KR101854527B1 - p110delta PI3K를 표적으로 하는 간세포암 치료제의 스크리닝 방법 - Google Patents

Abstract

본원은 AKT, 포스포 GSK3베타, 및 베타-카테닌을 스크리닝 방법의 마커로 이용한, p110δ PI3K를 표적으로 하는 간세포암 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법을 이용하여 p110δ PI3K를 표적으로 하는 간세포암 치료제, 특히 진행성 간세포암의 치료제를 효과적으로 스크리닝 할 수 있다.

Description

p110delta PI3K를 표적으로 하는 간세포암 치료제의 스크리닝 방법 {Method for screening p110delta PI3K inhibitors for treating hepatocellular carcinoma}

본 발명은 간세포암 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.

간암은 전세계적으로 암 관련 사망 중 2번째로 빈도가 높은 암이며 (Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, Eser S, Mathers C, Rebelo M, et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer. 2015;136:E359-86), 간암 중 85~90%가 간세포암이다. 간세포암 환자의 70~80%는 수술이 불가능한 진행성 간세포암으로 진단이 된다 (El-Serag HB, Rudolph KL. Hepatocellular carcinoma: epidemiology and molecular carcinogenesis. Gastroenterology. 2007;132:2557-76). 진행성 간세포암 환자에게 현재 승인된 전신 항암화학 치료제는 소라페닙(sorafenib)이 유일하지만 대조군에 비교하여 수개월의 생존기간 연장에 그치는 효과를 보여주었다. 간세포암의 발암과정(carcinogenesis)의 복잡한 분자기전(molecular mechanism)에는 Wnt-β-카테닌 경로, p53-Rb 경로, 크로마틴 리모델링 및 PI3K/AKT 경로가 포함된다 (Schulze K, Imbeaud S, Letouze E, Alexandrov LB, Calderaro J, Rebouissou S, et al. Exome sequencing of hepatocellular carcinomas identifies new mutational signatures and potential therapeutic targets. Nat Genet. 2015;47:505-11). 하지만 이러한 연구 결과에도 불구하고, 초기 HCC에서 진행성 HCC(GII 및 GIII HCC)로의 진행의 주요 결정인자는 아직 확인되지 않았다.

간세포암에 특이적으로 작용할 수 있는 항암제의 개발을 위해서는 분자생물학적 수준에서의 간세포암 기전에 대한 이해를 기본으로 하는 치료제의 개발이 필요하다.

대한민국 공개특허 제2012-0049281호는 PI3K 억제제를 이용한 간 장애 치료에 관한 것으로, PI3K 이소형, 특히 델타 이소형을 억제하는 화합물이 기재되어 있다. 대한민국 공개 특허 제2013-7011735호는 PI3K 억제제로서의 벤즈이미다졸 유도체에 관한 것으로, PI3Kα, PI3Kδ, PI3Kβ, 및/또는 PI3Kγ의 억제하는 화합물, 특히 PI3Kβ 선택성 화합물이 기재되어 있다.

본원에서는 p110δPI3K (또는 PI3Kδ)를 표적으로 하는 간세포암 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하고자 하며, 특히 활성산소(Reactive oxygen species, ROS) 신호에 유발되는 텔로머라제 역전사효소(telomerase reverse transcriptase, TERT) 및 텔로머라제 신장을 조절하는, 간세포암 치료제를 스크리닝 하는 방법을 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 고농도 활성산소종 세포, 고농도 활성산소종의 간암세포, 또는 간암세포를 제공하는 단계; 상기 세포에 PI3K p110델타의 활성을 억제할 수 있는 시험물질을 처리하는 단계; 상기 PI3K p110델타의 활성 억제 마커로서 상기 세포의 PI3K 활성, 포스포AKT, 포스포GSK3 베타, 베타-카테닌 농도 또는 측정하는 단계; 및 상기 측정 결과, 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 시험물질을 처리한 세포에서 상기 각 마커의 활성 또는 농도가 감소한 경우, 상기 시험물질을 간세포암 치료 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, 간세포암 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

본원에 따른 방법은 간암세포에 시험물질을 처리하기 전에 활성 산소(ROS)에 의해 TERT가 항진된 간암세포를 본원에 따른 방법에 사용할 수 있다. TERT의 활성은 간암세포(또는 간암조직)과 비간암세포(또는 비간암조직)을 비교하여 상대적인 활성도를 비교하여 높고 낮은 수준을 결정할 수 있다.

일 구현예에서 본원에 따른 방법에 포함될 수 있는 세포는 특히 활성산소종이 과발현되는 간암세포로서, 본원에서 규명된 기전에 따른 신호전달 경로가 존재하는 세포를 포함한다.

또 다른 구현예에서 본원에 따른 방법에서는 활성산소종의 농도를 증가시키기 위해, 스크리닝 목적으로 세포 또는 간암세포에 활성산소종의 농도를 증가시키는 물질을 처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본원에 따른 방법에서 세포는 간암세포 또는 활성산소종의 농도가 높은 확립된 세포주일 수 있다.

다른 양태에서 본원은 간세포암 환자의 생존율에 대한 정보를 제공하기 위하여, 간세포암 환자 유래의 시료를 제공하는 단계; 상기 시료에서 텔로미어 길이, ROS 농도 및 p110δ 농도를 측정하는 단계; 상기 측정결과, 대조군과 비교하여 텔로미어 길이가 길고, ROS 농도 및 p110δ 농도가 높은 경우, 상기 환자의 생존률이 낮은 것으로 판단하는 단계를 포함하는 간세포암 환자의 생존율을 예측하는 방법을 제공한다.

본원은 p110δ PI3K를 표적으로 하는 간세포암 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것으로, 특히 PI3K 억제에 의해 다운스트림에서 AKT, 포스포 GSK3베타, 및 베타-카테닌의 농도 감소가 되어 TERT 발현을 저해함으로써 TERT 및 텔로머라아제 활성을 조절하게 되는 기전을 규명하였다. 본원에서 규명된 방법은 p110δ PI3K를 표적으로 하는 간세포암 치료제, 특히 진행성 간세포암의 치료제의 스크리닝에 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1은 PI3Kδ를 표적으로 억제하는 물질인 이델라리십을 투여하였을 때 간세포암 세포의 증식, PI3K-AKT-TERT 시그널링 및 텔로미어 길이 유지가 억제되는 것을 보여준다. (A-B) HCC 세포주(Huh7, Hep3B)에서 p110δ PI3K이 고레벨로 나타나며 이델라리십에 의해 용량 의존적으로 증식이 억제되는 것을 보여준다 ; (C) THLE-3 세포주에서 p110δ PI3K가 낮은 레벨로 나타나며 이델라리십에 대한 IC₅₀이 >100 μmol/L로 효과적인 증식 억제가 되지 않는 것을 나타낸다 ; (D-F) 이델라리십에 의해 간세포암 세포에서 PI3K의 다운스트림인 pAKT, TERT가 억제되는 것을 보여준다 ; (G-M) 이델라리십에 의해 간세포암 세포에서 텔로미어 길이가 유의하게 감소되는 것을 보여주는 것으로, (G) 서던 블랏, (G-K) HCC 세포주, (L, M) THLE-3 세포; (N) 간세포암 세포에서 이델라리십과 소라페닙의 병합 요법에 의해 pAKT, TERT의 억제가 상승적으로 일어나는 것을 보여준다 ; (O) 간세포암 세포에서 이델라리십과 소라페닙의 병합 요법에 의해 증식의 억제가 상승적으로 일어나는 것을 보여준다 ; (P) 인 비보(마우스) 실험을 통하여 간세포암 세포에 대한 이델라리십(45 mg/kg, 2차례/일)의 암세포 성장 억제 효과를 보여주는 결과이다. 이종이식(Xenograft) 피하 주입 모델을 사용하였고 종양이 발생한 후 약제에 의해 성장이 억제하는지 확인하는 regression model을 이용하였다. 5 × 10⁶ 간세포암 세포를 주입 후, 피하에 종양을 만들고 이후 이델라리십 또는 vehicle을 주입하여 종양의 크기를 25일간 비교하여 암 성장이 억제되는지 확인하였다.
도 2는 PI3Kδ 표적으로 억제하는 물질인 이델라리십이 ROS에 의하여 매개되는 PI3K-AKT-TERT 시그널링 활성 및 텔로미어 신장을 억제하는 것을 보여준다. (A) HCC 세포주(Huh-7, HepG3B)와 THLE-3 세포에서 p110 아이소폼 mRNA 및 단백질 발현의 차이를 보여주는 결과이다. HCC 세포주에서 유의하게 모든 p110 아이소폼의 발현이 THLE-3 세포에 비교하여 유의하게 높다. (B) H₂O₂를 처리한 후 HCC 세포주(Huh-7, HepG3B)와 THLE-3 세포에서 p110 isoform mRNA및 단백질 발현의 차이를 보여주는 결과이다. H₂O₂를 처리한 후 HCC 세포주에서 유의하게 p110δ의 발현이 증가하는 것을 보여준다. (C-E) H₂O₂를 농도별 처리한 후 NAC 처리 유무에 따른 HCC 세포주(Huh-7, HepG3B)와 THLE-3 세포에서의 텔로미어 길이를 flow-FISH로 확인한 결과이다. HCC 세포주(Huh-7, HepG3B)에서 300μM의 H₂O₂를 처리한 경우 pAKT-TERT 활성화가 일어나면서 텔로미어 길이가 증가하였으며 NAC를 처리하였을 때 감소하는 것을 확인한 결과이다. THLE-3 세포에서는 150 μmol/L H₂O₂에 의하여 세포 사멸이 유의하게 관찰된다. (F-H) p110δ를 억제하는 이델라리십을 처리하였을 때, HCC 세포주(Huh-7, HepG3B)에서 300 μmol/L H₂O₂에 의하여 유도된 다운스트림 시그널(pAKT-TERT-텔로미어 신장)이 억제되는 것을 확인한 결과이다. THLE-3 세포에서는 150 μmol/L H₂O₂에 의하여 다운스트림 시그널이 유도되지 않는다. (I-K) HCC 세포주(Huh-7, HepG3B)에서 300 μmol/L H₂O₂에 의하여 항진된 텔로머라아제 활성도가 이델라리십에 의하여 유의하게 감소하는 것을 보여주는 결과이다. THLE-3 세포에서는 150 μmol/L H₂O₂에 의하여 텔로머라아제 활성도가 항진되지 않으며 이델라리십에 의하여도 변화하지 않는다.
도 3는 ROS가 HCC 세포주(Huh-7, HepG3B)에서 PI3K-AKT-β-카테닌 시그널링 항진을 통해 TERT 발현을 상승시키는 것을 보여주는 결과이다. (A) 300 μmol/L H₂O₂ 처리된 HCC 세포주(Huh-7, HepG3B)에서 타겟 항진 및 다운스트림 시그널링을 보여주는 결과이다. pAKT의 항진이 포스포-GSK3β의 상승과 동반되는 것을 보여주는 결과이다. THLE-3 세포에서는 150 μmol/L H₂O₂에 의하여 다운스트림 시그널링이 상승되지 않는 것을 보여준다. (B) GSK3β 억제제에 의하여 Huh-7 세포에서 TERT 발현이 유의하게 증가한다. pcDNA3는 empty 벡터로 음성 대조군으로 사용되었다. 활성 GSK3β 인산화 돌연변이인 GSK3β S9A에 의하여 TERT는 유의하게 억제되며 H₂O₂에 의하여 유의하게 상승된다. (C) Huh-7 세포에서 shRNA-mediated β-카테닌 (CTNNB1) 녹다운에 의한 TERT 발현이 감소되는 것을 보여주는 결과이다. 다른 GSK3 기질인 SNAI1에 대한 shRNA에 의하여서는 TERT 발현이 감소되지 않는다. (D) ROS-처리된 핵, 세포질 추출물의 β-카테닌에 대한 면역블랏 결과이다. H₂O₂에 의하여 세포질 β-카테닌의 분해가 억제되며 핵 β-카테닌 TERT 전사가 항진되는 것을 보여주는 결과이다. (E) p110δ (PIK3CD) 녹다운에 의한 핵 β-카테닌, 전(whole)-세포 추출물에서의 TERT, p110δ 발현의 변화를 보여주는 결과이다. (F) p110δ 억제제인 이델라리십에 의한 핵 β-카테닌, 전(whole)-세포 추출물에서의 TERT, p110δ 발현의 변화를 보여주는 결과이다. 핵 β-카테닌은 p110δ (PIK3CD) 녹다운 또는 p110δ 억제제인 이델라리십에 의하여 H₂O₂ 공동-처리상태에서도 억제되는 것을 확인한 결과이다. (G-H) 면역형광 분석을 통하여, 300 μmol/L H₂O₂ 처리된 Huh-7 세포에서 ROS 레벨이 DCF (G)와 8-oxo-dG (H) 염색 후 상승하는 것을 확인한 결과이다. NAC에 의하여 ROS 레벨이 감소하는 것을 확인한 결과이다. (I) Grade III 간세포암 조직과 종양이 없는 조직에서의 β-카테닌 (노란색), 8-oxo-dG (빨간색), TERT (녹색)의 발현을 면역형광 분석을 통하여 확인한 결과이다.
도 4는 PI3K-AKT 억제제로 인한 ROS-PI3K-AKT-β-카테닌TERT 활성 차단으로 인해 SetD1A (histone methyltransferase)가 항진되고 TERT 전사가 상승되고 크로마틴 리모델링이 일어나는 것을 보여주는 결과이다. (A) 300 μmol/L H₂O₂ 처리된 Huh-7 세포의 핵 추출물 또는 면역침강된 생성물(IP = immunoprecipitated product)을 대조군 IgG 및 β-카테닌 항체를 이용하여 면역블랏팅(IB)를 시행한 결과이다. SetD1A가 IB를 시행한 결과 β-카테닌에 결합되어 있음을 보여주는 결과이다. (B) 300 μmol/L H₂O₂ 처리된 Huh-7 세포에서의 항진된 β-카테닌과 SetD1A 발현을 보여주는 면역형광 염색 결과이다. Scale bar는 10μm 이다. (C) H₂O₂ 처리된Huh-7 세포에서 shRNA-mediated SetD1A 녹다운에 의하여 TERT 발현이 감소하는 것을 보여주는 결과이다. (D-F) H₂O₂ 처리된 Huh-7 세포에서 이델라리십 (D), 또는 AKT 저해제인 페리포신 (E) 치료 유무에 따라서 β-카테닌과 SetD1A의 TERT 프로모터에 대한 결합이 감소하는 것을 보여주는 결과이다. GSK3β 저해제인 XI (F)에 의하여, H₂O₂ 처리와 상관없이 β-카테닌과 SetD1A의 TERT 프로모터에 대한 결합이 증가하는 것을 확인할 수 있다. 실험은 3회 반복하였고, 에러바는 3회 실험 결과의 표준편차이다. (G-H) 인 비보(마우스) 실험을 통하여 300 μmol/L H₂O₂ 처리된 HCC 세포에 대한 25 μmol/L 이델라리십의 암세포 발현의 억제 효과를 보여주는 결과이다. 이종이식(Xenograft) 피하 주입 모델을 사용하였으며 1 × 10⁵ HCC 세포를 주입하였다. (G) 점 표시는 종양을 표시하며, 스케일 바는 10cm이다. (H) 평균 종양 부피를 매주 측정하였으며 대조군 4마리, H₂O₂ 처리군 4마리, H₂O₂ + 이델라리십 처리군 5마리를 실험하였다.
도 5는 간세포암 조직에서 ROS의 정도에 따라 텔로미어 길이가 증가하는 것을 보여주는 결과이다. (A-C) 간세포암의 조직학적 등급이 증가할수록 (Grade I → II → III) TERT mRNA 레벨(A), 텔로미어 형광(B), 8-oxo-dG 형광 강도가 증가하는 것을 확인한 결과이다 (P < 0.0001). (D) Grade III 간세포암 조직과 암세포가 없는 조직을 비교하여 텔로미어(노란색), 8-oxo-dG (빨간색), 핵(파란색), 센트로미어(녹색)을 면역형광 염색한 결과이다. (E) 8-oxo-dG의 발현이 높은 간세포암 조직이 텔로미어 형광(평균값이 수평막대에 해당하는 값) 값도 높은 것을 보여주는 결과이다 (P < 0.0001). (F) 간세포암의 조직학적 등급 (Grade I → II → III)이 증가할수록 PIK3CD (p110δ) 발현이 증가하는 것을 보여주는 결과이다 (P = 0.0001). PIK3CA (p110α), PIK3CB (p110β), PIK3CG (p110γ)는 변화의 차이가 없는 것을 확인한 결과이다. (G) p110 아이소폼의 발현 정도에 따른 TERT mRNA 레벨의 차이를 보여주는 결과이다. p110δ가 높은 그룹이 낮은 그룹에 비하여 유의하게 TERT mRNA 레벨이 높은 것을 확인한 결과이다 (P < 0.0001). (H) Grade III 간세포암 조직 및 암세포가 없는 조직을 비교하여 총 10 pair 조직에서 p110δ, p110α, p110β, p110γ, TERT 단백질의 발현 정도를 비교하였을 때에 간세포암 조직에서 p110δ와 TERT 단백질의 발현이 증가하는 것을 확인한 결과이다. (I) 선형 회귀 분석을 이용하여 간세포암 조직에서 p110 아이소폼의 발현 정도와 TERT 단백질 레벨과의 상관관계를 확인하였을 때, p110δ 만이 유의한 양의 상관관계를 보여주는 것을 확인한 결과이다. 단백질 발현의 정도는 densitometry (ImageJ)를 이용하여 측정하였고 β-액틴의 발현 정도에 비교하여 표준화하였다. (J) 선형 회귀 분석을 이용하여 8-oxo-dG 형광의 발현의 정도가 텔로미어 형광 발현 정도와 양의 상관관계가 있음을 보여주는 결과이다 (R = 0.524, P < 0.0001).
도 6은 높은 ROS 레벨, 긴 텔로미어 길이, 높은 p110δ PI3K 발현이 간세포암 환자의 불량한 생존 예후와 상관관계가 있음을 보여주는 결과이다. (A) 텔로미어가 긴 간세포암 환자군이 짧은 환자 군에 비하여 전체생존율이 낮고(hazard ratio [HR] = 6.771, P < 0.0001) 무재발 생존율이 낮게(HR = 5.515, P < 0.0001) 나타난 결과이다. (B) 8-oxo-dG 발현이 높은 간세포암 환자군이 낮은 환자 군에 비하여 전체생존율이 낮고(HR = 3.559, P = 0.0002)과 무재발 생존율이 낮게(HR = 5.095, P < 0.0001) 나타난 결과이다. (C) p110δ 발현이 높은 간세포암 환자군이 낮은 환자군에 비하여 무재발 생존율이 낮게 (HR = 7.015, P = 0.0002) 나타난 결과이다. (D) 진행성 간세포암종에서 ROS-PI3K-AKT-β-카테닌-TERT의 역할을 설명하는 molecular model을 보여준다.
도 7은 본원의 일 구현 예에 따른 스크리닝 방법을 도식적으로 나타낸 것이다. 활성산소종(ROS)을 처리한 간세포암 세포에 후보물질을 처리하여 1단계 (TERT activity), 2단계 (p110delta PI3K activity), 3단계 (phospho AKT activity), 및 4 단계 (phospho GSK3β와 β-catenin activity) 검증을 순차적으로 거친다. 5단계인 인비보 스크리닝 시스템으로 HCC　regression model을 이용하여 p110delta PI3K를 표적으로 하는 적합한 후보물질인지 최종적으로 스크리닝한다.

본원은 간세포암, 특히 진행단계의 간세포암에서 PIK3 헤테로다이머의 서브유니트인 p110 델타가 활성산소(Reactive oxygen species, ROS)에 의해 과발현되는 것을 규명하고, 이를 억제할 경우, 간세포암, 특히 진행단계 간세포암을 효과적으로 치료할 수 있다는 발견에 근거한 것이다. 구체적으로 ROS 증가에 의한 p110δ PI3K 과발현이 PI3K-AKT-TERT 신호전달을 활성화시켜 염색체 텔로미어의 길이를 신장시켜 암을 유발하는 기전 그리고 PI3K/AKT 경로 중 PI3K-AKT-TERT 시그널링이 불활성화되는 기전을 규명하였다.

따라서 한 양태에서 본원은 p110δ PI3K를 표적으로 하는 간세포암 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

PI3K(phosphatidylinositide 3-kinases)는 세포성장, 증식, 분화, 이동, 생존 및 세포간 트래피킹 조절과 같은 기능조절에 관여하는, 포스파티딜이노시톨 4,5-비스포스페이트(PIP2)를 인산화하며 포스파티딜이노시톨 3,4,5-트리포스페이트 (PIP3)을 생성하는 효소의 패밀리를 말한다 (Fruman DA, Rommel C. PI3K and cancer: lessons, challenges and opportunities. Nat Rev Drug Discov. 2014;13:140-56). 이는 클래스 I, II, III 및 IV로 나뉘며, 본원에서는 특히 조절 서브유닛과 촉매 서브유닛으로 구성되는 클래스 I, 특히 클래스 IA를 일컫는 것이다. 클래스 IA는 p110의 촉매 서브유닛과 p85의 조절 서브유닛으로 구성되며, 전자는 다시 p110α, p110β, p110δ 및 p110γ으로 나뉘며, 본원은 특히 p110δ를 일컫는 것이다.

p110δ는 주로 조혈세포(hematopoietic cell)에 과발현되는 단백질로 이를 억제하는 약제인 이델라리십이 림프성백혈병(lymphocytic leukemia)에서 치료제로 개발되었다 (Yang Q, Modi P, Newcomb T, Queva C, Gandhi V. Idelalisib: First-in-Class PI3K Delta Inhibitor for the Treatment of Chronic Lymphocytic Leukemia, Small Lymphocytic Leukemia, and Follicular Lymphoma. Clin Cancer Res. 2015;21:1537-42).

PI3K는 이어 다운스트림 키나아제인 AKT (serine/threonine kinase, protein kinase B [PKB])를 활성화시킨다. 암세포종에서 AKT 억제제인 페리포신(perifosine)은 텔로머라제 활성도를 억제하며 텔로미어 길이를 감소시킨다(Holohan B, Hagiopian MM, Lai TP, Huang E, Friedman DR, Wright WE, et al. Perifosine as a potential novel anti-telomerase therapy. Oncotarget. 2015;6:21816-26).

하지만 도 6d에 정리된 바와 같이 본원에서 규명된 바와 같은 간세포암에서 활성산소를 통한 p110δ 활성 및 이로 인한 PI3K-AKT-TERT 시그날링 과발현이 발암(carcinogenesis)에 미치는 기전 및 이를 기본으로 하는 간세포암 치료제 스크리닝 방법은 개시된 바 없다.

본원에 따른 p110δ PI3K를 표적으로 하는 간세포암 치료제를 스크리닝하는 방법은 일 구현예에서 간암세포, 또는 활성산소의 농도가 높은 진핵세포를 제공하는 단계; 상기 세포에 PI3K p110델타의 활성을 억제할 수 있는 시험물질을 처리하는 단계; 상기 세포에서 PI3K-AKT 활성, 포스포 GSK3 베타 및 베타-카테닌 농도 중 하나 이상을 측정하는 단계; 및 상기 측정 결과, 시험물질을 처리한 세포에서 상기 각 마커의 농도가 감소한 경우, 상기 시험물질을 간세포암 치료 후보물질로 선별하는 단계를 포함한다.

본원에서는 간세포암이 초기에서 진행성으로 진행할수록 ROS 농도가 증가되고 이에 따라 텔로미어 길이가 길어지고 TERT 활성이 상승하게 되어 암세포의 불멸화가 일어나는데, 이 과정에서 ROS에 의한 p110δ PI3K 발현이 PI3K-AKT-TERT 시그널링을 활성화시켜 텔로미어 길이 신장되는 것을 규명하였다.

따라서 본원에 따른 방법에서 시험물질의 처리 후에 시험물질이 간세포 치료제로의 후보물질로 선별하기 위한 일종의 마커로서 PI3K-AKT-TERT 시그널링에 관여하는 PI3K-AKT 활성, 포스포 GSK3베타 농도, 베터-카테닌 농도, 또는 발현 중 하나 이상이 사용될 수 있다. 도 6d를 참조하면, 간세포암 치료제 후보물질의 경우, PIK3 활성을 억제시키고, 이어 포스포 AKT 활성을 억제시키며, 이는 이어 포스포 GSK3베타 농도를 감소시키고, 핵내 베타-카테닌 농도를 감소시키고, TERT (telomerase reverse transcriptase) 유전자 발현이 억제된다. 따라서 상기 마커는 도 6d에 표시된 신호전달 경로에서 순차적으로 위치하며, 상위 수준의 마커가 하위 수준 마커의 활성 또는 발현에 영향을 미치기 때문에, 상기 경로 중 하나 이상의 마커를 측정하여 시험물질을 스크리닝할 수 있다.

본 방법에서 사용되는 세포의 종류 및 시험물질의 양 및 종류 등은 사용하는 구체적인 실험방법 및 시험물질의 종류에 따라 달라지며, 당업자라면 적절한 세포의 종류, 양 및/또는 조건을 선택할 수 있을 것이다.

본원에 따른 방법에 사용될 수 있는 세포는 ROS의 농도 증가에 의해 상기 PI3K-AKT-TERT 시그널링에 관여하는 PI3K-AKT 활성, 포스포 AKT 활성, 포스포 GSK3베타 농도, 베터-카테닌 농도, 또는 TERT (telomerase reverse transcriptase) 발현를 측정할 수 있는 세포라면 특별히 제한되지 않는다.

본원에 따른 일 구현 예에서는 간암세포, 특히 활성산소종이 과발현되는 간암세포를 포함하며, 이러한 세포는 확립된 세포주, 종양에서 분리된 일차 세포를 포함하는 것이다.

본원에 따른 다른 구현예에서는 간암세포 중에서 TERT 활성이 증가된 세포가 사용된다. 이 경우 본원에 따른 방법은 간암세포에 시험물질을 처리하기 전에 TERT 활성을 측정하여, 일정 수준 이상의 TERT 활성을 나타내는 간암세포를 선별에 사용할 수 있다. 이런 경우, 보다 효과적인 후보물질의 선별이 가능하다.

본원에 따른 일 구현 예에서는 확립된 간암세포주가 사용되며, 이러한 간암세포주는 예를 들면 Huh-1, Huh-6, Huh-7, HepG2, Hep3B, PLC/PRF/5 및 HLE가 포함되나 이로 제한하는 것은 아니다. 당업자라면 본 기술 분야의 기술을 참조하여 적절한 세포를 선택할 수 있을 것이며 예를 들면 Atlas of Human Tumor Cell Lines, ed Robert J. Hay et al. Academic Press, Hepatocellular Carcinomas, pp185-206)을 참조할 수 있다.

또한 본원에 따른 세포주는 본원에서 규명된 기전에 작용하는 후보물질의 선별을 위해서 활성산소의 농도가 암세포가 아닌 세포와 비교하여 또는 암세포인 경우라도 다른 암세포와 비교하여 특히 높은 것이 바람직하다. 활성산소종(ROS)은 화학적으로 활성인, 산소분자에서 유래된 다양한 분자 및 자유 라디칼(짝이 없는 전자를 갖는 chemical species)을 일컫는 것으로 예를 들면 Hydrogen peroxide (H₂O₂), Hydroxyl radical (HO), Nitric oxide (NO), Peroxyl radical (ROO), Peroxynitrite anion (ONOO), Singlet oxygen (¹O₂), Superoxide anion (O₂) 등을 포함한다.

이를 위해 스크리닝 목적을 위해 본원에 따른 방법에 사용되는 세포에 활성산소의 농도를 높이기 위한 처리를 추가로 수행될 수 있다. 활성산소의 농도를 높이기 위한 처리는 당업계에 공지된 것으로 예를 들면 세포에 H₂O₂ 또는 페나진메소설페이트 또는 파라쿼트(paraquat)와 같은 물질을 처리할 수 있으며, 이러한 물질은 예를 들면 각각 약 300 μM/L H₂O₂, 약 4 μM/L PMS, 또는 약 50 μM/L paraquat양으로 처리될 수 있다.

본원의 상기 시험물질은 상술한 바와 같은 p110δ PI3K의 활성 억제할 것으로 기대되는 물질을 의미하여, 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물), 또는 바이오의약품(예컨대, 단백질, 항체, 펩타이드, DNA, RNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, RNAi, 앱타머, RNAzyme 및 DNAzyme), 또는 당 및 지질 등을 포함하나 이로 한정하는 것은 아니다. 상기 저분자량의 화합물은, 예를 들면 중량이 400 Da, 600 Da 또는 800 Da과 같은 약 1000 Da 내외의 화합물이 사용될 수 있다. 목적에 따라 이러한 화합물은 화합물 라이브러리의 일부를 구성할 수 있으며, 라이브러리를 구성하는 화합물의 숫자도 수십개부터 수백만개까지 다양하다. 이러한 화합물 라이브러리는 펩타이드, 펩토이드 및 기타 환형 또는 선형의 올리고머성 화합물, 및 주형을 기본으로 하는 저분자 화합물, 예컨대 벤조디아제핀, 하이단토인, 바이아릴, 카보사이클 및 폴리사이클 화합물 (예컨대 나프탈렌, 페노티아진, 아크리딘, 스테로이드 등), 카보하이드레이트 및 아미노산 유도체, 디하이드로피리딘, 벤즈하이드릴 및 헤테로사이클 (예컨대 트리아진, 인돌, 티아졸리딘 등)을 포함하는 것일 수 있으나, 이는 단지 예시적인 것으로 이로 한정되는 것은 아니다. 상기 시험물질은 2개 이상의 아미노산 잔기, 예컨대 6개, 10개, 12개, 20개 이하 또는 20개 초과 예컨대 50개 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 시험 물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있으며 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 구입 가능하다. 시험 물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, “1-비드 1-화합물” 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다.

또한 예를 들면 바이올로직스가 스크리닝에 사용될 수 있다. 바이올로직스는 세포 또는 바이오분자를 일컫는 것으로, 바이오분자란, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질 또는 생체내 및 생체외에서 세포 시스템 등을 이용하여 생산된 물질을 일컫는 것이다. 바이오분자를 단독으로 또는 다른 바이오분자 또는 세포와 조합으로 제공될 수 있다. 바이오분자는 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 항체, 또는 기타 혈장에서 발견되는 단백질 또는 생물학적 유기물질을 포함하는 것이다.

본원 방법에 사용된 후보물질 선별을 위한 마커로서 인산화된 단백질 즉 포스포AKT, 포스포GSK3 베타는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 예를 들면 인산화된 단백질을 특이적으로 검출하는 항체는 시중에서 구입할 수 있으며, 이를 이용하여 웨스턴블랏의 방법으로 검출할 수 있다. 이러한 항체를 이용하여 특정 단백질 전체 발현양 또는 인산화된 단백질 양을 특이적으로 확인할 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 대조군(시험물질을 처리하지 않은 경우)과 비교하여, 특정 단백질의 인산화 정도가 억제한 것을 간암치료제 후보물질로 선별할 수 있다. 이 경우 단백질은 검출의 편이를 위해 다양한 표식물질, 예를 들면 단백질 태그, 바이오틴, 형광물질, 아세틸화, 방사선 동위원소와 같은 것으로 공지된 방법 또는 시중의 단백질 표지 키트를 사용하여 표지될 수 있으며, 표지된 물질에 적합한 검출기기를 사용하여 검출될 수 있다.

본원 방법에 사용된 후보물질 선별을 위한 마커로서 PI3K 활성화는 포스포AKT 및 p110델타의 단백질 수준에서 웨스턴블랏 또는 p110델타는 핵산수준에서 실시간 정량 PCR (Hennessy BT et al. Nat Rev Drug Discov. 2005 Dec;4(12):988-1004)로 분석될 수 있다.

본원 방법에 사용된 후보물질 선별을 위한 마커로서 베타-카테닌 및 TERT의 농도는 단백질 또는 핵산 수준에서 정량 또는 정성적으로 검출할 수 있는 시약을 사용하여 검출할 수 있는데, 예를 들면 본원에 따른 마커의 단백질 수준에서의 검출 시약은 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석, 또는 단백질 마이크로어레이용에 사용되는 시약을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 이러한 시약은 예를 들면 본원에 따른 단백질 마커의 전장 또는 그 단편을 특이적으로 인식하는 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 포함하는 것이나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 마커의 핵산 수준에서의 검출 시약은 중합효소연쇄반응, 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, 핵산 마이크로어레이 또는 노던블랏에 사용되는 시약을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 이러한 시약은 예를 들면 본원에 따른 단백질 마커를 코딩하는 핵산서열, 상기 핵산서열에 상보적인 핵산서열, 상기 핵산서열 및 상보적인 서열의 단편을 특이적으로 인식하는 폴리뉴클레오타이드로서, 예를 들면 포워드 및 리버스 프라미어 쌍, 또는 프로브, 또는 프라이머 쌍과 상기 프라이머 쌍에 포함되는 각 프라이머가 인식하는 서열 사이에 결합할 수 있는 프로브를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

본원의 방법을 이용한 실험결과 시험물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 존재하에서 상기 마커의 농도 감소를 가져오는 물질을 후보물질로 선별한다. 대조군과 비교 약 99% 이하 감소, 약 95% 이하 감소, 약 90% 감소, 약 85% 감소, 약 80% 감소, 약 75% 감소, 약 70% 감소, 약 65% 이하 감소, 약 60% 이하 감소, 약 55% 감소, 약 50% 이하 감소, 약 45% 이하 감소, 약 40% 이하 감소, 약 30% 이하 감소, 약 20% 이하 감소를 의미하나, 이를 벗어나는 범위를 제외하는 것은 아니다.

본원에서 사용된 용어, 간세포암은 알콜 남용, 바이러스성 간염 및 대상성 간질환과 같은 위험인자를 갖는 환자에서 발생하는 간조직 자체에서 발생하는 원발성 악성 종양을 일컫는 것이다. 간세포암은 전체 간암의 90％ 이상을 차지하며, 환자의 40~80％는 재발하는데, 대부분 다시 간에 재발하지만, 폐와 림프절, 복강을 둘러싸고 있는 안쪽 벽과 종격동에서 나타날 수도 있으며, 이러한 암도 본원에 포함된다.

간세포암의 진행 단계(grade)에 따른 구분은 당업계에 공지된 것으로 예를 들면 암분화도에 따른 조직학적 그레이딩 방법(histological grade of tumor differentiation)인 에드몬슨 슈타이너 그레이딩 시스템(Edmondson Steiner grading system)(Pirisi M et al., Arch Pathol Lab Med. 2010 Dec;134(12):1818-22)을 참조할 수 있다.

이에 따르면 본원 스크리닝 방법에 의한 치료제는 간세포암에 유효한 것으로, 상기 간세포암은 진행단계에 따라 1 내지 4단계로 구분되는 간세포암에서 grade II (grade II) 이상의 간세포암이다. 또한 American Joint Committee on Cancer (AJCC) TNM Staging for Liver Tumors (7th ed., 2010)나 Liver Cancer Study Group of Japan (LCSGJ)-T의 최근판 HCC TNM(Tumor node metastasis) staging을 참고할 수도 있다. 특히 진행단계에 따라 1 내지 4기로 구분되는 간세포암에서 2기 (stage II) 이상의 간세포암에 유효한 치료제 스크리닝에 유효할 수 있다.

본원에서는 또한 고 농도의 ROS에서 텔로미어 길이가 길어지며, 텔로미어 길이, ROS 농도 및 p110δ 농도와 간세포암 환자의 생존률의 상관관계를 규명하였다. 그 결과 텔로미어의 길이가 짧아지고, ROS의 농도 및 p110δ 농도가 증가할수록 생존율이 감소하는 것으로 나타났다.

따라서 한 양태에서 본원은 간세포암 환자의 생존율에 대한 정보를 제공하기 위하여, 간세포암 환자 유래의 시료를 제공하는 단계; 상기 시료에서 텔로미어 길이, ROS 농도 및 p110δ 농도를 측정하는 단계; 상기 측정결과, 대조군과 비교하여 텔로미어 길이가 길고, ROS 농도 및 p110δ 농도가 높은 경우, 상기 환자의 생존률이 낮은 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 간세포암 환자의 생존율을 예측하는 방법을 제공한다.

본원에서 생존률이란 간세포암의 진단 시점으로부터 특정 시점 예를 들면 본원에서는 5년까지 사망하지 않고 생존할 확률로 정의한다.

본원에 따른 생존률 예측 방법에서 대조군은 정상 대조군은 물론, 적절한 치료에 의해 회복한 대조군도 포함한다. 본원에 따른 방법에서 텔로미어 길이에 따른 비교일 경우 텔로미어 길이가 긴 그룹과 짧은 그룹을 비교하게 되어 대조군은 후자가 되고, 다른 측정 파라미터의 경우도 ROS 농도 및 p110delta 농도가 높은 그룹과 낮은 그룹을 비교하게 되며 여기서 대조군은 후자이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실험방법

종양 시료

인간 조직을 사용한 모든 실험은 서울대학교 임상시험심사위원회의 승인을 받았다(SNU IRB No. E1308/001-035). immunoFISH 및 면역염색을 하기 위하여, 133개의 외과적으로 절제하여 포르말린으로 고정하고 파라핀으로 포매한 HCC 종양 및 비-종양 간 조직 샘플을 분석하였다. 유전자 분석을 하기 위하여, 84개의 외과적으로 절제한 냉동 HCC 종양 및 비-종양 조직 샘플을 분석하였다. 2005년과 2009년 사이(133개의 파라핀-포매 샘플) 및 2011년과 2013년 사이(28개의 냉동 조직 샘플)에 대한민국 가톨릭대학 서울성모병원에서, 그리고 2010년과 2013년 사이(56개의 냉동 조직 샘플)에 고려대학교 구로병원(KU Guro Gene Bank 2013-020)에서 케이스를 예기적 지속적으로 확인하였다. 서울성모병원에서 얻은 133개의 파라핀-포매 샘플 중 93개, 28개의 냉동 조직 샘플 중 19개, 그리고 구로 병원에서 얻은 56개의 냉동 조직 샘플 중 53개를 포함하여, 사용된 대부분의 조직 샘플은 또한 기존 본 발명자의 시험에 사용된 것이다 (Ko E, Seo HW, Jung ES, Kim BH, Jung G. The TERT promoter SNP rs2853669 decreases E2F1 transcription factor binding and increases mortality and recurrence risks in liver cancer. Oncotarget. 2015; Ko E, Jung ES, Jung G. Telomerase reverse transcriptase promoter methylation is related to a risk of recurrence in hepatocellular carcinoma. Hepatology. 2015). HCC GI, GII, 및 GIII 각각의 p110δ mRNA 레벨을 정량하기 위하여 사용된 98개의 샘플 중 14개의 냉동 조직 역시 본 발명자의 예전 연구에 사용된 것이다 (Lim SO, Park YM, Kim HS, Quan X, Yoo JE, Park YN, et al. Notch1 differentially regulates oncogenesis by wildtype p53 overexpression and p53 mutation in grade III hepatocellular carcinoma. Hepatology. 2011;53:1352-62). HCC GIII의 p110 아이소폼 단백질 레벨을 탐지하기 위하여 사용된 10개의 냉동 조직도 예전 본 발명자의 연구에서 사용된 것이다 (Lim SO, Gu JM, Kim MS, Kim HS, Park YN, Park CK, et al. Epigenetic changes induced by reactive oxygen species in hepatocellular carcinoma: methylation of the E-cadherin promoter. Gastroenterology. 2008;135:2128-40, 40 e1-8). 조직학적 종양 분화 등급은, 최고 등급의 종양의 면적에 기초한 EdmondsonSteiner 등급 시스템에 따라 분류되었다.

세포 배양 및 shRNA 또는 siRNA -매개 유전자 싸일런싱

한국세포주은행(KCLB, Seoul,Korea)에서 HCC 세포주(Huh7 및 Hep3B)를 얻었다. THLE-3 세포주(SV40 large T 항원과의 감염을 통해 생산된 불멸화된 인간 간 내피세포)는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)에서 얻었다. KCLB 및 ATCC에서는 단연쇄반복분석(short tandem repeat analysis)을 통한 DNA 핑거프린팅을 사용하여 세포주를 공증하였다. 모든 세포주는 마이코박테리아 오염여부를 시험하였다. 37℃, 보습된 5% CO₂ 인큐베이터에서 10% 우태아혈청(FBS, GenDepot, Barker, TX, USA)이 보충된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, Welgene, Gyeongsan-si, Korea)에서 HCC 세포주를 배양하였다. ATCC 매뉴얼에 따라, 37℃, 보습된 5% CO₂ 인큐베이터에서 10% FBS로 보충된 BEGM(Lonza)에서 THLE-3를 배양하였다. β-catenin short hairpin RNA (clone1-TRCN0000314920, clone2-TRCN0000314991)를 인코딩하는 유전자인 SetD1A short hairpin RNA (TRCN0000152242) 및 CTNNB1를 발현하는 pLKO 렌티바이러스 벡터는 시그마-알드리치(MISSION® shRNA Bacterial Glycerol Stock; St.Louis, MO, USA)에서 구입하였고 대조군 pLKO scramble vector는 David Sabatini (Addgene plasmid #1864)에서 제공받았으며, 기존 방법(Lim SO, Gu JM, Kim MS, Kim HS, Park YN, Park CK, et al. Epigenetic changes induced by reactive oxygen species in hepatocellular carcinoma: methylation of the E-cadherin promoter. Gastroenterology. 2008;135:2128-40, 40 e1-8; 56)처럼 사용하였다. siRNA-매개 유전자 녹다운을 하기 위하여, 매뉴얼에 따라 100 nM PIK3CD siRNA SMARTpool (E-006775-00-0005, GE Healthcare Dharmacon, Lafayette, CO, USA) 또는 non-targeting siRNA (D-001910-01-05, Dharmacon)을 사용하여 Accell siRNA 시스템을 사용하였다.

ROS 유도제 및 스캐빈저 , 및 PI3K , AKT , 및 GSK3β 저해제 처리

매일 배양 배지를 교체하였고, 각각 300, 4, 또는 50 μM/L H₂O₂, PMS, 또는 파라콰트(H1009, P9625, and 36541, Sigma-Aldrich)에서 세포를 4일간 배양하였다. 몇몇 실험에서, 5 mM/L NAC (A7250, Sigma-Aldrich) (Lim SO, et al. Gastroenterology. 2008;135:2128-40, 40 e1-8), 10 μM/L LY294002 (440202, Calbiochem, Billerica, MA, USA)(Hu W, et al. Am J Physiol Cell Physiol. 2009;296:C1310-20), 25 μM/L 이델라리십 (I-7447, LC Laboratoties, Woburn, MA, USA), 1 μM/L 소라페닙 (sc-220125, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), 및 10 μM/L SH-6 (sc-205974, Santa Cruz Biotechnology)(Gallia GL, et al. Mol Cancer Ther. 2009;8:386-93), 25 μM/L 페리포신 (P-6522, LC Laboratoties, Woburn, MA, USA) 또는 30 μM/L GSK3β 저해제 (GSK3β 저해제 XI, sc-204770, Santa Cruz)로 H2O2 처리하기 1시간 전에 세포를 전-처리하였다. 멸균 증류수(pH 7.0)을 음성 대조군으로 사용하였다(mock 처리).

세포간 ROS 레벨의 결정

조직 또는 세포 ROS를 정량하기 위하여, 기존 방법(Lim SO, Gu JM, Kim MS, Kim HS, Park YN, Park CK, et al. Epigenetic changes induced by reactive oxygen species in hepatocellular carcinoma: methylation of the E-cadherin promoter. Gastroenterology. 2008;135:2128-40, 40 e1-8)처럼 공초점 레이저 현미경(CLSM, LSM700, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 8-oxo-dG의 형광 강도를 정량화하였다. 세포내 ROS 레벨을 가시화하기 위하여, 매뉴얼에 따라 CLSM을 사용하여 형광 DCF 이미지(C6827, Molecular probe)를 캡춰하였다.

DNA 시퀀싱

HCC 종양 조직 및 이에 상응하는 비-종양 조직에서 DNA를 추출하였다. 매뉴얼에 따라 Arcturus picopure DNA extraction kit (11815-00, Applied Biosciences, Foster City, CA, USA)를 사용하여 파라핀-포매 조직(Tissue microarrays; TMA)유래의 DNA를 분리하였고, NucleoSpin^® TriPrep Kit (740966.250, Macherey-Nagel, Duren, Germany)를 사용하여 냉동 조직 유래 DNA를 분리하였다.

Flow FISH

몇몇 변형을 하여 기존 방법(Rufer N, Dragowska W, Thornbury G, Roosnek E, Lansdorp PM. Telomere length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry. Nat Biotechnol. 1998;16:743-7)처럼 Flow FISH를 수행하였다.

ImmunoFISH

몇몇 변형을 하여 확립된 ImmunoFISH 프로토콜(Plentz RR, Park YN, Lechel A, Kim H, Nellessen F, Langkopf BH, et al. Telomere shortening and inactivation of cell cycle checkpoints characterize human hepatocarcinogenesis. Hepatology. 2007;45:968-76)을 사용하였다.

텔로미어 서던 블랏

매뉴얼에 따라 비-방사성 화학발광 TeloTAGGG 텔로미어 길이 분석법(12 209 136 001, Roche)을 사용하여 텔로미어 길이를 측정하였다.

qPCR을 사용항 상대적 텔로미어 길이 측정

세포에서 추출한 게놈 DNA으로 qPCR을 이용하여 상대적 텔로미어 반복 카피 수(T) 및 단일 카피 수(S)를 측정하였고, 기존에 기재된 변형된 방법(61)으로 T/S 비율을 계산하였다.

면역형광 분석법

파라핀-포매 조직 섹션을 자일렌을 사용하여 탈-파라핀화시켰고 에탄올 그래디언트를 사용하여 재수화시켰다. 100 mM/L 소디움 시트레이트(pH 6.0)에서 10분동안 마이크로웨이브에서 섹션을 보일링(boiling)하여 항원 복구(retrieval)을 수행하였다. β-카테닌-특이성 항체(1:1500, ab6302, Abcam, Cambridge, MA, USA)를 밤새 4℃에서 적용시킨 다음, 세척하여 2차 항원과 배양하였다. 고정 후, TERT-특이적 항원(1:150, ab117366, Abcam)을 밤새 4℃에서 적용시키고, 또한 세척 후 2차 항원과 배양하였다. 고정하여 50% 포름아마이드 처리한 후, 1% 소혈청알부민 및 0.1% 트리톤 X 100을 함유하는 PBS(phosphate-buffered saline)에 8-oxo-dG-특이적 항체 (1:100, ab62623, Abcam)를 희석하여 밤새 24℃에서 배양하였다. 세포 p110δ 및 AKT 발현을 가시화하기 위하여, p110δ-특이적(1:500, ab32401, Abcam) 및 AKT-특이적 (1:50, #2920, Cell Signaling Technology) 항원을 사용하였다. 슬라이드를 세척하여 4,6-다이아미디노-2-페닐인돌(DAPI, VectorLaboratories)을 함유하는 배지를 사용하여 마운트하였다. CLSM을 사용하여 이미지를 캡춰하였다. Image-Pro Plus 6.0 software (MediaCybernetics, Inc.)를 사용하여 이미지 분석을 수행하였다.

텔로미어 반복 증폭 프로토콜 분석법(TRAP Assay)

TRAPEZE^® RT Telomerase Detection Kit (S7710, Millipore, Darmstadt, Germany)를 사용하여 텔로머라아제 활성을 정량적으로 측정하기 위하여 텔로미어 반복 증폭 프로토콜을 수행하였다. 매뉴얼에 따라 각 반응마다 총 단백질 추출물(100ng)을 사용하였다.

qPCR에 의한 유전자 발현 레벨 측정

NucleoSpin^® TriPrep Kit (740966.250, Macherey-Nagel, Duren, Germany)를 사용하여 총 RNA를 분리하였고, TOPscript™ RT Drymix (dT18) (RT200, Enzynomics, Daejeon, Korea)를 사용하여 mock- 또는 지시된-시약이 처리된 세포의 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. TOPreal™ qPCR 2× PreMIX (SYBR Green with high ROX, RT501M, Enzynomics, Daejeon, Korea) 및 ABI Prism 7300 thermal cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 유전자 발현을 β- 액틴으로 노말라이즈하였다. 각 유전자에 대한 프라이머 서열은 하기에 지시된 바와 같다 : TERT (forward primer: GCCTTCAAGAGCCACGTC; reverse primer: CCACGAACTGTCGCATGT) (27), PIK3CA (forward primer: CCACGACCATCATCAGGTGAA; reverse primer: CCTCACGGAGGCATTCTAAAGT), PIK3CB (forward primer: GGATGTTGCCTTATGGCTGT; reverse primer: CAGGTCATCCCCAGAGTTGT), PIK3CD (forward primer: GTCCCCACTCGACCCCAGCAC; reverse primer: CTGTACATGATCCACAGGGGC), PIK3CG (forward primer: GGAACACCGACCTCACAGTT; reverse primer: CACAGCACCTCCTCTGTGAA), and β-Actin (forward primer: GCAAAGACCTGTACGCCAACA; reverse primer: TGCATCCTGTCGGCAATG). 프라이머 특이성을 체크하기 위하여 분리 단계를 추가하였다.

Immunoblot Analysis

5분간 2XSDS 샘플 버퍼(100 mM/L TrisHCl [pH6.8], 4% SDS, 0.2% 브로모페놀 블루, 20% 글리세롤, 및 200 mM/L β-멀캡토에탄올)에서 총 2 × 10⁵ 세포를 5분간 보일링하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏팅을 수행하였다. TERT 및 SetDIA를 탐지하기 위하여 15분간 55℃, 2XSDS 샘플 버퍼에서 세포를 배양하였다. TERT-특이적(1:400, 600-401-252, Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA), β-카테닌-특이적 (1:2000, ab6301, Abcam, Cambridge, MA, USA), β-카테닌-특이적(1:4000, ab6302, Abcam), GSK3β-특이적(1:1000, #9315, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), phospho-GSK3β-특이적(1:1000, #9336, Cell Signaling Technology), AKT-특이적 (1:1000, #9272, Cell Signaling Technology), phospho-AKT-특이적 (1:2000, #4060, Cell Signaling Technology), SetD1A-특이적 (1:1000, NBP1-81513, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA), Lamin B1-특이적 (1:1000, ab16048, Abcam), α-튜불린-특이적 (1:2000, ab7291, Abcam), p110α-특이적 (1:400, sc-7174, Santa Cruz Biotechnology), p110β-특이적 (1:400, sc-602, Santa Cruz Biotechnology), p110δ-특이적 (1:1000, ab1678, Abcam), p110γ-특이적 (1:400, sc-7177, Santa Cruz Biotechnology), GAPDH-특이적 (1:2000, sc-47724, Santa Cruz Biotechnology), 또는 β-Actin-특이적 (1:2000, A5441, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 항체를 TBS-트윈 20이 있는 소혈청 알부민 또는 5% 스킴밀크에 희석시켜 4℃에서 밤새 배양한 후, 세척하여 HRP-접합 2차 항체(1:1000, ab131368 or ab131366, Abcam)와 배양하였다. FUSION-SOLO imager (Vilber Lourmat, Marne La Vallee, France)를 사용하여 화학형광 이미지를 얻었다.

세포 분획

핵 및 세포질 분획을 하기 위하여, HCC 세포를 차가운 PBS로 세척하여 용해 버퍼(20 mM/L HEPES [pH 7.9], 10 mM/L KCl, 2 mM/L MgCl₂, 0.5% NP-40, 100 mM/L NaF, 1 mM/L Na₃VO₄, 1 mM/L PMSF, 및 프로테아제 저해제)로 재서스펜젼시켰다. 4℃에서 30분 동안 상기 세포를 로타리 세이커에서 가볍게 섞은 후 세포질 추출물을 얻기 위하여 4℃, 5000rpm에서 4분간 원심분리하여 핵과 상청액을 수집하였다. 버퍼(25 mM/L TrisHCl [pH8.0], 150 mM/L NaCl, 1% NP-40, 1 mM/L EDTA, 1 mM/L 다이티오스레이톨, 및 프로테아제 저해제)에서 핵 펠렛을 재서스펜젼시켰다.

세포 생존력

Cell Titer 96 MTS (G3580, Promega)를 사용하여 기존 방법(10)으로 세포 생존력을 측정하였다. 웰 당 500 내지 2000세포의 농도로 세포를 씨드하여 각 도면에 기재된 농도의 약물을 96시간 동안 처리하였다. 각 분석은 최소 세 번의 반복 실험을 독립적으로 수행하였다. 데이터를 플랏하여 GraphPad software를 사용하여 IC₅₀ 수치를 계산하였다. 포르마잔 생산의 광학 밀도를 Flexstation 3 multimode plate reader (MolecularDevices)를 사용하여 490nm에서 측정하였다.

크로마틴 면역침강

몇몇 변형을 시켜 기존 방법(Lim SO, Gu JM, Kim MS, Kim HS, Park YN, Park CK, et al. Epigenetic changes induced by reactive oxygen species in hepatocellular carcinoma: methylation of the E-cadherin promoter. Gastroenterology. 2008;135:2128-40, 40 e1-8; 27)으로 크로마틴 면역침강(ChIP) 실험을 수행하였다.

인 비보 종양형성

서울대학교 동물실험 윤리위원회의 승인(Approval number: SNU-130225-6)을 받은 프로토콜에 따라 동물 실험을 수행하였다. 통상의 조건(semi-specific pathogen-free) 하에 마우스를 관리하였고, 음식 및 물은 자유식(ad libitum)으로 제공하였다. 모든 이종이식 연구에 5주령 KSN/Slc nude 마우스를 사용하였다. 각 실험에서 18-20g 무게의 마우스를 사용하였다.

Idelalisib의 종양 성장 억제능을 평가하기 위하여 5 × 10⁶ Huh7 세포를 처리하여 피하에 tumor budding을 만들었다. 이후 45 mg/kg idelalisib을 경구로 하루 2차례 (time interval 4-5 시간), 총 25일 투여하였다. Idelalisib을 투여한 그룹과 vehicle을 투여한 대조군 그룹의 종양 부피를 25일간 비교하였다.

또한 이종이식 분석을 하기 위하여, 마우스를 그룹핑하여 1 × 10⁵ Huh7 세포를 처리하여 mock 처리를 하였고, 1 × 10⁵ Huh7 세포를 처리하여 300 μM/L H₂O₂ 단독, 또는 1 × 10⁵ Huh7 세포를 처리하여 25 μM/L 이델라리십 및 300 μM/L H₂O₂ 둘다 처리하였다. 상기 세포를 세척하여 Ca^{2 +} 또는 Mg^{2 +} 부존재하에 PBS에서 하베스트하였고 연이어 마우스 등의 피하조직에 0.2 mL 부피를 주입하였다. 종양의 2개의 수직 지름(D1 및 D2, 각각 larger and smaller 지름)을 캘리퍼(caliper) 측정을 사용하여 종양 성장을 매주 모니터하였다. 종양 부피는 π×D1×D2²/6 로 계산하였다.

통계 분석

텔로미어 길이 측정 및 생존율의 통계적 유의성은 각각 Fisher’s exact 및 the log-rank tests를 사용하여 평가하였다. mock 및 ROS 또는 PI3K-AKT 저해제 처리 사이의 mRNA 발현 레벨 및 텔로머라아제를 비교하는 P-수치는 two-tailed paired t-test를 사용하여 계산하였다. Shapiro-Wilk's test를 사용하여 빈보 분포의 정규성(normality)를 테스트하였다. R software (www.r-project.org) 또는 Prism GraphPad software version 6.07 (GraphPad Software Inc, SanDiego, CA, USA)를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 모든 실험은 최소 세 번 독립적으로 반복하였다. P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001, 및 P < 0.0001는 유의한 것으로 고려하였다.

실시예 1. PI3K - AKT 저해제의 HCC 세포 증식 및 텔로미어 길이 유지 저해가 PI3K-AKT 시그널링 활성 저해에 의한 것임을 규명

이델라리십 : 선택적 p110δ 키나아제 저해제인 이델라리십은 PI3K-AKT시그널링을 저해하며, 만성 림프성 백혈병을 가진 환자를 치료하는데 사용되고 있다. p110δ 키나아제의 레벨을 변화시키면서 간세포에 하버링하는 이델라리십의 활성을 측정하기 위하여, 본 발명자는 세 개의 간세포주를 사용하여 증식 분석을 수행하였다. 상기 세포에는 p110δ 발현이 고레벨로 나타나고 초기 HCC인 환자에게서 유래한 Huh7 및 Hep3B 내피-타입 HCC 세포주(도 1A 및 B) 및, p110δ 발현이 낮은 레벨로 나타나고 정상 성인 간 내피세포의 특징을 나타내는 정상 초기 간세포에서 유래한 THLE-3 불멸화된 내피 세포주(도 1C)가 포함된다. 이델라리십은 농도-의존적 방식으로 두 개의 HCC 세포주의 세포 증식을 저해하였다(도 1A 및 B). IC₅₀(최대저해농도의 절반)은 Huh7 및 Hep3B 세포에서는 <25 μM(도 1A 및 B)이고 THLE-3 세포에서는 >100 μM이다(도 1C). 본 발명자는 25 μM에서 두 개의 HCC 세포주에서 이델라리십에 의해 유도되는 AKT 인산화 저해를 측정하였다(도 1D 및 E). 낮은 기저 레벨의 THLE-3 세포의 AKT 인산화는 25 μM에서 이델라리십에 의해 감소되지는 않았다(도 1F). 이것은 THLE-3 세포에서 세포내 AKT 시그날링이 불활성화된다는 것을 의미한다.

본 발명자는 이델라리십이 HCC 세포에서 TERT 발현 감소 및 텔로미어 길이 감소 여부를 조사하여 두 개의 HCC 세포주에서 이러한 감소가 일어난다는 것을 발견하였지만(도 1D, E 및 G-K), THLE-3 세포에서는 그렇지 않다(도 1F, L 및 M)는 것을 발견하였다. 25 μM 농도에서 이델라리십은, TERT 단백질 발현을 감소시키는 방식(대략 2.0배 이상 감소, 도 1D 및 E)으로 HCC세포에서 텔로미어 길이 단축을 야기하였다(1.3 배 감소, 도 1G-K)(세포 IC₅₀은 Huh7에 대해서는 22.9 ± 2.5 μM 그리고 Hep3B에 대해서는 15.9 ± 1.9 μM ; 도 1A 및 1B). 기저 TERT 발현은 THLE-3 세포에서는 낮은데, THLE-3 세포에서의 TERT 발현이나 텔로미어 길이 둘다 이델라리십에 의해 감소하지 않았다(도 1F, L 및 M). 종합하여 보면, 이델라리십은 HCC 세포에서는 TERT 발현을 하향조절하면서 PI3K-AKT 시그날링 활성을 저해하는 반면, THLE-3 세포에서의 PI3K-AKT 시그널링은 미미하여, THLE-3 세포에서의 이델라리십에 의해 감소된 TERT 발현은 무시할 만 하였다. 이러한 결과는 세포 PI3K-AKT 시그널링 활성화가, TERT 발현 및 텔로미어 길이가 PI3K 저해제에 의해 감소되는 적절한 타겟이라는 것을 의미한다.

본원에서는 비보(마우스) 실험을 통하여 HCC 세포에 대한 이델라리십(45 mg/kg, 2차례/일)의 암세포 성장 억제 효과를 확인하였다 (도 1P). 이종이식(Xenograft) 피하 주입 모델을 사용하였다. 5 × 10⁶ HCC 세포를 주입 후, 피하에 종양을 만들었다. 이후 이델라리십 또는 vehicle(대조군)을 주입하여 두 그룹간에 25일 동안 종양의 부피를 비교하였으며 이델라리십이 대조군에 비해 유의하게 종양의 성장 속도를 억제하는 것을 확인하였다.

페리포신 : 다음으로 본 발명자는 AKT가 PI3K 시그널링의 일차 다운스트림 효능제이므로, AKT 저해제 페리포신(perifosine)이 HCC 세포주에서 AKT 인산화 매개의 TERT 발현을 저해하는지를 측정하였다. 두 개의 HCC 세포주에서 페리포신의 세포증식 저해는 이델라리십의 경우와 일치하였다(도 1). TERT 발현 및 텔로미어 길이는 HCC에서는 페리포신에 의해 감소되었지만 THLE-3 세포에서는 그렇지 않았는데, 이는 페리포신을 처리하면 HCC에서는 AKT-활성화가 저해되지만 THLE-3 세포에서는 그렇지않다는 것과 일치하였다. PI3K-매개 텔로머라아제 활성화를 저해하는 이델라리십과 유사하게, AKT 저해제(페리포신)는 AKT-TERT 시그널링을 저해함으로써 텔로머라아제 활성화를 저해하는 것으로 보인다.

소라페닙 : 다음으로, 본 발명자는 HCC에 대해 승인된 유일한 약인 소라페닙이 HCC 세포에서 AKT 인산화(pAKT) 및 TERT 발현에 영향을 미치는지 측정하였다. 소라페닙은 pAKT를 감소시키지만 TERT 발현은 그렇지 않고 변하지 않은 반면, 이델라리십은 pAKT 및 TERT 발현 둘다를 감소시켰다(도 1N). 소라페닙 및 이델라리십을 조합하면 pAKT 및 TERT 발현 레벨이 감소하였다(도 1N). 이러한 결과는 소라페닙에 의해 유도되는 AKT 활성화가 이델라리십에 의해 저해될 수 있다는 것을 의미한다. 비록 이델라리십-매개 시그널링이 소라페닙-매개 다운스트림 시그널링과 구분되는 것처럼 보이지만, 이델라리십이 소라페닙에 의해 유도된 AKT 활성화를 억제하였다. 나아가 이델라리십의 타겟 분자인 p110δ 키나아제가 HCC 세포에서 AKT 활성화에 주요한 역할을 한다는 것이 분석에서 밝혀졌다. 본 발명자는 본 실험을 통해, 소라페닙 및 이델라리십를 조합하여 치료하며, HCC 세포 증식을 효과적으로 저해하는 시너지 효과가 있다는 것을 발견하였다(도 1o). 이러한 결과는 HCC의 치료가 소라페닙 및 이델라리십의 시너지적 조합-치료에 의해 개선될 수 있다는 것을 말한다.

실시예 2. ROS에 의해 유도되는 p110δ PI3K - AKT TERT 시그널링이 간암진행의 주요 경로임을 규명

암세포에서 ROS가 PI3K-AKT 시그널링을 과활성화시킨다는 것이 기존 연구에서 입증되었다(Lim SO, Gu JM, Kim MS, Kim HS, Park YN, Park CK, et al. Epigenetic changes induced by reactive oxygen species in hepatocellular carcinoma: methylation of the E-cadherin promoter. Gastroenterology. 2008;135:2128-40, 40 e1-8; 24, 25). 그러나 ROS에 의해 PI3K-AKT 활성화를 야기하는 PI3K 아이소폼의 발현 레벨이 증가한다는 것은 현재 알려져 있지 않다. PI3K 아이소폼 p110δ의 발현은 THLE-3 세포보다는 HCC에서 더 높다(도 1A-C 및 2A). 이델라리십(선택적 p110δ 저해제)은 HCC 세포에서 pAKT 및 TERT의 발현과 텔로미어 유지를 저해한다(도 1). 이에 본 발명자는 ROS가 HCC 세포에서 p110δ 발현을 증가시키는지 조사하여, ROS 유도제인 과산화수소(H₂O₂)를 처리한 HCC 세포에서 클래스 I PI3K 아이소폼인 p110δ이 발현이 증가된 유일한 PI3K 아이소폼이라는 것을 발견하였다(도 2B). 이는 ROS가 p110δ 발현을 상향조절시킴으로써 PI3K-AKt 시그널링을 특이적으로 과활성화시킨다는 것을 의미한다.

다음으로, ROS가 AKT 활성화를 통해 TERT 발현 및 텔로미어 길이를 증가시키는지를 연구하기 위하여, 본 발명자는 100 μM간격으로 ROS 레벨을 증가시킴으로써 H₂O₂ 처리 후의 HCC 세포에서의 pAKT 레벨, TERT mRNA, TERT 단백질 및 텔로미어 길이를 비교하였다(도 2C 및 D). 300 μM H₂O₂ 처리하면, 비처리 대조군 HCC 세포에 비교하여, HCC 세포에서 pAKT 레벨, TERT mRNA, TERT 단백질 및 텔로미어 길이가 증가하였다(pAKT 레벨은 4.0배 증가, TERT mRNA 발현은 1.8배 증가, TERT 단백질은 2.0배 증가, 그리고 텔로미어 길이는 1.3배 증가: 도 2C 및 D). 150 μM H₂O₂에 노출되면, 대부분의 THLE-3 세포(85%)는 생존하지 못하였으며, 이 농도에서 텔로미어 길이는 감소하였다(도 2E). TERT 발현 레벨은 일정하게 유지되었는데, 이는 THLE-3 세포에서의 H₂O₂ 처리에 의해 pAKT 레벨이 변하지 않는다는 것을 의미한다(도 2E). H₂O₂ 처리에 의해 매개되어 pAKT 레벨, TERT mRNA, TERT 단백질 및 텔로미어 길이가 증가하는 것과 유사한 방법으로, 이델라리십은 HCC 세포에서 이들의 감소를 매개한다(도 2F 및 G). ROS 스캐빈저인 N-아세틸시스테인(NAC)와 같이 처리하면 H₂O₂-유도에 의한 pAKT 상승, TERT 상향조절, 및 텔로미어 신장이 없어졌다(도 2C 및 D). ROS 유도제인 페나진 메소설페이트 및 파라콰트 또한 두 개의 HCC 세포주 둘다에서 텔로미어 길이 및 TERT 발현을 증가시켰다. 이러한 결과는 ROS가 HCC 세포에서 pAKT 및 TERT 발현을 상향조절시킴으로써 텔로미어를 길어지게 한다는 것을 의미한다.

ROS-유도에 의한 PI3K-AKT 시그널링 과활성화에 대한 이델라리십의 효과를 알아보기 위하여, 본 발명자는 이델라리십에 노출된 H₂O₂-자극 HCC 세포에서의 TERT 발현, 텔로미어 길이 및 텔로머라아제 활성을 측정하였다. H₂O₂ 단독만 처리된 세포보다 이델라리십 및 H₂O₂ 공동-처리된 HCC 세포에서 TERT 발현 레벨 및 텔로미어 길이가 현저하게 낮아졌다(TERT mRNA 발현은 3.6배 감소, TERT 단백질은 4.0배 감소, 및 텔로미어 길이는 1.8배 감소; 도 2F 및 G). 이러한 결과는 이델라리십이 ROS-유도 PI3K-AKT 시그널링 과활성화를 저해한다는 것을 의미한다. TERT 발현 및 텔로미어 길이에 대한 결과(도 2F-H)와 유사하게, 이델라리십은 두 개의 HCC 세포주 둘다에서 텔로머라아제 활성을 감소시켰지만(도 2I 및 J), THLE-3 세포에서는 그렇지 않았다(도 2K). 활성화된 PI3K-AKT-TERT 경로에서, 이델라리십에 의해 특이적으로 저해되는 키나아제인 p110δ PI3K에 대하여 H₂O₂는 업스트림 시그날링 분자로 작용하였다(도 2B, F, 및 G). 이델라리십 처리 HCC 및, 이델라리십 및 H₂O₂ 동시-처리한 HCC 둘다에서 TERT 발현, 텔로머라아제 활성 및 텔로미어 길이가 유사하게 감소되는 것으로 관찰되었다(도 2F, G, I 및 J). 이러한 것은 이델라리십이 TERT 발현, 텔로머라아제 활성, 및 텔로미어 길이에 있어서 ROS-매개에 의한 증가를 완전히 저해한다는 것을 의미한다. TERT 발현 증가가 텔로머라아제 활성 및 텔로미어 길이를 증가시킨다는 전제를 고려하면, 이러한 결과는 ROS-매개의 p110δ PI3K-AKT-TERT 시그널링 과활성화에 의해 텔로미어가 길어질 수 있다는 것을 입증하는 것이다. 간암이 진행될수록 ROS 레벨 및 텔로미어 길이는 증가한다. 따라서 ROS에 의해 유도된 p110δ PI3K-AKT-TERT 시그널링이 간암 진행에서 중요한 경로이며 따라서 상기 경로가 이델라리십에 의해 저해되는 주요 타겟이라고 할 수 있다.

본원에서 진행성 HCC종양에서 관찰되는 PI3K-AKT-β-catenin-TERT 시그널링 과활성화 및 텔로미어 신장에 대한 초기 신호가 ROS라는 것을 밝혔다. 이델라리십은 전적으로 상기 시그널링을 저해하는데, 이는 이델라리십이 HCC에 대한 신규한 효과적 약물이라는 것을 의미한다. 본원 데이터에서는 비-종양에서와 비교하여 HCC 종양에서는 p110δ 발현이 더 높은 것으로 나타났다(도 5F, H, 및 I). 이에 본 발명자는 ROS 단독으로 class I PI3Ks (p110α, p110β, p110δ, and p110γ) 중에서 p110δ 발현이 증가되었고, 이델라리십이 HCC 세포의 ROS-매개 PI3K-AKT-TERT 과활성화를 완전히 저해한다는 것을 밝혔다. p110δ-선택적 약물인 이델라리십은 H2O2 처리후 높아진 pAKT 단백질 레벨, 핵 β-카테닌 레벨, TERT 단백질 레벨, 텔로머라아제 활성 및 텔로미어 길이를 감소시켰다(도 2 및 3). 이델라리십은 또한 전사활성인자(β-catenin and SetD1A)가 TERT 프로모터에 결합하는 것을 완전치 저해하여으며, 결과적으로 TERT 전사를 감소시켰다(도 2). 이러한 결과는 p110δ PI3K-dependent TERT 활성화가 진행성 HCC로 발전되는 주요한 경로라는 것을 의미한다.

실시예 3. ROS - PI3K - AKT 시그널링이 β- 카테닌 -매개 TERT 상향조절 촉진 규 명

다음으로 본 발명자는 ROS-매개 AKT 과활성화가 TERT 발현을 증가시키는 매카니즘을 조사하였다. 따라서 본 발명자는 AKT 다운스트림 매개자인 GSK3β(glycogen synthase kinase 3β) 및, GSK3β 활성에 대한 반응으로 프로테아좀에 의해 분해되는 β-카테닌에 초점을 두었다. pAKT, pGSK3β (불활성 GSK3β), 및 β-카테닌 단백질 레벨은 두 개의 HCC 세포주 둘다에서 H₂O₂ 의해 증가하였다(도 3A). H₂O₂를 처리하지 않은 대조군과 비교하여, H₂O₂-처리된 THLE-3 세포에서의 pGSK3β, β-카테닌 및 pAKT의 단백질 레벨에서는 차이가 없었다(도 3A). 30 μM GSK3β 저해제 XI를 처리하면 HCC 세포에서 TERT mRNA 및 β-카테닌 단백질 레벨이 증가하였다(도 3B). 추가로 H₂O₂ 처리하고 나서도, CTNNB1 (gene encoding β-카테닌)의 shRNA-유도 사일런싱에 의해 TERT mRNA가 감소하였다. TERT mRNA는 또다른 GSK3β 기질인 SNAI1 이 사일런스되었을 때에는 변하지 않았다 (도 3C).

이러한 결과는 AKT-매개 GSK3β 인산화가 세포질 β-카테닌의 분해를 감소시켜, 핵 β-카테닌-유도 TERT 전사를 증가시킨다는 것을 의미한다. 이러한 가정을 확인하기 위하여, 본 발명자는 H₂O₂ 처리 또는 무처리한 두 개의 HCC 세포주 둘다의 핵 분획을 분리하였다. 면역블랏 분석을 통해 H₂O₂ 처리후 핵 β-카테닌이 증가한 것으로 나타났다(도 3D). 그러나 PIK3CD (encoding p110δ) siRNA 및 H₂O₂, 그리고 이델라리십 및 H₂O₂를 공동처리한 둘다에서는 핵 β카테닌은 감소하였다(도 3 E 및 F). 이것은 핵 β-카테닌 레벨이 우선적으로 p110δ-매개 PI3K-AKT 시그널링에 좌우된다는 것을 의미한다.

다음으로 고레벨의 ROS 및, 핵 β-카테닌과 TERT 레벨의 증가 사이의 잠정적 연관관계를 HCC 조직으로 평가하였다. 우선, 8-옥소-2‘-데옥시구아노신(8-옥소-dG) 레벨이 세포내 ROS와 관련이 있는지를 확인하기 위하여, 본 발병자는 세포내 ROS 레벨을 측정하는데 사용되는 형광 프로브 2’,7‘-디클로로플루오레세인(DCF)의 레벨과 8-옥소-dG 레벨을 비교하였다. 형광 ROS-반응성 프로브 DCF를 HCC 세포내로 삽입한 후, 형광강도를 특정하였다. H₂O₂ 처리에 의해, ROS 레벨을 가시화하기 위한 마커로 사용되는 항-8-옥소-dG 항체를 사용하였을 때와 유사한 방식으로 DCF의 형광 강도가 증가하였다(도 3G 및 H). 8-옥소-dG는 산화적 DBA 부가물을 탐지하기 위한 분자 마커로 승인받은 것으로, HCC 조직에서 유래한 세포에서의 β-카테닌, TERT 발현 및 ROS 레벨이 합쳐져 가시화되도록 한다. 이러한 면역염색 분석 결과 8-oxo-dG, β-카테닌 및 TERT 발현이 GIII HCC 종양 세포 핵에서 증가하였다고 나타났다(도 3I). 종합하여 보면, 이러한 결과는 핵 β-카테닌 레벨이 ROS-매개로 상향조절됨으로써 진행성 HCC 종양에서 TERT 발현이 높게 유도되었다는 것을 의미한다.

실시예 4. PI3K - AKT 저해제가 ROS -매개 β- 카테닌 및 SetD1A의 TERT 프로모터와의 결합 저해 규명

TERT 발현 조절시의 핵 β-카테닌의 매카니즘을 설명하기 위하여, 본 발명자는 TERT 전사동안 TERT 프로모터에의 크로마틴 접근성이 증가하는 것과 β-카테닌이 연관이 있는지를 조사하였다. 이에 본 발명자는 내인성 β-카테닌 및, 크로마틴 리모델링동안 TERT 전사를 촉진하는 것으로 알려져 있는 히스톤 메틸트랜스퍼라아제 SetD1A의 항체를 사용하여 동시-면역침강실험을 수행하였다. 300 μM H₂O₂-처리된 HCC 세포에서 SetD1A는 β-카테닌에 결합되었다(도 4A). 면역염색 실험 또한 β-카테닌 및 SetD1A 둘다 300 μM H₂O₂-처리된 HCC 세포의 핵에 축적된 것으로 나타났다(도 4B). 추가로 본 발명자는 SetD1A 녹다운 존재 또는 부존재시에 H₂O₂-처리된 HCC 세포에서의 TERT mRNA 레벨의 변화를 정량화하였다. SetD1A이 사일런스되면, H₂O₂-처리후 일지라도 TERT 발현은 감소하였다(도 4C). H₂O₂-에 의해 유도된 pAKT 및 β-카테닌의 증가는 SetD1A 녹다운과는 독립적이었으나(도 4C), TERT 프로모터에서의 크로마틴 리모델링이 관여하는 것으로 나타났다. 크로마틴 면역침강 분석에서, H₂O₂-처리된 HCC 세포에서 SetD1A, β-카테닌, 및 RNA 폴리머라아제 II(Pol II)를 포함한 key TERT 전사적 활성화-연관 인자의 TERT 프로모터에의 결합이 증가한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 SetD1A이 TERT 프로모터에서의 크로마틴 접근성을 증가시킴으로써 ROS-연관 PI3K-AKT-β-catenin-TERT 시그널링에 관여한다는 것을 의미한다.

다음으로, 본 발명자는 PI3K 또는 AKT 저해제가 HCC 세포에서 β-카테닌 및 SetD1A의 TERT 프로모터와의 결합을 감소시키는지를 알아보았고, 이러한 것 또한 H₂O₂ 존재시에 일어난다는 것을 관찰하였다(도 4D 및 E). HCC 세포에서 β-카테닌 및 SetD1A의 TERT 프로모터와의 결합이 감소되는 것은 이델라리십 단독 처리 및 이델라리십 및 H₂O₂ 공동 처리에도 유사하였다(도 4D). 이러한 것은 이델라리십이 ROS-매개의 β-카테닌 및 SetD1A의 TERT 프로모터와의 결합을 온전히 저해한다는 것을 나타낸다. GSK3β 저해제는 H₂O₂ 처리와 상관없이 β-카테닌 및 SetD1A의 결합을 증가시켰다(도 4F). 이러한 결과는 ROS는 PI3K-AKT 시그널링 과활성화를 통해 핵 β-카테닌의 레벨을 증가시키고, 이어서 증가된 핵 β-카테닌이 SetD1A의 TERT 프로모터와의 결합을 증가시킨다는 것을 의미한다. 마우스 배아 세포 및 인간 대장암 세포주를 사용한 기존 연구에서 보고된 바와 같이, 핵 β-카테닌은 TERT 프로모터로의 SetD1A 리쿠르트를 촉진시켰다(Hoffmeyer K, Raggioli A, Rudloff S, Anton R, Hierholzer A, Del Valle I, et al. Wnt/beta-catenin signaling regulates telomerase in stem cells and cancer cells. Science. 2012;336:1549-54). 결과적으로 크로마틴 리모델링 인자 SetD1A가 TERT 전사 활성화를 이끌었다.

다음으로, 본 발명자는, 우선 H₂O₂-처리된 HCC 세포를 주입한 누드 마우스에서 종양 발달에서의 지연시간을 조사함으로써, 이델라리십이 인비보에서 PI3K-AKT 시그널링 과활성화에서 유래한 종장 성장을 저해하는지를 알아보았다. 본 발명자는 1 X 10⁵ H₂O₂-처리된 HCC 세포를 주입한 누드 마우스에서 종양 발달에 걸린 지연시간이 28일이라는 것을 밝혔다(도 4G 및 H). H₂O₂-처리하지 않은 1 X 10⁵ HCC 세포를 주입한 누드 마우스에서 종양이 나타나기까지의 평균 시간은 대략 70일이었는데(도 4H), 이는 동일한 1 X 10⁵ HCC 세포를 사용한 기존 연구에서의 평균시간과 유사하다. 반대로, 이델라리십 및 H₂O₂ 공동-처리한 HCC 세포를 주입한 후 70일까지 어떠한 종양도 형성되지 않았다(도 4H). 이러한 결과는 ROS-촉진 종양의 성장은 인비보에서 PI3K 저해제 이델라리십에 의해 저해된다는 것을 의미한다.

H₂O₂ 처리 후에, p110δ PI3K 및 TERT 단백질 레벨이 현저하게 증가하였다(대략 2배)(도 2, 3E 및 F). 게다가, H₂O₂ 처리 후에, 텔로머라아제 활성 및 텔로미어 길이 둘 다 상당히 증가(각각 대략 2배 및 1.3배)되는 것이 관찰되었다(도 2). H₂O₂ 처리에 의한 TERT mRNA 레벨, TERT 단백질 레벨, 텔로머라아제 활성, 및 텔로미어 길이의 증가는 이델라리십에 의해 완전히 감소되었다(도 2). 이러한 결과는 이델라리십이 H₂O₂ 처리에 의해 유도되는 종양 성장을 완전히 억제한다는 것을 나타내는 데이터와 일치하는 것이다(도 4 G 및 H). 이델라리십은 p110δ PI3K에의 ATP 결합과 경쟁하기 때문에, p110δ PI3K 활성을 매우 선택적으로 저해한다. 이러한 결과에 기초하여, 본 발명자는 HCC 세포에서 H₂O₂ 처리에 의해 유도된 p110δ PI3K 상향조절이 TERT 상향조절 및 텔로미어 신장에 충분하다고 결론지었다.

실시예 5. HCC 조직에서 ROS 레벨과 텔로미어 길이가 양적 연관관계에 있음을 규명

초기에서 진행성 HCC로의 진행은 TERT 발현 및 산화적 스트레스가 증가하는 것으로 특징지을 수 있다. 기존 연구와 일치하게도, 본 발명자는 초기 HCC 조직에서 진행성 조직(각각 GI 에서 GII, 및 GIII)으로 진행될수록 TERT 발현, 텔로미어 길이, 및 ROS 레벨이 증가하는 것을 관찰하였다(도 5A-C). 다음으로, 본 발명자는 HCC 조직에서 ROS 레벨과 텔로미어 길이가 양의 상관관계가 있는지를 알아보았다. HCC 조직에서 8-옥소-dG가 더 높게 나타내는 것은 ROS 레벨이 더 높음을 나타내는 것인데, 이러한 상기 조직에서 텔로미어 길이가 더 길게 나타났다(도 5D 및 E). 이러한 결과는 세포내 ROS 농도가 진행성 HCC 에서 TERT 발현 및 텔로미어 길이를 증가시키는데 기여한다는 것을 의미한다.

TERT 프로모터에 있는 2개의 체세포돌연변이는 인간 종양에서 TERT 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있다 (Vinagre J, Pinto V, Celestino R, Reis M, Populo H, Boaventura P, et al. Telomerase promoter mutations in cancer: an emerging molecular biomarker? Virchows Arch. 2014;465:119-33). 본 발명자는 기존에 TERT 프로모터 돌연변이를 함유하는 HCC 종양에서의 TERT mRNA 및 텔로미어 길이를 정량하였고, 이러한 돌연변이 단독으로는 HCC 종양에서 TERT mRNA 발현 레벨 또는 텔로미어 길이에 영향을 미치지는 않았다 (Ko E, Seo HW, Jung ES, Kim BH, Jung G. The TERT promoter SNP rs2853669 decreases E2F1 transcription factor binding and increases mortality and recurrence risks in liver cancer. Oncotarget. 2015). 기존 연구와 더불어, 본 발명자는 TERT 프로모터 돌연변이 및 야생형 종양 조직 사이에 TERT 발현이나 또는 텔로미어 길이 어느 것에서도 차이점을 발견하지 못하였다. 이러한 결과는 본 발명자의 실험 및 다른 등급(GI, GII, 및 GIII)의 HCC 종양 사이에 TERT 프로모터 돌연변이 빈도의 차이가 나타나지 않는 다른 연구결과(32-35)와 일치하는 것이다. 그러나 본 실험에서, 초기에서 진행성 등급으로 HCC 종양이 진행될수록 p110δ PI3K mRNA 레벨이 상당히 증가하였고(도 5F) TERT mRNA 발현 레벨 사이에 양의 연관관계가 있었다(도 5G). 다른 부류 I PI3K 아이소폼(p110α, p110β, 및 p110γ)을 발현하는 경우에는, 초기에서 진행성 등급으로 HCC 종양이 진행될 때 mRNA 레벨이 유의하게 증가하지는 않았고(도 5F) TERT mRNA 레벨과 연관되지도 않았다(도 5G). 비-종양일 때와 비교하여 GIII HCC 종양일 때 p110δ mRNA 레벨이 더 높다(12.0배)는 것을 발견하였으며, 이는 GIII HCC 종양에서 증가된 p110δ mRNA 레벨이 GIII HCC 종양에서의 p110α (4.3 배), p110β (5.4 배), 및 p110γ (4.4 배) mRNA 레벨보다 더 높았다(도 5F 및 G). 이는 대부분의 GIII HCC 종양(10 중 8)이 비종양과 비교하여 p110δ 단백질 레벨이 증가(>2.3 배)한 것으로 나타난 면역블랏 데이터와 일치하는 것이다(도 5H 및 I). 비종양과 비교하여 2.3배 이상의 p110α, p110β, 및 p110γ 단백질 레벨을 발현하는 각 GIII HCC 종양의 빈도는 각각 10 중 2, 10 중 1, 및 10 중 2였다(도 5H 및 I). p110δ mRNA 및 TERT mRNA 레벨 사이에 상당한 양의 상관관계가 있는 것과 더불어, 고레벨의 p110δ 단백질 레벨을 가지는 대부분의 GIII HCC 종양에서 TERT 단백질 레벨이 더 컸다(도 5H 및 I).

이러한 데이터는 초기 신호가 p110δ 및 TERT 발현을 증가시키는데 책임이 있다는 것을 의미한다. 본원 데이터(도 2)에 의하면, ROS는 p110δ 및 TERT 발현을 증가시켜, 텔로미어가 신장되게 한다. 따라서, ROS가 초기 신호에 포함되는 것으로 나타났다. 면역형광 in situ 혼성화(FISH) 분석에서 얻은 데이터를 선형 회귀 분석한 결과 ROS 레벨 및 텔로미어 길이 사이에 상당한 양적 상관관계가 있는 것으로 나타났다(P < 0.0001, 도 5J). 또한 HCC 종양에서 FISH 및 정량적 PCR 분석 둘다에서 텔로미어 길이에 대하 유사한 수치가 얻어졌다. 이러한 결과는 ROS 레벨이 증가하면 진행성 HCC 종양에서 TERT 발현 및 텔로미어 길이를 증가된다는 것을 의미한다.

실시예 6. HCC에서 텔로미어 길이, ROS 레벨 및 p110δ 레벨이 증가할수록 환자 생존율이 낮아짐을 규명

증가된 TERT 발현을 통한 텔로미어 안정화가, 암 사망률 위험을 증가시키게 하는 세포 불멸화의 관문이다. 텔로미어 길이 및 ROS 레벨은 둘다 HCC 사망율 및 재발율과 양적 상관관계가 있는 것을 발견하였다(로그-랭크 테스트, P < 0.0001 for telomere length-related overall survival rate [OSR], P < 0.0001 for telomere length-related recurrence-free survival rate [RFSR], P = 0.0002 for ROS level-related OSR, 및 P < 0.0001 for ROS level-related RFSR; 도 6A 및 B).

다변량 분석에서도 또한 텔로미어 길이 및 ROS 레벨이 HCC 사망율 및 재발율과 상당히 연관되어 있었다(위험비 = 4.594, 95% confidence interval [CI]= 1.84111.462, P = 0.0011 for longer telomere length-related OSR; 위험비 = 3.997, 95% CI = 1.6269.826, P = 0.0025 for longer telomere length-related RFSR; 위험비 = 2.504, 95% CI = 1.0695.868, P = 0.0346 for higher ROS level-related OSR; 및 위험비 = 2.905, 95% CI = 1.2366.831, P = 0.0145 for higher ROS level-related RFSR; 표 1). 최근 결과(Chen YL, Jeng YM, Chang CN, Lee HJ, Hsu HC, Lai PL, et al. TERT promoter mutation in resectable hepatocellular carcinomas: a strong association with hepatitis C infection and absence of hepatitis B infection. Int J Surg. 2014;12:659-65; Nault JC, Mallet M, Pilati C, Calderaro J, Bioulac-Sage P, Laurent C, et al. High frequency of telomerase reverse-transcriptase promoter somatic mutations in hepatocellular carcinoma and preneoplastic lesions. Nat Commun. 2013;4:2218)와 유사하게, TERT 프로모터 돌연변이 존재 또는 부존재 환자 사이의 생존율 차이는 무시할 만 하였는데(표 1), 이는 TERT 프로모터 돌연변이 존재 또는 부존재 HCC종양 사이에 TERT 발현 및 텔로미어 길이에서 차이가 없는 것으로 관찰된 것과 일치한다. p110δ의 mRNA 레벨이 높은 것이 무재발-생존율이 낮은 것과 연관이 있었는데(위험비 = 7.015, 95% CI = 2.53119.44, P = 0.0002; 도 6C), 이는 p110δ mRNA 발현이 높은 것이 TERT mRNA 고레벨, ROS 고레벨, 및 긴 텔로미어 길이와 유사하게 HCC 진단마커라는 것을 의미한다. 종합하여 보면, HCC 종양에서 TERT 발현 및 텔로미어가 증가하게 하는 주요 결정인자이며, 텔로미어 길이, ROS 레벨 및 p110δ가 중요하며, 이로 인해 사망율 및 암재발율을 증가하게 된다는 것을 알 수 있다.

표 1에서 Telomere-short인 환자 telomere-long인 환자의 비교는 생존 분석을 하여 두 그룹을 비교한 Hazard 비로 알 수 있다. 예를 들면 도 6a에서 HR = 6.771은 telomere-long인 환자들이, telomere-short인 환자들에 비교하여 6.771배로 사망률이 증가 (생존율이 감소)하는 것을 나타낸다. 본 연구에 근거하면 생존율 또는 사망률은 5년간 생존률 또는 사망률을 나타낸다고 볼 수 있다 (5-year survival).

[표 1] Cox 비례 위험모델을 이용한 단변량 및 다변량 분석

HCC의 주요 원인은 HBV 또는 HCV 간염, 알코올 섭취 또는 비알콜성 지방간에 의한 간경변이다. 이러한 위험인자는 ROS 레벨을 상승시키는 것으로 보고되어 있다. 항산화 효소 활성의 감소 또한 HCC 종양에서의 ROS 레벨을 높게 한다. 카탈라아제, 글루타치온 S-트랜스퍼라아제, 글루타치온 퍼옥시다아제, 구리-아연 수퍼옥사이드 디스뮤타아제, 및 망가니즈 수퍼옥사이드 디스뮤타아제를 포함하는 항산화 효소의 발현 레벨 또는 활성은 건강한 간에서는 대부분 풍부하다. 그러나 HCC 에서는 상기 효소의 레벨은 극적으로 감소되어 있다. 본 발명자는 H₂O₂ 또는 페나진 메소설페이트와 같은 ROS 유도제는 HCC 세포주에서 특정 조건하에 항산화 효소를 감소시키고, 상피-간엽 이행(epithelial-mesenchymal transition) 표현형을 유도하며 텔로미어 길이를 증가시킨다는 것을 발현하였다. 진행성 HCC의 특징에는 항산화 효소의 하향조절, 상피-간엽 이행 촉진, 및 텔로머라아제 과활성화에 의해 유도된 텔로미어 신장이 포함된다. 따라서, 진행성 HCC 종양을 최적으로 모방하기 위하여 본 실험을 ROS 레벨이 높은 상태의 HCC 세포에서 수행하였다.

세포의 산화적 스트레스는 텔로미어 단축을 유도하는데, 이는 세포 증식 및 생존에 부정적인 영향을 미친다. 텔로미어 DNA는 매우 반복적인 ROS-민감성 R-rich repeat을 가지고 있으므로 인비보에서 ROS-유도 산화적 스트레스는 텔로미어에는 파괴적인 것이다. 반대로, 본 발명자는 ROS가 인간 HCC세포에서 PI3K-AKT-β-catenin signaling을 과활성화시킴으로써 TERT 발현을 증가시켜 텔로미어 신장을 자극한다는 것을 발견하였다(도 6). 이러한 것은 ROS가 텔로머라아제 활성화를 통해 텔로미어 신장을 증가시키고, 텔로미어 신장은 산화적 손상에 의한 텔로미어 단축을 경쟁적으로 억제한다는 것을 의미한다. 이스트모델을 사용한 최근 연구에서 두가지 타입의 텔로머라아제 불활성화, 즉 초기 및 후기 텔로머라아제 불활성화(각각 ETI and LTI)가 있는 것으로 나타났다. 텔로미어 단축은 ETI보다는 LTI로 설명된다. 초기에서 진행성 HCC 종양으로 진행될수록 텔로미어는 더 길어진다. 이러한 기존 연구에 근거하여 보면, 인간 간암 발달동안에 LTI가 진화적으로 보존된 것일 수 있다. 초기 HCC 종양 세포에서의 LTI-내성이 생기게 된 것은 이러한 세포가 진행성 형태로 진행되는데 필요한 것으로 여겨진다.

AKT에 의한 인산화를 통해 GSK3β를 억제하면, 세포질 β-카테닌의 프로테아좀성 분해가 저해되어 핵에 축적된다. 기존 연구에 의하면 Wnt-mediated β-catenin 시그널링은 TERT를 상향조절하는 것으로 알려져 있다. Wnt 분자는 APC, GSK3β, Axin1, and disheveled proteins로 이루어진 분해복합물을 불활성화시킨다. 상기 복합물의 불활성화에 의해 β-카테닌이 핵으로 이동(translocation)하게 된다. 핵 β-카테닌의 로컬화 촉진에 있어 Wnt와 AKT 시그널링 사이에 현저한 차이가 있다: AKT 시그널링은 직접적으로 GSK3β의 Ser-9에 인산화시킴으로써 GSK3β 활성을 억제하는 반면, Wnt는 GSK3β를 함유하는 분해복합물을 억제한다. 본원 연구에서 HCC세포에서 핵내 β-catenin이 ROS-매개에 의해 축적되면 TERT 발현을 상향조절시킨다는 것이 밝혀졌다. 또한 ROS-처리된 HCC 세포에서 GSK3βinhibitor XI-treated HCC 세포에서와 유사한 방식으로 TERT 발현이 증가하였는데, 이는 ROS-매개 TERT 발현이 GSK3β 경로에 의존한다는 것을 의미한다. 나아가, GSK3β 의 구성적 활성화 형태인 phospho mutant GSK3β S9A가 β-카테닌 및 TERT 둘다의 발현을 감소시키는 것으로 나타났다. 따라서 AKT에 의한 GSK3β의 직접적 인산화를 저해하면 핵 β-카테닌 레벨이 감소되어 TERT 발현이 감소하게 된다. 반대로, AKT는 TERT 단백질을 인산화시킴으로써 텔로머라아제 활성을 증가시킨다는 것이 입증되었다(18, 51). 이러한 증거에도 불구하고, 텔로머라아제 활성은 TERT 내의 모든 잠정적 AKT 인산화 부위의 돌연변이에 의해 영향을 받지 않았다(52). 나아가, 본 발명자는 소라페닙-매개 AKT 인산화가 TERT 단백질 레벨을 증가시키지 않는다는 것을 밝혔다. 이와 함께 AKT-매개 TERT 인산화와 반대로 간암에서 AKT-매개 TERT 전사 상향조절이 텔로머라아제 활성 및 텔로미어 유지에 상당히 영향을 미치는 것으로 나타났다.

돌연변이된 간 driver 유전자를 동정하면 HCC 환자를 치료하는 다른 방법이 있을 수 있다 (Schulze K, Imbeaud S, Letouze E, Alexandrov LB, Calderaro J, Rebouissou S, et al. Exome sequencing of hepatocellular carcinomas identifies new mutational signatures and potential therapeutic targets. Nat Genet. 2015;47:505-11). 최근 whole 엑솜 서열 데이터에서 HCC의 30% 이상의 케이스에서 CTNNB1 mutation (β-catenin-activating mutation)이 있는 것으로 나타났다. 비록 CTNNB1 mutation이 고위험의 HCC 변형(transformation)과 연관되어 있지만, HCC 에서 β-카테닌이 직접적으로 ETRT 발현을 조절하는지는 여전히 불분명하다. 30-50%의 HCC 케이스에서 TERT 프로모터에서의 돌연변이가 탐지되었다. HCC의 전구체인 간경변 전(pre)- 종양성 손상(neoplastic lesion)에서 TERT 프로모터 돌연변이가 관찰될 때 TERT 발현이 높았다. 그러나 TERT 프로모터 돌연변이가 HCC 종양에서 TERT 발현레벨, 텔로미어 또는 환자 생존율에 직접적으로 영향을 미치지는 않았다. 다양한 인간 암에서, 네 개의 class I PI3K 촉매 아이소폼 중 PIK3CA (encoding p110α)만이 자주 돌연변이가 되었다. HCC 또한 2% 빈도로 lass I PI3K isoform 중 PIK3CA 돌연변이가 나타났는데, 이는 PIK3CD (encoding p110δ)를 포함한 PI3K isoform에서의 돌연변이가 HCC 진행에 약간의 영향을 미친다는 것을 의미한다. 종양과 연관된 유전자에서의 돌연변이가 HCC 진행에 영향을 미친다. 그러나 간세포암 생성에 필수적인 다른 원인이 있을 수 있다. 이러한 것은(초기에서 진행성 HCC로의 진행동안) ROS에 의해 유도되는 TERT 발현 상향조절 및 텔로미어 신장에 의해 뒷받침될 수 있다.

진행성 HCC를 포함한 인간 암에서 키나아제 활성의 탈조절(dysregulated)이 일어날 수 있다. 진행성 HCC 약물인 소라페닙은 미토젠-활성화된 단백질 키나아제, 혈관 내피 성장인자 수용체, 및 혈소판-유래 성장인자 수용체-β 경로를 저해함으로써 활성을 나타내지만, PI3K-AKT signaling을 저해하지는 않는다. 간암에서 활성화되는 핵심 시그널링 경로에는 PI3K-AKT and β-catenin pathways가 포함된다; 그러나, 이들을 자극하는 업스트림 인자는 알려져 있지 않다. 본 발명자는 진행성 HCC 조직의 88%(117케이스 중 103)가 비종양 조직과 비교하여 ROS 레벨이 더 높다는 것을 발견하였다(도 5C). 상기 데이터는, ROS가 간암에서 가장 중요한 인자라는 것을 암시한다. 따라서, ROS에 의한 PI3K-AKT signaling이 진행성 HCC 종양에 대한 가장 효과적인 경로임을 나타내는 것이다. 상기 시그널링은 간암이 진행됨에 따라 TERT 발현 레벨 및 텔로미어 길이를 증가시킨다. 이러한 발견은 ROS-mediated p110δ PI3K-AKT signaling이 TERT 상향조절 및 텔로미어 신장을 유도한다는 것을 의미하며, 이는 p110δ PI3K 저해를 통한 효과적 간세포암 치료제의 개발이 가능하다는 것을 나타낸다.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (6)

1. 간암세포를 제공하는 단계;
   상기 세포에 PI3K p110델타의 활성을 억제할 수 있는 시험물질을 처리하는 단계;
   시험물질이 처리된 상기 세포에서 상기 PI3K p110델타의 활성 억제 마커로서 상기 세포의 PI3K 활성, 포스포AKT 활성, 포스포GSK3 베타, 및 베타-카테닌 농도를 측정하는 단계; 및
   상기 측정 결과, 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 시험물질을 처리한 세포에서 상기 각 마커의 활성 또는 농도가 감소한 경우, 상기 시험물질을 간세포암 치료 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, 간세포암 치료제 스크리닝 방법.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 방법은 상기 시험물질을 처리하는 단계 전에 TERT의 활성을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 간세포암 치료제 스크리닝 방법.
   
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 간암세포에 활성산소종의 농도를 증가시키는 물질을 처리하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 간암세포는 확립된 세포주인, 방법.
   
5. 제 4 항에 있어서, 상기 확립된 세포주는 Huh-7, HepG2 또는 Hep3B인, 방법.
   
6. 삭제

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