979)。为了直接检验这一理念,我们进行了体外生化筛选,评估了用10μM和100μM的MTA处理后的33种不同N-甲基转移酶的酶活性(图4A)。仅在该组的小子集中观察到MTA的抑制,并且观察到对精氨酸甲基转移酶家族的成员PRMT5和PRMT4的最强的抑制(图4A)。此外,PRMT5在随后的测试多种MTA浓度的实验中表现出对MTA的强效敏感性(图4B)。接下来,我们分析了PRMT5、PRMT4和多种甲基转移酶子集的MTA Ki(图4C)。
明显地,PRMT5的MTA Ki(0.46μM)比任何其他甲基转移酶低20倍,这表明PRMT5对MTA的抑制作用比对所测试的任何其他甲基转移酶更敏感。该生化观察结果与我们的shRNA筛选数据一致,这证明PRMT5是在文库中代表的所有甲基转移酶中最强的命中并且在HCT116 MTAP-/-细胞中被选择性地消除(图1D)。
我们接下来讨论了MTA蓄积对细胞中PRMT5活性的影响。根据我们对MTAP缺陷型细胞(~100μM)中的细胞内MTA水平的LC-MS分析和我们的生化测定(3μM)中测量的MTA的PRMT5 IC50,我们假设MTA在MTAP缺陷型细胞中的蓄积足以导致PRMT5活性的抑制。在我们分析HCT116同基因对的总细胞裂解物中的PRMT5依赖性甲基标记期间,我们注意到HCT116MTAP-/-细胞似乎具有较低的基础甲基化水平(图2D)。为了进一步证实这一发现,我们对MTAP wt和MTAP缺失型细胞系子集的总细胞裂解物中的PRMT5依赖性甲基标记进行了蛋白质印迹分析(图4D)。我们观察到MTAP缺失型细胞系始终表现出较低水平的对称二甲基精氨酸标记(图4D)。最后,我们利用了MTAP的强效细胞渗透性过渡态类似物抑制剂的可用性(Basu等人,2011;Longshaw等人,2010)。我们用MTAP抑制剂处理HCT116 wt细胞三天,并测量MTAP的药理学抑制对二甲基精氨酸标记水平的影响(图4E)。用足以使MTA水平升高至HCT116 MTAP-/-细胞(图S4)中观察到的水平的MTAP抑制剂的剂量进行治疗导致二甲基精氨酸甲基标记水平降低,这与MTAP基因消融时观察到的相似(图4E)。这些数据强烈表明,MTAP缺失型细胞中的MTA损害PRMT5活性,这导致其蛋白质底物的甲基化减少,并且导致shRNA进一步降低PRMT5活性的易损性。此外,我们发现MTA抑制PRMT5提供了对用PRMT5抑制剂EPZ015666的MTAP选择性生长抑制的缺乏的解释。该抑制剂通过阳离子-π分子相互作用选择性结合至SAM-PRMT5复合物(Chan-Penebre等人,2015),而对于MTA-PRMT5复合物是不可能的。由于MTA阻止SAM与PRMT5结合,并且EPZ015666仅与SAM结合的PRMT5相互作用,因此MTA结合与EPZ015666结合相互排斥。单一酶的两种抑制剂只有在它们与单独的结合位点结合时才可具有协同作用,并且它们与靶点的相互作用不是相互排斥的(Breitinger)。
MAT2A在MTAP缺陷型细胞中是选择性必需的。
我们接下来想检验我们的shRNA筛选中最高命中的MAT2A是否也代表了MTAP缺陷型细胞中真正的合成致死靶标。因此,我们利用HCT116同基因对并产生稳定表达非靶向shRNA、MAT2A靶向shRNA的细胞系,以及另外用shRNA抗性MAT2A cDNA重建或表达MTAP cDNA的细胞系。我们通过蛋白质印迹证实了有效的MAT2A敲低,以及MAT2A和MTAP在HCT116细胞中的重新表达(图5A)。我们还证实,使用LC-MS分析,MAT2A敲低导致两种HCT116基因型中的SAM的细胞水平降低(图5B)。我们进一步证实,MTAP重新表达消除了HCT116 MTAP-/-细胞培养基中存在的高MTA水平。然后我们在4天和6天的体外生长测定中测试了MAT2A敲低对HCT116 wt与HCT116 MTAP-/-细胞的影响(图5C)。结果与我们的基因组筛选一致。MAT2A敲低选择性地减弱HCT116 MTAP-/-的生长,但不减弱HCT116 wt细胞的生长(图5C)。重要的是,通过引入shRNA抗性MAT2A cDNA构建体来挽救这种生长缺陷,表明shRNA的靶点命中(on-target)作用,并且还通过MTAP重新表达部分地挽救了该生长缺陷(图5C)。
为了研究我们发现的体外至体内的翻译,我们用表达诱导型MAT2A shRNA的HCT116同基因细胞系进行异种移植功效研究。在这些研究中,在用多西环素治疗动物之前使肿瘤形成,以评估MAT2A在已建立的肿瘤的增殖中的作用。通过蛋白质印迹证实体内MAT2A敲低的效率(图5D)。我们进一步证实,体内MAT2A基因消融导致两种基因型的HCT116异种移植物中SAM水平的类似降低(图5E)。根据我们的体外发现,由shRNA消除MAT2A后在体内观察到MTAP选择性生长抑制(图5F)。为了证明体内这种选择性生长抑制是靶点命中效应,我们用shMAT2A的野生型MAT2A挽救臂进行了体内扩增研究(图5G和5H)。该实验证实了在我们的第一次体内研究中观察到的功效(图5G和5H),并且与体外研究一样,在表达对MAT2A shRNA具有抗性的MAT2A cDNA的异种移植物中挽救了生长抑制(图5G和5H)。
最后,我们想在一个在MTAP基因座中具有内源性缺失的模型中证实我们的发现。因此,我们产生了稳定表达非靶向shRNA、MAT2A靶向shRNA的乳腺癌MCF7细胞系,以及另外用shRNA抗性MAT2A cDNA重建的细胞系。我们通过蛋白质印迹证明了MAT2A敲低和重新表达的效率(图5J)。与在HCT116模型***中进行的观察一致,MAT2A敲低在7天生长测定中减弱了MTAP缺失的MCF7细胞的生长(图5I),而MAT2A cDNA重建导致生长表型的完全挽救。因此,MAT2A在我们的模型中表现出与MTAP缺陷一致的合成致死率。
MAT2A丧失选择性地抑制MTAP缺失型细胞中的PRMT5活性。
在已确认PRMT5和MAT2A都是MTAP的真正合成致死配偶体之后,我们想要评估我们的筛选中两个最高命中之间是否存在机械联系。实际上,MAT2A产生SAM,其对于所有细胞甲基转移酶的活性是必需的,并且预期在MAT2A基因消融时SAM水平的降低会广泛影响其功能(包括PRMT5的功能)。因此,我们测量了在我们的MAT2A shRNA HCT116同基因对中的组蛋白质H4上的PRMT5依赖性对称二甲基精氨酸标记的水平,以及在MAT2A敲低后在MAT2A重构和MTAP重新表达细胞系中的水平(图6A)。有趣的是,我们观察到尽管两种基因型的HCT116细胞中SAM水平的降低程度相等(图5B),但H4R3me2s标记在MTAP缺陷型细胞中而不是在MTAPwt细胞中选择性地降低,并且在MAT2A和MTAP cDNA存在下得到挽救(图6A)。结合我们关于MTA对PRMT5活性的强烈抑制作用的观察结果,这些数据表明,MTAP缺失型背景中的PRMT5功能高度依赖于SAM的充分可用性。文献报道PRMT5对SAM具有低亲和力(Antonysamy等人,2012;Sun等人,2011)。我们因此比较了来自我们的体外生物化学组分析的N-甲基转移酶的SAM Km值,并观察到PRMT5确实表现出对SAM的最低亲和力(图6B)。该发现可以解释PRMT5对适当的MAT2A功能的依赖性,尤其是在MTAP缺陷型细胞的代谢改变的高MTA环境中(图6C)。因此,由于MTAP缺陷引起的代谢易损性延伸到PRMT5的上游,从而产生对PRMT5底物SAM的可用性的依赖性,并因此依赖于SAM产生酶MAT2A的活性。
多个PRMT5共复合物在MTAP缺失型细胞中容易损坏。
含有蛋白质RIOK1的Rio结构域在我们的shRNA消除筛选活动中是另一个强命中。由于其是PRMT5结合配偶体,我们试图在HCT116 MTAP同基因细胞中基因消融RIOK1后确认合成致死表型。类似于对PRMT5和MAT2A的表征,诱导型RIOK1 shRNA细胞系,以及RIOK1 wt拯救和RIOK1活性位点(D324N)和ATP结合域(K208R)催化失活突变体(Angermayr等人,2002;Widmann等人,2012)细胞系被创建。通过蛋白质印迹评估RIOK1敲低和再表达效率(图7A)。确认我们在基因组筛选中的发现,RIOK1敲低导致HCT116 MTAP-/-细胞生长的选择性抑制,对HCT116 wt细胞的生长影响最小(图7B)。通过表达shRNA抗性wt RIOK1而不是催化失活的K208R、D324N突变体RIOK1来挽救生长表型(图7B)。这些数据表明,通过MAP在MTAP缺陷背景中的蓄积而产生的代谢易损性通过对PRMT5结合配偶体RIOK1的影响而进一步延伸到PRMT5的下游。
PRMT5加入数种多聚体蛋白质共复合物,包括专性结合配偶体WD45/MEP50(Wilczek等人,2011)、互斥配偶体pICln和RIOK1(Guderian等人,2011)、特异性COPR5的核调节因子(PRMT5的合作者)(Lacroix等人,2008)等。在我们的shRNA文库中没有代表MEP50,也没有代表pICln或PRMT5的其他结合配偶体。因此,为了评估MTAP缺陷型细胞的易损性进一步扩展到超出RIOK1共复合物的PRMT5共复合物的可能性,我们进行了siRNA库介导的多个PRMT5共复合物成员的敲低,包括PRMT5本身、HCT116同基因对中的RIOK1、MEP50、pICln和COPR5(图7C和7D)。我们观察到在敲低PRMT5共复合物的每个成员后选择性抑制MTAP缺陷型细胞的生长(图7C)。重要的是,不管其MTAP状态如何,敲低单独的PRMT5结合蛋白质、由SMARCA4基因编码的ATP依赖性解旋酶Brgl (Pal等人,2004)抑制HCT116细胞的生长(图7C)。这些数据表明,PRMT5下游的MTAP缺陷型细胞的易损性不仅限于RIOK1共复合物,而是相当广泛地影响涉及作为结合配偶体的PRMT5的数种共复合物。MTAP缺失型细胞中的MTA蓄积降低了PRMT5活性并且对PRMT5的靶向产生了附带的易损性。这种易损性扩展到驻留在PRMT5上游和下游的代谢、表观基因和信号传导途径成员。
哺乳动物代谢组特征在于高度的灵活性和冗余性(Thielle&Pallson NatBiotech 2013以及Folger和Shlomi Molec Sys Bio 2011)。因此,MTA的不寻常之处在于它被单独的、非冗余的酶MTAP消耗。我们观察到在MTAP缺失后,MTA蓄积至约100uM的细胞内浓度,并且细胞开始排出过量的MTA。MTA的这种蓄积导致精氨酸甲基转移酶PRMT5中出乎意料的附带易损性。虽然shRNA文库含有39种甲基转移酶,但PRMT5在其高度的MTAP选择性方面是独特的。甲基转移酶的生物化学分析揭示了这种现象的分子基础。在我们体外测试的32种甲基转移酶中,PRMT5是对MTA抑制最敏感的酶。MTA对PRMT5的体外抑制在与MTAP-缺失型细胞中观察到的浓度非常相似的浓度下发生,表明这是一种生物相关现象。与此一致,我们观察到MTAP缺失的细胞中PRMT5甲基标记的基础水平显著降低。
降低的基础PRMT5活性产生了由shRNA进一步消融PRMT5的易损性。有趣的是,用PRMT5抑制剂EPZ-015666处理不会导致MTAP缺失型细胞中的选择性生长抑制。EPZ-015666具有非常独特的PRMT5抑制模式。该抑制剂是SAM-非竞争性的,并且通过与SAM上的部分带正电荷的甲基的不寻常的阳离子-π相互作用而与酶结合的SAM形成关键结合相互作用(Chan-penebre Nat Chem Bio 2015)。MTA不能与EPZ-015666(CITE Chan-penebre)形成这种协同结合相互作用。因此,这种现有的PRMT5抑制剂在MTAP缺失型癌症中不显示优势活性。利用MTAP缺失型癌症中的PRMT5易损性可能需要开发MTA选择性PRMT5抑制剂,其结合至MTA结合形式的PRMT5并将酶捕获在该状态。MTA选择性抑制剂可能提供比非选择性抑制剂更大的治疗窗,因为正常组织中的MTAP表达应通过维持低MTA水平提供保护作用。小鼠基因学研究表明,PRMT5在正常生理学中具有重要作用;PRMT5敲除导致胚胎致死性(Tee 2010),并且在CNS(Bezzi 2013)、骨骼肌(Zhang 2015)和造血谱系(Liu 2015)中的组织特异性PRMT5敲除时产生实质毒性。这些毒性可能在临床环境中变成剂量限制性的,从而缩小了以非选择性方式靶向PRMT5的药剂的治疗潜力。
细胞甲基转移酶活性受小分子代谢物的调节控制。先前已经确定甲基转移酶受底物SAM和产物SAH的相对平衡调节(Vance Cui Biochim Biophys Acta 1997)。SAM/SAH比率用于将细胞“甲基化潜力”计算为进行甲基转移酶反应的细胞平衡的量度(Williams&Schalinske J Nutrition 2006)。我们观察到PRMT5可被MTA抑制,这意味着PRMT5作为生物化学不同的甲基转移酶家族的示例成员,其可通过SAM/MTA比例调节。这种新的调节模式在MTAP缺失型癌细胞中非常清楚地揭示,其中MTA水平急剧蓄积。关于正常组织中的MTA水平的信息仅是有限的(Stevens&Oefner,J chromatography 2010),并且更广泛的MTA筛选可能揭示其中MTA蓄积导致PRMT5抑制的其他情境。我们还注意到PRMT5对SAM具有相当弱的结合亲和力。这在甲基转移酶家族中是不常见的,因为大多数哺乳动物甲基转移酶的SAM Km值比SAM的生理浓度低10至100倍(Richon&Copeland Chem Biol Drug Design 2011)。该生物化学发现表明将PRMT5准备为SAM敏感性甲基转移酶,并且通过在MTAP-缺失型细胞中MAT2A消除后观察到的PRMT5甲基标记的减少来举例说明这种敏感性。
PRMT5调节许多增殖和生物合成过程,例如控制细胞周期基因表达的组蛋白甲基化(Chung&Sif JBC 2013),生长因子信号传导组分如EGFR和Raf的甲基化(Hsu&Hung NatCell Bio 2011,Andreu-Perez&Recio,Sci Signaling 2011),以及核糖体和剪接体复合物成熟所需的关键蛋白成分的甲基化(Ren&Xu,JBC 2010,以及Friesen&Dreyfuss Mol CellBio 2001)。因此,PRMT5活性导致一系列促增殖和生物合成途径的协调上调。PRMT5在MTAP缺陷型癌症中的易损性延伸到PRMT5的上游(到MAT2A)和PRMT5的下游(到RIOK1和其他PRMT5共复合物成员)。总的来说,这些蛋白质包括代谢-表观遗传-信号传导轴,该轴感测并向位于PRMT 5下游的多种生物合成途径传递关于营养可用性(MAT2A底物甲硫氨酸)的信息。该轴为MTAP缺陷型癌症的靶向疗法提供了契机。除了设计MTA选择性PRMT5抑制剂的潜力之外,我们的工作表明,MAT2A、RIOK1或其他PRMT5共复合物成员的治疗靶向可以选择性地影响MTAP缺失型癌症,同时保留表达MTAP的正常组织。因此,这一易损轴包括许多蛋白质,这些蛋白质值得进一步考虑作为治疗靶点,以解决约15%的人的缺失MTAP/p16/CDKN2A位点的癌症。
用AGI-512和AGI-673筛选细胞系
AG-512和AG-673是MAT2A酶活性的小分子抑制剂,在生化测定中分别表明IC50为83nM和143nM,并抑制细胞中SAM的产生,IC50分别为80和490nM。对这些化合物进行筛选,以抑制数种具有不同组织来源的癌细胞系的生长,对这些癌细胞系测定MTAP状态(缺失型或野生型)。
表1
如表1所示数据表明,在细胞培养物或体内生长的MTAP缺失的肿瘤细胞对MAT2A抑制剂的抑制表现出预料不到的敏感性。数据表明,MTAP状态决定了肿瘤对MAT2A抑制剂的敏感性水平。据证明,肿瘤对MAT2A抑制剂的敏感性水平可以通过确定肿瘤细胞表达的MTAP的状态来评估。例如,其中不存在MTAP基因(即,MTAP缺失)或表达下调或MTAP蛋白功能受损的肿瘤细胞,与具有正常MTAP基因表达和MTAP蛋白功能的肿瘤细胞相比,与对MAT2A抑制剂有更高的敏感性。因此,这些观察结果可以为预测MAT2A抑制剂对肿瘤生长的作用的有价值的新诊断方法奠定基础,并为肿瘤学家提供另一种工具,帮助他们为患者选择最合适的治疗。
因此,本发明提供治疗个体中癌症的方法,其中所述肿瘤特征在于MTAP表达降低或缺失或者MTAP基因的缺失或者MTAP蛋白功能降低或无功能,所述方法包括向所述个体给药治疗有效量的MAT2A抑制剂。在一个实施方案中,所述癌症特征在于MTAP缺失(absence),即它是MTAP缺失的(null)。在另一个实施方案中,所述癌症特征在于MTAP基因的表达降低,例如,降低至所述癌症中MTA的水平足以抑制PRMT5甲基化活性的程度。在另一个实施方案中,所述癌症特征在于MTAP蛋白功能降低或无功能,例如,至所述癌症中MTA水平升高到抑制正常PRMT5甲基化活性的程度。PRMT5抑制剂包括但不限于WO/2014/145214、WO/2014/100716、WO/2014/100730、WO/2014/100695、WO/2014/100734和WO/2011/079236中记载的那些。
在特定实施方案中,本发明提供治疗个体中MTAP缺失型癌症的方法,其包括向所述个体给药治疗有效量的MAT2A抑制剂。在一个实施方案中,前述方法还包括检测所述癌症中MTAP基因的缺失,例如取自患者的癌症样品。
哺乳动物中的“癌症”是指存在具有癌症典型特征(例如不受控制的增殖、不死、转移潜能、快速生长和增殖速率)以及某些特征性形态特征的细胞。术语癌症和肿瘤在本文中可互换使用。通常,癌细胞是实体瘤的形式,但是这样的细胞可以单独存在于动物体内,或者可以作为独立的细胞在血流中循环,例如白血病细胞
除非另有说明,本文中所用的术语“治疗”是指部分或完全逆转、减轻、抑制进展或预防患者的肿瘤、肿瘤转移、或其它致癌或肿瘤细胞的生长。除非另有说明,本文中所用的术语“治疗”是指治疗的行为。“治疗癌症的方法”是指,经设计以减少或消除动物体内癌细胞数量或减轻癌症症状的行为操作或过程。
术语“有效量”或“有效量”是指MAT2A抑制剂化合物的量,或其与另一种药物组合的量,所述量会引起组织、***或动物体(例如被探寻的人体)的生物或医学反应。在一个实施方案中,所述反应是抑制肿瘤体积或肿瘤体积随时间增加的速率,例如静止体积或减小的体积。在另一个实施方案中,有效量是减少癌细胞数量或减少癌细胞数量增加速率的MAT2A抑制剂的量。在另一个实施方案中,有效量是足以引起至少一部分癌细胞分化的MAT2A抑制剂的量,例如,在血液肿瘤中未分化的母细胞向功能性中性白细胞的转化。治疗有效量并不一定意味着癌细胞会被完全消除,或者细胞数量会减少到零或无法检测,或者癌症症状被完全缓解。
肿瘤或肿瘤细胞中MTAP基因的表达水平和存在与否,以及MTAP蛋白功能可以使用常规技术来确定。例如,在美国专利No.5,942,393中记载了使用寡核苷酸探针确定肿瘤细胞中MTAP状态的方法。Norbori等人((1991)Cancer Res.51:3193-3197);和(1993)CancerRes.53:1098-1101)中记载了在牛MTAP中使用多克隆抗血清以在免疫印迹分析中检测从肿瘤细胞系或原发肿瘤标本中分离的MTAP蛋白。Garcia-Castellano等人(2002,同上)描述了使用抗人MTAP鸡抗体筛选包埋在OCT冷冻块中的骨肉瘤肿瘤样品。MTAP蛋白功能可通过测序MTAP蛋白以鉴定任何功能丧失突变或从样品中分离蛋白并测量其将MTA直接或间接转化成甲硫氨酸和/或腺嘌呤的能力来确定。
在本发明的另一个方面提供抑制癌细胞增殖或存活的方法,其中所述癌细胞特征在于MTAP表达的降低或缺失或者MTAP基因的缺失或者MTAP蛋白的功能降低,所述方法包括使所述癌细胞与有效量的MAT2A抑制剂接触。
另一方面,本发明提供诊断患者中肿瘤的方法,其包括在所述肿瘤的样品中测定MTAP基因表达水平的降低、MTAP基因的缺失或者MTAP蛋白水平或功能的降低,以及向所述患者给药治疗可接受量的MAT2A抑制剂。
另一方面,本发明提供表征肿瘤细胞的方法,其包括测量所述肿瘤细胞中MTAP基因表达水平、MTAP基因的存在与否或者存在的MTAP蛋白水平,其中,相对于参比细胞,MTAP表达的降低或缺失或者MTAP基因的缺失或者MTAP蛋白水平或功能的降低表明所述肿瘤细胞的存活或增殖能够被MAT2A抑制剂抑制。
在本发明的另一个方面提供测定是否能够通过使肿瘤细胞与MAT2A抑制剂接触来抑制所述肿瘤细胞的存活或增殖的方法,所述方法包括测定所述肿瘤细胞中MTAP的状态,其中MTAP表达的降低或缺失或者MTAP基因的缺失或者MTAP蛋白水平或功能的降低表明所述肿瘤细胞的存活或增殖能够被MAT2A抑制剂抑制。
对表1中细胞系的进一步基因组分析显示,与当存在KRAS突变时(p.008),49个中有24个(49%)MTAP野生型细胞系敏感相比,在也掺入KRAS突变的16个MTAP缺失细胞系中,14个(88%)对用AGI-512和AGI-673的MAT2A抑制敏感,此外,发现与不存在p53突变相比,MTAP缺失状态的共突变体p53突变的存在与对MAT2A抑制剂的改善的敏感性相关。
表2
*N-末端片段1-195
因此,本发明的方法还提供测定癌症或癌细胞中突变体KRAS或p53的存在,由此KRAS或p53突变的存在表明所述癌症或癌细胞易于用MAT2A抑制剂治疗。突变体KRAS或KRAS突变,是指掺入改变其正常功能的激活突变的KRAS蛋白以及编码所述蛋白的基因。例如,突变体KRAS蛋白可在第12或13位掺入单个氨基酸取代。在特定实施方案中,KRAS突变体掺入G12X或G13X取代。在特定实施方案中,所述取代是G12V、G12R、G12C或G13D。在另一个实施方案,所述取代是G13D。“突变体p53”或“p53突变”是指掺入抑制或消除其肿瘤抑制功能的突变的p53蛋白(或编码所述蛋白的基因)。适用于本发明的p53突变的实例显示在表2中
因此,本发明提供治疗个体中癌症的方法,其中所述癌症特征在于MTAP表达的降低或缺失或者MTAP基因的缺失或者MTAP蛋白的功能降低,所述方法包括向所述个体给药治疗有效量的MAT2A抑制剂,其中所述癌症特征还在于存在突变体KRAS或突变体p53。
本发明提供测定是否能够通过使肿瘤细胞与MAT2A抑制剂接触来抑制所述肿瘤细胞的存活或增殖的方法,所述方法包括测定所述肿瘤细胞中MTAP的状态和KRAS或p53突变的存在,其中除KRAS或p53突变之外,MTAP表达的降低或缺失或者MTAP基因的缺失或者MTAP蛋白的水平或功能的降低表明所述肿瘤细胞的存活或增殖能够被MAT2A抑制剂抑制。
另一方面,本发明提供表征肿瘤细胞的方法,其包括测量所述肿瘤细胞中MTAP基因表达水平、MTAP基因存在与否或者存在的MTAP蛋白的水平,并测定KRAS或p53突变的存在,其中相对于参比细胞,MTAP表达的降低或缺失或者MTAP基因的缺失或者MTAP蛋白水平或功能的降低,以及KRAS或p53突变的存在表明所述肿瘤细胞的存活或增殖可以被MAT2A抑制剂抑制。
另一方面,本发明提供测定肿瘤对MAT2A抑制反应性的方法,其包括在所述肿瘤的样品中测定MTAP基因的表达水平降低、MTAP基因的缺失或者MTAP蛋白水平或功能的降低与KRAS或p53突变的组合,其中MTAP基因的表达水平降低、MTAP基因的缺失或者MTAP蛋白水平或功能的降低以及KRAS或p53突变的存在表明所述肿瘤对MAT2A抑制剂有反应。
另一方面,本发明提供药盒,其包含用于测量肿瘤样品中MTAP基因的表达水平、MTAP基因的缺失或者MTAP蛋白的水平或功能的降低以及KRAS或p53突变的存在的试剂,所述药盒还包含给药治疗有效量的MAT2A抑制剂的说明书。
在本文中所述的方法中,所述肿瘤细胞通常来自被诊断患有癌症、癌前状态或其他形式的异常细胞生长并需要治疗的患者。所述癌症可以是肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC))、胰腺癌、头颈癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌或下文所述的多种其他癌症中的任一种。
在本发明的方法中,MTAP表达水平和MTAP蛋白功能可以相对于参比细胞(例如非癌细胞)中的MTAP表达水平和MTAP蛋白功能进行评估。在本发明的方法中,肿瘤细胞表达的MTAP水平可以通过使用本领域已知的用于测定基因表达水平的任何标准生物测定方法来评估,其包括例如ELISA、RIA、免疫沉淀法、免疫印迹法、免疫荧光显微镜检查、RT-PCR、原位杂交、cDNA微阵列等,如下面详细描述的那样。在本发明的方法中,MTAP的表达水平优选通过分析活组织检查来评估。
在本发明的方法中,所述癌细胞可以是任意组织类型,例如胰腺、肺、膀胱、乳腺、食道、结肠、卵巢。在特定实施方案中,所述癌细胞是胰腺。在另一实施方案中,所述癌细胞是肺。在另一实施方案中,所述癌细胞是食道。所述肿瘤细胞优选为已知或预期为MTAP缺失类型的细胞。
MAT2A抑制剂是调节MAT2A功能的任何药剂,例如,与MAT2A相互作用以抑制或增强MAT2A活性或以其他方式影响正常MAT2A功能的药剂。MAT2A功能可以在任意水平上受到影响,包括转录、蛋白质表达、蛋白质定位和细胞或细胞外活性。在本发明的方法中,所述MAT2A抑制剂可以是任何MAT2A抑制剂。在特定实施方案中,所述MAT2A抑制剂是通过例如结合和抑制MAT2A核酸(即DNA或mRNA)来抑制MAT2A基因表达或产物活性的寡核苷酸。在特定实施方案中,所述MAT2A抑制剂是寡核苷酸,例如为反义寡核苷酸、shRNA、siRNA、microRNA或适体。在特定实施方案中,所述MAT2A抑制剂是寡核苷酸,例如,如WO2004065542中所记载。在特定实施方案中,所述MAT2A抑制剂是siRNA,例如,如专利申请CN 2015-10476981或Wang等人,Zhonghua Shiyan Waike Zazhi,2009,26(2):184-186或Wang等人,Journal ofExperimental&Clinical Cancer Research(2008)第27卷中所记载。在特定实施方案中,所述MAT2A抑制剂是microRNA寡核苷酸,例如,如美国专利申请公开NO.20150225719或者Lo等人,PLoS One(2013),8(9),e75628中所记载。在一实施方案中,所述MAT2A抑制剂是结合MAT2A的抗体。
在特定实施方案中,所述MAT2A抑制剂是小分子化合物,例如AGI-512或AGI-673。在一实施方案中,所述MAT2A抑制剂是Zhang等人,ACS Chem Biol,2013,8(4):796-803中所记载的氟化N,N-二烷基氨基二苯乙烯。在一实施方案中,所述MAT2A抑制剂是Sviripa等人,J Med Chem,2014,57:6083-6091中所记载的2′,6′-二卤代苯乙烯基苯胺、吡啶或嘧啶。在特定实施方案中,所述化合物选自化合物1a-12b:
在另一实施方案中,所述MAT2A抑制剂为WO2012103457中所记载的化合物。在一实施方案中,所述MAT2A抑制剂为下式的化合物:
X-Ar1-CRa=CRb-Ar2
其中Ra和Rb独立地为H、烷基、卤素(halo)、烷氧基、氰基;X表示Ar1上的至少一个卤素(halogen),例如氟、氯、溴或碘取代基;Ar1和Ar2各自为芳基(例如苯基、萘基)和杂芳基(例如吡啶基、吡咯烷基、哌啶基、嘧啶基、吲哚基、噻吩基),其可进一步被卤素、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、芳基烷基氨基、二烷基氨基的N-氧化物、三烷基铵、巯基、烷硫基、烷酰基、硝基、亚硝酰基、氰基、烷氧基、烯基氧基、芳基、杂芳基、磺酰基、磺酰胺基、CONR11R12、NR11CO(R13)、NR11COO(R13)、NR11CONR12Rn取代,其中R11、R12、R13独立地为H、烷基、芳基、杂芳基或氟;条件是Ar2在芳环中包含至少一个氮原子或者在芳环上包含至少一个氮取代基;例如Ar2上的NRcRdZ取代基,其中Rc为H、烷基、烷氧基、芳基、杂芳基,Rd为烷基,Z为未共享电子对、H、烷基、氧。
在另一实施方案中,所述MAT2A抑制剂为下式的化合物:
其中Ra和Rb如上文所定义,R1至R10独立地为H、卤素、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、二烷基氨基的N-氧化物、芳基烷基氨基、二烷基氧基氨基、三烷基铵、巯基、烷硫基、烷酰基、硝基、亚硝酰基、氰基、烷氧基、烯基氧基、芳基、杂芳基、磺酰基、磺酰胺基、CONR11R12、NR11CO(R13)、NR11COO(R13)、NR11CONR12R13,其中R11、R12、R13独立地为H、烷基、芳基、杂芳基或氟;条件是R1至Rs中的至少一个为卤素,例如氟和/或氯;并且R6至R10中的至少一个为含氮取代基,例如NRcRdZ取代基,其中Rc为H、烷基(例如低级烷基)、烷氧基、芳基、杂芳基,Rd为烷基,Z为未共享电子对、H、烷基、氧,或其药学上可接受的盐,或其生物素化衍生物。
在另一实施方案中,所述MAT2A抑制剂为下式的化合物:
其中R1、R2、R3、R5、R6、R7、R9、R10、Ra、Rb和NRcRdZ如上文所定义,或其药学上可接受的盐,或其生物素化衍生物。在本公开的-个方面中,Ra、Rb均为H,R1、R2、R3或R5中的至少一个为氟或氯,并且Rc为H或低级烷基,诸如甲基、乙基、丙基,并且Rd为低级烷基,诸如甲基、乙基、丙基。在一实施方案中,所述MAT2A抑制剂选自(E)-4-(2-氟苯乙烯基)-N,N-二甲基苯胺;(E)-4-(3-氟苯乙烯基)-N,N-二甲基苯胺;(E)-4-(4-氟苯乙烯基)-N,N-二甲基苯胺;(E)-4-(2-氟苯乙烯基)-N,N-二乙基苯胺;(E)-4-(2-氟苯乙烯基)-N,N-二苯基苯胺;(E)-1-(4-(2-氟苯乙烯基)苯基)-4-甲基哌嗪;(E)-4-(2-氟苯乙烯基)-N,N-二甲基萘-1-胺;(E)-2-(4-(2-氟苯乙烯基)苯基)-1-甲基-1H-咪唑;(E)-4-(2,3-二氟苯乙烯基)-N,N-二甲基苯胺;(E)-4-(2,4-二氟苯乙烯基)-N,N-二甲基苯胺;(E)-4-(2,5-二氟苯乙烯基)-N,N-二甲基苯胺;(E)-2-(2,6-二氟苯乙烯基)-N,N-二甲基苯胺;(E)-3-(2,6-二氟苯乙烯基)-N,N-二甲基苯胺;(E)-4-(2,6-二氟苯乙烯基)-N,N-二甲基苯胺;(E)-4-(2,6-二氟苯乙烯基)-N,N-二乙基苯胺;(E)-4-(3,4-二氟苯乙烯基)-N,N-二甲基苯胺;(E)-4-(3,5-二氟苯乙烯基)-N,N-二甲基苯胺;(E)-N,N-二甲基-4-(2,3,6-三氟苯乙烯基)苯胺;(E)-N,N-二甲基-4-(2,4,6-三氟苯乙烯基)苯胺;(E)-4-(2-氯-6-氟苯乙烯基)-N,N-二甲基苯胺;(E)-4-(2,6-二氯苯乙烯基)-N,N-二甲基苯胺;(E)-4-(2,6-二氟苯乙基)-N,N-二甲基苯胺;和(E)-2-苯甲酰胺-4-(2,6-二氟苯乙烯基)-N,N-二甲基苯胺。
在本发明的另一个方面提供治疗个体中癌症的方法,其中所述肿瘤特征在于MTAP表达降低或缺失或者MTAP基因的缺失或者MTAP蛋白功能降低或无功能,所述方法包括向所述个体给药治疗有效量的RIOK1抑制剂。在一实施方案中,MAT2A抑制剂与RIOK1抑制剂联合给药。在一实施方案中,所述癌症特征在于MTAP缺失,即它是MTAP缺失的。在另一实施方案中,所述癌症特征在于MTAP基因的表达降低。在另一实施方案中,所述癌症的进一步特征在于存在KRAS或p53突变。另一方面提供治疗MTAP缺失型癌症的方法,其包括给药有效量的RIOK1抑制剂。在一实施方案中,所述癌症掺入突变体KRAS或突变体p53。
在本发明的另一个方面提供治疗个体中癌症的方法,其中所述肿瘤特征在于MTAP表达降低或缺失或者MTAP基因的缺失或者MTAP蛋白功能降低或无功能,所述方法包括向所述个体给药治疗有效量的PRMT5抑制剂。在一实施方案中,MAT2A抑制剂与PRMT5抑制剂联合给药。在一实施方案中,所述癌症特征在于MTAP缺失,即它是MTAP缺失的。在另一实施方案中,所述癌症特征在于MTAP基因的表达降低。在另一实施方案中,所述癌症的进一步特征在于存在KRAS或p53突变。另一方面提供治疗MTAP缺失型癌症的方法,其包括给药有效量的PRMT5抑制剂。在一实施方案中,所述癌症掺入突变体KRAS或突变体p53。
在上述涉及患者样品的任何方法中,这种样品的实例可以是肿瘤活组织检查。为了评估肿瘤细胞MTAP表达,包含肿瘤细胞或由这些肿瘤细胞产生的蛋白质或核酸的患者样品可用于本发明的方法中。在这些实施方案中,MTAP的表达水平通过评估肿瘤细胞样品中MTAP的量(例如,绝对量或浓度)来评估,例如从患者获得的肿瘤活组织检查,或包含肿瘤来源材料的其他患者样品(例如血液、血清、尿或如上所述的其他体液或***物)。当然,在评估样品中标记物的量之前,可以对细胞样品进行多种众所周知的收集后制备和储存技术(例如,核酸和/或蛋白质提取、固定、储存、冷冻、超滤、浓缩、蒸发、离心等)。同样地,肿瘤活组织检查也可进行收集后制备和储存技术,例如固定。
在另一实施方案中,通过从细胞或患者样品中制备mRNA/cDNA(即转录的多核苷酸),并通过将mRNA/cDNA与作为MTAP核酸或其片段的互补物的参比多核苷酸杂交来评估MTAP的表达。cDNA可任选地在与参比多核苷酸杂交之前使用多种聚合酶链反应方法中的任何一种扩增。一种或多种生物标志物的表达同样可以使用定量PCR来检测,以评估MTAP的表达水平。
MTAP在正常(即非癌)人体组织中的表达水平可以通过多种方式评估。在一实施方案中,该正常表达水平通过评估生物标记物在似乎为非癌细胞部分中的表达水平,然后将该正常表达水平与肿瘤细胞部分中的表达水平进行比较来评估。或者,特别是当由于常规实施本文中所述方法而获得进一步信息时,可以使用本发明生物标记物正常表达的群体平均值。在其他实施方案中,可以通过评估从非癌症患者获得的患者样品、从患者中疑似癌症发作之前从所述患者获得的患者样品、从存档的患者样品等中获得的患者样品中的表达来确定表达MTAP的“正常”水平。
用于检测生物样品中是否存在MTAP蛋白或核酸的示例性方法包括由测试个体获得生物样品(例如肿瘤相关体液),并将所述生物样品与能够检测多肽或核酸(例如mRNA、基因组DNA或cDNA)的化合物或试剂接触。因此,本发明的检测方法可用于检测例如体外和体内生物样品中的mRNA、蛋白质、cDNA或基因组DNA。例如,mRNA的体外检测技术包括Northern杂交和原位杂交。用于生物标记物蛋白的体外检测技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀和免疫荧光。基因组DNA的体外检测技术包括Southern杂交。mRNA的体内检测技术包括聚合酶链反应(PCR)、Northern杂交和原位杂交。此外,用于生物标记物蛋白的体内检测技术包括将针对该蛋白或其片段的标记抗体引入个体。例如可用放射性的标记物将抗体标记,然后通过标准的成像技术检测其在个体内的存在和位置。
这种诊断和预后测定分析的一般原理包括在适当的条件下制备可能包含MTAP基因和探针的样品或反应混合物,并经过一段足以使MTAP基因和探针相互作用和结合的时间,从而形成可在反应混合物中移除和/或检测的复合物。这些测定可以多种方式进行。例如,进行这种测定的一种方法会涉及将MTAP基因或其片段或探针锚定在固相载体(也称为底物)上,并在反应结束时检测锚定在固相上的靶MTAP基因/探针复合物。在这种方法的一个实施方案中,来自要测定MTAP基因的存在和/或浓度的个体的样品可以锚定在载体或固相载体上。在另一实施方案中,也可能是相反的情况,其中将探针锚定在固相上并使个体样品当作测定中未锚定组分来进行反应。
有许多现成的方法用于将测定组分锚定到固相上。这些包括但不限于MTAP基因或其片段或通过生物素和链霉抗生物素蛋白缀合固定的探针分子。这种生物素化的测定组分可使用本领域已知的技术(例如生物素化药盒、Pierce Chemicals、Rockford,I11.)由生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)制备,并将其固定在链霉抗生物素蛋白包被的96孔板(PierceChemical)的孔中。在某些实施方案中,具有固定的测定组分的表面可以预先制备并储存。公知的载体包括但不限于玻璃、聚苯乙烯、尼龙、聚丙烯、尼龙、聚乙烯、葡聚糖、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁矿。
为了用上述方法进行测定,将未固定的组分加入第二组分锚定的固相中。反应完成后,可以在使形成的任何络合物保持固定在固相上的条件下移除(例如通过洗涤)未络合的组分。锚定在固相上的MTAP基因/探针复合物的检测可通过本文列出的多种方法完成。在一实施方案中,当探针是未锚定的测定组分时,可以直接或间接地用本文所讨论的并且是本领域技术人员熟知的可检测标记来标记探针,以便检测和读出测定结果。还可以直接检测MTAP基因/探针复合物的形成,而无需进一步操作或标记任何组分(基因或探针),例如通过利用荧光共振能量转移技术(即FRET,参见例如,Lakowicz等人美国专利No.5,631,169;Stavrianopoulos等人,美国专利No.4,868,103)。选择第一“供体”分子上的荧光团标记,使得在用适当波长的入射光激发时,其发射的荧光能量会被第二“受体”分子上的荧光标记吸收,所述第二“受体”分子进而能够由于吸收的能量而发荧光。作为另外的选择,“供体”蛋白分子可仅利用色氨酸残基的天然荧光能量。选择发射不同光波长的标记,从而使“受体”分子标记可以与“供体”分子标记区分开来。由于标记间能量转移的效率与分子分离距离相关,因此可以评估分子间的空间关系。在分子间发生结合的情况下,测定中“受体”分子标记的荧光发射应该最大。FRET结合情况可以方便地通过本领域公知的标准荧光检测装置(例如使用荧光计)来测量。
在另一实施方案中,通过利用诸如实时生物分子相互作用分析(BIA)的技术,可以在不标记测定组分(探针或MTAP基因)的情况下测定探针识别生物标记物的能力(参见例如,Sjolander,S.和Urbaniczky,C.,1991,Anal.Chem.63:2338-2345和Szabo等人,1995,Curr.Opin.Struct.Biol.5:699-705)。本文中所用的“BIA”或“表面等离子体共振”是一种用于实时研究生物特异性相互作用而不标记任何相互作用剂(例如,BIAcore)的技术。结合表面质量的改变(指示结合情况)导致近表面光折射率的改变(表面等离子共振(SPR)的光学现象),这导致产生可用作指示生物分子间实时反应的可检测信号。
作为另外的选择,在另一实施方案中,可以用MTAP基因和探针作为液相溶质进行类似的诊断和预后测定。在这样的测定中,通过众多标准技术(包括但不限于:差速离心、色谱法、电泳和免疫沉淀)中的任何一种,将复合生物标记物和探针与未复合组分分离。在差速离心中,MTAP基因/探针复合物可以通过一系列离心步骤由未络合的测定组分中分离出来,这是因为复合物的不同沉降平衡基于它们的不同大小和密度而不同(参见例如Rivas G和Minton A.P.,1993,Trends Biochem Sci.18(8):284-7)。标准色谱技术也可用于分离复合分子和未复合分子。例如,凝胶过滤色谱法根据大小分离分子,并且通过以柱形式使用合适的凝胶过滤树脂,例如,相对较大的复合物可以与相对较小的未复合组分分离。类似地,与未复合组分相比,MTAP基因/探针复合物的相对不同的电荷性质可用于区分复合物和未复合组分,例如通过使用离子交换色谱法树脂。所述树脂和色谱技术对本领域技术人员而言是众所周知(参见例如Heegaard,N.H.,1998,J.Mol.Recognit.Winter 11(1-6):141-8;Hage,D.S.,和Tweed,S.A.J.Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997Oct 10;699(1-2):499-525)。凝胶电泳也可用于将复合测定组分与未结合组分分离(参见例如,Ausubel等人,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,1987-1999)。例如,在该技术中,蛋白质或核酸复合物根据大小或电荷来分离。为了在电泳过程中保持结合相互作用,非变性凝胶基质材料和无还原剂存在的条件通常是优选的。特定测定及其组分的合适条件对于本领域技术人员来说是众所周知的。
在特定实施方案中,MTAP mRNA的水平可以使用本领域已知的方法通过生物样品中的原位和体外形式来测定。术语“生物样品”旨在包括从个体分离的组织、细胞、生物流体及其分离物,以及存在于个体内的组织、细胞和流体。许多表达检测方法使用分离的RNA。对于体外方法,任何不选择性阻止分离mRNA的RNA分离技术可用于从肿瘤细胞中纯化RNA(参见例如,Ausubel等人,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York 1987-1999)。此外,大量组织样品可以使用本领域技术人员熟知的技术容易地处理,例如,Chomczynski(1989美国专利No.4,843,155)的一步RNA分离方法。分离的mRNA可以用于杂交或扩增测定,其包括但不限于Southern或Northern分析、聚合酶链反应分析和探针阵列。一个优选的检测mRNA水平的诊断方法包括将分离的mRNA与核酸分子(探针)接触,所述核酸分子可与被检测基因编码的mRNA杂交。所述核酸探针可以是例如全长cDNA或其部分,例如长度为至少7、15、30、50、100、250或500个核苷酸的寡核苷酸,并足以在严格条件下与编码MTAP的mRNA或基因组DNA特异性杂交。本文描述了用于本发明诊断测定的其它合适探针。mRNA与探针杂交表明MTAP基因正在表达。在一种方式中,将mRNA固定在固体表面上并与探针接触,例如通过在琼脂糖凝胶上分离mRNA并将mRNA从凝胶转移到诸如硝化纤维素膜上。在其它供选择的方式中,将探针固定在固体表面上并使探针与mRNA接触,例如在Affymetrix基因芯片阵列中。技术人员可以容易地调整已知的mRNA检测方法,以用于检测由MTAP基因编码的mRNA水平。
测定样品中MTAP mRNA水平的另一供选择的方法包括核酸扩增处理,例如通过RT-PCR(Mullis,1987,美国专利No.4,683,202中提出的实验实施方案),连接酶链式反应(Barany,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:189-193),自我持续序列复制(Guatelli等人,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874-1878),转录扩增***(Kwoh等人,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173-1177),Q-β复制酶(Lizardi等人,1988,Bio/Technology 6:1197),滚环复制(Lizardi等人,美国专利No.5,854,033)或其他任何的核酸扩增方法,然后使用本领域技术人员熟知的技术检测扩增的分子。如果核酸分子以非常低的量存在时,则这些检测方案对于所述核酸分子的检测特别有用。如本文中所使用,扩增引物定义为核酸分子对,其将基因(分别是正链和负链,或反之亦然)的5′或3′区域退火,并在其间包含短区域。通常,扩增引物的长度为约10至30个核苷酸,并且位于约50至200个核苷酸长的区域的侧面。在合适条件下并用合适的试剂,则这些引物使得包含了与引物侧接的核苷酸序列的核酸分子扩增。
对于原位方法,在检测前不需要从肿瘤细胞中分离mRNA。在这样的方法中,使用已知的组织学方法制备/处理细胞或组织样品。然后将样品固定在载体(通常是载玻片)上,然后同可与编码生物标记物的mRNA杂交的探针接触。
在本发明的另一实施方案中,检测MTAP蛋白。用于检测MTAP蛋白的优选试剂是能够结合MTAP蛋白或其片段的抗体,优选具有可检测标记的抗体。抗体可为多克隆的或更优选地为单克隆的。可以使用完整抗体或其片段或衍生物(例如Fab或F(ab’)2)。关于探针或抗体,术语“标记”旨在涵盖通过将可检测物质偶联(即物理连接)到探针或抗体来直接标记探针或抗体,以及通过与直接标记的另一试剂反应来间接标记所述探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的二级抗体检测一级抗体,以及用生物素对DNA探针进行末端标记,从而使其可以用荧光标记的链霉抗生物素蛋白检测。
MTAP蛋白可使用本领域技术人员熟知的技术从肿瘤细胞中分离。所采用的蛋白质分离方法可以是,例如Harlow和Lane (Harlow和Lane,1988,Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)中所记载的。可以采用多种形式来确定样品是否含有与给定抗体结合的蛋白。这种形式的实例包括但不限于酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)、蛋白质印迹分析和酶联免疫吸附测定(ELISA)。技术人员可以容易地调整已知的蛋白/抗体检测方法,以用于确定肿瘤细胞是否表达本发明的生物标记物。在一种形式中,抗体或抗体片段或衍生物可用于诸如蛋白质印迹或免疫荧光技术的方法中,以检测表达的MTAP蛋白。在这样的应用中,通常优选将抗体或MTAP蛋白固定在固体载体上。合适的固相载体(support)或载体(carrier)包括任何能结合抗原或抗体的载体。众所周知的载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁矿。本领域技术人员会理解,存在许多其它适合结合抗体或抗原的载体,并且能够使这种载体适于与本发明一起使用。例如,从肿瘤细胞分离的MTAP蛋白可以在聚丙烯酰胺凝胶电泳上运行,并固定在固相载体如硝化纤维素上。然后可以用合适的缓冲液洗涤载体,接着用可检测标记的抗体处理。然后可以用缓冲液再次洗涤固相载体,以除去未结合的抗体。然后通过常规的方法检测固相载体上结合的标记的量。
对于ELISA测定,特异性结合对可以是免疫型或非免疫型的。免疫特异性结合对的实例是抗原-抗体***或半抗原/抗半抗原***。可以提及荧光素/抗荧光素、二硝基苯基/抗二硝基苯基、生物素/抗生物素、肽/抗肽等。特异性结合对的抗体成员可以通过本领域技术人员熟悉的常规方法产生。这些方法包括用特异性结合对的抗原成员免疫动物。如果特异性结合对的抗原成员不是免疫原性的,例如半抗原,那么它可以共价偶联到载体蛋白上以使其具有免疫原性。非免疫结合对包括其中两种组分彼此具有天然亲和力但不是抗体的***。示例性的非免疫对是生物素-链霉抗生物素蛋白、固有因子-维生素B12、叶酸-叶酸结合蛋白等。
多种方法可用于用特异性结合对的成员共价标记抗体。根据特异性结合对成员的性质、所需连接的类型以及抗体对各种缀合化学物质的耐受性来选择方法。生物素可以通过利用市售活性衍生物共价偶联到抗体上。其中一些是生物素-N-羟基-琥珀酰亚胺,其与蛋白质上的胺基团结合;通过碳二亚胺偶联与碳水化合物部分、醛和羧基结合的生物素酰肼;以及结合巯基的生物素马来酰亚胺和碘乙酰基生物素。荧光素可以使用异硫氰酸荧光素偶联到蛋白质胺基团上。二硝基苯基可以用2,4-二硝基苯硫酸盐或2,4-二硝基氟苯偶联到蛋白质胺基团上。可以采用其它缀合的标准方法将单克隆抗体偶联到特定结合对的成员上,包括二醛、碳二亚胺偶联、同功能交联和异双功能交联。碳二亚胺偶联是将一种物质上的羧基偶联到另一种物质上的胺基团上的有效方法。通过使用市售试剂1-乙基-3-(二甲基-氨基丙基)-碳二亚胺(EDAC)促进碳二亚胺偶联。
包含双官能亚氨酸酯和双官能N-羟基琥珀酰亚胺酯的同官能交联剂可商购获得,并用于将一种物质上的胺基团偶联到另一种物质上的胺基团上。异双官能交联剂是具有不同官能团的试剂。最常见的市售异双官能交联剂具有胺反应性N-羟基琥珀酰亚胺酯作为一个官能团,以及巯基反应性基团作为第二个官能团。最常见的巯基反应性基团是马来酰亚胺、吡啶基二硫化物和活性卤素。官能团之一可以是光敏芳基氮宾,其在辐射后与各种基团反应。
特异性结合对的可检测标记的抗体或可检测标记的成员通过偶联到报告子来制备,所述报告子可以是放射性同位素、酶、荧光、化学发光或电化学材料。两种常用的放射性同位素是125I和3H。标准放射性同位素标记步骤包括氯胺T、乳过氧化物酶和Bolton-Hunter法用于125I以及还原甲基化3H。术语“可检测标记的”是指标记分子使得其可以通过标记的固有酶活性或通过与另一种组分的标记结合而容易地检测到,所述另一种组分本身可以容易地检测到。
适用于本发明的酶包括但不限于,辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、荧光素酶(包括萤火虫和海肾荧光素酶)、β-内酰胺酶、脲酶、绿色荧光蛋白(GFP)和溶菌酶。酶标记通过使用上述二醛、碳二亚胺偶联、同双功能交联剂和异双功能交联剂将抗体与特定结合对的成员偶联来促进。
所选择的标记方法取决于酶和待标记材料上可用的官能团,以及两者对缀合条件的耐受性。本发明中使用的标记方法可以是但不限于,目前使用的任何常规方法之一,包括由Engvall和Pearlmann,Immunochemistry 8,871(1971)、Avrameas和Ternynck,Immunochemistry 8,1175(1975)、Ishikawa等人,J.Immunoassay 4(3):209-327(1983)和Jablonski,Anal.Biochem.148:199(1985)中所描述的那些。标记可以通过间接方法完成,例如使用间隔物或特定结合对的其他成员。其实例是用未标记的链霉抗生物素蛋白和生物素化酶检测生物素化抗体,链霉抗生物素蛋白和生物素化酶被顺序或同时加入。因此,根据本发明,用于检测的抗体可以用报告子直接检测标记,或者用特异性结合对的第一成员间接检测标记。当抗体偶联到特异性结合对的第一成员时,则通过使特异性结合复合物的抗体-第一成员与如上所述标记或未标记的结合对的第二成员反应来进行检测。此外,未标记的检测器抗体可以通过使未标记的抗体与对于未标记的抗体特异的标记抗体反应来检测。在这种情况下,如上文使用的“可检测标记的”是指含有表位,对于未标记抗体特异的抗体可通过该表位结合。这种抗抗体可以使用上文所讨论任何方法直接或间接标记。例如,所述抗抗体可以与生物素偶联,生物素通过与上文讨论的链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶***反应来检测。在本发明的一个实施方案中,使用生物素。生物素化抗体进而与链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶复合物反应。邻苯二胺、4-氯-萘酚、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS、BTS或ASA可以用于实现显色检测。
在实施本发明的一种免疫测定形式中,使用前向夹心测定法,其中使用常规技术将捕获试剂固定在载体表面上。用于测定的合适载体包括合成聚合物载体,例如聚丙烯、聚苯乙烯、取代的聚苯乙烯(例如,胺化或羧化聚苯乙烯)、聚丙烯酰胺、聚酰胺、聚氯乙烯、玻璃珠、琼脂糖或硝化纤维素。
在本发明的一个方面提供药盒,其包含用于测量肿瘤样品中的MTAP基因的表达水平、MTAP基因的缺失或者MTAP蛋白的水平或功能的降低的试剂,所述药盒还包含用于给药治疗有效量的MAT2A抑制剂的说明书。这种药盒可以用于测定个体是否正患有肿瘤或者发展为肿瘤的风险增大,所述肿瘤不通过MAT2A抑制剂抑制。例如,所述药盒可包含能够检测生物样品中的MTAP蛋白或核酸的标记化合物或试剂以及用于测定所述样品中的蛋白质或mRNA的量的装置(如结合蛋白质或者其片段的抗体,或者结合到编码所述蛋白质的DNA或mRNA的寡核苷酸探针)。药盒还可包含用于解释用所述药盒得到结果的说明书。对于基于抗体的药盒,所述药盒可包含如(1)第一抗体(例如,连接到固体载体),其结合到MTAP蛋白;以及任选存在的(2)另一不同的抗体,其结合到蛋白质或者第一抗体并且缀合到可检测标记。
对于基于寡核苷酸的药盒,所述药盒可包含例如(1)寡核苷酸,如可检测标记的寡核苷酸,其与编码MTAP蛋白的核酸序列杂交,或者(2)可用于扩增MTAP核酸的一对引物。所述药盒还包含例如缓冲剂、防腐剂或蛋白稳定剂。所述药盒可还包含对于检测可检测标记所必需的组分(如酶或底物)。所述药盒还可包含一个对照样品或一系列对照样品,所述对照样品可被测定并与测试样品相比较。所述药盒的每个组分可以与用于解释用所述药盒进行测定所得的结果的说明书一起包装在单个容器中,而且所有的各种容器都可以在单个包装中。
本发明还提供用于治疗患者中肿瘤的方法,其包括通过例如本文所述的用于测定MTAP基因的表达水平的任意方法评估MTAP状态(即,MTAP基因的表达是否已经减少,MTAP基因是否缺失或者MTAP蛋白是否缺失或者功能降低)来诊断患者对MAT2A抑制剂的可能反应性,以及向所述患者给药治疗有效量的MAT2A抑制剂的步骤。在该方法中,结合有关各患者的任何额外情况,一种或多种额外的抗癌药或疗法可以与所述MAT2A抑制剂同时或顺序联合给药,如给药医师考虑到患者对MTAP抑制剂的可能反应性的预测下判断为合适的。
医学领域技术人员会理解,在诊断患者对MAT2A抑制剂的可能反应性后向所述患者给药治疗有效量的MAT2A抑制剂的精确方式会由主治医师判断。给药方式(包括剂量、与其他抗癌药联用、给药的时机和频率等)可能受患者对MAT2A抑制剂的可能反应性的诊断以及患者的病症和病史的影响。
在本发明的上下文中,所述MAT2A抑制剂可以与细胞毒性化疗或抗癌药联合给药,所述细胞毒性化疗或抗癌药包括例如:烷化剂或者具有烷化作用的药剂如环磷酰胺(CTX;如)、苯丁酸氮芥(CHL;如)、顺铂(Cisp;如)、白消安(如)、美法仑、卡莫司汀(BCNU)、链脲霉素、曲他胺(TEM)、丝裂霉素C等;抗代谢药,例如甲氨蝶呤(MTX)、依托泊苷(VP16;如)、6-巯嘌呤(6MP)、6-硫鸟嘌呤(6TG)、阿糖胞苷(Ara-C)、5-氟尿嘧啶(5-FU),卡培他滨(如)、达卡巴嗪(DTIC)等;抗生素类,例如放线菌素D、多柔比星(DXR;如)、柔红霉素(道诺霉素)、博来霉素、普卡霉素等;生物碱类,例如长春花生物碱类,例如长春新碱(VCR)、长春碱等;以及其它抗肿瘤药剂例如紫杉醇(如)和紫杉醇衍生物、细胞生长抑制剂、糖皮质激素如***(DEX;如)和皮质类固醇例如波尼松、核苷酶抑制剂例如羟基脲、氨基酸耗竭酶(amino acid depleting enzymes)例如天冬酰胺酶、亚叶酸(leucovorin)和其它叶酸衍生物,以及类似不同的抗肿瘤药。还可以将下列药剂用作附加药剂:氨磷汀(如)、放线菌素D、二氯甲基二乙胺(氮芥)、链佐星、环磷酰胺、洛莫司汀(CCNU)、多柔比星脂质体(lipo)(如)、吉西他滨(如)、柔红霉素脂质体(如)、丙卡巴肼、丝裂霉素、多西他赛(如)、阿地白介素、卡铂、奥沙利铂、克拉屈滨、喜树碱、CPT 11(伊立替康)、10-羟基7-乙基-喜树碱(SN38)、氟尿苷、氟达拉滨、异环磷酰胺、伊达比星、美司钠、干扰素β、干扰素α、米托蒽醌、托泊替康、亮丙瑞林、甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、普卡霉素、米托坦、培门冬酶、喷司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、他莫昔芬、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、噻替派、乌拉莫司汀、长春瑞滨、苯丁酸氮芥。
本发明还提供用于治疗患者中肿瘤的上述方法,其包括向所述患者给药治疗有效量的MAT2A抑制剂,且另外同时或顺序给药一种或者多种抗激素剂。如本文所用,术语“抗激素剂”包括天然的或者合成的有机或者肽化合物,其用以调节或者抑制激素对肿瘤的作用。抗激素剂包括例如:载体激素受体拮抗剂、抗***类(例如他莫昔芬、雷洛昔芬)、芳香酶抑制4(5)-咪唑、其它芳香酶抑制剂、42-羟基他莫昔芬,曲奥昔芬、雷洛西芬(keoxifene)、LY 117018、奥那司酮和托瑞米芬(如);抗雄激素类(例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林);以及上述任何药剂的药学上可接受的盐、酸或者衍生物;糖蛋白激素的激动剂和/或拮抗剂例如滤泡刺激激素(FSH)、促甲状腺素(TSH),以及促黄体激素(LH)和LHRH(促黄体激素释放激素);可作为(AstraZeneca)商购的LHRH激动剂戈舍瑞林醋酸酯;LHRH拮抗剂D-丙氨酰胺N-乙酰基-3-(2-萘基)-D-丙氨酰-4-氯-D-苯丙氨酰-3-(3-吡啶基)-D-丙氨酰-L-丝氨酰-N6-(3-吡啶基羰基)-L-赖氨酰-N6-(3-吡啶基羰基)-D-赖氨酰-L-亮氨酰-N6-(1-甲基乙基)-L-赖氨酰-L-脯氨酸(如Ares-Serono);LHRH拮抗剂醋酸加尼瑞克;可作为(Bristol-MyersOncology)商购的甾体抗雄激素类醋酸环丙孕酮(CPA)和醋酸甲地孕酮;可作为(Schering Corp.)商购的非甾体抗雄激素氟他胺(2-甲基-N-[4,20-硝基-3-(三氟甲基)苯丙酰胺];非甾体抗雄激素尼鲁米特,(5,5-二甲基-3-[4-硝基-3-(三氟甲基-4′-硝基苯基)-4,4-二甲基-咪唑烷-二酮];以及其它非许可受体的拮抗剂,例如RAR、RXR、TR、VDR等的拮抗剂。
化疗方案中使用上述细胞毒性的和其它的抗癌药在癌症疗法领域已经被很好的表征,并且在一些调节的情况下,它们在本文中的应用归入对耐药性和有效性的监测以及对给药途径和剂量的控制进行相同的考虑。例如,细胞毒性药剂的实际剂量可以是变化的,其取决于通过使用组织培养方法测定的患者的培养细胞应答。通常,相比于在没有额外其它药剂时使用的量,所述剂量会减少。有效细胞毒性试剂的典型剂量可以在制备商推荐的范围内,并且当通过体外应答或者动物模型中的应答表明时,可将其降低高达约一个数量级的浓度或者量。因此,实际的剂量会取决于医师的判断、患者的病况,和治疗方法的有效性,所述治疗方法基于初级培养的恶性肿瘤细胞或者组织培养的组织样品的体外有效性,或者在适当动物模型中观察到的反应。
本发明还提供用于治疗患者中肿瘤或者肿瘤转移的上述方法,其包括向所述患者给药治疗有效量的MAT2A抑制剂,且另外同时或顺序给药一种或者多种血管生成抑制剂。抗血管生成剂包括例如:VEGFR抑制剂如SU-5416和SU-6668(Sugen Inc.of South SanFrancisco,Calif.,USA),或者如诸如国际申请No.WO 99/24440、WO 99/62890、WO 95/21613、WO 99/61422、WO 98/50356、WO 99/10349、WO 97/32856、WO 97/22596、WO 98/54093、WO 98/02438、WO 99/16755和WO 98/02437以及美国专利No.5,883,113、5,886,020、5,792,783、5,834,504和6,235,764中所记载;VEGF抑制剂例如IM862(Cytran Inc.ofKirkland,Wash.,USA);血管酶(angiozyme),一种来自核酶(Boulder,Colo.)和Chiron(Emeryville,Calif.)的合成核酶;以及VEGF的抗体,例如贝伐单抗(如AVASTINTM,Genentech,South San Francisco,CA),VEGF的重组人源化抗体;整合蛋白受体拮抗剂和整合蛋白拮抗剂,例如αvβ3、αvβ5和αvβ6整合蛋白及其亚型的拮抗剂,例如西仑吉肽(EMD121974),或者抗整合蛋白抗体诸如αvβ3特异性人源化抗体(如);因子如IFN-α(美国专利No.41530,901、4,503,035和5,231,176);血管生成抑制因子(angiostatin)和血纤蛋白溶解酶原片段(例如kringle 1-4、kringle 5、kringle 1-3(O′Reilly,M.S.等人(1994)Cell 79:315-328;Cao等人(1996)J.Biol.Chem.271:29461-29467;Cao等人(1997)J.Biol.Chem.272:22924-22928);内皮他丁(O′Reilly,M.S.等人(1997)Cell 88:277;和国际专利申请No.WO 97/15666);凝血酶敏感蛋白(TSP-1;Frazier,(1991)Curr.Opin.CellBiol.3:792);血小板因子4(PF4);纤维蛋白溶酶原激活剂/尿激酶抑制剂;尿激酶受体拮抗剂;肝素酶;夫马洁林类似物如TNP-4701;舒拉明和舒拉明类似物;血管抑素类固醇;bFGF拮抗剂;flk-1和flt-1拮抗剂;抗血管生成剂如MMP-2(基质-金属蛋白酶2)抑制剂和MMP-9(基质-金属蛋白酶9)抑制剂。有用的基质金属蛋白酶抑制剂的实例在国际专利公开No.WO 96/33172、WO 96/27583、WO 98/07697、WO 98/03516、WO 98/34918、WO 98/34915、WO 98/33768、WO 98/30566、WO 90/05719、WO 99/52910、WO 99/52889、WO 99/29667和WO 99/07675,欧洲专利公开No.818,442、780,386、1,004,578、606,046和931,788;英国专利公开No.9912961和U.S.专利No.5,863,949和5,861,510中记载。优选的MMP-2和MMP-9抑制剂是具有很少或者没有抑制MMP-1的活性的那些。更优选地,是相对于其它基质-金属蛋白酶(即MMP-1、MMP-3、MMP-4、MMP-5、MMP-6、MMP-7、MMP-8、MMP-10、MMP-11、MMP-12和MMP-13)选择性地抑制MMP-2和/或MMP-9的那些。
本发明还提供用于治疗患者中肿瘤的上述方法,其包括向所述患者给药治疗有效量的MAT2A抑制剂,且另外同时或顺序给药一种或多种肿瘤细胞促凋亡剂或者凋亡刺激剂。本发明还提供用于治疗患者中肿瘤的上述方法,其包括向所述患者给药治疗有效量的MAT2A抑制剂,且另外同时或顺序给药一种或多种信号转导抑制剂。信号转导抑制剂包括例如:erbB2受体抑制剂,例如有机分子,或者结合到erbB2受体的抗体,如曲妥珠单抗(如);其它蛋白酪氨酸激酶抑制剂如imitinib(如);ras抑制剂;raf抑制剂(如BAY 43-9006、Onyx Pharmaceuticals/Bayer Pharmaceuticals);MEK抑制剂;mTOR抑制剂;细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂;蛋白激酶C抑制剂;和PDK-1抑制剂(参见Dancey,J.和Sausville,E.A.(2003)Nature Rev.Drug Discovery 2:92-313,用于描述这些抑制剂的数种实例,以及它们在治疗癌症的临床试验中的应用)。ErbB2受体抑制剂包括例如:ErbB2受体抑制剂诸如GW-282974(Glaxo Wellcome plc)、单克隆抗体例如AR-209(Aronex Pharmaceuticals Inc.of The Woodlands,Tex.,USA)和2B-1(Chiron),以及诸如国际公开No.WO 98/02434、WO 99/35146、WO 99/35132、WO 98/02437、WO 97/13760和WO95/19970以及U.S.专利No.5,587,458、5,877,305、6,465,449和6,541,481中记载的erbB2抑制剂。
本发明还提供用于治疗患者中肿瘤的上述方法,其包括向所述患者给药治疗有效量的MAT2A抑制剂,且另外同时或顺序给药一种或多种额外的抗增殖剂。额外的抗增殖剂包括例如:酶法呢基(farnesyl)蛋白转移酶的抑制剂和受体酪氨酸激酶PDGFR的抑制剂,包括U.S.专利No.6,080,769、6,194,438、6,258,824、6,586,447、6,071,935、6,495,564、6,150,377、6,596,735和6,479,513以及国际专利公布WO 01/40217中公开和请求保护的化合物。
本发明还提供用于治疗患者中的肿瘤的上述方法,其包括向所述患者给药治疗有效量的MAT2A抑制剂,且另外同时或顺序进行放射治疗或用放射性药物治疗。辐射源对被治疗患者来说可以是外部或者内部的。当所述源对患者是外部时,该疗法被称为外部光束放射疗法(EBRT)。当辐射源对患者是内部时,所述治疗被称为近距离放射疗法(BT)。在本发明上下文中使用的放射性原子可以选自包括但不仅限于:镭、铯-137、铱-192、镅-241、金-198、钴-57、铜-67、锝-99、碘-123、碘-131,以及铟-111。当本发明的MAT2A抑制剂为抗体时,用这样的放射性同位素标记所述抗体也是可能的。放射疗法是用于控制无法切除或者不宜手术的肿瘤和/或肿瘤转移的标准治疗。当将放射疗法与化学疗法联合时已经观察到了改善的结果。放疗基于这样的原理:将高剂量的放射递送到靶区域会导致肿瘤和正常组织中的繁殖细胞死亡。放射剂量方案通常以放射吸收剂量(Gy)、时间和分级来定义,并且必须由肿瘤学家仔细定义。患者接受的放射量会取决于多种考虑,但是最重要的两个考虑是肿瘤相对于身体其它重要结构和器官的位置,以及肿瘤已经扩展的程度。患者所要经历的放射治疗的典型疗程为在1周-6周时间的治疗计划,其中给予所述患者的全部剂量为10-80Gy,每一天为约1.8-2.0Gy的单一部分,一周5天。在本发明的优选实施方案中,当用本发明的治疗与放射治疗联合治疗人患者的肿瘤时,会有协同效果。换句话说,当联合放射疗法,任选地联合额外的化疗或抗癌药时,通过含有本发明组合的药剂增强了对肿瘤生长的抑制。辅助放射疗法的参数包含在例如国际专利公开WO99/60023中。
本发明还提供用于治疗患者中肿瘤或肿瘤转移的上述方法,其包括向所述患者给药治疗有效量的MAT2A抑制剂,且另外同时或顺序用能够增强抗肿瘤免疫应答的一种或多种药剂进行治疗。能够增强抗肿瘤免疫应答的药剂包括例如:CTLA4(细胞毒性淋巴细胞抗原4)抗体(如MDX-CTLA4),和其它能够阻断CTLA4的药剂。可应用于本发明的具体CTLA4抗体包括美国专利No.6,682,736中记载的那些。
如本文中使用,术语“患者”优选指因任何目的需要MAT2A抑制剂治疗的人,更优选需要这种治疗来治疗癌症或者癌前状态或者病损的人。但是,术语“患者”也可以指非人动物,优选需要MAT2A抑制剂治疗的哺乳动物如狗、猫、马、牛、猪、绵羊以及非人灵长类动物等。
所述癌症优选是通过给药MAT2A抑制剂可部分或者全部治疗的任何癌症。所述癌症可以是例如,肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、支气管肺泡细胞肺癌(bronchioloalviolarcell lung cancer)、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或者眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、***区域的癌症、胃癌(stomach cancer)、胃部癌(gastric cancer)、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、***、***癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌***癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、***癌、***癌、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆管癌(biliarycancer)、慢性或者急性白血病、淋巴细胞淋巴瘤、中枢神经***(CNS)瘤、脊椎瘤、脑干胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经鞘瘤、室管膜细胞瘤、髓母细胞瘤、脑脊膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤,包括任何上述癌症的难治性版本,或一种或者多种上述癌症的组合。癌前状态或者病损包括例如:口腔白斑、光化性角化病(日光性角化病)、结肠或者直肠的癌前息肉、胃上皮发育不良、腺瘤发育不良、遗传性非息肉病性结肠癌综合征(HNPCC)、巴雷特食管、膀胱发育不良和癌前宫颈病症。
通常以这样的给药方案将MAT2A抑制剂向患者给药,所述方案提供如本领域已知对待治疗患者最有效的癌症治疗(同时从效力和安全角度考虑)。在实施本发明治疗方法时,可将所述MAT2A抑制剂以任何本领域已知的有效方式进行给药,例如经口、局部、静脉内、腹膜内、肌肉内、关节内、皮下、鼻内、眼内、***、直肠或者真皮内途径,这取决于所要治疗癌症的种类、所使用MAT2A抑制剂的类型(例如小分子、抗体、RNAi、核酶或者反义构建体),以及处方医生如基于例如已公开的临床研究结果的医学判断。
所给药的MAT2A激酶抑制剂的量和给药时机取决于被治疗患者的类型(种族、性别、年龄、重量等)和病况、被治疗疾病或病况的严重性,以及给药途径。例如,可以剂量范围0.001-100mg/kg体重每天或者每周以单独或者分开的剂量,或者通过连续输注将小分子MAT2A激酶抑制剂向患者给药。可以剂量范围0.1-100mg/kg体重每天或者每周以单独或者分开的剂量,或者通过连续输注将基于抗体MAT2A抑制剂,或者反义RNAi或者核酶构建体向患者给药。在一些情况下,低于前述范围下限的剂量水平可以是足够的,而在另一些情况下,可以使用更大的剂量而不引起任何有害的副作用,条件是这些更大的剂量在全天给药前首先被分成数个小剂量。
所述MAT2A抑制剂可以与多种药学上可接受的惰性载体一起以下列形式给药:片剂、胶囊、糖锭、锭剂、硬糖、散剂、喷雾剂、乳膏剂、油膏、栓剂、胶冻、凝胶、糊剂、洗剂、软膏、酏剂、糖浆等。这些剂型的给药可以单个或多个剂量进行。载体包括固体稀释剂或者填充剂,无菌水性介质和各种非毒性有机溶剂等等。口服药物组合物可以被适当地变甜和/或调味。所述抑制剂可以与多种药学上可接受不的惰性载体以下列各种形式组合:喷雾剂、乳膏剂、油膏、栓剂、胶冻、凝胶、糊剂、洗剂、软膏等。这些剂型的给药可以单个或多个剂量进行。载体包括固体稀释剂或者填充剂,无菌水性介质和各种非毒性有机溶剂等。应该对所有含有蛋白质抑制剂的制剂进行选择以避免抑制剂变性和/或降解和丧失生物活性。
制备包含MAT2A抑制剂的药物组合物的方法是本领域已知的,并记载在例如Remington′s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,第18版(1990)中。对于口服给药抑制剂,含有一种或者全部所述活性剂的片剂与各种赋形剂的任何一种组合,所述赋形剂例如微晶纤维素、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸,以及各种崩解剂例如淀粉(并且优选玉米、马铃薯或者木薯淀粉),藻酸和某些复合硅酸盐,以及粒化粘合剂例如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖,明胶和***胶。另外,润滑剂例如硬脂酸镁、月桂硫酸钠和滑石粉通常对于压片目的是有用的。类似类型的固体组份还可以被用作明胶胶囊中的填充剂;在这一点,优选的材料还包括半乳糖或者乳糖以及高分子量的聚乙二醇。当水性混悬剂和/或酏剂需要口服给药时,所述抑制剂可以与各种甜味剂或调味剂、着色物质或者染料结合使用,如果需要,也有乳化剂和/或助悬剂,连同稀释剂如水、乙醇、丙二醇、甘油及其各种可能的组合。对于肠胃外给药任何一种或者全部两种所述活性剂,可以使用芝麻油或者花生油中的溶液,或者使用水性丙二醇中的溶液,以及含有所述活性剂或其相应的水溶性盐的无菌水溶液。这样的无菌水溶液被优选适当地缓冲并还优选使其等渗,例如,用足量的盐水或者葡萄糖。这些特别的水溶液特别适于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内注射目的。油性溶液适用于关节内、肌肉内和皮下注射目的。所有这些溶液在无菌条件下的制备通过本领域技术人员熟知的标准制药技术可以很容易地实现。应该对任何给予蛋白质抑制剂的肠胃外制剂进行选择以避免所述抑制剂变性和丧失生物活性。
另外,依照标准药学实践,可以通过以下方式局部给药一种或者全部两种所述活性剂:例如乳膏剂、洗剂、胶冻、凝胶、糊剂、油膏、软膏等。例如,可以制备含有约0.1%(w/v)至约5%(w/v)浓度的MAT2A抑制剂的局部制剂。
为了兽用目的,可以将所述活性剂以上述任何形式和任何途径分别或者一起向动物给药。在优选的实施方案中,以胶囊、大丸剂、片剂、液体灌药(liquid drench)的形式通过注射或者作为植入物给药所述抑制剂。作为其它的选择,可将所述抑制剂与动物饲料一起给药,为此目的,可以制备浓缩的饲料添加剂或者预混和物以用于正常动物饲养。依照标准的兽医实践,以常规方法制备这样的制剂。
用于制备和分离单克隆抗体和抗体片段的技术在本领域为人熟知,并且描述在Harlow和Lane,1988,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory中,以及在J.W.Goding,1986,Monoclonal Antibodies:Principles andPractice,Academic Press,London中。人源化抗MAT2A抗体和抗体片段也可以通过已知的技术制备,如在Vaughn,T.J.等人,1998,Nature Biotech.16:535-539及其中引用的文献中记载的那些,并且这些抗体或其片段在实施本发明中同样有用。
本发明使用的MAT2A抑制剂可另外基于反义寡核苷酸构建体。包括反义RNA分子和反义DNA分子的反义寡核苷酸可以通过结合其上来直接阻断MAT2A mRNA的翻译,并由此防止蛋白翻译或者增加mRNA降解,从而降低MAT2A蛋白水平,并因此减少其在细胞内的活性。例如通过如常规的磷酸二酯技术可以合成至少约15个碱基的且与编码MAT2A的mRNA转录序列的独特区域互补的反义寡核苷酸,并通过例如静脉内注射或者输液给药。使用反义技术来特异抑制其序列已知的基因的基因表达的技术为本领域熟知(参见例如U.S.专利No.6,566,135;6,566,131;6,365,354;6,410,323;6,107,091;6,046,321和5,981,732)。
小抑制性RNA(siRNA)也可以作为抑制剂用于本发明。MAT2A基因表达可以通过用小双链RNA(dsRNA)或者引起小双链RNA产生的载体或构建体来接触肿瘤、个体或者细胞而降低,从而MAT2A的表达被特异性抑制(即RNA干扰或者RNAi)。对于序列已知的基因,选择合适的dsRNA或者dsRNA-编码载体的方法在本领域为人熟知(例如参见Tuschi,T.等人(1999)Genes Dev.13(24):3191-3197;Elbashir,S.M.等人(2001)Nature 411:494-498;Hannon,G.J.(2002)Nature 418:244-251;McManus,M.T.and Sharp,P.A.(2002)Nature ReviewsGenetics 3:737-747;Bremmelkamp,T.R.等人(2002)Science 296:550-553;U.S.专利No.6,573,099和6,506,559;以及国际专利公开No.WO 01/36646、WO 99/32619和WO 01/68836)。
核酶也可以作为抑制剂用于本发明。核酶是能够催化RNA特异切割的酶RNA分子。核酶作用的机理涉及核酶分子与互补靶RNA的序列特异性杂交,随后被核酸内切切割。因此特异并有效地催化mRNA序列的核酸内切切割的工程化的发卡状或锤头状基序核酶分子在本发明的范围内有用。任何可能RNA靶中的特殊核酶切割位点通过扫描靶分子找寻核酶切割位点而被最初鉴定,其通常包括下列序列:GUA、GUU和GUC。一旦鉴定出来后,可以评价相应于含有切割位点的靶基因区域的大约15-20个核糖核苷酸的短RNA序列的预测结构特征,例如二级结构,这可以导致寡核苷酸序列不合适。也可以通过测试他们与互补寡核苷酸的杂交可接近性来评价候选靶的合适性,例如使用核酶保护测定。
可以通过已知的方法来制备用作抑制剂的反义寡核苷酸和核酶。这些包括用于化学合成的技术例如诸如通过固相亚磷酰胺(phosphoramatide)化学合成。或者,可以通过体外或者体内转录编码RNA分子的DNA序列来产生反义RNA分子。这样的DNA序列可以被掺入到各种各样的载体内,所述载体掺入合适的RNA聚合酶启动子如T7或者SP6聚合酶启动子。作为增加细胞内稳定性和半衰期的手段,可以引入对本发明寡核苷酸的多种修饰。可能的修饰包括但不限于将核糖核苷酸或者脱氧核糖核苷酸的侧翼序列加到所述分子的5’和/或3’末端,或者在寡核苷酸骨架中使用硫代磷酸酯(phosphorothioate)或者2′-O-甲基而不是磷酸二酯酶键。
术语“药学上可接受的盐”指的是由药学上可接受的非毒性的碱或者酸制备的盐。当本发明的化合物是酸性时,其相应的盐可以由药学上可接受的非毒性碱中方便地制备,包括无机碱和有机碱。由这样的无机碱衍生的盐包括铝、铵、钙、铜(铜和亚铜)、铁、亚铁、锂、镁、锰(锰和亚锰)、钾、钠、锌等盐。特别优选的是铵、钙、镁、钾和钠盐。衍生自药学上可接受的有机非毒性碱的盐包括伯胺、仲胺和叔胺的盐,以及环胺和取代的胺如天然存在的和合成取代的胺的盐。其它可以形成盐的药学上可接受的有机非毒性碱包括离子交换树脂例如精氨酸、甜菜碱、咖啡碱、胆碱、N′,N′-二苄乙二胺、二乙胺、2-二乙基氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、二乙胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、葡糖胺、氨基葡糖、组氨酸、哈胺(hydrabamine)、异丙胺、赖氨酸、甲基葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、聚胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨基丁三醇(tromethamine)等等。
当本发明中使用的化合物是碱性时,其相应的盐可以方便地从药学上可接受的非毒性酸来制备,所述酸包括无机酸和有机酸。这些酸包括例如乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、富马酸、葡糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、硝酸、扑酸、泛酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对苯甲磺酸等。特别优选的是柠檬酸、氢溴酸、盐酸、马来酸、磷酸、硫酸和酒石酸。
用于本发明的含有作为活性成分的MAT2A抑制剂化合物(包括其药学上可接受的盐)的药物组合物可包含药学上可接受的载体和任选存在的其它治疗组分或者助剂。其它的治疗剂可以包括如上列出的那些细胞毒性的、化疗的或者抗癌药,或者提高这些药剂的效果的药剂。所述组合物包括适用于口服、直肠、局部和肠胃外给药(包括皮下、肌肉内和静脉内)的组合物,尽管任何给定情况中最合适的途径将取决于特定的宿主,以及所要给药活性成分的病况的性质和严重性。所述药物组合物可以单位剂型方便地给出,并且以药学领域所熟知的任何方法制备。
在实践中,依照常规药物组合技术,可以将本发明的抑制剂化合物(包括其药学上可接受的盐)以活性成分的形式与药物载体组合在紧密掺合物中。所述载体可以采用广泛种类的形式,这取决于需要给药的制剂的类型,例如经口或者肠胃外(包括静脉内)。因此,本发明的药物组合物可以呈现为适于口服给药的离散单位如胶囊、扁囊剂或者片剂,其各自都含有预定量的活性成分。此外,所述组合物可以呈现为散剂、颗粒、溶液、水性液体中的悬浮剂、非水性液体、水包油乳剂,或者油包水液体乳剂。除了上面举出的常规剂型外,MAT2A抑制剂化合物(包括其每种组分的药学上可接受的盐)还可以通过缓释方式和/或递送装置给药。可以通过任何药学方法制备组合组合物。通常,这样的方法包括将活性成分与构成一种或者多种必需成分的载体相关联的步骤。通常,通过均匀化和紧密掺合活性成分与液体载体或细碎的固体载体或两者来制备所述组合物。然后,可将产品方便地制成需要呈现的形状。
用于本发明的抑制剂化合物(包括其药学上可接受的盐)可以与一种或多种其他治疗活性化合物组合包含在药物组合物中。其它的治疗活性化合物可以包括如上面列出的那些细胞毒性的、化疗的或者抗癌药,或者增强这些药剂效果的药剂。因此在本发明的一个实施方案中,所述药物组合物可以含有与抗癌药联用的MAT2A抑制剂,其中所述抗癌药是选自下列的一员:烷基化药物、抗代谢药、微管抑制剂、鬼臼毒素、抗生素、亚硝基脲、激素疗法、激酶抑制剂、肿瘤细胞凋亡活化剂,以及抗血管生成剂。应用的药物载体可以是例如固体、液体或者气体。固体载体的实例包括乳糖、白土、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、***胶、硬脂酸镁和硬脂酸。液体载体的实例是糖浆、花生油、橄榄油和水。气体载体的实例包括二氧化碳和氮气。在制备用于口服剂型的组合物中,可以使用任何方便的药物介质。例如水、二醇、油、醇类、调味剂、防腐剂、着色剂等可以被用于形成口服液体制剂例如混悬剂、酏剂和溶液;而例如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、粒化剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等的载体可以被用于形成口服固体制剂例如散剂、胶囊和片剂。由于他们给药方便,所以片剂和胶囊是优选的口服剂量单位,由此应用固体药用载体。任选地,片剂可以用标准的水性或者非水性技术包衣。含有用于本发明使用的组合物的片剂可以任选地与一种或者多种附属组分或者助剂通过压制或者成型来制备。压缩片剂可以通过在合适的机器中压缩自由流动形式如粉末或颗粒的活性组分来制备,所述活性组分任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂或者分散剂混和。成型片剂可以通过在适宜的机器中将用惰性液体稀释剂润湿的粉末化合物的混合物塑型来制备。各片剂优选含有大约0.05mg至大约5g的活性组分,并且各扁囊剂或者胶囊剂优选含有大约0.05mg至大约5g的活性成分。例如,用于向人口服给药的制剂可以含有大约0.5mg至大约5g的活性剂,与可从大约5%变化至大约95%全部组合物的合适且便捷量的载体物质混合。单位剂型通常含有从大约1mg到大约2g的活性组分,通常为25mg、50mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、800mg或者1000mg。
用于本发明的适用于肠胃外给药的药物组合物可以被制备为在水中的活性化合物的溶液或者混悬剂。可以包含合适的表面活性剂,诸如羟丙基纤维素。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇及其在油中的混和物中来制备。此外,可以包含防腐剂以防止微生物的有害生长。用于本发明的适合注射用的药物组合物包括无菌的水性溶液或者分散体。此外,所述组合物可以无菌粉末的形式用于临时制备这样的无菌可注射溶液或者分散体。在所有情况下,最终的可注射形式必须是无菌的并且必须是有效的流体以方便注射。所述药物组合物必须在制备和储存条件下是稳定的;因此,其优选应该以防止微生物如细菌和真菌的污染作用的方式保存。所述载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、植物油及其适当的混合物的溶剂或者分散介质。本发明的药物组合物可以适用于局部使用的方式存在,例如气溶胶、乳膏剂、软膏剂、洗剂、撒粉等。此外,所述组合物可以是适用于经皮装置的形式。这些制剂可以利用MAT2A抑制剂化合物(包括其药学上可接受的盐),经由常规方法制备。作为实例,通过混和亲水物质和水,以及大约5重量%到大约10重量%的所述化合物来制备乳膏剂或者软膏剂,以制备具有所需稠度的乳膏剂或者软膏剂。
本发明的药物组合物可以是适于直肠给药的形式,其中载体是固体。优选的是,混和物形成单位剂量栓剂。合适的载体包括可可脂和其它本领域常用的物质。所述栓剂可以通过首先将所述组合物与软化的或者融化的载体混和并在模具中冷却和成型来方便地形成。除了上述载体成分外,上文描述的药物制剂,如果合适,可以包含一种或者多种另外的载体组分,例如稀释剂、缓冲剂、调味剂、粘合剂、表面活性剂、增稠剂、润滑剂,防腐剂(包括抗氧化物)等。另外,可以包含其它的助剂来使得所述制剂与目的受体的血液等渗。含有MAT2A抑制剂化合物(包括其药学上可接受的盐)的组合物也可以制备成粉末或者液体浓缩物形式。
用于实施本发明的化合物的剂量水平可以近似地如本文所述,或者如本领域对这些化合物的描述那样。但是应该理解的是,对于任何具体患者的特定剂量水平会取决于许多因素,包括年龄、体重、综合健康、性别、饮食、给药时间、给药途径、***率、药物组合以及受治疗的具体疾病的严重性。
在实践本发明中,本领域已知的许多其它供选择的实验方法可以成功替代本文中具体描述的那些,例如可用于本发明相关技术领域的许多出色的手册和课本中描述的(例如Using Antibodies,A Laboratory Manual,由Harlow,E.和Lane,D.编辑,1999,ColdSpring Harbor Laboratory Press,(例如ISBN 0-87969-544-7);Roe B.A.等人1996,DNAIsolation and Sequencing(Essential Techniques Series),John Wiley&Sons.(例如ISBN 0-471-97324-0);Methods in Enzymology:Chimeric Genes and Proteins″,2000,ed.J.Abelson,M.Simon,S.Emr,J.Thorner.Academic Press;Molecular Cloning:aLaboratory Manual,2001,第3版,Joseph Sambrook和Peter MacCallum,(之前的ManiatisCloning工具书)(例如ISBN 0-87969-577-3);Current Protocols in MolecularBiology,Ed.Fred M.Ausubel等人John Wiley&Sons(例如ISBN 0-471-50338-X);CurrentProtocols in Protein Science,Ed.John E.Coligan,John Wiley&Sons(例如ISBN 0-471-11184-8);以及Methods in Enzymology:Guide to protein Purification,1990,Vol.182,Ed.Deutscher,M.P.,Acedemic Press,Inc.(例如ISBN 0-12-213585-7)),或者致力于描述分子生物学中的实验方法的许多大学和商业网站所描述的。
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实施例
由下面的实施例会更好地理解本发明。然而,本领域技术人员会易于认识到所讨论的具体方法和结果仅仅是如所附权利要求书中更完整地描述的本发明的解释,且并不认为是以任何方式限制本发明。
细胞系
由Horizon Discovery许可HCT116结肠癌MTAP wt和MTAP-/-同基因细胞系。所有其他细胞系均得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)、RIKEN生物资源中心细胞库或DSMZ。
基于shRNA的基因组筛选
Cellecta公司通过片上DNA合成制备包含50,468个shRNA靶向6317基因的shRNA库,并随后克隆入pRSI16-U6-sh-13kCB22-HTS6-UbiC-TagRFP-2A-Puro载体(来自Cellecta公司的hGW模块1库)。按照供应商shRNA库筛选参考手册v2a(www.cellecta.com)和(Kampmann和Weissman自然方案2014)进行HCT116-MTAP-/-和HCT116 MTAP WT的慢病毒载体制备、滴度测定和转导。shRNA库条码***片段是通过2轮PCR扩增并使用Illumina Hiseq2000测序的。与库条码精确匹配的所有读取值包括在数据分析中。
稳定可诱导的shRNA和cDNA的产生拯救细胞系。
将所有shRNA构建体克隆入pLKO-Tet-on慢病毒骨架载体(Wiederschain等人,2009)。将MTAP、PRMT5、Mat2a以及RIOK1 wt和催化死亡的突变体cDNA克隆入pLVX-IRES-neo/puro/blast慢病毒载体。靶向的具体序列为
shNT:5’-CAACAAGATGAAGAGCACCAA-3’
shPRMT5:5’-GGATAAAGCTGTATGCTGT-3’
shMat2a:5’-CAGTTTAATGAAGATCTAAAT-3’
shMat2a1:5’-CTTGTGAAACTGTTGCTAA-3’
shRIOK1:5’-GTCATGAGTTTCATTGGTAAA-3’
通过测序确认所有构建体。使用来自布罗德研究所(Broad Institute)的标准TRC协议来制备基于慢病毒(shRNA或cDNA过表达)的构建体(http://www.broadinstitute.org/rnai/public/resources/protocols)。在病毒转导后,采用合适的药物(嘌呤霉素、新霉素、杀稻瘟素)选出表达shRNA或cDNA的细胞池。
siRNA转染
按照供销商协议,使用Lipofectamine RNAiMAX(13778-150,Life Technologies)采用ON-Target加SMARTpool siRNAs(Dharmacon)转染细胞。为了确保靶标的坚固和耐久敲低,通过在完全生长培养基(RPMI+10%FBS)中恢复24小时来执行、分离两次连续的转染。在第二次转染24小时后,对细胞进行胰蛋白酶化、计数和铺板用于96孔格式生长测定。
生长测定
在siRNA转染或采用相关的200ng/ml多西环素处理4天后,以2000或3000细胞/孔将细胞铺板于96孔的组织培养板中。在t0和细胞培养期结束时(如图解中所示)在平行测定板上进行细胞滴度glo ATP测定(Promega)。根据tend/t0的百分比变化计算生长百分比。对于集落形成测定,以6孔板的每个孔中1,000个细胞进行铺板,并且使用作为媒介物对照的等体积无菌水在铺板时进行多西环素处理(200ng/ml)。10天后固定集落并采用溶于4.5%低聚甲醛溶液的0.05%结晶紫染色24h。使用Li-Cor图像处理软件(Li-Cor Bisciences,Lincoln NE)对集落进行定量。
免疫印迹法
所使用的抗体是PRMT5(2252S,Cell Signaling Technology)、Mat2a(sc-166452,Sanat Cruz Biotechnology)、MTAP(sc-100782,Santa Cruz Biotechnology)、H4R3me2s(A-3718,Epigentek)、组蛋白H4(ab10158,abcam)、eIF4E(9742,Cell Signaling)RIOK1(A302-456A,Bethyl Laboratories,Inc.)、β-肌动蛋白(3700S,Cell SignalingTechnology)。所使用的第二抗体是IRDye 680RD驴抗兔(926-68073,LI-COR)和IRDye800CW驴抗鼠(926-32212,LI-COR)。
体外活性测定中的N-甲基转移酶
使用Eurofins CEREP Panlabs的甲基转移酶分析板进行MTA抑制的甲基转移酶的体外筛选以及SAM Km测量。
代谢物提取和目标LC-MS分析
对于培养基分析,从培养至少24小时的细胞收集条件培养基并在LC-MS分析前稀释20倍。对于细胞内代谢物,在对细胞数量进行标准化后(分析100,000个细胞/样品),采用包含作为内标添加的d8-腐胺的冷80/20(v/v)甲醇/水进行有机提取。然后在减压下干燥样品并在-80℃下储存直至LC-MS分析。
在对重量(mg)进行标准化后,采用包含d8-腐胺内标的80/20MeOH/水(v/v)提取快速冷冻的肿瘤。使用组织溶解仪以最大频率使肿瘤样品均质化1分钟。在4℃下以14,000RPM将均质化的样品离心15分钟。在减压下蒸发等同于2mg组织/孔的一定体积上清液并在-80℃下储存直至LC-MS分析。在注射前,在含有0.1%甲酸的LC-MS级水中重构干燥的提取物。
在先前所述的QExactive轨道离子阱质谱仪(Thermo Fisher Scientific,SanJose,CA)上使用定量液相色谱-质谱分析所提取的样品(Jha等人,2015)。简而言之,ThermoAccela 1250泵以400μL/min递送0.025%七氟丁酸、0.1%甲酸的水溶液和乙腈的梯度。固定相是Atlantis T3,3μm 2.1x150mm柱。在70,000分辨能力下使用QExactive质谱仪以获得全扫描模式的数据。采用MAVEN(Melamud等人,2010)和Spotfire进行数据分析。使用外部校准曲线进行定量。
结肠癌异种移植物中的MAT2A抑制
为了研究体内MAT2A抑制的效应,制备具有表达可诱导MAT2A shRNA的HCT116同基因细胞系的异种移植物。在用多西环素处理动物之前使肿瘤形成,以评估MAT2A在已建立肿瘤的增殖中的作用。通过蛋白质印迹证实体内MAT2A敲低的效率。确认体内MAT2A基因消融以降低MTAP-/-和wt MTAP基因型的HCT116异种移植物中的SAM水平。为了证明体内的选择性生长抑制是靶点命中效应,采用shMAT2A的野生型MAT2A挽救臂进行了体内扩增研究。该实验证实了在我们的第一次体内研究中观察到的功效,并且与体外研究一样,在表达对MAT2AshRNA具有抗性的MAT2A cDNA的异种移植物中拯救了生长抑制。
采用MAT2A抑制剂AG-512和AG-673进行肿瘤细胞生长抑制
AG-512和AG-673是MAT2A酶活性的小分子抑制剂(其在生化测定中IC50分别为83nM和143nM),并抑制细胞中的SAM的产生,IC50分别为80nM和490nM。
基因修饰HCT116细胞的同基因克隆以删除MTAP基因的外显子6,导致与亲代HCT116相比,MTAP表达的完全缺失。细胞在96孔板上生长并采用MAT2A抑制剂AG-512和AG-673处理4天。通过测定第4天时孔中的ATP水平对在第0天(即,药物处理的起始时刻)测定的对照板中的ATP水平来确定%生长。如图8A所示,AG-512抑制wt MTAP细胞的肿瘤细胞生长,其IC50为8.98μM,但在MTAP缺失型细胞中ICs0为143nM。类似地,AG-673抑制wt MTAP细胞,其IC50为2.76μM,且抑制MTAP缺失型细胞,其IC50为552nM。观察具有不同化学结构的大于50个小分子抑制剂以抑制MTAP-缺失型肿瘤细胞的生长,该MTAP-缺失型肿瘤细胞与化合物降低SAM水平的效力相关。
细胞系板中的MAT2A抑制
332个细胞系(68个MTAP缺失型细胞,224个MTAP wt)在96孔板中生长,并采用一定剂量水平的MAT2A抑制剂处理6天,或者计算每个剂量点的AGI-673百分比(%)生长,并且将曲线拟合用于确定GI50(导致50%生长降低的药物浓度)。将GI50<2μM用作敏感度界限,MTAP缺失细胞系中68个中有36个(53%)对AGI-673抑制敏感,而MTAP wt细胞系中224个中仅34个(15%)对其敏感(p=2e-9)。进一步基因组分析显示,在还掺入KRAS突变(G12X或G13X)的16个MTAP缺失细胞系中,14个(88%)对用AGI-673的MAT2A抑制敏感,而当存在KRAS突变时,49个中有24个(49%)MTAP野生型细胞系是敏感的(p.008)。
援引加入
本文中公开的所有专利、公开的专利申请以及其它文献在此明确通过援引加入。
等同物
本领域技术人员会认识到,或者能够确定,使用不多于常规实验,得到本文中具体描述的本发明的具体实施方案的许多等同物。这样的等同物意图涵盖在所附权利要求的范围内。
Claims (22)
1.治疗个体中MTAP缺失型癌症的方法,其包括向所述个体给药治疗有效量的MAT2A抑制剂。
2.权利要求1的方法,其还包括检测所述癌症中,例如取自患者的癌症样品中,MTAP基因的缺失。
3.权利要求1或2的方法,其中所述癌症包含KRAS突变。
4.权利要求1或2的方法,其中所述癌症包含p53突变。
5.测定是否能够通过使肿瘤细胞与MAT2A抑制剂接触来抑制所述肿瘤细胞的存活或增殖的方法,所述方法包括测定所述肿瘤细胞中MTAP的状态,其中MTAP表达的降低或缺失或者MTAP基因的缺失或者MTAP蛋白水平或功能的降低表明所述肿瘤细胞的存活或增殖能够被MAT2A抑制剂抑制。
6.权利要求5的方法,其中测定所述MTAP基因的缺失。
7.权利要求5或6的方法,其还包括测定KRAS突变的存在,其中MTAP表达的降低或缺失或者所述MTAP基因的缺失或者MTAP蛋白水平或功能的降低以及KRAS突变的存在表明所述肿瘤细胞的存活或增殖能够被MAT2A抑制剂抑制。
8.权利要求5或6的方法,其还包括测定p53突变的存在,其中MTAP表达的降低或缺失或者所述MTAP基因的缺失或者MTAP蛋白水平或功能的降低以及p53突变的存在表明所述肿瘤细胞的存活或增殖能够被MAT2A抑制剂抑制。
9.表征肿瘤细胞的方法,其包括测量所述肿瘤细胞中MTAP基因表达水平、检测MTAP基因的存在与否或者测量存在的MTAP蛋白水平,其中相对于参比细胞,MTAP表达的降低或缺失或者所述MTAP基因的缺失或者MTAP蛋白水平或功能的降低表明所述肿瘤细胞的存活或增殖能够被MAT2A抑制剂抑制。
10.权利要求9的方法,其中检测所述肿瘤细胞中MTAP基因的缺失。
11.权利要求9或10的方法,其还包括检测KRAS突变的存在,其中MTAP表达的降低或缺失或者所述MTAP基因的缺失或者MTAP蛋白水平或功能的降低以及KRAS突变的存在表明所述肿瘤细胞的存活或增殖能够被MAT2A抑制剂抑制。
12.权利要9或10的方法,其还包括检测p53突变的存在,其中MTAP表达的降低或缺失或者所述MTAP基因的缺失或者MTAP蛋白水平或功能的降低以及p53突变的存在表明所述肿瘤细胞的存活或增殖能够被MAT2A抑制剂抑制。
13.药盒,其包含用于测量肿瘤样品中MTAP基因的表达水平、MTAP基因的缺失或者MTAP蛋白的水平或功能的降低的试剂,所述药盒还包含给药治疗有效量的MAT2A抑制剂的说明书。
14.权利要求13的药盒,其中所述试剂用于检测所述样品中MTAP基因的缺失。
15.权利要求13或14的药盒,其中所述药盒还包含用于检测KRAS突变的存在的试剂。
16.权利要求13或14的药盒,其中所述药盒还包含用于检测p53突变的存在的试剂。
17.权利要求3、7和11中任一项的方法,其中所述KRAS突变为G12X或G13X氨基酸取代。
18.权利要求17的方法,其中所述KRAS突变为G12C、G12D、G12R、G12V或G13D。
19.权利要求4、8和12的方法,其中所述p53突变为Y126_剪接、K132Q、M133K、R174fs、R175H、R196*、C238S、C242Y、G245S、R248W、R248Q、I255T、D259V、S261_剪接、R267P、R273C、R282W、A159V或R280K。
20.权利要求1-19中任一项的方法或药盒,其中所述MAT2A抑制剂为下式的化合物:
X-Ar1-CRa=CRb-Ar2
其中Ra和Rb独立地为H、烷基、卤素、烷氧基、氰基;X表示Ar1上的至少一个卤素,例如氟、氯、溴或碘取代基;Ar1和Ar2各自为例如苯基、萘基的芳基和例如吡啶基、吡咯烷基、哌啶基、嘧啶基、吲哚基、噻吩基的杂芳基,所述芳基和杂芳基可进一步被卤素、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、芳基烷基氨基、二烷基氨基的N-氧化物、三烷基铵、巯基、烷硫基、烷酰基、硝基、亚硝酰基、氰基、烷氧基、烯基氧基、芳基、杂芳基、磺酰基、磺酰胺基、CONR11R12、NR11CO(R13)、NR11COO(R13)、NR11CONR12Rn取代,其中R11、R12、R13独立地为H、烷基、芳基、杂芳基或氟;条件是Ar2在芳环中包含至少一个氮原子或者在芳环上包含至少一个氮取代基;例如Ar2上的NRcRdZ取代基,其中Rc为H、烷基、烷氧基、芳基、杂芳基,Rd为烷基,Z为未共享电子对、H、烷基、氧。
21.权利要求1-19中任一项的方法或药盒,其中所述MAT2A抑制剂为下式的化合物或其药学上可接受的盐,或其生物素化衍生物:
其中Ra和Rb如上所定义,R1至R10独立地为H、卤素、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、二烷基氨基的N-氧化物、芳基烷基氨基、二烷基氧基氨基、三烷基铵、巯基、烷硫基、烷酰基、硝基、亚硝酰基、氰基、烷氧基、烯基氧基、芳基、杂芳基、磺酰基、磺酰胺基、CONR11R12、NR11CO(R13)、NR11COO(R13)、NR11CONR12R13,其中R11、R12、R13独立地为H、烷基、芳基、杂芳基或氟;条件是R1至Rs中的至少一个为卤素,例如氟和/或氯;并且R6至R10中的至少一个为含氮取代基,例如NRcRdZ取代基,其中Rc为H、例如低级烷基的烷基、烷氧基、芳基、杂芳基,Rd为烷基,Z为未共享电子对、H、烷基、氧。
22.权利要求21的方法或药盒,其中所述MAT2A抑制剂选自(E)-4-(2-氟苯乙烯基)-N,N-二甲基苯胺;(E)-4-(3-氟苯乙烯基)-N,N-二甲基苯胺;(E)-4-(4-氟苯乙烯基)-N,N-二甲基苯胺;(E)-4-(2-氟苯乙烯基)-N,N-二乙基苯胺;(E)-4-(2-氟苯乙烯基)-N,N-二苯基苯胺;(E)-1-(4-(2-氟苯乙烯基)苯基)-4-甲基哌嗪;(E)-4-(2-氟苯乙烯基)-N,N-二甲基萘-1-胺;(E)-2-(4-(2-氟苯乙烯基)苯基)-1-甲基-1H-咪唑;(E)-4-(2,3-二氟苯乙烯基)-N,N-二甲基苯胺;(E)-4-(2,4-二氟苯乙烯基)-N,N-二甲基苯胺;(E)-4-(2,5-二氟苯乙烯基)-N,N-二甲基苯胺;(E)-2-(2,6-二氟苯乙烯基)-N,N-二甲基苯胺;(E)-3-(2,6-二氟苯乙烯基)-N,N-二甲基苯胺;(E)-4-(2,6-二氟苯乙烯基)-N,N-二甲基苯胺;(E)-4-(2,6-二氟苯乙烯基)-N,N-二乙基苯胺;(E)-4-(3,4-二氟苯乙烯基)-N,N-二甲基苯胺;(E)-4-(3,5-二氟苯乙烯基)-N,N-二甲基苯胺;(E)-N,N-二甲基-4-(2,3,6-三氟苯乙烯基)苯胺;(E)-N,N-二甲基-4-(2,4,6-三氟苯乙烯基)苯胺;(E)-4-(2-氯-6-氟苯乙烯基)-N,N-二甲基苯胺;(E)-4-(2,6-二氯苯乙烯基)-N,N-二甲基苯胺;(E)-4-(2,6-二氟苯乙基)-N,N-二甲基苯胺;和(E)-2-苯甲酰胺-4-(2,6-二氟苯乙烯基)-N,N-二甲基苯胺。
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