CN107973851A - 与多分子的抗原重复结合的抗原结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于提供：促进通过抗原结合分子向细胞内摄入抗原的方法、增加通过1分子的抗原结合分子结合抗原的次数的方法、通过给予抗原结合分子促进血浆中抗原浓度的减少的方法、改善抗原结合分子的血浆中滞留性的方法、抗原向细胞内的摄入得到促进的抗原结合分子、对抗原的结合次数增加的抗原结合分子、通过给予能够促进血浆中抗原浓度的减少的抗原结合分子、改善了血浆中滞留性的抗原结合分子、含有该抗原结合分子的药物组合物、和它们的制造方法。本发明人发现，通过使用显示出钙依赖性抗原抗体反应的抗原结合分子，可以解决上述课题。

Description

与多分子的抗原重复结合的抗原结合分子
本申请是国际申请日2011年11月30日，国际申请号PCT/JP2011/077619，中国申请号为201180066242.5，发明名称为“与多分子的抗原重复结合的抗原结合分子”的分案申请。
背景技术
抗体在血浆中的稳定性高、副作用也少，因而作为医药品受到关注。其中，IgG型的抗体医药有大量上市，现在也正在开发着数量众多的抗体医药(非专利文献1、非专利文献2)。另一方面，作为能适用于第二代抗体医药的技术，开发有各种技术，报道了使效应器功能、抗原结合能力、药代动力学、稳定性提高的技术、或者使免疫原性风险降低的技术等(非专利文献3)。通常，抗体医药的给药量非常高，因而作为课题可考虑到难以制作皮下给药制剂，制造成本高等。作为降低抗体医药的给药量的方法，可考虑提高抗体的药代动力学的方法、和提高抗体与抗原的亲和性(affinity)的方法。
作为提高抗体的药代动力学的方法，报道有恒定区的人工氨基酸置换(非专利文献4、5)。作为增强抗原结合能力、抗原中和能力的技术，报道有亲和力成熟技术(非专利文献6)，通过对可变区的CDR区等的氨基酸导入突变可以增强对抗原的结合活性。通过增强抗原结合能力，可以提高体外的生物活性，或者降低给药量，进而也可以提高体内的药效(非专利文献7)。
另一方面，每1分子抗体能够中和的抗原量依赖于亲和性，可以通过增强亲和性来以少的抗体量中和抗原，可以通过各种方法增强抗体的亲和性(非专利文献6)。进而，只要可共价地与抗原结合，使亲和性无限大，则可以用1分子的抗体来中和1分子的抗原(2价的情形为2抗原)。但是，迄今为止的方法中，限制是1分子抗体对1分子抗原(2价的情形是2抗原)的化学计量的中和反应，不可能用抗原量以下的抗体量来完全中和抗原。即，在增强亲和性的效果方面存在限制(非专利文献9)。中和抗体的情形中，为了使其中和效果持续一定期间，需要给予机体内在该期间产生的抗原量以上的抗体量，仅通过上述的抗体药代动力学提高、或者亲和力成熟技术，在降低必要抗体给药量方面存在限制。因此，为了用抗原量以下的抗体量来使抗原的中和效果持续目标期间，需要用1个抗体来中和多个抗原。
作为实现其的新方法，最近报道了pH依赖性地与抗原结合的抗体(专利文献1)。在血浆中的中性条件下与抗原强结合、在内体内的酸性条件下从抗原解离的pH依赖性抗原结合抗体可以在内体内从抗原解离。pH依赖性抗原结合抗体在将抗原解离后，若抗体通过FcRn被循环至血浆中，则可以再次与抗原结合，从而可以用1个抗体重复与多个抗原结合。
另外，与结合至FcRn而被循环的抗体相比，抗原的血浆中滞留性非常短。血浆中滞留性长的抗体与这种血浆中滞留性短的抗原结合时，抗体抗原复合体的血浆中滞留性变得与抗体同样地长。因此，抗原通过与抗体结合，不仅血浆中滞留性变长，而且血浆中抗原浓度上升。这样的情形中，即使抗体对抗原的亲和性提高，也不能促进抗原从血浆中的消除。上述的pH依赖性抗原结合抗体据报道与通常的抗体相比，作为促进抗原从血浆中消除的方法也是有效的(专利文献1)。
如此，pH依赖性抗原结合抗体可以用1个抗体与多个抗原结合，与通常的抗体相比，能促进抗原从血浆中的消除，因此具有通常的抗体所无法实现的作用。然而，迄今为止，为了实现该pH依赖性抗原结合抗体的能重复与抗原结合的效果、以及促进抗原从血浆中的消除的效果，只知道利用血浆中与内体内的pH的不同来对抗原抗体反应赋予pH依赖性的方法。
应予说明，本发明的现有技术文献如下所示。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO 2009/125825，ANTIGEN-BINDING MOLECULE CAPABLE OF BINDING TOTWO OR MORE ANTIGEN MOLECULES REPEATEDLY
非专利文献
非专利文献1：Monoclonal antibody successes in the clinic，Janice MReichert，Clark J Rosensweig，Laura B Faden&Matthew C Dewitz，NatureBiotechnology 23，1073-1078(2005)
非专利文献2：Pavlou AK，Belsey MJ.，The therapeutic antibodies market to2008.，Eur J Pharm Biopharm.2005Apr；59(3)：389-96.
非专利文献3：Kim SJ，Park Y，Hong HJ.，Antibody engineering for thedevelopment of therapeutic antibodies.，Mol Cells.2005 Aug 31；20(1)：17-29.Review.
非专利文献4：Hinton PR，Xiong JM，Johlfs MG，Tang MT，Keller S，Tsurushita N.，An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life.，J Immunol.2006Jan 1；176(1)：346-56
非专利文献5：Ghetie V，Popov S，Borvak J，Radu C，Matesoi D，Medesan C，Ober RJ，Ward ES.，Increasing the serum persistence of an IgG fragment by randommutagenesis.，Nat Biotechnol.1997 Jul；15(7)：637-40
非专利文献6：Proc Natl Acad Sci U S A.2005 Jun 14；102(24)：8466-71.Epub2005 Jun 6.A general method for greatly improving the affinity of antibodiesby using combinatorial libraries.Rajpal A，Beyaz N，Haber L，Cappuccilli G，YeeH，Bhatt RR，Takeuchi T，Lerner RA，Crea R.
非专利文献7：Wu H，Pfarr DS，Johnson S，Brewah YA，Woods RM，Patel NK，White WI，Young JF，Kiener PA.Development of Motavizumab，an Ultra-potent Antibody forthe Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper andLower Respiratory Tract.J Mol Biol.2007，368，652-665
非专利文献8：Hanson CV，Nishiyama Y，Paul S.Catalytic antibodies and theirapplications.Curr Opin Biotechnol.2005 Dec；16(6)：631-6.
非专利文献9：Rathanaswami P，Roalstad S，Roskos L，Su Q J，Lackie S，BabcookJ.Demonstration of an in vivo generated sub-picomolar affinity fully humanmonoclonal antibody to interleukin-8.Biochem Biophys Res Commun.2005 Sep 9；334(4)：1004-13。
发明内容
发明要解决的技术问题
本发明是鉴于上述状况而完成的发明，其目的在于提供：促进通过抗原结合分子向细胞内摄入抗原的方法、增加通过1分子的抗原结合分子结合抗原的次数的方法、通过给予抗原结合分子促进血浆中抗原浓度的减少的方法、改善抗原结合分子的血浆中滞留性的方法、抗原向细胞内的摄入得到促进的抗原结合分子、对抗原的结合次数增加的抗原结合分子、通过给予能够促进血浆中抗原浓度的减少的抗原结合分子、改善了血浆中滞留性的抗原结合分子、含有该抗原结合分子的药物组合物、和它们的制造方法。
用于解决技术问题的方法
本发明人对于促进基于抗原结合分子(具有抗原结合能力的多肽等分子)向细胞内摄入抗原的方法、增加1分子的抗原结合分子结合抗原的次数的方法、通过给予抗原结合分子促进血浆中抗原浓度的减少的方法、改善抗原结合分子的血浆中滞留性的方法进行了深入研究。结果本发明人着眼于血浆中与早期内体内的钙浓度的差异，发现：通过使用具有显示出钙依赖性的抗原抗体反应的抗原结合分子，能够促进基于抗原结合分子的抗原向细胞内的摄入；通过抗原结合分子与抗原多次结合，能够增加1分子的抗原结合分子结台抗原的次数；通过给予抗原结合分子，能够促进血浆中抗原浓度的减少；能够改善抗原结合分子的血浆中滞留性。
即，本发明涉及：通过具有显示出钙依赖性的抗原抗体反应的抗原结合分子，促进抗原向细胞内摄入的方法；增加通过1分子的抗原结合分子结合抗原的次数的方法；通过给予抗原结合分子促进血浆中抗原浓度的减少的方法：改善抗原结合分子的血浆中滞留性的方法；抗原向细胞内的摄入得到促进的抗原结合分子；对抗原的结合次数增加的抗原结合分子；通过给予能够促进血浆中抗原浓度的减少的抗原结合分子；改善了血浆中滞留性的抗原结合分子；含有该抗原结合分子的药物组合物、和它们的制造方法等，更具体地，涉及以下内容。
〔1〕抗原结合分子，其是含有抗原结合结构域和人FcRn结合结构域的抗原结合分子，其在2个不同钙浓度条件下的抗原结合活性不同，抗原结合分子的低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性，且在中性pH条件下具有对人FcRn的结合活性。
〔2〕 〔1〕所述的抗原结合分子，其中，低钙浓度是离子化钙浓度0.1μM～30μM。
〔3〕 〔1〕所述的抗原结合分子，其中，高钙浓度是离子化钙浓度100μM～10mM。
〔4〕 〔1〕或〔2〕所述的抗原结合分子，其中，低钙浓度是内体内的离子化钙浓度。
〔5〕 〔1〕或〔3〕所述的抗原结合分子，其中，高钙浓度是血浆中的离子化钙浓度。
〔6〕 〔1〕～〔5〕中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述FcRn结合结构域是Fc区。
〔7〕 〔1〕～〔6〕中任一项所述的抗原结合分子，其中，进一步地，酸性pH条件下的抗原结合活性低于中性pH条件下的抗原结合活性。
〔8〕 〔7〕所述的抗原结合分子，其特征在于，至少1个氨基酸被组氨酸所置换、或者***有至少1个组氨酸。
〔9〕 〔1〕～〔8〕中任一项所述的抗原结合分子，其特征在于，与膜抗原或者可溶型抗原结合。
〔10〕 〔1〕～〔9〕中任一项所述的抗原结合分子，其特征在于，抗原是选自IL-6R、IL-6、IgA、人磷脂酰肌醇聚糖3和IgE中的抗原。
〔11〕抗原结合分子，其是含有抗原结合结构域和人FcRn结合结构域的抗原结合分子，其在2个不同钙浓度条件下的抗原结合活性不同，抗原结合分子的低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性，且抗原结合结构域所含的轻链或重链中含有来源于人抗体的钙结合模体。
〔12〕 〔11〕所述的抗原结合分子，其中，钙结合模体含有在抗原结合结构域的轻链CDR1、CDR2和/或CDR3中。
〔13〕 〔12〕所述的抗原结合分子，其中，钙结合模体含有在轻链CDR1的以Kabat编号表示的30位、31位和/或32位。
〔14〕 〔12〕或〔13〕所述的抗原结合分子，其中，钙结合模体含有在轻链CDR2的以Kabat编号表示的50位。
〔15〕 〔12〕～〔14〕中任一项所述的抗原结合分子，其中，钙结合模体含有在轻链CDR3的以Kabat编号表示的92位。
〔16〕 〔12〕～〔15〕中任一项所述的抗原结合分子，其中，抗原结合分子是IgA或人磷脂酰肌醇聚糖3的任一者。
〔17〕 〔11〕所述的抗原结合分子，其中，钙结合模体含有在抗原结合结构域的重链CDR1、CDR2和/或CDR3中。
〔18〕 〔16〕所述的抗原结合分子，其中，钙结合模体含有在重链CDR3的以Kabat编号表示的95位、96位、100a位、和/或101位。
〔19〕 〔17〕或〔18〕所述的抗原结合分子，其中，抗原结合分子是IL-6R或IL-6中的任一者。
〔20〕 〔11〕～〔19〕中任一项所述的抗原结合分子，其含有FcRn结合结构域，该FcRn结合结构域具有在pH中性范围的条件下的对FcRn的结合活性。
〔21〕 〔20〕所述的抗原结合分子，其中，前述FcRn结合结构域为Fc区。
〔22〕 〔1〕～〔10〕、〔20〕或〔21〕中任一项所述的抗原结台分子，其中，前述Fc区是这样的Fc区，其氨基酸序列中以EU编号表示的248、250、252、254、255、256、257、258、265、286、289、297、303、305、307、308、309、311、312、314、315、317、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、428、433、434和436中的任一个以上的氨基酸与天然型Fc区的氨基酸不同。
〔23〕 〔22〕所述的抗原结合分子，其包含下述中任一者或其组合：
237位的氨基酸为Met、
248位的氨基酸为Ile、
250位的氨基酸为Ala、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp、或Tyr、
252位的氨基酸为Phe、Trp、或Tyr、
254位的氨基酸为Thr、
255位的氨基酸为Glu、
256位的氨基酸为Asp、Glu、或Gln、
257位的氨基酸为Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、或Val、
258位的氨基酸为His、
265位的氨基酸为Ala、
286位的氨基酸为Ala或Glu、
289位的氨基酸为His、
297位的氨基酸为Ala、
303位的氨基酸为Ala、
305位的氨基酸为Ala、
307位的氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、或Tyr、
308位的氨基酸为Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、或Thr、
309位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、或Arg、
311位的氨基酸为Ala、His、或Ile、
312位的氨基酸为Ala或His、
314位的氨基酸为Lys或Arg、
315位的氨基酸为Ala、Asp或His、
317位的氨基酸为Ala、
332位的氨基酸为Val、
334位的氨基酸为Leu、
360位的氨基酸为His、
376位的氨基酸为Ala、
380位的氨基酸为Ala、
382位的氨基酸为Ala、
384位的氨基酸为Ala、
385位的氨基酸为Asp或His、
386位的氨基酸为Pro、
387位的氨基酸为Glu、
389位的氨基酸为Ala或Ser、
424位的氨基酸为Ala、
428位的氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr、
433位的氨基酸为Lys、
434位的氨基酸为Ala、Phe、His、Ser、Trp、或Tyr、或
436位的氨基酸为His、Ile、Leu、Val，
其中，所述氨基酸是前述Fc区的以EU编号表示的氨基酸。
〔24〕 〔1〕～〔23〕中任一项所述的抗原结合分子，其特征在于，抗原结合分子是抗体。
〔25〕抗原结合分子的制造方法，其含有以下的步骤(a)～(e)，所述抗原结合分子具有选自(i)促进抗原向细胞内摄入的功能、(ii)与抗原结合2次以上的功能、(iii)促进血浆中的抗原浓度的减少的功能、和(iv)优异的血浆中滞留性功能中的至少1种功能；
(a)获得低钙浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性的步骤、
(b)获得高钙浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性的步骤、
(c)选择低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合分子的步骤、
(d)获得编码前述步骤(c)中选择的抗原结合分子的基因的步骤、
(e)使用前述步骤(d)中所得的基因制造抗原结合分子的步骤。
〔26〕抗原结合分子的制造方法，其含有以下的步骤(a)～(e)，所述抗原结台分子具有选自(i)促进抗原向细胞内摄入的功能、(ii)与抗原结合2次以上的功能、(iii)促进血浆中的抗原浓度的减少的功能、和(iv)优异的血浆中滞留性功能中的至少1种功能：
(a)在高钙浓度条件下使抗原结合分子或者抗原结合分子文库与抗原接触的步骤、
(b)将在前述步骤(a)中与抗原结合了的抗原结合分子置于低钙浓度条件下的步骤、
(c)获得在前述步骤(b)中解离的抗原结合分子的步骤、
(d)获得编码在前述步骤(c)中获得的抗原结合分子的基因的步骤、
(e)使用在前述步骤(d)中获得的基因来制造抗原结合分子的步骤。
〔27)抗原结合分子的制造方法，其含有以下的步骤(a)～(f)，所述抗原结合分子具有选自(i)促进抗原向细胞内摄入的功能、(ii)与抗原结合2次以上的功能、(iii)促进血浆中的抗原浓度的减少的功能、和(iv)优异的血浆中滞留性功能中的至少1种功能；
(a)在低钙浓度条件下使抗原结合分子或者抗原结合分子文库与抗原接触的步骤、
(b)选择在前述步骤(a)中未与抗原结合的抗原结合分子的步骤、
(c)使在前述步骤(b)中选择的抗原结合分子在高钙浓度条件下与抗原接触的步骤、
(d)获得在前述步骤(c)中与抗原结合了的抗原结合分子的步骤、
(e)获得编码在前述步骤(d)中获得的抗原结合分子的基因的步骤、
(f)使用在前述步骤(e)中获得的基因来产生抗原结合分子的步骤。
〔28〕 〔25〕～〔27〕中任一项所述的制造方法，其中，进一步包含改变抗原结合分子中的氨基酸，而赋予或提高中性pH条件下的对人FcRn的结合活性的步骤。
〔29〕 〔25〕～〔27〕中任一项所述的制造方法，其中，进一步包含改变抗原结合分子中的氨基酸，而使酸性pH条件下的抗原结合活性低于中性pH条件下的抗原结合活性的步骤。
〔30〕 〔25〕～〔27〕中任一项所述的制造方法，其中，低钙浓度是离子化钙浓度0.1μM～30μM。
〔31〕 〔25〕～〔27〕中任一项所述的制造方法，其中，高钙浓度是离子化钙浓度100μM～10mM。
〔32〕 〔25〕～〔27〕中任一项所述的制造方法，其中，低钙浓度是内体内的离子化钙浓度。
〔33〕 〔25〕～〔27〕中任一项所述的制造方法，其中，高钙浓度是血浆中的离子化钙浓度。
〔34〕 〔29〕所述的制造方法，其中，抗原结合分子中的氨基酸的改变是将抗原结合分子中的至少1个以上的氨基酸用组氨酸置换或者***至少1个组氨酸的改变。
〔35〕 〔25〕～〔34〕中任一项所述的制造方法，其特征在于，前述抗原结合分子结合的抗原是选自IL-6R、IL-6、IgA、人磷脂酰肌醇聚糖3和IgE中的抗原。
〔36〕 〔25〕～〔35〕中任一项所述的制造方法，其特征在于，前述抗原结合分子是抗体。
〔37〕药物组合物，其含有〔1〕～〔24〕中任一项所述的抗原结合分子或由〔25〕～〔36〕中任一项所述的制造方法制造得到的抗原结合分子、和药学上可接受的载体。
〔38〕 〔37〕所述的药物组合物，其是用于促进抗原向细胞内摄入的药物组合物。
〔39〕 〔37〕所述的药物组合物，其是用于促进血浆中抗原浓度的减少的药物组合物。
〔40〕用于促进抗原向细胞内摄入、或促进血浆中的抗原浓度的减少的药物组合物，其含有抗原结合分子，该抗原结合分子含有抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，该抗原结合分子在2个不同钙浓度条件下的抗原结合活性不同，抗原结合分子的低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性。
〔41〕 〔40〕所述的药物组合物，其中，低钙浓度是离子化钙浓度0.1μM～30μM。
〔42〕 〔40〕所述的药物组合物，其中，高钙浓度是离子化钙浓度100μM～10mM。
〔43〕 〔40〕或〔41〕所述的药物组合物，其中，低钙浓度是内体内的离子化钙浓度。
〔44〕 〔40〕或〔42〕所述的药物组合物，其中，高钙浓度是血浆中的离子化钙浓度。
〔45〕 〔40〕～〔44〕中任一项所述的药物组合物，其中，前述抗原结合分子中所含的FcRn结合结构域是Fc区。
〔46〕 〔40〕～〔45〕中任一项所述的药物组合物，其中，进一步地，前述抗原结合分子的酸性pH条件下的抗原结合活性低于中性pH条件下的抗原结合活性。
〔47〕权利要求46所述的药物组合物，其特征在于，前述抗原结合分子的至少1个氨基酸被组氨酸所置换、或者***有至少1个组氨酸。
〔48〕 〔40〕～〔47〕中任一项所述的药物组合物，其特征在于，前述抗原结合分子结合的抗原是选自IL-6R、IL-6、IgA、人磷脂酰肌醇聚糖3和IgE中的抗原。
〔49〕抗原结合分子的筛选方法，其含有以下的步骤(a)～(c)，所述抗原结合分子具有选自(i)促进抗原向细胞内摄入的功能、(ii)与抗原结合2次以上的功能、(iii)促进血浆中的抗原浓度的减少的功能、和(iv)优异的血浆中滞留性功能中的至少1种功能；
(a)获得低钙浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性的步骤、
(b)获得高钙浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性的步骤、
(c)选择低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合分子的步骤。
〔50〕抗原结合分子的筛选方法，其含有以下的步骤(a)～(c)，所述抗原结合分子具有选自(i)促进抗原向细胞内摄入的功能、(ii)与抗原结合2次以上的功能、(iii)促进血浆中的抗原浓度的减少的功能、和(iv)优异的血浆中滞留性功能中的至少1种功能；
(a)在高钙浓度条件下使抗原结合分子或者抗原结合分子文库与抗原接触的步骤、
(b)将在前述步骤(a)中与抗原结合了的抗原结合分子置于低钙浓度条件下的步骤、
(c)获得在前述步骤(b)中解离的抗原结合分子的步骤。
〔51〕抗原结合分子的筛选方法，其含有以下的步骤(a)～(d)，所述抗原结合分子具有选自(i)促进抗原向细胞内摄入的功能、(ii)与抗原结合2次以上的功能、(iii)促进血浆中的抗原浓度的减少的功能、和(iv)优异的血浆中滞留性功能中的至少1种功能；
(a)在低钙浓度条件下使抗原结合分子或者抗原结合分子文库与抗原接触的步骤、
(b)选择在前述步骤(a)中未与抗原结合的抗原结合分子的步骤、
(c)使在前述步骤(b)中选择的抗原结合分子在高钙浓度条件下与抗原结合的步骤、
(d)获得在前述步骤(c)中与抗原结合了的抗原结合分子的步骤。
〔52〕 〔49〕～〔51〕中任一项所述的筛选方法，其中，低钙浓度是离子化钙浓度0.1μM～30μM。
〔53〕 〔49〕～〔51〕中任一项所述的筛选方法，其中，高钙浓度是离子化钙浓度100μM～10mM。
〔54〕 〔49〕～〔52〕中任一项所述的筛选方法，其中，低钙浓度是内体内的离子化钙浓度。
〔55〕 〔49〕～〔51〕或〔53〕中任一项所述的筛选方法，其中，高钙浓度是血浆中的离子化钙浓度。
〔56〕 〔49〕～〔55〕中任一项所述的筛选方法，其特征在于，前述抗原结合分子结合的抗原是选自IL-6R、IL-6、IgA、人磷脂酰肌醇聚糖3和IgE中的抗原。
〔57〕 〔49〕～〔56〕中任一项所述的筛选方法，其特征在于，抗原结合分子是抗体。
〔58〕促进基于抗原结合分子的抗原向细胞内摄入的方法，其是通过给子〔1〕～〔24〕中任-项所述的抗原结合分子或由〔25〕～〔36〕中任一项所述的制造方法制造得到的抗原结合分子来进行的。
〔59〕促进血浆中抗原浓度的减少的方法，其是通过给予〔1〕～〔24〕中任一项所述的抗原结合分子或由〔25〕～〔36〕中任一项所述的制造方法制造得到的抗原结合分子来进行的。
〔60〕增加1分子的抗原结合分子对抗原的结合次数的方法，其是通过使用〔1〕～〔24〕中任一项所述的抗原结合分子或由〔25〕～〔36〕中任一项所述的制造方法制造得到的抗原结合分子来进行的。
〔61〕改善抗原结合分子的血浆中滞留性的方法，其是通过使用〔1〕～〔24〕中任一项所述的抗原结合分子或由〔25〕～〔36〕中任一项所述的制造方法制造得到的抗原结合分子来进行的。
〔62〕促进基于抗原结合分子的抗原向细胞内摄入的方法，其是通过给予抗原结合分子来进行的，该抗原结合分子含有抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，该抗原结合分子在2个不同钙浓度条件下的抗原结合活性不同，抗原结合分子的低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性。
〔63〕促进血浆中的抗原浓度的减少的方法，其是通过给予抗原结合分子来进行的，该抗原结合分子含有抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，该抗原结合分子在2个不同钙浓度条件下的抗原结合活性不同，抗原结合分子的低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性。
〔64〕增加1分子的抗原结合分子对抗原的结合次数的方法，其是通过使用抗原结合分子来进行的，该抗原结合分子含有抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，该抗原结合分子在2个不同钙浓度条件下的抗原结合活性不同，抗原结合分子的低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性。
〔65〕改善抗原结合分子的血浆中滞留性的方法，其是通过使用抗原结合分子来进行的，该抗原结合分子含有抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，该抗原结合分子在2个不同钙浓度条件下的抗原结合活性不同，抗原结合分子的低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性。
〔66〕 〔62〕～〔65〕中任一项所述的方法，其中，前述低钙浓度是离子化钙浓度0.1μM～30μM。
〔67〕 〔62〕～〔66〕中任一项所述的方法，其中，高钙浓度是离子化钙浓度100μM～10mM。
〔68〕 〔62〕～〔67〕中任一项所述的方法，其中，低钙浓度是内体内的离子化钙浓度。
〔69〕 〔62〕～〔68〕中任一项所述的方法，其中，高钙浓度是血浆中的离子化钙浓度。
〔70〕 〔62〕～〔69〕中任一项所述的方法，其中，前述抗原结合分子中所含的FcRn结合结构域是Fc区。
〔71〕 〔62〕～〔70〕中任一项所述的方法，其中，进一步地，前述抗原结合分子的酸性pH条件下的抗原结合活性低于中性pH条件下的抗原结合活性。
〔72〕 〔71〕所述的方法，其特征在于，前述抗原结合分子的至少1个氨基酸被组氨酸所置换、或者***有至少1个组氨酸。
〔73〕 〔62〕～〔72〕中任一项所述的方法，其特征在于，前述抗原结合分子结合的抗原是选自IL-6R、IL-6、IgA、人磷脂酰肌醇聚糖3和IgE中的抗原。
〔74〕 〔62〕～〔73〕中任一项所述的方法，其中，前述抗原结合分子是抗体。
另外本发明还涉及用于在本发明的方法中使用的试剂盒，其包含本发明的抗原结合分子或由本发明的制造方法制造得到的抗原结合分子。本发明还涉及含有本发明的抗原结合分子或由本发明的制造方法制造得到的抗原结合分子作为有效成分的、基于抗原结合分子的抗原向细胞内摄入的促进剂、血浆中抗原浓度的减少促进剂、1分子的抗原结合分子对抗原的结合次数的增加剂、或抗原结合分子的血浆中滞留性改善剂。本发明还涉及本发明的抗原结合分子或由本发明的制造方法制造得到的抗原结合分子在制造基于抗原结合分子的抗原向细胞内摄入的促进剂、血浆中抗原浓度的减少促进剂、1分子的抗原结合分子对抗原的结合次数的增加剂、或抗原结合分子的血浆中滞留性改善剂中的用途。本发明还涉及用于在本发明的方法中使用的、本发明的抗原结合分子或由本发明的制造方法制造得到的抗原结合分子。
[发明效果]
根据本发明，提供了促进基于抗原结合分子的抗原向细胞内摄入的方法、增加1分子的抗原结合分子对抗原的结合次数的方法、通过给予抗原结合分子促进血浆中抗原浓度的减少的方法、改善抗原结合分子的血浆中滞留性的方法。通过促进基于抗原结合分子的抗原向细胞内摄入，使得可以通过给予抗原结合分子来促进抗原的血浆中抗原浓度的减少，同时可以改善抗原结合分子的血浆中滞留性，可以增加通过1分子的抗原结合分子结合抗原的次数，从而可以在体内比通常的抗原结合分子发挥更优异的效果。
[附图说明]
[图1]示出pH依赖性结合抗体重复与可溶型抗原结合的图。(i)抗体与可溶型抗原结合；(ii)非特异性通过胞饮作用向细胞内摄入；(iii)抗体在内体内与FcRn结合，可溶型抗原从抗体解离；(iv)可溶型抗原转移至溶酶体并被分解；(v)可溶型抗原解离了的抗体通过FcRn而被再循环至血浆中；(vi)经再循环的抗体可以再次与可溶型抗原结合。
[图2]示出pH依赖性结合抗体重复与膜型抗原结合的图。(i)抗体与膜型抗原结合；(ii)以抗体与膜型抗原的复合体的状态被内含到细胞内；(iii)在内体内从膜型抗原解离；(iv)膜型抗原转移至溶酶体并被分解；(v)从膜型抗原解离的抗体被再循环至血浆中；(vi)经再循环的抗体可以再次与膜型抗原结合。
[图3]示出pH依赖性结合抗体在血浆中(pH7.4)和内体内(pH6.0)的与抗原的相互作用的方式的图。
[图4]示出钙依赖性结合抗体在血浆中(Ca2+2mM)和内体内(Ca2+3μM)的与抗原的相互作用的方式的图。
[图5]示出pH和钙依赖性结合抗体在血浆中(pH7.4、Ca2+2mM)和内体内(pH6.0、Ca2 +3μM)的与抗原的相互作用的方式的图。
[图6]示出使用Biacore的显示抗人IL-6受体抗体在Ca2+2mM和Ca2+3μM条件下与可溶型人IL-6受体的相互作用的传感图。
[图7]示出H54/L28-IgG1在Ca2+2mM和Ca2+3μM条件下与可溶型人IL-6受体的相互作用的Biacore传感图。
[图8]示出FH4-IgG1在Ca2+2mM和Ca2+3μM条件下与可溶型人IL-6受体的相互作用的Biacore传感图。
[图9]示出6RL#9-IgG1在Ca2+2mM和Ca2+3μM条件下与可溶型人IL-6受体的相互作用的Biacore传感图。
[图10]示出H54/L28-IgG1、FH4-IgG1、和6RL#9-IgG1的正常小鼠血浆中抗体浓度变化的图。
[图11]示出H54/L28-IgG1、FH4-IgG1、和6RL#9-IgG1的正常小鼠血浆中可溶型人IL-6受体(hsIL-6R)浓度变化的图。
[图12]示出H54/L28-N434W、FH4-N434W、和6RL#9-N434W的正常小鼠血浆中抗体浓度变化的图。
[图13]示出H54/L28-N434W、FH4-N434W、和6RL#9-N434W的正常小鼠血浆中可溶型人IL-6受体(hsIL-6R)浓度变化的图。
[图14]示出通过X射线晶体结构分析确定的6RL#9抗体的Fab片段的重链CDR3的结构的图。
[图15]示出使用Biacore的显示抗人IL-6抗体在Ca2+1.2mM和Ca2+3μM条件下与人IL-6的相互作用的传感图。
[图16]含有人Vk5-2序列的抗体、与含有人Vk5-2序列中的糖链添加序列经改变的hVk5-2_L65序列的抗体的离子交换色谱图。实线表示含有人Vk5-2序列的抗体(重链：CIM_H、序列编号：48和轻链：hVk5-2、序列编号：41与序列编号：28的融合分子)的色谱图，虚线表示具有hVk5-2_L65序列的抗体(重链：CIM_H(序列编号：48)、轻链：hVk5-2_L65(序列编号47))的色谱图。
[图17]含有LfVk1_Ca序列的抗体(重链：GC_H、序列编号：102和轻链：LfVk1_Ca、序列编号：61)、与含有LfVk1_Ca序列中的Asp(D)残基改变为Ala(A)残基的序列的抗体在5℃保存后(实线)或50℃保存后(点线)的离子交换色谱图。分别以5℃保存后的离子交换色谱图的最高的峰作为主峰，并用主峰进行y轴标准化而得的图。
[图18]含有LfVk1_Ca序列的抗体(重链：GC_H、序列编号：102和轻链：LfVk1_Ca、序列编号：61)、与含有LfVk1_Ca序列中的30位(Kabat编号)的Asp(D)残基改变为Ser(S)残基的LfVk1_Ca6序列(重链：GC_H、序列编号：102和轻链：LfVk1_Ca6、序列编号：75)的抗体在5℃保存后(实线)或50℃保存后(点线)的离子交换色谱图。分别以5℃保存后的离子交换色谱图的最高的峰作为主峰，并用主峰进行y轴标准化而得的图。
[图19]示出使用Biacore的显示抗人CD4抗体在Ca2+1.2mM和Ca2+3μM条件下与可溶型人CD4的相互作用的传感图。
[图20]示出抗人CD4抗体的正常小鼠血浆中抗体浓度变化的图。
[图21]示出可溶型人CD4单独给药组、TNX355-IgG1抗体给药组、Q425抗体给药组和Q425L9抗体给药组的正常小鼠血浆中可溶型人CD4的浓度变化的图。
[图22]示出使用Biacore的显示抗人IgA抗体在Ca2+1.2mM和Ca2+3μM条件下与人IgA的相互作用的传感图。
[图23]示出GA1-IgG1抗体给药组、GA2-IgG1抗体给药组、GA3-IgG1和GA2-N434W抗体给药组的正常小鼠血浆中抗体浓度变化的图。
[图24]示出人IgA单独给药组、GA1-IgG1抗体给药组、GA2-IgG1抗体给药组、GA3-IgG1抗体给药组和GA2-N434W抗体给药组的正常小鼠血浆中人IgA的浓度变化的图。
[图25]示出GA1-IgG1抗体给药组、GA2-IgG1抗体给药组、GA3-IgG1抗体给药组和GA2-N434W抗体给药组的正常小鼠血浆中的非结合型人IgA的浓度变化的图。
[图26]例示与多价抗原形成大的免疫复合体的普通抗体的、每1分子抗体使抗原消除的效率的图。
[图27]例示含有与多价抗原形成大的免疫复合体的天然IgG1的恒定区的pH/Ca依赖性抗体的、每1分子抗体使抗原消除的效率的图。
[图28]例示识别存在于单价抗原的2个以上的表位并适于形成大的免疫复合体的多特异性pH/Ca依赖性抗体的、每1分子抗体使抗原消除的效率的图。
[图29]示出使用ELISA法的抗人磷脂酰肌醇聚糖3抗体在Ca2+1.2mM和Ca2+3μM条件下与重组人磷脂酰肌醇聚糖3的相互作用的图。
[图30]示出使用ELISA法的抗人IgE抗体在Ca2+2mM和Ca2+3μM条件下与重组人IgE的相互作用的图。
[图31]示出人FcRn转基因小鼠中抗体的血浆中浓度变化的图。
[图32]示出人FcRn转基因小鼠中可溶型人IL-6受体的血浆中浓度变化的图。
[图33]示出正常小鼠中抗体的血浆中浓度变化的图。
[图34]示出正常小鼠中可溶型人IL-6受体的血浆中浓度变化的图。
[图35]示出正常小鼠中非结合型(unbound)可溶型人IL-6受体的血浆中浓度变化的图。
[图36]示出人FcRn转基因小鼠的血浆中可溶型人IL-6受体浓度变化的图。
[图37]示出Fv4-IgG1-F14以低用量(0.01mg/kg)或1mg/kg给予后的血浆中可溶型人IL-6受体浓度变化的图。
[图38]示出Fv4-IgG1-F14以低用量(0.01mg/kg)或1mg/kg给予后的血浆中抗体浓度变化的图。
[图39]示出对血浆中可溶型人IL-6受体浓度维持稳态的正常小鼠给予抗人IL-6受体抗体后的血浆中可溶型人IL-6受体浓度变化的图。
[图40]示出对人FcRn转基因小鼠(品系276)同时给予hsIL-6R和抗人IL-6受体抗体后的血浆中抗体浓度变化的图。
[图41]示出对人FcRn转基因小鼠(品系276)同时给予hsIL-6R和抗人IL-6受体抗体后的血浆中可溶型人IL-6受体浓度变化的图。
[图42]示出pH7.0时Fc变体对人FcRn的结合亲和性、与对人FcRn转基因小鼠(品系276)同时给予hsIL-6R和抗人IL-6受体抗体1天后的血浆中hsIL-6R浓度的关系的图。
[图43]示出pH7.0时Fc变体对人FcRn的结合亲和性、与对人FcRn转基因小鼠(品系276)同时给予hsIL-6R和抗人IL-6受体抗体1天后的血浆中抗体浓度的关系的图。
[图44]示出对人FcRn转基因小鼠(品系276)同时给予hsIL-6R和抗人IL-6受体抗体后的抗原/抗体摩尔比(C值)的变化的图。
[图45]示出pH7.0时Fc变体对人FcRn的结合亲和性、与对人FcRn转基因小鼠(品系276)同时给予hsIL-6R和抗人IL-6受体抗体1天后的抗原/抗体摩尔比(C值)的关系的图。
[图46]示出对血浆中hsIL-6R浓度维持稳态的人FcRn转基因小鼠(品系276)(稳态注入模型)以低用量(0.01或0.2mg/kg)或1mg/kg给予Fv4-IgG1-F14后的血浆中hsIL-6R浓度变化的图。
[图47]示出对人FcRn转基因小鼠(品系276和32)同时给予hsIL-6R和抗人IL-6受体抗体后的人FcRn转基因小鼠品系276和品系32中的血浆中hsIL-6R浓度变化的图。
[图48]示出对人FcRn转基因小鼠(品系276和品系32)同时给予hsIL-6R和抗人IL-6受体抗体后的人FcRn转基因小鼠品系276和品系32中的血浆中抗体浓度变化的图。
[图49]示出对血浆中hsIL-6R浓度维持稳态的人FcRn转基因小鼠(品系32)(稳态注入模型)给予抗人IL-6受体抗体后的血浆中hsIL-6R浓度变化的图。
[图50]示出对血浆中hsIL-6R浓度维持稳态的人FcRn转基因小鼠(品系32)(稳态注入模型)给予抗人IL-6受体抗体后的血浆中抗体浓度变化的图。
[图51]示出对血浆中hsIL-6R浓度维持稳态的人FcRn转基因小鼠(品系32)(稳态注入模型)给予抗人IL-6受体抗体后的抗原/抗体摩尔比(C值)的变化的图。
[图52]示出pH7.0时Fc变体对人FcRn的结合亲和性、与对血浆中hsIL-6R浓度维持稳态的人FcRn转基因小鼠(品系32)(稳态注入模型)给予抗人IL-6受体抗体1天后的抗原/抗体摩尔比(C值)的关系的图。
[图53]示出对血浆中hsIL-6R浓度维持稳态的人FcRn转基因小鼠(品系32)(稳态注入模型)给予具有F11、F39、F48、和F264的Fc变体的抗人IL-6受体抗体后的血浆中抗体浓度变化的图。
[图54]示出对血浆中hsIL-6R浓度维持稳态的人FcRn转基因小鼠(品系32)(稳态注入模型)给予具有F11、F39、F48、和F264的Fc变体的抗人IL-6受体抗体后的血浆中hsIL-6R浓度变化的图。
[图55]示出对血浆中hsIL-6R浓度维持稳态的人FcRn转基因小鼠(品系32)(稳态注入模型)给予具有F157、F196、和F262的Fc变体的抗人IL-6受体抗体后的血浆中抗体浓度变化的图。
[图56]示出对血浆中hsIL-6R浓度维持稳态的人FcRn转基因小鼠(品系32)(稳态注入模型)给予具有F157、F196、和F262的Fc变体的抗人IL-6受体抗体后的血浆中hsIL-6R浓度变化的图。
具体实施方式
本发明提供：促进基于抗原结合分子的抗原向细胞内摄入的方法、增加1分子的抗原结合分子对抗原的结合次数的方法、通过给予抗原结合分子促进血浆中抗原浓度的减少的方法、和改善抗原结合分子的血浆中滞留性的方法。具体地，通过使用抗原结合分子的低钙浓度条件下的抗原结合活性(本发明中有时也记载为“结合能力”)低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合分子，促进基于抗原结合分子的抗原向细胞内摄入的方法、增加1分子的抗原结合分子对抗原的结合次数的方法、通过给予抗原结合分子促进血浆中抗原浓度减少的方法、和改善抗原结合分子的血浆中滞留性的方法。
氨基酸
本说明书中，例如，如Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、Val/V所示，氨基酸用单字母密码或三字母密码、或其两者来标记。
抗原
本说明书中，“抗原”只要含有抗原结合结构域所结合的表位，则其结构并不限于特定的结构。换而言之，抗原可以是无机物、也可以是有机物，对本发明所要给予的机体而言可以是外源性的、或内源性的物质。作为通过本发明的方法改善了药代动力学的抗原结合分子含有的抗原结合结构域所结合的抗原的实例，优选可举出例如：受体蛋白(膜结合型受体、可溶型受体)、细胞表面标记物等膜抗原、细胞因子等可溶型抗原、含有仅存于外源性生物中的表位的抗原等。作为抗原，可例示如下述的分子；17-IA、4-1BB、4Dc、6-酮-PGFla、8-异-PGF2a、8-氧代-dG、A1腺苷受体、A33、ACE、ACE-2、激活素、激活素A、激活素AB、激活素B、激活素C、激活素RIA、激活素RIA ALK-2、激活素RIB ALK-4、激活素RIIA、激活素RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、地址素(Addressins)、脂联素、ADP核糖基环化酶-1、aFGF、AGE、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、变应原、α1-抗胰凝乳蛋白酶、α1-抗胰蛋白酶、α-突触核蛋白、α-V/β-1拮抗剂、层连蛋白(aminin)、支链淀粉、淀粉样蛋白β、淀粉样蛋白免疫球蛋白重链可变区、淀粉样蛋白免疫球蛋白轻链可变区、雄激素、ANG、血管紧张素原、促血管生成素配体-2、抗Id、抗凝血酶III、炭疽、APAF-1、APE、APJ、Apo Al、Apo血清淀粉样蛋白A、Apo-SAA、APP、APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、ASPARTIC、心房钠尿因子、心房钠尿肽、心房钠尿肽A、心房钠尿肽B、心房钠尿肽C、av/b3整联蛋白、Axl、B7-1、B7-2、B7-H、BACE、BACE-1、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)防御抗原、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、β-2-微球蛋白、β内酰胺酶、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、B淋巴细胞刺激因子(BIyS)、BMP、BMP-2(BMP-2a)、BMP-3(成骨蛋白(Osteogenin))、BMP-4(BMP-2b)、BMP-5、BMP-6(Vgr-1)、BMP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BMPR-II(BRK-3)、BMP、BOK、蛙皮素、骨衍生神经营养因子(Bone-derived neurotrophic factor)、牛生长激素、BPDE、BPDE-DNA、BRK-2、BTC、B淋巴细胞细胞粘附分子、C10、C1抑制因子、C1q、C3、C3a、C4、C5、C5a(补体5a)、CA125、CAD-8、钙黏蛋白-3、降钙素、cAMP、碳酸酐酶-IX、癌胚抗原(CEA)、癌相关抗原(carcinoma-associated antigen)、心肌营养因子-1、组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C/DPPI、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S、组织蛋白酶V、组织蛋白酶X/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1/I-309、CCL11/嗜酸粒细胞趋化蛋白、CCL12/MCP-5、CCL13/MCP-4、CCL14/HCC-1、CCL15/HCC-2、CCL16/HCC-4、CCL17/TARC、CCL18/PARC、CCL19/ELC、CCL2/MCP-1、CCL20/MIP-3-α、CCL21/SLC、CCL22/MDC、CCL23/MPIF-1、CCL24/嗜酸粒细胞趋化蛋白-2、CCL25/TECK、CCL26/嗜酸粒细胞趋化蛋白-3、CCL27/CTACK、CCL28/MEC、CCL3/M1P-1-α、CCL3L1/LD-78-β、CCL4/MIP-1-β、CCL5/RANTES、CCL6/C10、CCL7/MCP-3、CCL8/MCP-2、CCL9/10/MTP-1-γ、CCR、CCR1、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD10、CD105、CD11a、CD11b、CD11c、CD123、CD13、CD137、CD138、CD14、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD15、CD152、CD16、CD164、CD18、CD19、CD2、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD26、CD27L、CD28、CD29、CD3、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67蛋白质)、CD34、CD37、CD38、CD3E、CD4、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD49b、CD5、CD51、CD52、CD54、CD55、CD56、CD6、CD61、CD64、CD66e、CD7、CD70、CD74、CD8、CD80(B7-1)、CD89、CD95、CD105、CD158a、CEA、CEACAM5、CFTR、cGMP、CGRP受体、CINC、CKb8-1、封闭蛋白18、CLC、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)毒素、难辨梭状芽胞杆菌(Clostridiumdifficile)毒素、产气荚膜杆菌(Clostridium perfringens)毒素、c-Met、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、补体因子3(C3)、补体因子D、皮质类固醇结合球蛋白、集落刺激因子-1受体、COX、C-Ret、CRG-2、CRTH2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1/断裂因子、CX3CR1、CXCL、CXCL1/Gro-α、CXCL10、CXCL11/I-TAC、CXCL12/SDF-1-α/β、CXCL13/BCA-1、CXCL14/BRAK、CXCL15/Lungkine、CXCL16、CXCL16、CXCL2/Gro-β CXCL3/Gro-γ、CXCL3、CXCL4/PF4、CXCL5/ENA-78、CXCL6/GCP-2、CXCL7/NAP-2、CXCL8/IL-8、CXCL9/Mig、CXCL10/IP-10、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、胱抑素 C、细胞角蛋白肿瘤相关抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、促衰变因子、δ样蛋白质(Delta-like protein)配体4、脱(1-3)-IGF-1(脑IGF-1)、Dhh、DHICA氧化酶、Dickkopf-1、地高辛、二肽基肽酶 IV、DK1、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、含EGF样结构域的蛋白质7(EGF like domain containing protein 7)、弹性蛋白酶、弹性蛋白、EMA、EMMPRIN、ENA、ENA-78、内皮唾液酸蛋白(Endosialin)、内皮素受体、内毒素、脑啡肽酶、eNOS、Eot、嗜酸粒细胞趋化蛋白、嗜酸粒细胞趋化蛋白-2、eotaxini、EpCAM、Ephrin B2/EphB4、Epha2酪氨酸激酶受体、上皮生长因子受体(EGFR)、ErbB2受体、ErbB3酪氨酸激酶受体、ERCC、***(EPO)、***受体、E-选择素、ET-1、Exodus-2、RSV的F蛋白质、F10、F11、F12、F13、F5、F9、第Ia因子、第IX因子、第Xa因子、第VII因子、第VIII因子、第VIIIc因子、Fas、FcαR、FcεRI、FcγIIb、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa、FcγRIIIb、FcRn、FEN-1、铁蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF-2受体、FGF-3、FGF-8、酸性FGF(FGF-acidic)、碱性FGF(FGF-basic)、FGFR、FGFR-3、纤维蛋白、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-10、纤连蛋白、FL、FLIP、Flt-3、FLT3配体、叶酸受体、促卵胞激素(FSH)、分形趋化因子(CX3C)、游离型重链、游离型轻链、FZD1、FZD10、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、G250、Gas 6、GCP-2、GCSF、G-CSF、G-CSF受体、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-15(MIC-1)、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14/CDMP-1)、GDF-6(BMP-13/CDMP-2)、GDF-7(BMP-12/CDMP-3)、GDF-8(筒箭毒碱)、GDF-9、GDNF、凝溶胶蛋白、GFAP、GF-CSF、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、GF-β1、gH包膜糖蛋白、GITR、胰高血糖素、胰高血糖素受体、胰高血糖素样肽1受体、Glut 4、谷氨酸羧肽酶II、糖蛋白激素受体、糖蛋白11b/111a(GP 11b/111a)、磷脂酰肌醇聚糖-3、GM-CSF、GM-CSF受体、gp130、gp140、gp72、粒细胞-CSF(G-CSF)、GRO/MGSA、生长激素释放因子、GRO-β、GRO-γ、幽门螺旋杆菌(H.pylori)、半抗原(NP-cap或NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCC 1、HCMVgB包膜糖蛋白、HCMV UL、造血生长因子(Hemopoietic growth factor)(HGF)、Hep Bgp120、乙酰肝素酶、肝素辅因子II、肝细胞生长因子(hepatic growth factor)、炭疽杆菌防御抗原、丙型肝炎病毒E2糖蛋白、戊型肝炎、铁调素、Her1、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、单纯疱疹病毒(HSV)gB糖蛋白、HGF、HGFA、高分子量黑色素瘤相关抗原(High molecular weight melanoma-associated antigen)(HMW-MAA)、GP120等HIV包膜蛋白、HIV MIB gp 120 V3环、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HMGB-1、HRG、Hrk、HSP47、Hsp90、HSV gD糖蛋白、人心肌球蛋白、人巨细胞病毒(HCMV)、人生长激素(hGH)、人血清白蛋白、人组织型人组织型纤溶酶原活性化因子(t-PA)、亨廷顿蛋白、HVEM、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IgA、IgA受体、IgE、IGF、IGF结合蛋白、IGF-1、IGF-1R、IGF-2、IGFBP、IGFR、IL、IL-1、IL-10、IL-10受体、IL-11、IL-11受体、IL-12、IL-12受体、IL-13、IL-13受体、IL-15、IL-15受体、IL-16、IL-16受体、IL-17、IL-17受体、IL-18(IGIF)、IL-18受体、IL-1α、IL-1β、IL-1受体、IL-2、IL-2受体、IL-20、IL-20受体、IL-21、IL-21受体、IL-23、IL-23受体、IL-2受体、IL-3、IL-3受体、IL-31、IL-31受体、IL-3受体、IL-4、IL-4受体、IL-5、IL-5受体、IL-6、IL-6受体、IL-7、IL-7受体、IL-8、IL-8受体、IL-9、IL-9受体、免疫球蛋白免疫复合体、免疫球蛋白、INF-α、INF-α受体、INF-β、INF-β受体、INF-γ、INF-γ受体、I型IFN、I型IFN受体、流感病毒、抑制素、抑制素α、抑制素β、iNOS、胰岛素、胰岛素A链、胰岛素B链、***1、***2、***结合蛋白、整联蛋白、整联蛋白α2、整联蛋白α3、整联蛋白α4、整联蛋白α4/β1、整联蛋白α-V/β-3、整联蛋白α-V/β-6、整联蛋白α4/β7、整联蛋白α5/β1、整联蛋白α5/β3、整联蛋白α5/β6、整联蛋白α-δ(αV)、整联蛋白α-θ、整联蛋白β1、整联蛋白β2、整联蛋白β3(GPIIb-IIIa)、IP-10、I-TAC、JE、激肽释放酶、激肽释放酶11、激肽释放酶12、激肽释放酶14、激肽释放酶15、激肽释放酶2、激肽释放酶5、激肽释放酶6、激肽释放酶L1、激肽释放酶L2、激肽释放酶L3、激肽释放酶L4、激肽释放酶结合蛋白、KC、KDR、角质形成细胞生长因子(KGF)、角质形成细胞生长因子-2(KGF-2)、KGF、杀伤细胞免疫球蛋白样受体、kit配体(KL)、Kit酪氨酸激酶、层连蛋白5、LAMP、LAPP(支链淀粉、胰淀粉样蛋白多肽)、LAP(TGF-1)、潜伏期相关肽、潜伏型TGF-1、潜伏型TGF-1bp1、LBP、LDGF、LDL、LDL受体、LECT2、Lefty、瘦蛋白、促黄体激素(leutinizing hormone)(LH)、Lewis-Y抗原、Lewis-Y相关抗原、LFA-1、LFA-3、LFA-3受体、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-选择素、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面活性剂、促黄体激素、淋巴细胞趋化肽、淋巴毒素β受体、溶性鞘脂受体、Mac-1、巨噬细胞-CSF(M-CSF)、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、maspin、MCAM、MCK-2、MCP、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-I(MCAF)、M-CSF、MDC、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、megsin、Mer、MET酪氨酸激酶受体家族、金属蛋白酶、膜糖蛋白OX2、间皮蛋白、MGDF受体、MGMT、MHC(HLA-DR)、微生物蛋白质(microbial protein)、MIF、MIG、MIP、MIP-1 α、MIP-1 β、MIP-3 α、MIP-3 β、MIP-4、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、单核细胞趋化蛋白(monocyte attractant protein)、单核细胞集落抑制因子(monocyte colonyinhibitory factor)、小鼠***相关(gonadotropin-associated)肽、MPIF、Mpo、MSK、MSP、MUC-16、MUC18、粘蛋白(Mud)、缪勒管抑制因子、Mug、MuSK、髓鞘相关糖蛋白、骨髓前体细胞抑制因子-1(MPIF-I)、NAIP、纳米体(Nanobody)、NAP、NAP-2、NCA 90、NCAD、N-钙黏蛋白、NCAM、脑啡肽酶、神经细胞粘附分子、神经丝氨酸蛋白酶抑制剂(neroserpin)、神经生长因子(NGF)、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、神经营养蛋白-6、神经毡蛋白1、Neurturin、NGF-β、NGFR、NKG20、N-甲硫氨酰人生长激素、nNOS、NO、Nogo-A、Nogo受体、丙型肝炎病毒衍生的非结构蛋白3型(NS3)、NOS、Npn、NRG-3、NT、NT-3、NT-4、NTN、OB、OGG1、オンコスタチンM、OP-2、OPG、OPN、OSM、OSM受体、骨诱导因子(osteoinductive faetor)、骨桥蛋白、OX40L、OX40R、氧化型LDL、p150、p95、PADPr、甲状旁腺激素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-钙黏蛋白、PCNA、PCSK9、PDGF、PDGF受体、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-D、PDK-1、PECAM、PEDF、PEM、PF-4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIGF、PIN、PLA2、胎盘生长因子、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)、胎盘催乳激素、纤溶酶原活化因子抑制因子-1、血小板生长因子(platelet-growth factor)、plgR、PLP、不同大小的聚乙二醇链(poly glycol chain)(例如、PEG-20、PEG-30、PEG40)、PP14、前激肽释放酶、朊病毒蛋白质、降钙素原、程序性细胞死亡蛋白1、胰岛素原、催乳素、蛋白质原转化酶 PC9、松弛素原(prorelaxin)、前立腺特异性膜抗原(PSMA)、蛋白质A、蛋白质C、蛋白质D、蛋白质S、蛋白质 Z、PS、PSA、PSCA、PsmAr、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、P-选择素糖蛋白配体-1、R51、RAGE、RANK、RANKL、RANTES、松弛素、松弛素A链、松弛素B链、肾素、呼吸道合胞体病毒(RSV)F、Ret、reticulon 4、类风湿因子、RLI P76、RPA2、RPK-1、RSK、RSV Fgp、S100、RON-8、SCF/KL、SCGF、Sclerostin、SDF-1、SDF1 α、SDF1 β、SERINE、血清淀粉样蛋白P、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、志贺样毒素II、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、鞘氨醇一磷酸受体1、葡萄球菌的脂磷壁酸、Stat、STEAP、STEAP-II、干细胞因子(SCF)、链激酶、过氧化物歧化酶、黏结蛋白聚糖-1、TACE、TACI、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白-72)、TARC、TB、TCA-3、T细胞受体α/β、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、生腱蛋白、TERT、睾丸PLAP样碱性磷酸酶、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、TGF-β泛特异性(TGF-β Pan Specific)、TGF-β RII、TGF-β RIIb、TGF-β RIII、TGF-β R1(ALK-5)、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、TGF-I、凝血酶、血小板生成素(TPO)、胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic stromal lymphoprotein)受体、胸腺Ck-1、促甲状腺激素(TSH)、甲状腺素、甲状腺素结合球蛋白、Tie、TIMP、TIQ、组织因子、组织因子蛋白酶抑制剂、组织因子蛋白质、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF受体I、TNF受体II、TNF-α、TNF-β、TNF-β 2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2/DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5/KILLER/TRICK-2A/TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1/LIT/TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2/TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R/TRANCE R)、TNFRSF11B(OPG OCIF/TR1)、TNFRSF12(TWEAK RFN14)、TNFRSF12A、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEM ATAR/HveA/LIGHT R/TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITR AITR)、TNFRSF19(TROY TAJ/TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF R1 CD120a/p55-60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b/p75-80)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2TNFRH2)、TNFRSF25(DR3Apo-3/LARD/TR-3/TRAMP/WSL-1)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbR TNFRIII/TNFC R)、TNFRSF4(OX40 ACT35/TXGP1R)、TNFRSF5(CD40 p50)、TNFRSF6(Fas Apo-1/APT1/CD95)、TNFRSF6B(DcR3M68/TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1 BBCD137/ILA)、TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1)、TNFSF10(TRSIL Apo-2配体/TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK配体ODF/OPG配体)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配体/DR3配体)、TNFSF13(APRILTALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS/TALL1/THANK/TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM配体/LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR 配体 AITR 配体/TL6)、TNFSF1A(TNF-a Conectin/DIF/TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa/TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC/p33)、TNFSF4(OX40配体gp34/TXGP1)、TNFSF5(CD40配体CD154/gp39/HIGM1/IMD3/TRAP)、TNFSF6(Fas配体Apo-1配体/APT1配体)、TNFSF7(CD27配体CD70)、TNFSF8(CD30配体CD153)、TNFSF9(4-1BB配体CD137配体)、TNF-α、TNF-β、TNIL-I、毒性代谢产物(toxic metabolite)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、运铁蛋白受体、TGF-α和TGF-β等转化生长因子(TGF)、跨膜型糖蛋白NMB、运甲状腺素蛋白、TRF、Trk、TROP-2、滋养层糖蛋白、TSG、TSLP、肿瘤坏死因子(TNF)、肿瘤相关抗原CA 125、表达Lewis Y相关糖的肿瘤相关抗原、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VAP-1、血管内皮生长因子(VEGF)、vaspin、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-钙黏蛋白、VE-钙黏蛋白-2、VEFGR-1(flt-1)、VEFGR-2、VEGF受体(VEGFR)、VEGFR-3(flt-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、维生素B12受体、玻连蛋白受体、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整联蛋白、冯维勒布兰德因子(vWF)、WIF-1、WNT1、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、XCL1、XCL2/SCM-1-β、XCL1/淋巴细胞趋化肽、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、HMGB1、IgA、Aβ、CD81，CD97，CD98，DDR1，DKK1，EREG、Hsp90，IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、氧化LDL，PCSK9，激肽释放酶原，RON，TMEM16F、SOD1，嗜铬粒蛋白A，嗜铬粒蛋白B、tau，VAP1、高分子激肽原、IL-31、IL-31R、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、EPCR、C1，C1q，C1r，C1s，C2，C2a，C2b，C3，C3a，C3b，C4，C4a，C4b，C5，C5a，C5b，C6，C7，C8，C9，因子B，因子D，因子H，备解素、骨硬化蛋白(sclerostin)、纤维蛋白原，纤维蛋白，凝血酶原，凝血酶，组织因子，因子V，因子Va，因子VII，因子VIIa，因子VIII，因子VIIIa，因子IX，因子IXa，因子X，因子Xa，因子XI，因子XIa，因子XII，因子XIIa，因子XIII，因子XIIIa，TFPI，抗凝血酶III，EPCR，血栓调节蛋白、TAPI，tPA，纤溶酶原，纤溶酶，PAI-1，PAI-2、GPC3、多配体蛋白聚糖-1、多配体蛋白聚糖-2、多配体蛋白聚糖-3、多配体蛋白聚糖-4、LPA、S1P以及用于激素和生长因子的受体中的在机体体液中不固定于细胞而以可溶型存在的分子。
表示存在于抗原中的抗原決定基的表位，意指本说明书中公开的抗原结合分子中的抗原结合结构域所结合的抗原上的部位。因此，例如，表位能够通过其结构来定义。另外，也可以通过相对于识别该表位的抗原结合分子中的抗原的结合活性来定义该表位。抗原为肽或者多肽时，还可以通过构成表位的氨基酸残基来规定表位。另外，表位为糖链时，也可以通过特定的糖链结构来规定表位。
线性表位是下述表位，其包含氨基酸一级序列得到识别的表位。线性表位在固有序列中典型地含有至少3个氨基酸，和最普通地含有至少5个、例如约8至约10个、6至20个氨基酸。
与线性表位相对地，立体结构表位是这样的表位，其中，含有表位的氨基酸的一级序列并非是被识别表位的单一规定成分(例如，氨基酸的一级序列不需要被规定表位的抗体所识别的表位)。立体结构表位相对于线性表位可以含有增大数目的氨基酸。关于立体结构表位的识别，抗体识别肽或蛋白质的三维结构。例如，蛋白质分子折叠形成三维结构时，形成立体结构表位的某氨基酸和/或多肽主链变得并排，使得抗体可以识别表位。确定表位的立体结构的方法包括例如：X射线结晶学、二维核磁共振分光学以及位点特异性旋转标记和电子顺磁共振分光学，但并非限定于此。例如，参照Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular Biology(1996)、第66卷、Morris(编)。
结合活性
下述例示了通过含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子来确认对表位的结合的方法，但通过含有针对IL-6R以外的抗原的抗原结合结构域的被测抗原结合分子来确认对表位的结合的方法也可以基于下述例示而适宜实施。
例如，含有针对IL-6R抗原结合结构域的被测抗原结合分子是否识别存在于IL-6R分子中的线性表位，可通过如下所示操作来确认。为了上述目的，合成了包含构成IL-6R的细胞外结构域的氨基酸序列的线性肽。该肽可化学性地合成。或者，可以利用IL-6R的cDNA中编码相当于细胞外结构域的氨基酸序列的区域，通过基因工程技术得到。接着，对包含构成细胞外结构域的氨基酸序列的线性肽、和含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的结合活性进行评价。例如，通过以固定化线性肽作为抗原的ELISA，可以评价该抗原结合分子对该肽的结合活性。或者，基于该抗原结合分子对IL-6R表达细胞的结合中的、线性肽造成的抑制水平，也可以明确对线性肽的结合活性。通过这些试验，可以明确该抗原结合分子对线性肽的结合活性。
另外，还可以如下所述来确认含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子是否识别立体结构表位。为了上述目的，制备了表达IL-6R的细胞。可举出：含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子在与IL-6R表达细胞接触时与该细胞强结合，但该抗原结合分子与经固定化的包含构成IL-6R细胞外结构域的氨基酸序列的线性肽实质上不结合的情形等。这里，实质上不结合是指，对人IL-6R表达细胞的结合活性的80％以下、通常50％以下、优选30％以下、特别优选15％以下的结合活性。
作为测定对含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的IL-6R表达细胞的结合活性的方法，可举出例如：Antibodies A Laboratory Manual记载的方法(EdHarlow，David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)359-420)。即，可通过以IL-6R表达细胞为抗原的ELISA或FACS(fluorescence activated cell sorting)的原理来进行评价。
在ELISA形式中，对含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的IL-6R表达细胞的结合活性，通过比较由酶反应生成的信号水平而定量地进行评价。即，将被测多肽复合体添加至固定有IL-6R表达细胞的ELISA板，利用识别被测抗原结合分子的酶标记抗体，检出与细胞结合的被测抗原结合分子。或者在FACS中，制作被测抗原结合分子的稀释系列，确定相对于IL-6R表达细胞的抗体结合效价(titer)，由此可以比较被测抗原结合分子对IL-6R表达细胞的结合活性。
被测抗原结合分子与悬浮于缓冲液等中的细胞表面上表达的抗原的结合可以通过流式细胞仪检测出。作为流式细胞仪，已知例如如下的装置。
FACSCantoTM II
FACSAriaTM
FACSArrayTM
FACS VantageTM SE
FACSCaliburTM(均为BD Biosciences公司的商品名)
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(均为Beckman Coulter公司的商品名)。
例如，含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子对抗原的结合活性的优选测定方法的一例，可举出以下方法。首先，将表达IL-6R的细胞与被测抗原结合分子反应，将其用识别被测抗原结合分子的经FITC标记的二次抗体染色。将被测抗原结合分子用适宜的优选缓冲液稀释，由此将该抗原结合分子制备为所期望的浓度来使用。例如，能够以10μg/ml至10ng/ml之间的任意浓度使用。接着，通过FACSCalibur(BD公司)测定荧光强度和细胞数。抗体对该细胞的结合量被反映为使用CELL QUEST Software(BD公司)进行分析而得的荧光强度、即几何平均值。即，通过得到该几何平均值，能够测定由被测抗原结合分子的结合量表示的被测抗原结合分子的结合活性。
含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子是否与某抗原结合分子共有表位，可通过两者对相同表位的竞争来确认。抗原结合分子间的竞争通过交叉阻断试验等来检测。例如竞争ELISA试验是优先的交叉阻断试验。
具体地，在交叉阻断试验中，涂布于微量滴定板的孔上的IL-6R蛋白在候选竞争抗原结合分子的存在下、或非存在下经孵育后，添加被测抗原结合分子。与孔中的IL-6R蛋白结合的被测抗原结合分子的量与竞争结合相同表位的候选竞争抗原结合分子的结合能力间接地相关。即，竞争抗原结合分子对相同表位的亲和性越大，则被测抗原结合分子对涂布有IL-6R蛋白的孔的结合活性越降低。
经由IL-6R蛋白而与孔结合的被测抗原结合分子的量可以通过预先标记抗原结合分子来容易地测定。例如，经生物素标记的抗原结合分子通过使用亲和素过氧化酶结合物和合适的底物来测定。利用过氧化酶等酶标记的交叉阻断试验特别被称为竞争ELISA试验。抗原结合分子能够用可检测或可测定的其它标记物质进行标记。具体地，公知的是放射标记或荧光标记等。
与在候选竞争抗原结合分子复合体的非存在下实施的对照试验中得到的结合活性进行比较，竞争抗原结合分子只要可以阻断至少20％、优选至少20-50％、进一步优选至少50％的含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的结合，则该被测抗原结合分子是与竞争抗原结合分子实质上结合于相同表位、或者竞争结合于相同的表位的抗原结合分子。
在鉴定含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子所结合的表位的结构时，被测抗原结合分子与对照抗原结合分子是否共有表位，能够通过比较两抗原结合分子对在构成该表位的肽中导入氨基酸突变而得的肽的结合活性来进行评价。
作为这种测定结合活性的方法，例如，在前述ELISA形式中，可通过比较被测抗原结合分子和对照抗原结合分子对导入突变的线性肽的结合活性来测定。作为ELISA以外的方法，通过使被测抗原结合分子与对照抗原结合分子流过该柱后，对洗脱液中洗脱的抗原结合分子进行定量，也可以测定对结合于柱的该突变肽的结合活性。使突变肽作为例如与GST的融合肽的形式而吸附于柱的方法是公知的。
另外，鉴定的表位为立体表位时，被测抗原结合分子与对照抗原结合分子是否共有表位可通过以下方法来评价。首先，制备表达IL-6R的细胞、和表达在表位中导入了突变的IL-6R的细胞。将这些细胞悬浮于PBS等适当的缓冲液中，向所得细胞悬浮液添加被测抗原结合分子和对照抗原结合分子。接着，用合适的缓冲液洗涤，向所得细胞悬浮液添加能够识别被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的经FITC标记的抗体。被标记抗体染色的细胞的荧光强度和细胞数通过FACSCalibur(BD公司)来测定。被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的浓度通过合适的缓冲液适当稀释，由此可以制备为所期望的浓度来使用。例如，以10μg/ml至10ng/ml之间的任意浓度使用。标记抗体对该细胞的结合量被反映为使用CELLQUEST Software(BD公司)进行分析而得的荧光强度、即几何平均值。即、通过得到该几何平均值，可以测定由标记抗体的结合量表示的被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的结合活性。
本方法中，例如“实质上不与突变IL-6R表达细胞结合”可通过以下方法判断。首先，用标记抗体染色与表达突变IL-6R的细胞结合的被测抗原结合分子和对照抗原结合分子。接着，检测细胞的荧光强度。荧光检测中使用作为流式细胞仪的FACSCalibur时，所得的荧光强度可以使用CELL QUEST Software进行分析。由多肽复合体存在下和非存在下的几何平均值，通过下式计算该比较值(ΔGeo-Mean)，由此可以求出抗原结合分子的结合造成的荧光强度的增加比例。
ΔGeo-Mean＝Geo-Mean(多肽复合体存在下)/Geo-Mean(多肽复合体非存在下)将通过解析得到的、反映被测抗原结合分子对突变IL-6R表达细胞的结合量的算术平均比较值(突变IL-6R分子ΔGeo-Mean值)、与反映被测抗原结合分子对IL-6R表达细胞的结合量的ΔGeo-Mean比较值进行比较。此时，计算相对于突变IL-6R表达细胞和IL-6R表达细胞的ΔGeo-Mean比较值时使用的被测抗原结合分子的浓度特别优选制备为相互相同或者实质上相同的浓度。预先确定了识别IL-6R中的表位的抗原结合分子被用作对照抗原结合分子。
被测抗原结合分子相对于突变IL-6R表达细胞的ΔGeo-Mean比较值只要小于被测抗原结合分子相对于IL-6R表达细胞的ΔGeo-Mean比较值的至少80％、优选50％、进一步优选30％、特别优选15％，则认为“实质上不与突变IL-6R表达细胞结合”。计算Geo-Mean值(算术平均)的计算式记载于CELL QUEST Software User’ s Guide(BD biosciences公司)。通过对比较值进行比较，只要是能够将其实质上视为相同的程度，则能够评价被测抗原结合分子与对照抗原结合分子的表位相同。
抗原结合结构域
本说明书中，“抗原结合结构域”只要与目标抗原结合，则可以使用任意结构的结构域。作为这类结构域的实例，可优选举出例如：抗体的重链和轻链的可变区、机体内存在的细胞膜蛋白Avimer中所含的35个氨基酸程度的被称为A结构域的组件(WO2004/044011、WO2005/040229)、含有与在细胞膜表达的糖蛋白fibronectin中的蛋白质结合的结构域10Fn3结构域的Adnectin(WO2002/032925)、以构成ProteinA的包含58个氨基酸的三个螺旋束(bundle)的IgG结合结构域为scaffold的Affibody(WO1995/001937)、具有含33个氨基酸残基的转角和2个反向平行螺旋以及环的亚基重复重叠而成的结构的锚蛋白重复序列(ankyrin repeat：AR)的分子表面露出的区域DARPins(Designed Ankyrin Repeatproteins)(WO2002/020565)、支持中性粒细胞明胶酶结合脂质运载蛋白(neutrophilgelatinase-associated lipocalin(NGAL))等脂质运载蛋白分子中高度保守的8个反向平行链在中央方向扭曲的桶结构的单侧的4个环区域Anticalin等(WO2003/029462)、作为七鳃鳗、八目鳗等无颚类的获得免疫***且不具有免疫球蛋白结构的可变性淋巴细胞受体(variable lymphocyte receptor(VLR))的亮氨酸残基富集重复(leucine-rich-repeat(LRR))组件重复重叠而成的马蹄铁形的结构内部的平行型片结构的凹陷区域(WO2008/016854)。作为本发明的抗原结合结构域的优选实例，可举出含有抗体的重链和轻链的可变区de抗原结合结构域。作为这种抗原结合结构域的实例，优选可举出“scFv(单链Fv)”、“单链抗体”、“Fv”、“scFv2(单链Fv2)”、“Fab”或“F(ab′)2”等。
本发明的抗原结合分子中的抗原结合结构域可以与相同的表位结合。这里，相同的表位可以存在于例如包含序列编号：15所述的氨基酸序列的蛋白质中。另外，可以存在于包含序列编号：15所述的氨基酸序列的第20至第365个氨基酸的蛋白质中。或者，本发明的抗原结合分子中的抗原结合结构域可以与相互不同的表位结合。这里，不同的表位可以存在于包含例如序列编号：15所述的氨基酸序列的蛋白质中。另外，可以存在于包含序列编号：15所述的氨基酸序列的第20至第365个氨基酸的蛋白质中。
钙结合模体
本发明的抗原结合分子中的抗原结合结构域包含钙结合模体。只要低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性，则钙结合模体可以含有在抗原结合结构域的任意位置。抗原结合结构域为抗体的可变区时，钙结合模体可以含有于可变区的重链中，也可以含有于可变区的轻链中。另外，钙结合模体也可以含有于重链和轻链两者中。在非限定的另一实施方式中，钙结合模体可以含有于可变区的框架序列中，也可以含有于可变区的CDR序列中。另外，钙结合模体也可以含有于框架序列和CDR序列两者中。
作为本发明的一个非限定实施方式，钙结合模体含有氨基酸残基，该氨基酸残基根据钙离子浓度的条件而使抗原结合分子对抗原的结合活性发生改变。作为该氨基酸残基的实例，可以优选使用具有金属螯合作用的氨基酸。作为具有金属螯合作用的氨基酸的实例，优选可举出例如：丝氨酸(Ser(S))、苏氨酸(Thr(T))、天冬酰胺(Asn(N))、谷氨酰胺(Gln(Q))、天冬氨酸(Asp(D))、谷氨酸(Glu(E))、组氨酸(His(H))和酪氨酸(Tyr(Y))等。具有低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的性质的现存抗原结合结构域中存在的钙结合模体能够适宜用作本发明的钙结合模体。作为这种现存抗原结合结构域的一个非限定实例，可优选使用低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗体的可变区所含的钙结合模体。作为这类抗体的非限定实例，可举出含有序列编号：1和序列编号：2的IL-6受体抗体和含有序列编号：25和序列编号：26的IL-6抗体。另外，已知具有多个钙离子结合位点，且认为在分子进化上来源于共同起源的肌钙蛋白C、钙调蛋白、小白蛋白、肌球蛋白轻链等，其结合模体也可以作为本发明的钙结合模体使用。
本发明的抗原结合结构域为抗体的可变区时，钙结合模体可以含有于可变区的重链中，也可以含有于可变区的轻链中。另外，钙结合模体也可以含有于重链和轻链两者中。在非限定的另一实施方式中，钙结合模体可以含有于可变区的框架序列中，也可以含有于可变区的CDR序列中。另外，钙结合模体也可以含有于框架序列和CDR序列两者中。还能以被这些钙结合模体所含有的方式设计重链或轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3。例如，在本发明的一个非限定实施方式中，可以设计由序列编号：41、序列编号：63、序列编号：64所示的人抗体的轻链可变区所含的钙结合模体，以使含有在本发明的抗原结合分子的轻链可变区中。作为这种钙结合模体，可举出以Kabat编号表示的30位、31位、32位、50位和/或92位中的任一者以上的氨基酸包含具有金属螯合作用的氨基酸的钙结合模体。作为这种钙结合模体的一个非限定实施方式，优选可举出下述钙结合模体，其中，与由序列编号：41、序列编号：63、序列编号：64所示的人抗体的轻链可变区的以Kabat编号表示的30位、31位、32位、50位和/或92位这5个氨基酸中选出的1～4的氨基酸相同的氨基酸含有在对应的Kabat编号的氨基酸位点。此时，在轻链可变区的以Kabat编号表示的30位、31位、32位、50位和/或92位这5个氨基酸位点中，优选在下述氨基酸位点含有具有金属螯合作用的氨基酸，在该位点处，氨基酸与由序列编号：41、序列编号：63、序列编号：64所示的人抗体的轻链可变区中的对应氨基酸位点所含的氨基酸不相同。另外，例如在本发明的另一个非限定实施方式中，还可以设计由序列编号：1表示的重链可变区中所含的钙结合模体，以使含有在本发明的抗原结合分子的重链可变区中。作为这种钙结合模体，可举出下述钙结合模体，其中以Kabat编号表示的95位、96位和/或100a位的氨基酸包含具有金属螯合作用的氨基酸。另外，例如在本发明的另一个非限定实施方式中，还可以设计由序列编号：25表示的重链可变区中所含的钙结合模体，以使含有在本发明的抗原结合分子的重链可变区中。作为这种钙结合模体，可举出下述钙结合模体，其中，以Kabat编号表示的95位和/或101位的氨基酸包含具有金属螯合作用的氨基酸。作为这些具有金属螯合作用的氨基酸，可举出例如：丝氨酸(Ser(S))、苏氨酸(Thr(T))、天冬酰胺(Asn(N))、谷氨酰胺(Gln(Q))、天冬氨酸(Asp(D))、谷氨酸(Glu(E)、组氨酸(His(H))和酪氨酸(Tyr(Y))等。另外，这些位置的氨基酸的主链羰基也可以参与钙离子的结合。如后述实施例所述，通过将钙结合模体所含的氨基酸移植到所期望的抗原结合结构域，出人意料的是，可以对该抗原结合结构域赋予钙离子结合活性。另外，也可以适宜使用钙黏蛋白结构域、钙调蛋白所含的EF手、蛋白激酶C所含的C2结构域、凝血蛋白因子IX所含的Gla结构域、脱唾液酸糖蛋白受体或甘露糖结合受体所含的C型凝集素、LDL受体所含的A结构域、膜联蛋白、血小板反应蛋白3型结构域和EGF样结构域。
特异性
特异性是指一分子对作为其结合对象的一个或多个分子以外的分子不显示任何显著性的结合的状态。另外，也可以用于抗原结合结构域对某抗原中所含的多个表位中特定的表位为特异性的情形。另外，抗原结合结构域所结合的表位含有在多个不同的抗原中时，具有该抗原结合结构域的抗原结合分子可以与含有该表位的各种抗原结合。
抗体
本说明书中，抗体是指天然的免疫球蛋白或者通过部分或完全合成制造得到的免疫球蛋白。抗体可从天然存在其的血浆、血清等天然资源或产生抗体的杂交瘤细胞的培养上清中分离得到，或者通过使用基因重组等方法而部分或完全合成。作为抗体的实例，优选可举出：免疫球蛋白的同种型和这些同种型的亚类。作为人的免疫球蛋白，已知有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM这9种类型(同种型)。本发明的抗体中可包含这些同种型中的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。
制造具有所期望结合活性的抗体的方法对本领域技术人员来说是公知的。以下例示与IL-6R结合的抗体(抗IL-6R抗体)的制作方法。与IL-6R以外的抗原结合的抗体也可以根据下述例示而适宜制作。
抗IL-6R抗体可以使用公知的方法以多克隆或单克隆抗体的形式获得。作为抗IL-6R抗体，可优选制作来源于哺乳动物的单克隆抗体。来源于哺乳动物的单克隆抗体包含：由杂交瘤产生的单克隆抗体、和利用基因工程技术通过用含有抗体基因的表达载体进行了转化的宿主细胞产生的单克隆抗体等。本申请发明的单克隆抗体包含“人源化抗体”和“嵌合抗体”。
产生单克隆抗体的杂交瘤可以通过使用公知技术，例如如下所示来制作。即，使用IL-6R蛋白作为敏化抗原，按照通常的免疫方法来免疫哺乳动物。通过通常的细胞融合法，将所得免疫细胞与公知的亲本细胞融合。接着，通过通常的筛选方法筛选单克隆的抗体产生细胞，由此可以选择出产生抗IL-6R抗体的杂交瘤。
具体地，单克隆抗体的制作例如如下所示地进行。首先，表达其核苷酸序列公开在序列编号：16中的IL-6R基因，由此可得到由序列编号：15表示的IL-6R蛋白，其用作敏化抗原用于抗体制备。即，将编码IL-6R的基因序列***公知的表达载体，由此转化适当的宿主细胞。以公知的方法从该宿主细胞中或培养上清中纯化所期望的人IL-6R蛋白。为了从培养上清中获得可溶型的IL-6R，代替由序列编号：15表示的IL-6R蛋白，表达了例如，如Mullberg等(J.Immunol.(1994)152(10)，4958-4968)所记载的可溶型IL-6R、即，由序列编号：15表示的IL-6R多肽序列中的第1至357个氨基酸构成的蛋白质。另外，纯化的天然IL-6R蛋白也可以同样地用作敏化抗原。
作为用于免疫哺乳动物的敏化抗原，可使用该纯化IL-6R蛋白。另外，IL-6R的部分肽也可以用作敏化抗原。此时，该部分肽也可以根据人IL-6R的氨基酸序列通过化学合成获得。另外，也可以通过将IL-6R基因的一部分整合至表达载体并进行表达来获得。进而，还可以使用蛋白质分解酶分解IL-6R蛋白来获得，用作部分肽的IL-6R肽的区域和大小并不特别限于特定的方式。对于优选的区域，可以从序列编号：15的氨基酸序列中相当于第20-357个氨基酸的氨基酸序列中选择任意的序列。构成作为敏化抗原的肽的氨基酸的数目优选为至少5个以上、例如6个以上、或7个以上。更具体地，可以将8～50、优选10～30个残基的肽用作敏化抗原。
另外，也可以将IL-6R蛋白的所期望的部分多肽或肽与不同的多肽进行融合而得的融合蛋白用作敏化抗原。为了制造用作敏化抗原的融合蛋白，例如，可以优选利用抗体的Fc片段或肽标签等。表达融合蛋白的载体可如下制作：将编码所期望的两种或两种以上的多肽片段的基因框内融合，将该融合基因如前所述地***表达载体。融合蛋白的制作方法记载于Molecular Cloning 2nd ed.(Sambrook，J et al.，Molecular Cloning 2nd ed.，9.47-9.58(1989)Cold Spring Harbor Lab.press)。用作敏化抗原的IL-6R的获得方法和使用它的免疫方法也具体记载于WO2003/000883、WO2004/022754、WO2006/006693等中。
作为用该敏化抗原免疫的哺乳动物，并不限定于特定的动物，优选考虑与细胞融合中使用的亲本细胞的适应性来选择。通常优选使用啮齿类的动物，例如，小鼠、大鼠、仓鼠、或兔、猴等。
按照公知的方法将上述动物用敏化抗原免疫。例如，作为通常的方法，通过将敏化抗原给予至哺乳动物的腹腔内或皮下来实施免疫。具体地，将用PBS(Phosphate-BufferedSaline)或生理盐水等以适当稀释倍率稀释的敏化抗原根据需要与通常的佐剂、例如弗氏完全佐剂混合，在乳化后将该敏化抗原对哺乳动物每4至21天给予数次。另外，敏化抗原免疫时可以使用适当的载体。特别是将分子量小的部分肽用作敏化抗原时，有时期望将与白蛋白、匙孔血蓝蛋白等载体蛋白质结合的该敏化抗原肽进行免疫。
另外，产生所期望抗体的杂交瘤可通过使用DNA免疫，如下所示来制作。DNA免疫是指下述免疫方法：被给予了以能在免疫动物中表达编码抗原蛋白的基因的方式构建的载体DNA的该免疫动物中，敏化抗原在该免疫动物的机体内表达，由此赋予免疫刺激。与将蛋白质抗原给予免疫动物的通常的免疫方法相比，DNA免疫期待如下优越性。
-能够维持如IL-6R的膜蛋白的结构而赋予免疫刺激
-无需纯化免疫抗原
为了通过DNA免疫获得本发明的单克隆抗体，首先，对免疫动物给予表达IL-6R蛋白的DNA。编码IL-6R的DNA可通过PCR等公知方法合成。将所得DNA***适当的表达载体，给予免疫动物。作为表达载体，可优选利用例如pcDNA3.1等市售的表达载体。作为将载体给予机体的方法，可采用通常所使用的方法。例如，将吸附有表达载体的金粒子用基因枪导入免疫动物个体的细胞内，由此进行DNA免疫。进而，识别IL-6R的抗体的制作也可以采用国际公开WO2003/104453中记载的方法来制作。
如此将哺乳动物免疫，确认到血清中与IL-6R结合的抗体效价的上升后，从哺乳动物采集免疫细胞，供细胞融合。作为优选的免疫细胞，特别可使用脾细胞。
作为与前述免疫细胞融合的细胞，可使用哺乳动物的骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞优选具备用于筛选的适当的选择标记物。选择标记物指的是赋予细胞能够在特定培养条件下存活(或死亡)的性质。选择标记物中，公知的是次黄嘌吟-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶缺陷(以下简称为HGPRT缺陷)、或胸苷激酶缺陷(以下简称为TK缺陷)等。具有HGPRT、TK缺陷的细胞具有次黄嘌呤-氨基蝶吟-胸苷敏感性(以下简称为HAT敏感性)。HAT敏感性的细胞不能在HAT选择培养基中进行DNA合成而会死亡，但若与正常细胞发生融合，则可利用正常细胞的补救途径继续DNA的合成，因此在HAT选择培养基中也会增殖。
HGPRT缺陷、TK缺陷的细胞各自可通过含有6硫代鸟嘌呤、8氮杂鸟嘌吟(以下简称为8AG)、或5′溴脱氧尿苷的培养基来选择。DNA中整合有这些嘧啶类似物的正常细胞会死亡。而无法整合这些嘧啶类似物的缺乏上述酶的细胞则可以在选择培养基中存活。此外，被称为G418抗性的选择标记物可通过新霉素抗性基因赋予针对2-脱氧链霉胺系抗生素(庆大霉素类似物)的抗性。细胞融合中优选的各种骨髓瘤细胞是公知的。
作为这类骨髓瘤细胞，可优选使用，例如，P3(P3x63AgS.653)(J.Immunol.(1979)123(4)，1548-1550)、P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81，1-7)、NS-1(C.Eur.J.Immunol.(1976)6(7)，511-519)、MPC-11(Cell(1976)8(3)，405-415)、SP2/0(Nature(1978)276(5685)，269-270)、FO(J.Immunol.Methods(1980)35(1-2)，1-21)、S194/5.XX0.BU.1(J.Exp.Med.(1978)148(1)，313-323)、R210(Nature(1979)277(5692)，131-133)等。
基本上，根据公知方法，例如Kohler和Milstein等的方法(Methods Enzymol.(1981)73，3-46)等，进行前述免疫细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合。
更具体地，例如，可以在细胞融合促进剂的存在下、在通常的营养培养液中实施前述细胞融合。作为融合促进剂，使用例如聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，进而为了提高融合效率，根据期望添加二甲基亚砜等助剂使用。
免疫细胞和骨髓瘤细胞的使用比例可以任意设定。例如，相对于骨髓瘤细胞，优选使免疫细胞为1至10倍。作为用于前述细胞融合的培养液，使用例如适于前述骨髓瘤细胞株的增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液、以及用于此种细胞培养的通常的培养液，进而可优选添加胎牛血清(FCS)等血清补液。
对于细胞融合，将前述免疫细胞和骨髓瘤细胞在前述培养液中以规定量充分混合，将预先加热至37℃左右的PEG溶液(例如平均分子量1000至6000左右)通常以30至60％(w/v)的浓度添加。通过缓缓混合混合液，形成所期望的融合细胞(杂交瘤)。接着，依次添加上述列举的适当的培养液，通过重复进行离心除去上清的操作，可以除去对杂交瘤的生长不利的细胞融合剂等。
这样得到的杂交瘤可通过用通常的选择培养液、例如HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养液)培养来进行选择。使用上述HAT培养液的培养可持续足够所期望的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡的时间(通常，所述足够的时间为数天至数周)。接着，通过通常的有限稀释方法，实施产生所期望抗体的杂交瘤的筛选和单克隆。
如此得到的杂交瘤は可通过使用对应于用于细胞融合的骨髓瘤所具有的选择标记物的选择培养液来进行选择。例如，具有HGPRT、TK缺陷的细胞可以通过用HAT培养液(含有次黄嘌吟、氨基蝶呤和胸苷的培养液)培养来进行选择。即，在细胞融合中使用HAT敏感性的骨髓瘤细胞时，在HAT培养液中，与正常细胞的细胞融合成功了的细胞可选择性地增殖。使用上述HAT培养液的培养可以持续足够所期望的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡的时间。具体地，通常通过数天至数周的培养，可以选择所期望的杂交瘤。接着，可通过通常的有限稀释方法，实施产生所期望抗体的杂交瘤的筛选和单克隆。
所期望抗体的筛选和单克隆优选可通过公知的基于抗原抗体反应的筛选方法来实施。例如，与IL-6R结合的单克隆抗体可以与细胞表面表达的IL-6R结合。这类单克隆抗体可通过例如FACS(fluorescence activated cell sorting，荧光活化细胞分选***)来筛选。FACS是可以用激光分析与荧光抗体接触的细胞，测定各细胞发出的荧光，由此可以测定抗体对细胞表面的结合的***。
为了利用FACS来对产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤进行筛选，首先制备表达IL-6R的细胞。优选用于筛选的细胞是强制表达IL-6R的哺乳动物细胞。作为对照，通过使用用作宿主细胞的未转化的哺乳动物细胞，可以选择性地检测出抗体对细胞表面的IL-6R的结合活性。即，通过选择产生不与宿主细胞结合、而与IL-6R强制表达细胞结合的抗体的杂交瘤，可以获得产生IL-6R单克隆抗体的杂交瘤。
或者，可以基于ELISA的原理来评价抗体对固定化的IL-6R表达细胞的结合活性。例如，将IL-6R表达细胞固定于ELISA板的孔中。使杂交瘤的培养上清与孔内的固定化细胞接触，检出与固定化细胞结合的抗体。单克隆抗体来源于小鼠时，与细胞结合的抗体可通过抗小鼠免疫球蛋白抗体检出。通过这些筛选选择出的、产生对抗原具有结合能力的所期望的抗体的杂交瘤可以通过有限稀释方法等进行克隆。
这样制作的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在通常的培养液中传代培养。另外，该杂交瘤可以在液氮中长期保存。
按照通常的方法培养该杂交瘤，可从其培养上清中获得所期望的单克隆抗体。或者，可以将杂交瘤给予和其具有适应性的哺乳动物并使其增殖，从其腹水中获得单克隆抗体。前者的方法适于获得高纯度的抗体。
也可以适宜地使用由从该杂交瘤等抗体产生细胞克隆的抗体基因编码的抗体。将克隆的抗体基因整合至适当的载体中，导入宿主，由此表达由该基因所编码的抗体。用于抗体基因的分离、向载体中的导入、以及宿主细胞的转化的方法已经由例如Vandamme等确立(Eur.J.Biochem.(1990)192(3)，767-775)。另外，如下所述的重组抗体的制造方法也是公知的。
例如，由产生抗IL-6R抗体的杂交瘤细胞获得编码抗IL-6R抗体的可变区(V区域)的cDNA。为此，通常首选从杂交瘤提取总RNA。作为用于从细胞提取mRNA的方法，例如，可使用如下所述的方法。
-胍超离心法(Biochemistry(1979)18(24)，5294-5299)
-AGPC法(Anal.Biochem.(1987)162(1)，156-159)提取的mRNA可使用mRNAPurification Kit(GE Healthcare Bioscience制)等进行纯化。或者还市售有QuickPrepmRNA Purification Kit(GE Healthcare Bioscience制)等这样的用于从细胞直接提取总mRNA的试剂盒。使用这种试剂盒，可从杂交瘤获得mRNA。可以由所得mRNA，使用反转录酶来合成编码抗体V区域的cDNA。cDNA可通过AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNASynthesis Kit(生化学工业社制)等合成。另外，为了cDNA的合成和扩增，可以适宜采用使用了SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech制)和PCR的5’-RACE法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85(23)，8998-9002、Nucleic Acids Res.(1989)17(8)，2919-2932)。进而，可以在这种cDNA的合成过程中向cDNA的两末端导入后述适合的限制酶位点。
从所得PCR产物纯化出目标cDNA片段，接着与载体DNA连接。如此制作重组载体，并导入大肠杆菌等中，选择菌落后，可以由形成该菌落的大肠杆菌制备所期望的重组载体。而且，对于该重组载体是否具有目标cDNA的碱基序列，可以通过公知的方法，例如，双脱氧核苷酸链终止法等来确认。
为了获得编码可变区的基因，简便的是利用5’-RACE法，其中使用了可变区基因扩增用的引物。首先，将从杂交瘤细胞提取的RNA作为模板来合成cDNA，获得5’-RACE cDNA文库。5’-RACE cDNA文库的合成中可适宜地使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒等市售的试剂盒。
以所得的5’-RACE cDNA文库为模板，通过PCR法扩增抗体基因。基于公知的抗体基因序列，可设计小鼠抗体基因扩增用的引物。这些引物根据免疫球蛋白的亚类而具有不同的碱基序列。因此，理想的是使用Iso Strip小鼠单克隆抗体亚型检测试剂盒(ロッュ·ダィァグノスティックス)等市售试剂盒来预先确定亚类。
具体地，例如为了获得编码小鼠IgG的基因时，可以使用下述引物，其能够扩增编码作为重链的γl、γ2a、γ2b、γ3、作为轻链的κ链和λ链的基因。为了扩增IgG的可变区基因，通常，3’侧的引物采用会退火到相当于接近可变区的恒定区的部分上的引物。而5′侧的引物则采用5’RACE cDNA文库制作试剂盒所附带的引物。
采用这样扩增得到的PCR产物，可以重构由重链和轻链的组合构成的免疫球蛋白。将经重构的免疫球蛋白的针对IL-6R的结合活性作为指标，可筛选所期望的抗体。例如，为了获得针对IL-6R的抗体时，进一步优选抗体对IL-6R的结合是特异性的。与IL-6R结合的抗体可例如如下所述进行筛选；
(1)使包含由杂交瘤获得的cDNA所编码的V区域的抗体与IL-6R表达细胞接触的步骤、
(2)检测IL-6R表达细胞与抗体的结合的步骤、和
(3)选择与IL-6R表达细胞结合的抗体的步骤。
检测抗体和IL-6R表达细胞的结合的方法是公知的。具体地，通过如前所述的FACS等方法，可检测出抗体与IL-6R表达细胞的结合。为了评价抗体的结合活性，可适宜利用IL-6R表达细胞的固定标本。
作为以结合活性为指标的抗体的筛选方法，还可适宜采用淘选法，其利用了噬菌体载体。从多克隆抗体表达细胞群以重链和轻链的亚类的文库的形式获得抗体基因时，有利的是利用噬菌体载体的筛选方法。编码重链和轻链的可变区的基因通过用适当的接头序列连接，可形成单链Fv(scFv)。通过将编码scFv的基因***噬菌体载体，可以获得在表面表达scFv的噬菌体。该噬菌体与所期望的抗原接触后，回收与抗原的噬菌体，从而可以回收编码具有目标结合活性的scFv的DNA。通过根据需要重复该操作，可以浓缩具有所期望结合活性的scFv。
得到目标的编码抗IL-6R抗体的V区域的cDNA后，通过识别***该cDNA的两末端的限制酶位点的限制酶，将该cDNA消化。优选的限制酶会识别并消化在构成抗体基因的碱基序列中出现频率低的碱基序列。进而，为了将1拷贝的消化片段以正确方向***载体，优选***能提供粘性末端的限制酶。将如上所述消化的编码抗IL-6R抗体的V区域的cDNA***适当的表达载体，由此可获得抗体表达载体。此时，只要将编码抗体恒定区(C区域)的基因、和编码前述V区域的基因框内融合，则可获得嵌合抗体。这里，嵌合抗体是指恒定区和可变区的来源不同。因此，除了小鼠-人等异种嵌合抗体之外，人-人同种嵌合抗体也包含在本发明的嵌合抗体中。通过在预先具有恒定区的表达载体中***前述V区域基因，可以构建嵌合抗体表达载体。具体地，例如，可在保持有编码所期望抗体恒定区(C区域)的DNA的表达载体的5’侧适宜地配置消化前述V区域基因的限制酶的限制酶识别序列。对经相同组合的限制酶消化的两者进行框内融合，由此构建嵌合抗体表达载体。
为了制造抗IL-6R单克隆抗体，以在表达调控区的调控下进行表达的方式，将抗体基因整合至表达载体中。用于表达抗体的表达调控区包含例如增强子和启动子。另外，可以在氨基酸末端添加合适的信号序列，以使表达的抗体分泌到细胞外。例如，作为信号序列，可以使用具有氨基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS(序列编号：113)的肽，除此之外，也可以添加适当的信号序列。表达的多肽在上述序列的羧基末端部分被切断，被切断的多肽能够以成熟多肽的形式分泌到细胞外。接着，用该表达载体转换适当的宿主细胞，由此可以获得表达编码抗IL-6R抗体的DNA的重组细胞。
为了表达抗体基因，编码抗体重链(H链)和轻链(L链)的DNA被分别整合于不同的表达载体中。通过用整合有H链和L链的载体同时转化(co-transfect)相同的宿主细胞，可以表达具备H链和L链的抗体分子。或者，也可以将编码H链和L链的DNA整合于单一表达载体中，并用其转化宿主细胞(参照国际公开WO 1994011523)。
用于将分离的抗体基因导入适当的宿主来制作抗体的宿主细胞和表达载体的多个组合是公知的。这些表达***均可用于分离本发明的抗原结合结构域。将真核细胞用作宿主细胞时，可适宜使用动物细胞、植物细胞、或真菌细胞。具体地，动物细胞可例示下述细胞。
(1)哺乳类细胞、：CHO、COS、骨髓瘤、BHK(baby hamster kidney)、Hela、Vero等
(2)两栖类细胞：非洲蟾蜍***等
(3)昆虫细胞：sf9、sf21、Tn5等
或者，作为植物细胞，公知有基于来源于烟草(Nicotiana tabacum)等烟草(Nicotiana)属的细胞的抗体基因表达***。植物细胞的转化中，可以适宜使用进行了愈伤组织培养的细胞。
进而，作为真菌细胞，可以使用如下细胞。
-酵母：酿酒酵母(Saccharomyces serevisiae)等酵母(Saccharomyces)属、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)等毕赤酵母属
-丝状真菌：黑曲霉菌(Aspergillusniger)等曲霉(Aspergillus)属
另外，利用原核细胞的抗体基因表达***也是公知的。例如，使用细菌细胞时，可适宜利用大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌等细菌细胞。通过转化向这些细胞中导入含有目标抗体基因的表达载体。通过在体外培养经转化的细胞，可以从该转化细胞的培养物中获得所期望的抗体。
除了上述宿主细胞之外，重组抗体的产生也可以利用转基因动物。即，可以从导入有编码所期望抗体的基因的动物获得该抗体。例如，抗体基因可以通过框内***编码乳汁中固有产生的蛋白质的基因的内部，而构建为融合基因。作为分泌至乳汁中的蛋白质，可利用例如山羊β酪蛋白等。将含有***了抗体基因的融合基因的DNA片段注入山羊的胚胎，再将该进行了注入的胚胎导入母山羊。由接受胚胎的山羊生出的转基因山羊(或其后代)产生的乳汁中，能够以与乳汁蛋白的融合蛋白的形式获得所期望的抗体。另外，为了使由转基因山羊产生的含有所期望抗体的乳汁量增加，可以对转基因山羊给予激素(Bio/Technology(1994)，12(7)，699-702)。
对人给予本说明书中记载的抗原结合分子时，作为该复合体中的抗原结合结构域，可以适宜采用来源于基因重组型抗体的抗原结合结构域，该基因重组型抗体为了降低针对人的异源抗原性等目的已进行了人工修饰。基因重组型抗体包含例如人源化(Humanized)抗体等。这些修饰抗体可使用公知方法适宜制造。
为了制作本说明书中记载的抗原结合分子的抗原结合结构域所使用的抗体的可变区通常由被4个框架区域(FR)夹持的3个互补决定区(complementarity-determiningregion；CDR)构成。CDR是实质上决定抗体结合特异性的区域。CDR的氨基酸序列富有多样性。另一方面，构成FR的氨基酸序列即便是在具有不同结合特异性的抗体之间也多显示高度的同一性。因此，通常认为可以通过CDR的移植来将某抗体的结合特异性移植到其它抗体。
人源化抗体也被称为重构(reshaped)人抗体。具体地，将人以外的动物例如小鼠抗体的CDR移植到人抗体中的人源化抗体等是公知的。用于获得人源化抗体的通常的基因重组方法也是已知的。具体地，作为用于将小鼠抗体的CDR移植到人的FR中的方法，公知的是例如Overlap Extension PCR。Overlap Extension PCR中，用于合成人抗体FR的引物中添加有编码待移植小鼠抗体CDR的碱基序列。针对4个FR分别准备引物。通常，对于将小鼠CDR移植到人FR中，选择与小鼠FR同一性高的人FR，在维持CDR功能方面被认为有利。即，通常优选使用下述人FR，其包含与待移植小鼠CDR的相邻FR氨基酸序列的同一性高的氨基酸序列。
另外，连接的碱基序列被设计为相互框内连接。通过各引物单独地合成人FR。结果得到各FR上添加有编码小鼠CDR的DNA的产物。各产物的编码小鼠CDR的碱基序列被设计为相互重叠。接着，使以人抗体基因为模板合成的产物的重叠CDR部分相互退火，进行互补链合成反应。通过该反应，人FR通过小鼠CDR序列而连接。
最终3个CDR和4个FR连接得到的V区域基因，通过会与其5′末端和3′末端发生退火并添加有适当的限制酶识别序列的引物而扩增出其全长。将如上所述得到的DNA和编码人抗体C区域的DNA以进行框内融合的方式***表达载体中，由此可以制作人型抗体表达用载体。将该整合载体导入宿主建立重组细胞后，培养该重组细胞，通过表达编码该人源化抗体的DNA，从而在该培养细胞的培养物中产生该人源化抗体(参照欧州专利公开EP239400、国际公开WO1996/002576)。
通过定性或者定量地测定并评价如上所述制作的人源化抗体对抗原的结合活性，可以适宜地选择人抗体FR，以便通过CDR连接时该CDR形成良好的抗原结合位点。根据需要，也可以按照重构人抗体CDR形成合适抗原结合位点的方式来置换FR的氨基酸残基。例如，可以应用将小鼠CDR移植到人FR中使用的PCR法，向FR导入氨基酸序列的突变。具体地，可以向会与FR发生退火的引物中导入部分碱基序列的突变。通过这类引物合成的FR中导入了碱基序列的突变。通过用上述方法测定并评价进行了氨基酸置换的突变型抗体对抗原的结合活性，可以选择具有所期望性质的突变FR序列(Cancer Res.，(1993)53，851-856)。
另外，将具有人抗体基因的全部组成成分的转基因动物(参照国际公开WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735参照)作为免疫动物，可以通过DNA免疫获得所期望的人抗体。
进而，使用人抗体文库通过淘选法获得人抗体的技术也是已知的。例如，人抗体的V区域以单链抗体(scFv)的形式通过噬菌体展示法表达在噬菌体的表面。可以选择表达与抗原结合的scFv的噬菌体。通过对选择的噬菌体的基因进行分析，可以确定编码与抗原结合的人抗体V区域的DNA序列。确定与抗原结合的scFv的DNA序列后，将该V区域序列与所期望的人抗体C区域序列框内融合后，***适当的表达载体，由此可以制作表达载体。将该表达载体导入上述列举的适宜表达细胞中，通过使编码该人抗体的基因表达，可以获得该人抗体。这些方法已经公知(参照国际公开WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388)。
另外，作为获得抗体基因的方法，除了上述之外，还可适宜地使用如Bernasconi等(Science(2002)298，2199-2202)或WO2008/081008中记载的B细胞克隆(各抗体的编码序列的鉴定和克隆、其分离、以及用于制备各抗体(特别是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的表达载体构建用的用途等)的方法。
EU编号
根据本发明中使用的方法，分配给抗体的CDR和FR的氨基酸位置依照Kabat规定(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute ofHealth，Bethesda，Md.，1987年和1991年)。本说明书中，抗原结合分子为抗体或抗原结合片段时，可变区的氨基酸按照Kabat编号来表示，恒定区的氨基酸按照基于Kabat氨基酸位置的EU编号来表示。
抗原向细胞内的摄入或向细胞内摄入的促进
本发明中，基于抗原结合分子的“抗原向细胞内的摄入”意指抗原通过胞吞作用被摄入到细胞内。另外，本发明中，“促进向细胞内的摄入”意指血浆中与抗原结合的抗原结合分子摄入细胞内的速度被促进、和/或摄入的抗原被再循环至血浆中的量减少。对于本发明中向细胞内的摄入速度的促进程度，与使抗原结合分子在低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的之前的抗原结合分子相比，向细胞内的摄入速度可以得到促进。因此，本发明中是否通过抗原结合分子促进了抗原向细胞内的摄入，可以通过抗原向细胞内的摄入速度是否增大来进行判断。抗原向细胞内摄入的速度例如可以如下计算：在含有人FcRn表达细胞的培养液添加抗原结合分子和抗原，经时性地测定抗原的培养液中浓度的减少、或者经时性地测定人FcRn表达细胞内摄入的抗原的量，由此算出。
通过利用本发明的抗原结合分子促进抗原向细胞内摄入的速度的方法，例如，通过给予抗原结合分子，可以促进血浆中抗原的消除速度。因此，基于抗原结合分子的抗原向细胞内的摄入是否得到促进也可以通过测定，例如，血浆中存在的抗原的消除速度是否得到加速、或血浆中的抗原浓度是否因给予抗原结合分子而降低来确认。即，通过给予本发明的抗原结合分子，也可以促进血浆中抗原浓度的减少。
1分子的抗原结合分子对抗原的结合次数
另外，本发明中“1分子的抗原结合分子对抗原的结合次数”意指直至1分子的抗原结合分子被分解消除为止期间可以结合至抗原的次数。本发明中“增加1分子的抗原结合分子对抗原的结合次数”是指，以抗原在血浆中与抗原结合分子结合、结合了抗原的抗原结合分子被摄入细胞内、抗原在内体内解离后抗原结合分子返回到血浆中作为1个循环时，使直至1分子的抗原结合分子被分解消除为止期间可以完成的该循环的数量增加。本发明中，与抗原结合分子在低钙浓度条件下的抗原结合活性不低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合分子、或使低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的之前的抗原结合分子相比，循环数可以增大。因此，循环数是否增大可以通过前述“向细胞内的摄入得到促进”与否、或后述“血浆中滞留性得到改善”与否来进行判断。
血浆中滞留性的改善
本发明中“血浆中滞留性的改善”换而言之可以是“药代动力学的提高”、“药代动力学的改善”、“优异的药代动力学”、“血浆中滞留性的提高”、“优异的血浆中滞留性”或“延长血浆中滞留性”，这些用语在使用时含义相同。
本发明中“改善血浆中滞留性”不仅包括对人、小鼠、大鼠、猴、兔、狗等动物给予抗原结合分子后直至从血浆中消除为止(例如，直至在细胞内被分解等并且抗原结合分子无法返回血浆中的状态)的时间变长，也包括抗原结合分子在被给予后直至被分解消除为止期间以能够与抗原结合的状态(例如，抗原结合分子未与抗原结合的状态)滞留于血浆中的时间变长。即，也包括未与抗原结合的抗原结合分子(抗原非结合型抗原结合分子)被分解消除为止的时间变长。
即使抗原结合分子存在于血浆中，在该抗原结合分子已结合有抗原时，该抗原结合分子也无法与新的抗原结合。因此，抗原结合分子未与抗原结合的时间越长，则可以与新的抗原结合的时间越变长(可以与新的抗原结合的机会越变多)、可以减少抗原在机体内未与抗原结合分子结合的时间，可以延长抗原与抗原结合分子结合的时间。只要可通过给予抗原结合分子来加速抗原从血浆中消除，则抗原非结合型抗原结合分子的血浆中浓度增加，另外，抗原与抗原结合分子结合的时间变长。即，本发明中“抗原结合分子的血浆中滞留性的改善”包括：与低钙浓度条件下的抗原结合活性不低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原非结合型抗原结合分子、或使低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的之前的抗原非结合型抗原结合分子相比，本发明的抗原非结合型抗原结合分子的药代动力学参数均得到改善(血浆中半衰期的增加、平均血浆中滞留时间的增加、血浆中清除率的降低中的任一者)、或者在给予抗原结合分子后抗原与抗原结合分子结合的时间得到延长、或者基于抗原结合分子的抗原从血浆中的消除得到加速。
药代动力学参数是否得到改善可以通过测定抗原结合分子或抗原非结合型抗原结合分子的血浆中半衰期、平均血浆中滞留时间、血浆中清除率等中的任一参数(ファ一マコキネティクス演習にょる理解(南山堂))来进行判断。例如，对小鼠、大鼠、猴、兔、狗、人等给予了抗原结合分子时，测定抗原结合分子或抗原非结合型抗原结合分子的血浆中浓度，计算各参数，在血浆中半衰期变长或者平均血浆中滞留时间变长的情形等中，可以说抗原结合分子的血浆中滞留性得到了改善。这些参数可通过本领域技术人员公知的方法进行测定，例如，使用药代动力学分析软件WinNonlin(Pharsight)，按照附带的说明书进行Noncompartmental分析，由此可以进行适宜评价。抗原非结合型抗原结合分子的血浆中浓度的测定可通过本领域技术人员公知的方法实施，例如，可采用Clin Pharmacol.2008Apr；48(4)：406-17中的测定方法。
本发明中“改善血浆中滞留性”还包括在给予抗原结合分子后，抗原与抗原结合分子结合的时间得到延长。给予抗原结合分子后抗原与抗原结合分子结合的时间得到延长与否，可以测定抗原结合分子非结合型抗原(游离型抗原)的血浆中浓度、或相对于总抗原浓度的抗原结合分子非结合型抗原浓度(游离型抗原浓度)，由该浓度的比例出现上升为止的时间来进行判断。
本发明中“血浆中的抗原浓度”的测定，可通过使用本领域技术人员公知的方法测定抗原结合分子非结合型抗原的血浆中浓度、或相对于总抗原浓度的抗原结合分子非结合型抗原浓度的比例来实施，例如，可使用Pharm Res.2006Jan；23(1)：95-103中的测定方法。
另外，抗原在机体内显示某种功能时，抗原与中和抗原的功能的抗原结合分子(拮抗剂分子)结合与否也可以通过该抗原的功能是否被中和来进行评价。抗原的功能被中和与否也可以通过测定反映抗原的功能的某种机体内的标记物来进行评价。抗原是否与活化抗原的功能的抗原结合分子(激动剂分子)结合，可过测定反映抗原的功能的某种机体内的标记物来进行评价。
抗原结合分子非结合型抗原的血浆中浓度的测定、相对于总抗原浓度的抗原结合分子非结合型的抗原浓度的比例的测定、机体内标记物的测定等测定没有特别限定，优选在给予抗原结合分子起经过一定时间后进行。本发明中“给予抗原结合分子起经过一定时间后”没有特别限定，本领域技术人员可根据经给予的抗原结合分子的性质等适时决定，可举出例如：给予抗原结合分子起经过1天后、给予抗原结合分子起经过3天后、给予抗原结合分子起7天后、给予抗原结合分子起经过14天后、给予抗原结合分子起经过28天后等。
本发明中，优选人的血浆中滞留性改善。难以测定人的血浆中滞留性时，可以基于小鼠(例如、正常小鼠、人抗原表达转基因小鼠、人FcRn表达转基因小鼠、等)或猴(例如、食蟹猴等)的血浆中滞留性来预测人的血浆中滞留性。
在细胞外与抗原结合分子结合的抗原在细胞内从抗原结合分子解离
另外，本发明还可用作促进在细胞外与抗原结合分子结合的抗原在细胞内从抗原结合分子解离的方法。本发明中，抗原从抗原结合分子解离的位置只要是在细胞内则可以为任意位置，优选为早期内体内。本发明中，“在细胞外与抗原结合分子结合的抗原在细胞内从抗原结合分子解离”是指在细胞外与抗原结合分子结合并被摄入细胞内的抗原在细胞内不必完全从抗原结合分子解离，在细胞内从抗原结合分子解离的抗原的比例，与抗原结合分子的低钙浓度条件下的抗原结合活性不低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合分子、或使低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的之前的抗原结合分子相比，在细胞内从抗原结合分子解离的抗原的比例可以变得更高。另外，促进在细胞外与抗原结合分子结合的抗原在细胞内从抗原结合分子解离的方法也能说成是对抗原结合分子赋予下述性质的方法：促进与抗原结合的抗原结合分子向细胞内摄入、容易促进细胞内的抗原从抗原结合分子解离。
在与抗原结合的状态下被摄入细胞内的抗原结合分子的、在未与抗原结合的状态 下向细胞外的释放
另外，本发明还可用作促进在与抗原结合的状态下被摄入细胞内的抗原结合分子的、在未与抗原结合的状态下向细胞外的释放的方法。本发明中，“在与抗原结合的状态下被摄入细胞内的抗原结合分子的、在未与抗原结合的状态下向细胞外的释放”是指，在与抗原结合的状态下被摄入细胞内的抗原结合分子不必全部都以未与抗原结合的状态释放至细胞外，以未与抗原结合的状态释放至细胞外的抗原结合分子的比例，与抗原结合分子的低钙浓度条件下的抗原结合活性不低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合分子、或使低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的之前的抗原结合分子相比，释放至细胞外的抗原结合分子的比例可以变高。释放至细胞外的抗原结合分子优选维持着抗原结合活性。另外，促进在与抗原结合的状态下被摄入细胞内的抗原结合分子的以未与抗原结合的状态向细胞外释放的方法也可以说成是赋予抗原结合分子下述性质的方法：促进与抗原结合的抗原结合分子向细胞内摄入、容易促进抗原结合分子以未与抗原结合的状态向细胞外释放。
钙浓度的条件
本发明中，低钙浓度条件下通常意指离子化钙浓度为0.1μM～30μM。优选为0.5μM～10μM、特别优选为与机体内的早期内体内的离子化钙浓度接近的1μM～5μM。另外，本发明中，高钙浓度条件下通常意指离子化钙浓度为100μM～10mM、优选为200μM～5mM、特优选为与机体内的血浆中(血中)的离子化钙浓度接近的0.5mM～2.5mM。
因此，本发明中，“抗原结合分子的低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性”意指抗原结合分子在离子化钙浓度为0.1μM～30μM时的抗原结合活性比离子化钙浓度为100μM～10mM时的抗原结合活性弱。优选意指抗原结合分子在离子化钙浓度为0.5μM～10μM时的抗原结合活性弱于离子化钙浓度为200μM～5mM时的抗原结合活性，特别优选意指机体内的早期内体内的离子化钙浓度下的抗原结合活性弱于机体内的血浆中的离子化钙浓度下的抗原结合活性，具体地，意指抗原结合分子在离子化钙浓度为1μM～5μM时的抗原结合活性弱于离子化钙浓度为0.5mM～2.5mM时的抗原结合活性。
进而，在本发明中，“抗原结合分子的低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性”的表述也可以表述为抗原结合分子的高钙浓度条件下的抗原结合活性高于低钙浓度条件下的抗原结合活性。另外，“抗原结合分子的低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性”的表述中也包括：通过对抗原结合分子中的氨基酸序列进行改变等，使得抗原结合分子的低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性、或使抗原结合分子的高钙浓度条件下的抗原结合活性高于低钙浓度条件下的抗原结合活性的情形。即，本发明中，抗原结合分子的低钙浓度条件F的抗原结合活性和高钙浓度条件下的抗原结合活性之比可以变大。例如，如后所述，可举出使KD(Ca 3μM)/KD(Ca 2 mM)的值增大的方式。为了使抗原结合分子的低钙浓度条件下的抗原结合活性与高钙浓度条件下的抗原结合活性之比增大，例如，可以选择低钙浓度条件下的抗原结合活性低的抗原结合分子、或者通过对抗原结合分子中的氨基酸序列进行改变等来使低钙浓度条件下的抗原结合活性变低，也可以选择高钙浓度条件下的抗原结合活性高的抗原结合分子、或者通过对抗原结合分子中的氨基酸序列进行改变等来使高钙浓度条件下的抗原结合活性变高，或者可以为这两种方法。
应予说明，本发明中，有时也将“低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性”记载为“低钙浓度条件下的抗原结合能力弱于高钙浓度条件下的抗原结合能力”，另外，有时也将“使低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性”记载为“使低钙浓度条件下的抗原结合能力弱于高钙浓度条件下的抗原结合能力”。
FcRn
与属于免疫球蛋白超级家族的Fcγ受体不同，FcRn、特别是人FcRn在结构上与主要组织相容性复合体(MHC)I类的多肽结构类似，与I类的MHC分子具有22至29％的序列同一性(Ghetie等，Immunol.Today(1997)18(12)，592-598)。FcRn表达为异源二聚体，其由与可溶性β或轻链(β2微球蛋白)复合化而成的跨膜α或重链构成。如MHC那样，FcRn的α链包含3个细胞外结构域(α1、α2、α3)，短的细胞质结构域将蛋白质固定于细胞表面。α1和α2结构域与抗体的Fc区中的FcRn结合结构域相互作用(Raghavan等(Immunity(1994)1，303-315)。
FcRn在哺乳动物的母体胎盘或卵黄囊中表达，其参与IgG从母体向胎儿的转移。此外，表达有FcRn的啮齿类新生儿的小肠中，FcRn参与母体IgG从所摄取的初乳或乳中穿过刷状边缘上皮的移动。FcRn在大量种类的大量的其它组织、以及各种内皮细胞系中表达。其也在人成年血管内皮、肌肉血管系、和肝窦毛细血管中也有表达。FcRn被认为与IgG结合，将其再循环至血清中，由此起到维持IgG的血浆中浓度的作用。通常，FcRn对IgG分子的结合严格地为pH依赖性，最佳结合在小于7.0的pH酸性范围内观察到。
以含有序列编号：17所示信号序列的多肽作为前体的人FcRn在机体内(序列编号：18记载了含有信号序列的该多肽)形成与人β2-微球蛋白的复合体。与β2-微球蛋白形成复合体的可溶型人FcRn可利用通常的重组表达方法来制造。可以评价本发明的FcRn结合结构域对这种与β2-微球蛋白形成复合体的可溶型人FcRn的结合活性。本发明中，没有特别记载时，人FcRn是指可以与本发明的FcRn结合结构域结合的形态，作为实例，可举出人FcRn与人β2-微球蛋白的复合体。
FcRn结合结构域
本发明的抗原结合分子具有抗原结合结构域和人FcRn结合结构域。人FcRn结合结构域没有特别限定，只要抗原结合分子在酸性pH和/或中性pH下具有人FcRn结合活性，另外，也可以是直接或间接地具有对人FcRn的结合活性的结构域。作为这种结构域，可举出例如：直接地具有对人FcRn的结合活性的IgG型免疫球蛋白的Fc区、白蛋白、白蛋白domain3、抗人FcRn抗体、抗人FcRn肽、抗人FcRn Scaffold分子等、或间接地具有对人FcRn的结合活性的IgG或与白蛋白结合的分子等。本发明中，在pH酸性范围和pH中性范围下具有人FcRn结合活性的结构域是优选的。只要是在pH酸性范围和pH中性范围下已具有人FcRn结合活性的结构域，则该结构域可以直接使用。该结构域在pH酸性范围和/或pH中性范围下没有人FcRn结合活性或者该人FcRn结合活性弱时，可以对抗原结合分子中的氨基酸进行改变以获得人FcRn结合活性，优选对人FcRn结合结构域中的氨基酸进行改变以获得pH酸性范围和/或pH中性范围下的人FcRn结合活性。另外，也可以对在pH酸性范围和/或pH中性范围下已具有人FcRn结合活性的结构域中的氨基酸进行改变，以提高人FcRn结合活性。对于人FcRn结合结构域的氨基酸改变，可以通过对氨基酸改变前和改变后的pH酸性范围和/或pH中性范围下的人FcRn结合活性进行比较来寻找所期望的改变。
人FcRn结合结构域优选为直接与人FcRn结合的区域。作为人FcRn结合区域的优选实例，可举出抗体的Fc区。然而，能够与白蛋白或IgG等具有与人FcRn的结合活性的多肽结合的区域，可以通过白蛋白或IgG等而间接地与人FcRn结合。因此，本发明中的人FcRn结合区域也可以是与下述多肽结合的区域，该多肽具有与白蛋白或IgG的结合活性。特别是，人FcRn结合结构域在中性pH下的人FcRn结合活性越高越优选，可以预先选择中性pH下的人FcRn结合活性高的人FcRn结合结构域，也可以对抗原结合分子中的氨基酸进行改变以赋予中性pH下的人FcRn结合活性，或者也可以提高中性pH下的人FcRn结合活性。
本领域技术人员可以适宜选择测定对人FcRn的结合活性时的pH以外的条件，没有特别限定。例如，如WO2009/125825中记载所述，可以在MES缓冲液、37℃的条件下进行测定。另外，抗原结合分子的人FcRn结合活性的测定可通过本领域技术人员公知的方法来进行，例如，可以使用Biacore(GE Healthcare)等来进行测定。抗原结合分子与人FcRn的结合活性的测定可以通过以分析物形式向固定有抗原结合分子或人FcRn的芯片分别加载人FcRn或抗原结合分子来进行评价。
这里，酸性pH下的对人FcRn的结合活性意指pH4.0～pH6.5时的人FcRn结合活性。优选意指pH5.5～pH6.5时的人FcRn结合活性，特别优选意指与机体内的早期内体内pH接近的pH5.8～pH6.0时的人FcRn结合活性。另外，中性pH下的对人FcRn的结合活性意指pH6.7～pH10.0时的人FcRn结合活性。优选意指pH7.0～pH8.0时的人FcRn结合活性，特别优选意指与机体内的血浆中pH接近的pH7.4时的人FcRn结合活性。
对抗原结合分子中的氨基酸进行改变以赋予中性pH下的人FcRn结合活性、或提高中性pH下的人FcRn结合活性时，例如，在使用IgG型免疫球蛋白的Fc区作为人FcRn结合结构域的情形中，通过对人FcRn结合结构域的氨基酸进行改变，可以对抗原结合分子赋予中性pH下的人FcRn结合活性、或提高中性pH下的人FcRn结合活性。作为改变用的优选IgG型免疫球蛋白的Fc区，可举出例如：天然型IgG(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)的Fc区。其它对氨基酸的改变，只要可赋予中性pH下的人FcRn结合活性或提高人FcRn结合活性，则可以对任意位置的氨基酸进行改变。抗原结合分子含有人IgG1的Fc区作为人FcRn结合结构域时，优选包含下述改变，该改变使得中性pH下对人FcRn的结合强于人天然型IgG1。作为可实现这种改变的氨基酸，可举出例如：EU编号第221位～第225位、第227位、第228位、第230位、第232位、第233位～第241位、第243位～第252位、第254位～第260位、第262位～第272位、第274位、第276位、第278位～第289位、第291位～第312位、第315位～第320位、第324位、第325位、第327位～第339位、第341位、第343位、第345位、第360位、第362位、第370位、第375位～第378位、第380位、第382位、第385位～第387位、第389位、第396位、第414位、第416位、第423位、第424位、第426位～第438位、第440位和第442位位置的氨基酸。更具体地，可举出例如表1所述的氨基酸的改变。提高使用这些改变，可以赋予、或提高(增强)IgG型免疫球蛋白的Fc区在中性pH下对人FcRn的结合活性。另外，与人天然型IgG1相比可以增强pH酸性范围下对人FcRn的结合活性的改变的实例示于表2。这些改变中，可以适宜选择并在本发明中使用中性pH下也可以增强与人FcRn的结合的改变。
FcRn结合结构域的“氨基酸的改变”或“氨基酸改变”包含改变为与亲本FcRn结合结构域的氨基酸序列不同的氨基酸序列。只要亲本FcRn结合结构域的修饰改变体在pH中性范围可以与人FcRn结合，则任意FcRn结合结构域均可以用作亲本FcRn结合结构域。另外，将已经施加了改变的FcRn结合结构域作为亲本FcRn结合结构域而进一步施加改变而得的FcRn结合结构域也可以适宜地用作本发明的FcRn结合结构域。亲本FcRn结合结构域可以意指多肽本身、含有亲本FcRn结合结构域的组合物、或编码亲本FcRn结合结构域的多核苷酸序列。亲本FcRn结合结构域可以包含已在抗体一项中简介了的通过重组产生的公知的Fc区。亲本FcRn结合结构域的起源没有限定，可以由非人动物的任意生物或人获得。作为任意生物，优选可举出选自小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猫、兔、狗、山羊、绵羊、牛、马、骆驼、和非人灵长类中的生物。在其它实施方式中，亲本FcRn结合结构域还可以从食蟹猴、狨猴、恒河猴、黑猩猩、或人中获得。亲本FcRn结合结构域优选可由人IgG1获得，但并不限于IgG的特定种类。这意味着可以适宜使用人IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4的Fc区作为亲本FcRn结合结构域。同样地，本说明书中也意指可以将来源于前述任意生物的IgG的任意种类或亚型的Fc区优选用作亲本FcRn结合结构域。天然存在的IgG的变体或修饰型的实例记载于公知文献(Curr.Opin.Biotechnol.(2009)20(6)，685-91、Curr.Opin.Immunol.(2008)20(4)，460-470、Protein Eng.Des.Sel.(2010)23(4)，195-202、WO2009/086320、WO2008/092117、WO2007/041635、和WO2006/105338)中，但并不受其限定。
作为改变的实例，包含一个以上的突变，例如，被置换为与亲本FcRn结合结构域的氨基酸不同的氨基酸残基的突变、或对亲本FcRn结合结构域的氨基酸***一个以上的氨基酸残基或者亲本FcRn结合结构域的氨基酸中的一个以上氨基酸的缺失等。优选改变后的FcRn结合结构域的氨基酸序列中包含下述氨基酸序列，其含有非天然产生的FcRn结合结构域的至少一部分。这类变种必然与亲本FcRn结合结构域具有小于100％的序列同一性或类似性。在优选的实施方式中，变种具有与亲本FcRn结合结构域的氨基酸序列为约75％～小于100％的氨基酸序列同～性或类似性、更优选为约80％～小于100％、更优选为约85％～小于100％、更优选为约90％～小于100％、最优选为约95％～小于100％的同一性或类似性的氨基酸序列。本发明的一个非限定方式中，亲本FcRn结合结构域和本发明的经改变的FcRn结合结构域之间具有至少1个氨基酸的差异。亲本FcRn结合结构域与改变FcRn结合结构域的氨基酸的不同也可以通过特别是前述EU编号所指定的氨基酸残基的位置的所指定的氨基酸的不同而适宜地指定。
另外，与亲本人IgG相比可以增强pH酸性范围下与人FcRn的结合的改变的实例示于表2。这些改变中，可以适宜选择并在本发明中使用pH中性范围下也可以增强与人FcRn的结合的改变。另外，可以使Fv4-IgG1在酸性条件下与人FcRn的结合增强的改变的组合示于表6-1和6-2。作为特别优选的亲本人IgG的Fc区的改变氨基酸，可举出例如：EU编号第237位、第238位、第239位、第248位、第250位、第252位、第254位、第255位、第256位、第257位、第258位、第265位、第270位、第286位、第289位、第297位、第298位、第303位、第305位、第307位、第308位、第309位、第311位、第312位、第314位、第315位、第317位、第325位、第332位、第334位、第360位、第376位、第380位、第382位、第384位、第385位、第386位、第387位、第389位、第424位、第428位、第433位、第434位和436位的位置的氨基酸。
作为特别优选的改变，可举出例如：亲本IgG的Fc区的EU编号
第237位的Gly置换为Met的氨基酸置换、
第238位的Pro置换为Ala的氨基酸置换、
第239位的Ser置换为Lys的氨基酸置换、
第248位的Lys置换为Ile的氨基酸置换、
第250位的Thr置换为Ala、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp、或Tyr的氨基酸置换、
第252位的Met置换为Phe、Trp、或Tyr的氨基酸置换、
第254位的Ser置换为Thr的氨基酸置换、
第255位的Arg置换为Glu的氨基酸置换、
第256位的Thr置换为Asp、Glu、或Gln的氨基酸置换、
第257位的Pro置换为Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、或Val的氨基酸置换、
第258位的Glu置换为His的氨基酸置换、
第265位的Asp置换为Ala的氨基酸置换、
第270位的Asp置换为Phe的氨基酸置换、
第286位的Asn置换为Ala或Glu的氨基酸置换、
第289位的Thr置换为His的氨基酸置换、
第297位的Asn置换为Ala的氨基酸置换、
第298位的Ser置换为Gly的氨基酸置换、
第303位的Val置换为Ala的氨基酸置换、
第305位的Val置换为Ala的氨基酸置换、
第307位的Thr置换为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、或Tyr的氨基酸置换、
第308位的Val置换为Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、或Thr的氨基酸置换、
第309位的Leu或Val置换为Ala、Asp、Glu、Pro、或Arg的氨基酸置换、
第311位的Gln置换为Ala、His、或Ile的氨基酸置换、
第312位的Asp置换为Ala或His的氨基酸置换、
第314位的Leu置换为Lys或Arg的氨基酸置换、
第315位的Asn置换为Ala或His的氨基酸置换、
第317位的Lys置换为Ala的氨基酸置换、
第325位的Asn置换为Gly的氨基酸置换、
第332位的Ile置换为Val的氨基酸置换、
第334位的Lys置换为Leu的氨基酸置换、
第360位的Lys置换为His的氨基酸置换、
第376位的Asp置换为Ala的氨基酸置换、
第380位的Glu置换为Ala的氨基酸置换、
第382位的Glu置换为Ala的氨基酸置换、
第384位的Asn或Ser置换为Ala的氨基酸置换、
第385位的Gly置换为Asp或His的氨基酸置换、
第386位的Gln置换为Pro的氨基酸置换、
第387位的Pro置换为Glu的氨基酸置换、
第389位的Asn置换为Ala或Ser的氨基酸置换、
第424位的Ser置换为Ala的氨基酸置换、
第428位的Met置换为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr的氨基酸置换、
第433位的His置换为Lys的氨基酸置换、
第434位的Asn置换为Ala、Phe、His、Ser、Trp、或Tyr的氨基酸置换、和
第436位的Tyr或Phe置换为His的氨基酸置换。
改变的氨基酸的数目没有特别限定，可以仅改变1处氨基酸，也可以改变2处以上的氨基酸。作为2处以上的氨基酸改变的组合，可举出例如表3所述的组合。另外，与亲本人IgG相比可以增强pH酸性范围下与人FcRn的结合的改变的组合示于表4-1～4-5。这些改变中，可以适宜选择并在本发明中使用pH中性范围也可以增强与人FcRn的结合的改变的组合。进而，可以使Fv4-IgG1在中性条件下与人FcRn的结合增强的改变的组合示于表5-1和5-2。
通过将选自这些氨基酸中的至少1个氨基酸置换为其它氨基酸，可以提高抗原结合分子在pH中性范围下的人FcRn结合活性。
[表1]
[表2]
[表3]
[表4-1]
表4-2是表4-1的续表。
[表4-2]
表4-3是表4-2的续表。
[表4-3]
表4-4是表4-3的续表。
[表4-4]
表4-5是表4-4的续表。
[表4-5]
[表5-1]
表5-2是表5-1的续表。
[表5-2]
[表6-1]
表6-2是表6-1的续表。
[表6-2]
对于这些氨基酸改变，可以使用公知技术适宜实施，例如Drug MetabDispos.2007 Jan；35(1)：86-94、Int Immunol.2006 Dec；18(12)：1759-69、J BiolChem.2001 Mar 2；276(9)：6591-604、J Biol Chem.2007；282(3)：1709-17、JImmunol.2002；169(9)：5171-80、J Immunol.2009；182(12)：7663-71、Molecular Cell，Vol.7，867-877，April，2001、Nat Biotechnol.1997 Jul；15(7)：637-40、NatBiotechnol.2005 Oct；23(10)：1283-8、Proc Natl Acad Sci U S A.2006 Dec 5；103(49)：18709-14、EP2154157、US20070141052、WO2000/042072、WO2002/060919、WO2006/020114、WO2006/031370、WO2010/033279、WO2006/053301、WO2009/086320中，进行了人天然型IgG1的Fc区的改变。
根据The Journal of Immunology，2009 182：7663-7671，pH酸性范围(pH6.0)下人天然型IgG1的人FcRn结合活性为KD 1.7μM，pH中性范围下人天然型IgG1基本检测不到人FcRn结合活性。所以，作为可用于本发明方法中的抗原结合分子的优选方式，可举出pH酸性范围下的人FcRn结合活性为KD 20μM以下、并且pH中性范围下的人FcRn结合活性为人天然型IgG1以上的抗原结合分子。作为更优选的方式，可举出pH酸性范围下的人FcRn结合活性为KD 2.0μM以下、并且pH中性范围下的人FcRn结合活性为KD 40μM以下的抗原结合分子。作为进一步优选的方式，可举出pH酸性范围下的人FcRn结合活性为KD 0.5μM以下、并且pH中性范围下的人FcRn结合活性为KD 15μM以下的抗原结合分子。即、优选使抗原结合分子在酸性pH条件下的抗原结合活性低于中性pH条件下的抗原结合活性。应予说明，这里示出的KD值是通过The Journal of Immunology，2009 182：7663-7671中记载的方法(将抗原结合分子固定于芯片，以分析物形式加载人FcRn)进行测定时的值。
作为人FcRn结合活性的值，可以使用KD(解离常数)，人天然型IgG1的人FcRn结合活性在pH中性范围(pH7.4)下基本不能观察到，因而难以以KD形式算出。作为pH7.4时的人FcRn结合活性是否高于人天然型IgG1的判断方法，可举出通过在Biacore中以相同浓度加载分析物时的结合响应的大小来进行判断的方法。即、与将人FcRn在pH7.4下加载于固定有人天然型IgG1的芯片时的响应相比，将人FcRn在pH7.4下加载于固定有抗原结合分子的芯片时的响应越大，则可以判断该抗原结合分子在pH7.4时的人FcRn结合活性高于人天然型IgG1。
另外，也可以将pH7.0作为pH中性范围使用。通过使用作为中性pH的pH7.0，可以促进人FcRn与FcRn结合结构域的弱的相互作用。作为测定条件中所使用的温度，可以在10℃～50℃的任意温度下对结合亲和性进行评价。为了确定人FcRn结合结构域与人FcRn的结合亲和性，优选使用15℃～40℃的温度。更优选地，为了确定人FcRn结合结构域与人FcRn的结合亲和性，同样使用如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、和35℃中的任一温度的20℃至35℃的任意温度。实施例5所述的25℃的温度是本发明实施方式涉及的一例。在优选的实施方式中，人FcRn与FcRn结合结构域的相互作用如实施例5所述可以在pH7.0和25℃下进行测定。抗原结合分子对人FcRn的结合亲和性如实施例3所述可通过Biacore进行测定。
在更优选的实施方式中，本发明的抗原结合分子在pH7.0和25℃下具有高于天然型人IgG的人FcRn结合活性。在更优选的实施方式中，pH7.0和25℃时的人FcRn结合活性比天然型人IgG高28倍、或比KD 3.2μM强。在更优选的实施方式中，pH7.0和25℃时的人FcRn结合活性比天然型人IgG高38倍、或比KD 2.3μM强。
天然型人IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4可优选用作天然型人IgG，在人FcRn结合活性或机体内的结合活性方面用于与抗原结合分子进行比较的参照天然型人IgG用途。优选地，可适宜使用参照抗原结合分子，其含有与目标抗原结合分子相同的抗原结合结构域以及作为人FcRn结合结构域的天然型人IgG Fc区。更优选地，天然型人IgG1可在人FcRn结合活性或机体内的结合活性方面用于与抗原结合分子进行比较的参照天然型人IgG用途。
更具体地，对本发明所述的对血浆中的抗原消除活性具有长期效果的抗原结合分子在pH7.0和25℃下，与天然型人IgG1相比具有28倍～440倍高的范围的FcRn结合活性，或者具有KD为3.0μM至0.2μM范围的FcRn结合活性。为了评价本发明的抗原结合分子对血浆中的抗原消除活性的长期效果，长期的血浆中抗原浓度通过在给予抗原结合分子2天后、4天后、7天后、14天后、28天后、56日后、或84天后对血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度和抗原/抗原结合分子摩尔比进行测定来确定。血浆中抗原浓度或抗原/抗原结合分子摩尔比的减少是否由本发明所述的抗原结合分子实现可通过在之前所述的1个或多个任意时刻对减少进行评价来确定。
更具体地，对本发明所述的血浆中的抗原消除活性具有短期效果的抗原结合分子在pH7.0和25℃下，与天然型人IgG相比具有440倍高的人FcRn结合活性、或者具有KD强于0.2μM的FcRn结合活性。为了评价本发明的抗原结合分子对血浆中的抗原消除活性的短期效果，短期的血浆中抗原浓度通过在给予抗原结合分子15分钟后、1小时后、2小时后、4小时后、8小时后、12小时后、或24小时后对血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度和抗原/抗原结合分子摩尔比进行测定来确定。
本发明的方法可应用于任意抗原结合分子而无论靶抗原的种类如何。
例如，抗原结合分子为与膜抗原结合的抗体时，给予至机体内的抗体与抗原结合，然后抗体在与抗原结合的状态下与抗原一起通过内化而被摄入细胞内的内体中。然后，抗体在与抗原结合的状态下转移至溶酶体，抗体与抗原一起被溶酶体分解。内化介导的血浆中的消除被称为抗原依赖性消除，在多数抗体分子中有报道(Drug Discov Today.2006Jan；11(1-2)：81-8)。1分子的IgG抗体以2价的形式与抗原结合时，1分子的抗体在与2分子抗原结合的状态下被内化，并直接在溶酶体中分解。因此，为通常的抗体时，1分子的IgG抗体无法与3分子以上的抗原结合。例如，在具有中和活性的1分子IgG抗体的情形中，无法中和3分子以上的抗原。
IgG分子的血浆中滞留性较长(消除缓慢)的原因在人FcRn的作用，所述人FcRn已知为IgG分子的补救受体(salvage receptor)。通过胞饮作用摄入内体的IgG分子在内体内的酸性条件下与在内体内表达的人FcRn结合。无法与人FcRn结合的IgG分子会进入溶酶体，并在此处被分解，而与人FcRn结合的IgG分子则转移至细胞表面，在血浆中的中性条件下下从人FcRn解离，由此再次返回到血浆中。
另外，抗原结合分子为与可溶型抗原结合的抗体时，给予至机体内的抗体与抗原结合，然后抗体在与抗原结合的状态下被摄入细胞内。被摄入细胞内的抗体多数通过FcRn释放到细胞外，但此时由于是以与抗原结合的状态释放到细胞外，因而无法再次与抗原结合。所以，和与膜抗原结合的抗体一样，在通常的抗体的情形中，1分子的IgG抗体无法与3分子以上的抗原结合。
在血浆中的高钙浓度条件下与抗原强结合、在内体内的低钙浓度条件下从抗原解离的钙浓度依赖性抗原结合抗体可以在内体内从抗原解离。对于钙浓度依赖性抗原结合抗体，若在解离抗原后抗体通过FcRn被再循环至血浆中，则可以再次与抗原结合，因而可以用1个抗体与多个抗原重复结合。另外，与抗原结合分子结合的抗原通过在内体内解离而无法再循环至血浆中，因而可以促进基于抗原结合分子的抗原向细胞内的摄入，促进通过给予抗原结合分子的来消除抗原，使血浆中的抗原浓度降低。
抗原结合分子
本发明提供抗原结合分子，其是具有抗原结合结构域和人FcRn结合结构域的抗原结合分子，其在2个不同钙浓度条件下的抗原结合活性不同，抗原结合分子的低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性。
本发明中的抗原结合分子只要具有下述抗原结合结构域则没有特别限定，该抗原结合结构域具有针对靶抗原的特异性结合活性。作为抗原结合结构域的优选实例，可举出具有抗体的抗原结合区的结构域。作为抗体的抗原结合区的实例，可举出CDR和可变区。抗体的抗原结合区为CDR时，可以含有全长抗体中所含的6个CDR全部，也可以含有1个或2个以上的CDR。含有CDR作为抗体的结合区时，所含的CDR可进行氨基酸的缺失、置换、添加和/或***等，或者可以是CDR的一部分。
另外，作为本发明方法作为对象的抗原结合分子，可举出：具有拮抗剂活性的抗原结合分子(拮抗剂抗原结合分子)、具有激动剂活性的抗原结合分子(激动剂抗原结合分子)、具有细胞毒性的分子等，作为优选方式，可举出：拮抗剂抗原结合分子、特别是受体和细胞因子等识别抗原的拮抗剂抗原结合分子。
本发明中作为对象的抗原结合分子没有特别限定，可以是任意抗原结合分子。本发明中使用的抗原结合分子优选具有抗原结合活性(抗原结合结构域)和人FcRn结合结构域。本发明中，特别优选含有与人FcRn的结合结构域的抗原结合分子。
作为具有抗原结合结构域和人FcRn结合结构域的抗原结合分子的实例，可举出抗体。作为本发明抗体的优选实例，可举出IgG抗体。使用IgG抗体作为抗体时，其种类没有限定，可以使用IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等同种型(亚类)的IgG。另外，本发明的抗原结合分子中可以含有抗体的恒定区，恒定区部分可以导入氨基酸突变。导入的氨基酸突变可举出例如使对Fcγ受体的结合增大或降低的突变(Proc Natl Acad Sci U S A.2006 Mar 14；103(11)：4005-10.)等，但并不限定于此。另外，通过选择IgG2等适当的恒定区，也可以改变pH依赖性的结合。
本发明作为对象的抗原结合分子为抗体时，抗体可以是小鼠抗体、人抗体、大鼠抗体、兔抗体、山羊抗体、骆驼抗体等来源于任意动物的抗体。进而，还可以为例如嵌合抗体、尤其是对人源化抗体等的氨基酸序列进行了置换的改变抗体。另外，还可以是双特异性抗体、结合各种分子的抗体修饰物、含有抗体片段的多肽等。
“嵌合抗体”是指组合来源于不同动物的序列制作的抗体。作为嵌合抗体的具体实例，可举出例如：包含小鼠抗体的重链、轻链的可变(V)区域和人抗体的重链、轻链的恒定(C)区域的抗体。
“人源化抗体”也称为重构(reshaped)人抗体，是将来源于人以外的哺乳动物的抗体、例如小鼠抗体的互补决定区(CDR；complementarity determining region)移植到人抗体的CDR而成的抗体。用于鉴定CDR的方法是公知的(Kabat et al.，Sequence of Proteinsof Immunological Interest(1987)，National Institute of Health，Bethesda，Md.；Chothia et al.，Nature(1989)342：877)。另外，其通常的基因重组方法也是公知的(参照欧州专利申请公开编号EP 125023号公报、WO 96/02576号公报)。
双特异性抗体是指：在同一抗体分子内具有识别不同表位的可变区的抗体。双特异性抗体可以是识别2个以上不同抗原的抗体、也可以是识别同一抗原上不同的2个以上表位的抗体。
另外，作为含有抗体片段的多肽，可举出例如：Fab片段、F(ab′)2片段、scFv(NatBiotechnol.2005 Sep；23(9)：1126-36.)结构域抗体(dAb)(WO2004/058821，WO2003/002609)、scFv-Fc(WO2005/037989)、dAb-Fc、Fc融合蛋白等。含有Fc区的分子可以将Fc区用作人FcRn结合结构域。另外，也可以在这些分子中融合人FcRn结合结构域。
进而，本发明可使用的抗原结合分子可以是抗体样分子。抗体样分子(scaffold分子、肽分子)是指通过与靶分子结合而发挥功能的分子(Current Opinion inBiotechnology 2006，17：653-658、Current Opinion in Biotechnology 2007，18：1-10、Current Opinion in Structural Biology 1997，7：463-469、Protein Science 2006，15：14-27)，可举出例如：DARPins(WO2002/020565)、Affibody(WO1995/001937)、Avimer(WO2004/044011，WO2005/040229)、Adnectin(WO2002/032925)等。即使是这些抗体样分子，也可以与靶分子钙浓度依赖性地结合，从而促进基于抗原结合分子的抗原向细胞内的摄入、促进通过给予抗原结合分子来减少血浆中抗原浓度、改善抗原结合分子的血浆中滞留性、增加1个抗原结合分子对抗原的结合次数。
另外，抗原结合分子可以是与靶结合的受体蛋白中融合了人FcRn结合结构域而成的蛋白，可举出例如：TNFR-Fc融合蛋白、IL1R-Fc融合蛋白、VEGFR-Fc融合蛋白、CTLA4-Fc融合蛋白等(Nat Med.2003 Jan；9(1)：47-52、BioDrugs.2006；20(3)：151-60.)。这些受体人FcRn结合结构域融合蛋白也可以与靶分子钙浓度依赖性地结合，从而促进基于抗原结合分子的抗原向细胞内的摄入、促进通过给予抗原结合分子来减少血浆中抗原浓度、改善抗原结合分子的血浆中滞留性、增加1个抗原结合分子对抗原的结合次数。
另外，抗原结合分子可以是与靶结合并具有中和效果的人工配体蛋白与人FcRn结合结构域的融合蛋白，可举出例如：作为人工配体蛋白的突变IL-6(EMBO J.1994 Dec 15；13(24)：5863-70.)等。这些人工配体融合蛋白也可以与靶分子钙浓度依赖性地结合，从而促进基于抗原结合分子的抗原向细胞内的摄入、促进通过给予抗原结合分子来减少血浆中抗原浓度、改善抗原结合分子的血浆中滞留性、增加1个抗原结合分子对抗原的结合次数。
进而，本发明的抗体中糖链可以被改变。作为糖链被改变的抗体的实例，可举出例如：糖基化修饰的抗体(WO99/54342等)、糖链添加的岩藻糖缺失的抗体(WO00/61739、WO02/31140、WO2006/067847、WO2006/067913等)、具有平分型GlcNAc的糖链的抗体(WO02/79255等)等。
本领域技术人员可以适宜选择测定对抗原的结合活性时的离子化钙浓度以外的条件，没有特别限定。例如，可以在HEPES缓冲液、37℃的条件下进行测定。例如，可以使用Biacore(GE Healthcare)等进行测定。对于抗原结合分子和抗原的结合活性的测定，在抗原为可溶型抗原时，通过对固定有抗原结合分子的芯片加载作为分析物的抗原，由此可以评价对可溶型抗原的结合活性，在抗原为膜型抗原时，通过对固定有抗原的芯片加载作为分析物的抗原结合分子，由此可以评价对膜型抗原的结合活性。
本发明的抗原结合分子中，只要低钙浓度条件下的抗原结合活性弱于高钙浓度条件下的抗原结合活性，则低钙浓度条件下的抗原结合活性和高钙浓度条件下的抗原结合活性之比没有特别限定，优选相对于抗原的低钙浓度条件下的KD(Dissociation constant：解离常数)和高钙浓度条件下的KD之比KD(Ca 3μM)/KD(Ca 2mM)的值为2以上、进一步优选KD(Ca 3μM)/KD(Ca 2mM)的值为10以上、进一步优选KD(Ca 3μM)/KD(Ca 2mM)的值为40以上。KD(Ca 3μM)/KD(Ca 2mM)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术可以制作，则可以是400、1000、10000等任意的值。
作为抗原结合活性的值，在抗原为可溶型抗原时可以使用KD(解离常数)，而在抗原为膜型抗原时可以使用表观KD(Apparent dissociation constant：表观解离常数)。KD(解离常数)、和表观KD(表观解离常数)可通过本领域技术人员公知的方法进行测定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、斯卡查德图(Scatchard plot)、流式细胞仪等。
另外，本发明的抗原结合分子中，作为示出低钙浓度条件下的抗原结合活性和高钙浓度条件下的抗原结合活性之比的其它指标，还可以使用例如解离速度常数kd(Dissociation rate constant：解离速度常数)。代替KD(解离常数)而使用kd(解离速度常数)来作为示出结合活性之比的指标时，相对于抗原的低钙浓度条件下的kd(解离速度常数)与高钙浓度条件下的kd(解离速度常数)之比kd(低钙浓度条件下)/kd(高钙浓度条件下)的值优选为2以上、进一步优选为5以上、进一步优选为10以上、更优选为30以上。kd(低钙浓度条件下)/kd(高钙浓度条件下)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术常识可以制作，则可以为50、100、200等任意的值。
作为抗原结合活性的值，在抗原为可溶型抗原时可以使用kd(解离速度常数)，在抗原为膜型抗原时可以使用表观kd(Apparent dissociation rate constant：表观解离速度常数)。kd(解离速度常数)、和表观kd(表观解离速度常数)可通过本领域技术人员公知的方法进行测定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、流式细胞仪等。
应予说明，本发明中，在测定不同钙浓度下的抗原结合分子的抗原结合活性时，钙浓度以外的条件优选为相同。
为了获得低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合分子，使抗原结合分子的低钙浓度条件下的抗原结合活性低于(弱于)高钙浓度条件下的抗原结合活性的方法(赋予钙浓度依赖性抗原结合活性的方法)没有特别限定。低钙浓度条件下的抗原结合活性低于(弱于)高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合分子(显示钙浓度依赖性结合的抗原结合分子)可通过例如，以如上所述的对抗原的钙浓度依赖性结合作为指标，从体外展示的抗体文库中进行筛选，由此直接获得。
作为这以外的方法，可举出直接获得具有这种性质的抗原结合分子的方法。例如，用抗原免疫动物(小鼠、大鼠、仓鼠、兔、人免疫球蛋白转基因小鼠、人免疫球蛋白转基因大鼠、人免疫球蛋白转基因兔、美洲驼、骆驼等)而得到抗体，以对抗原的钙浓度依赖性结合作为指标对该抗体进行筛选，可以直接获得具有目标性质的抗体。另外，也可以向抗原结合分子中的氨基酸序列导入随机的突变，按照上述方法测定不同钙浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性，与改变前的抗原结合分子进行比较，选择低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合分子。
通过上述方法等使抗原结合分子的低钙浓度条件下的抗原结合活性低于(弱于)高钙浓度条件下的抗原结合活性(使KD(低钙浓度条件下)/KD(高钙浓度条件下)的值增大)时，没有特别限定，与原本的抗体相比，KD(低钙浓度条件下)/KD(高钙浓度条件下)的值通常为2倍以上、优选为5倍以上、进一步优选为10倍以上。
进而，通过将赋予本发明的钙浓度依赖性抗原结合活性的方法与使用具有中性pH下的人FcRn结合活性的抗原结合分子的方法、或赋予或提高中性pH下的人FcRn结合活性的方法组合，可以增强：促进抗原向细胞内摄入的功能、增加1分子的抗原结合分子对抗原的结合次数的功能、基于给予抗原结合分子的促进血浆中抗原浓度的减少的功能、或改善抗原结合分子的血浆中滞留性的功能。作为赋予或提高中性pH下的人FcRn结合活性的方法，可举出例如改变上述人FcRn结合结构域的氨基酸的方法。这里，“中性pH下的人FcRn结合活性”意指pH6.7～pH10.0时对人FcRn的结合活性，作为优选的人FcRn结合活性，可举出pH7.0～pH8.0之间的人FcRn结合活性，作为更优选的人FcRn结合活性，可举出pH7.4时的人FcRn结合活性。
进一步地，通过将赋予本发明的钙浓度依赖性抗原结合活性的方法与使用具有pH依赖性抗原结合活性的抗原结合分子的方法、或赋予pH依赖性抗原结合活性的方法组合，也可以增强：促进抗原向细胞内摄入的功能、增加1分子的抗原结合分子对抗原的结合次数的功能、基于给予抗原结合分子的促进血浆中抗原浓度的减少的功能、或改善抗原结合分子的血浆中滞留性的功能。作为赋予pH依赖性抗原结合活性的方法，可举出例如WO2009/125825中记载的方法。
具体地，例如，可以将本发明的钙浓度依赖性抗原结合分子、与使抗原结合分子的酸性pH下的抗原结合活性低于(弱于)中性pH下的抗原结合活性的方法组合使用。这里，“使酸性pH下的抗原结合活性低于(弱于)中性pH下的抗原结合活性”意指使抗原结合分子的pH4.0～pH6.5时的抗原结合活性弱于pH6.7～pH10.0时的抗原结合活性。优选意指使抗原结合分子的pH5.5～pH6.5时的抗原结合活性弱于pH7.0～pH8.0时的抗原结合活性，特别优选意指使抗原结合分子的pH5.8时的抗原结合活性弱于pH7.4时的抗原结合活性。本发明中，酸性pH通常是指pH4.0～pH6.5、优选pH5.5～pH6.5、特别优选pH5.8。另外，本发明中，中性pH通常是指pH6.7～pH10.0、优选pH7.0～pH8.0、特别优选pH7.4。
另外，使抗原结合分子的“酸性pH下的结合活性低于中性pH下的抗原结合活性”也可以表述为使抗原结合分子的中性时的抗原结合活性高于酸性pH下的抗原结合活性。即，本发明中，抗原结合分子的酸性pH下的抗原结合活性和中性pH下的抗原结合活性之差可以增大(例如，如后所述可以增大KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值)。为了增大抗原结合分子的酸性pH下的抗原结合活性与中性pH下的抗原结合活性之差，例如，可以降低酸性pH下的抗原结合活性，也可以增高中性pH下的抗原结合活性，或者可以进行这两者。
本发明中，只要酸性pH下的抗原结合活性弱于中性pH下的抗原结合活性，则酸性pH下的抗原结合活性与中性pH下的抗原结合活性之差没有特别限定，优选相对于抗原的pH5.8时的KD与pH7.4时的KD(Dissociation constant：解离常数)之比KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值为2以上、进一步优选KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值为10以上、进一步优选KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值为40以上。KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术可以制作，则可以为400、1000、10000等任意的值。
另外，作为示出酸性pH下的抗原结合活性和中性pH下的抗原结合活性之差的其它指标，也可以使用例如解离速度常数kd(Dissociation rate constant：解离速度常数)。代替KD(解离常数)而使用kd(解离速度常数)来作为示出结合活性之差的指标时，相对于抗原的pH5.8时的kd(解离速度常数)与pH7.4时的kd(解离速度常数)之比kd(pH5.8)/kd(pH7.4)的值优选为2以上、进一步优选为5以上、进一步优选为10以上、更优选为30以上。kd(pH5.8)/kd(pH7.4)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术常识可以制作，则可以为50、100、200等任意的值。
赋予pH依赖性抗原结合活性的方法没有特别限定，可举出例如：通过将抗原结合分子中的至少1个氨基酸置换为组氨酸、或者在抗原结合分子中***至少1个组氨酸而使pH5.8时的抗原结合活性弱于pH7.4时的抗原结合活性的方法。通过用组氨酸置换抗体中的氨基酸可以对抗体赋予pH依赖性的抗原结合活性是已知的(FEBS Letter，309(1)，85-88，(1992))。本发明中，对抗原结合分子导入(进行)组氨酸突变(置换)或***的位置没有特别限定，只要与突变或***前相比使pH5.8时的抗原结合活性弱于pH7.4时的抗原结合活性(KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值增大)，则可以为任意位点。例如，抗原结合分子为抗体时，可举出抗体的可变区等。导入(进行)组氨酸突变或***的数目可以由本领域技术人员适宜决定，可以仅将1处用组氨酸置换、或者可以仅在1处***组氨酸、也可以将2处以上的多个位置用组氨酸置换、或者也可以在2处以上的多个位置***组氨酸。另外，也可以同时导入组氨酸突变以外的突变(对组氨酸以外的氨基酸的突变)。进而还可以同时进行组氨酸突变和组氨酸***。组氨酸的置换或组氨酸的***可以通过组氨酸扫描等方法随机地进行，该方法是将本领域技术人员公知的丙氨酸扫描中的丙氨酸替换为组氨酸而成的方法，可以从随机地导入了组氨酸突变或***的抗原结合分子文库之中，选择与突变前相比KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值增大的抗原结合分子。
相对于抗原结合分子，将至少1个氨基酸置换为组氨酸、或者在抗原结合分子氨基酸中***至少1个组氨酸时，没有特别限定，优选组氨酸置换或***后的抗原结合分子的pH7.4时的抗原结合活性与组氨酸置换或***前的抗原结合分子的pH7.4时的抗原结合活性等同。这里，组氨酸置换或***后的抗原结合分子的pH7.4时的抗原结合活性与组氨酸置换或***前的抗原结合分子的pH7.4时的抗原结合活性等同是指，组氨酸置换或***后的抗原结合分子维持组氨酸置换或***前的抗原结合分子所具有的抗原结合活性的10％以上、优选50％以上、进一步优选80％以上、更优选90％以上。组氨酸置换或***而使抗原结合分子的抗原结合活性降低时，可以通过抗原结合分子中的1个或多个氨基酸的置换、缺失、添加和/或***等使抗原结合活性与组氨酸置换或***前的抗原结合活性等同。本发明中，也包含这种在组氨酸置换或***后通过进行1个或多个氨基酸的置换、缺失、添加和/或***而使结合活性变得等同的抗原结合分子。
另外，作为使抗原结合分子的pH5.8时的抗原结合活性弱于pH7.4时的抗原结合活性的其它方法，可举出：将抗原结合分子中的氨基酸置换为非天然型氨基酸的方法、或者在抗原结合分子中的氨基酸中***非天然型氨基酸的方法。已知非天然氨基酸可以人工地控制pKa(Angew.Chem.Int.Ed.2005，44，34、Chem Soc Rev.2004Sep 10；33(7)：422-30.、Amino Acids.1999；16(3-4)：345-79.)。因此，本发明中还可以代替上述组氨酸而使用非天然型氨基酸。另外，上述的组氨酸置换和/或***、与非天然型氨基酸的置换和/或***可以同时进行。本发明中使用的非天然型氨基酸可以是任意的非天然型氨基酸，可以使用本领域技术人员公知的非天然型氨基酸等。
进而，在抗原结合分子是含有抗体恒定区的物质时，作为使抗原结合分子的pH5.8时的抗原结合活性弱于pH7.4时的抗原结合活性的其它方法，可举出对抗原结合分子中所含的抗体恒定区进行改变的方法。作为这种抗体恒定区的改变的具体例，可举出例如WO2009/125825中记载的置换恒定区的方法。
另外，作为抗体恒定区的改变方法，可举出例如，研究多种恒定区的同种型(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、选择pH5.8时的抗原结合活性降低(pH5.8时的解离速度变快)的同种型的方法。进而，还可举出在野生型同种型的氨基酸序列(野生型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4氨基酸序列)中导入氨基酸置换，使pH5.8时的抗原结合活性降低(pH5.8时的解离速度加快)的方法。根据同种型(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)的不同，抗体恒定区的铰链区序列大不相同，铰链区氨基酸序列的不同对抗原结合活性造成严重影响，因而通过根据抗原或表位的种类选择适合的同种型，可以选择pH5.8时的抗原结合活性降低(pH5.8时的解离速度变快)的同种型。另外，铰链区氨基酸序列的不同对抗原结合活性造成严重影响，因而作为野生型同种型的氨基酸序列的氨基酸置换位置，认为理想的是铰链区。
通过上述方法等使抗原结合物质的pH5.8时的抗原结合活性弱于pH7.4时的抗原结合活性(使KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值变大)时，虽没有特别限定，但优选与原本的抗体相比，KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值通常为2倍以上、优选为5倍以上、进一步优选为10倍以上。
抗原结合分子
进而，本发明提供2个不同钙浓度条件下的抗原结合活性不同、且低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合分子。本发明优选提供离子化钙浓度0.1μM～30μM的低钙浓度条件下的抗原结合活性低于离子化钙浓度100μM～10mM的高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合分子。更具体地，可举出：机体内的早期内体内的离子化钙浓度(低钙浓度、例如1μM～5μM)下的抗原结合活性低于机体内的血浆中的离子化钙浓度(高钙浓度、例如0.5mM～2.5mM)下的抗原结合活性的抗原结合分子。
本发明的低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合分子，只要低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性，则其结合活性之差没有限定，低钙浓度条件下的抗原结合活性可以只低一点点。
作为本发明的低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合分子的优选方式，低钙浓度条件下的KD与高钙浓度条件下的KD之比KD(低Ca)/KD(高Ca)的值为2以上、进一步优选KD(低Ca)/KD(高Ca)的值为10以上、进一步优选KD(低Ca)/KD(高Ca)的值为40以上。KD(低Ca)/KD(高Ca)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术可以制作，则可以为400、1000、10000等任意的值。
进而，作为本发明的低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合分子的其它优选方式，相对于抗原的低钙浓度条件下的kd与pH7.4时的kd之比kd(低Ca)/kd(高Ca)的值为2以上、进一步优选kd(低Ca)/kd(高Ca)的值为5以上、进一步优选kd(低Ca)/kd(高Ca)的值为10以上、进一步优选kd(低Ca)/kd(高Ca)的值为30以上。kd(低Ca)/kd(高Ca)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术可以制作，则可以是50、100、200等任意的值。
进而，本发明的抗原结合分子还可以具有上述中性pH条件下的人FcRn结合活性。通过将该中性pH条件下的人FcRn结合活性、与钙浓度依赖性抗原结合活性组合，可以增强：促进抗原向细胞内摄入的功能、增加1分子的抗原结合分子对抗原的结合次数的功能、基于给予抗原结合分子的促进血浆中抗原浓度减少的功能、或改善抗原结合分子的血浆中滞留性的功能。
进一步地，本发明的抗原结合分子还可以具有上述pH依赖性的抗原结合活性、即酸性pH条件下的抗原结合活性低于中性pH条件下的抗原结合活性的抗原结合活性。通过将该pH依赖性的抗原结合活性、与钙浓度依赖性的抗原结合活性组合，可以增强：促进抗原向细胞内摄入的功能、增加1分子的抗原结合分子对抗原的结合次数的功能、基于给予抗原结合分子的促进血浆中抗原浓度减少的功能、或改善抗原结合分子的血浆中滞留性的功能。
另外，本发明的抗原结合分子只要低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性，则也可以具有其它任意的性质，例如可以是激动剂抗原结合分子或拮抗剂抗原结合分子等。作为本发明的优选的抗原结合分子的实例，可举出拮抗剂抗原结合分子。拮抗剂抗原结合分子通常是抑制配体(激动剂)与受体的结合、抑制受体介导的向细胞内的信号传导的抗原结合分子。
另外，被赋予了pH依赖性抗原结合活性的抗原结合分子中，可以将至少1个氨基酸用组氨酸置换、或者可以***至少1个组氨酸。
另外，本发明的抗原结合分子所结合的抗原没有特别限定，可以与任意抗原结合。例如，可举出受体蛋白(膜结合型受体、可溶型受体)和细胞表面标记物等膜抗原、细胞因子等可溶型抗原等。其它抗原的具体例如上所述。
筛选方法
本发明提供抗原结合分子的低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合分子的筛选方法。另外，提供具有选自下述中的至少1种功能的抗原结合分子的筛选方法，
(i)促进抗原向细胞内摄入的功能、
(ii)与抗原结合2次以上的功能、
(iii)促进血浆中的抗原浓度的减少的功能、和
(iv)优异的血浆中滞留性功能。
具体地，本发明提供包括以下步骤(a)～(c)的抗原结合分子的筛选方法；
(a)获得低钙浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性的步骤、
(b)获得高钙浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性的步骤、
(c)选择低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合分子的步骤。
进而本发明还提供包括以下步骤(a)～(c)的抗原结合分子的筛选方法；
(a)在高钙浓度条件下使抗原结合分子或抗原结合分子文库与抗原接触的步骤、
(b)将在前述步骤(a)中与抗原结合了的抗原结合分子置于低钙浓度条件下的步骤、
(c)获得在前述步骤(b)中解离的抗原结合分子的步骤。
进而，本发明还提供包括以下步骤(a)～(d)的抗原结合分子的筛选方法；
(a)在低钙浓度条件下使抗原结合分子或抗原结合分子文库与抗原接触的步骤、
(b)选择在前述步骤(a)中未与抗原结合的抗原结合分子的步骤、
(c)使在前述步骤(b)中选择的抗原结合分子在高钙浓度条件下与抗原结合的步骤、
(d)获得在前述步骤(c)与抗原结合的抗原结合分子的步骤。
进而，本发明还提供包括以下步骤(a)～(c)的抗原结合分子的筛选方法；
(a)在高钙浓度条件下使抗原结合分子或抗原结合分子文库与固定有抗原的柱接触的步骤、
(b)将在前述步骤(a)中与柱结合的抗原结合分子在低钙浓度条件下从柱洗脱的步骤、
(c)获得在前述步骤(b)中洗脱的抗原结合分子的步骤。
进而，本发明还提供包括以下步骤(a)～(d)的抗原结合分子的筛选方法；
(a)在低钙浓度条件下使抗原结合分子或抗原结合分子文库通过固定有抗原的柱的步骤、
(b)回收在前述步骤(a)中未与柱结合而洗脱的抗原结合分子的步骤、
(c)使在前述步骤(b)中回收的抗原结合分子在高钙浓度条件下与抗原结合的步骤、
(d)获得在前述步骤(c)中与抗原结合了的抗原结合分子的步骤。
进而，本发明还提供包括以下步骤(a)～(d)的抗原结合分子的筛选方法；
(a)在高钙浓度条件下使抗原结合分子或抗原结合分子文库与抗原接触的步骤、
(b)获得在前述步骤(a)中与抗原结合了的抗原结合分子的步骤、
(c)将在前述步骤(b)中获得的抗原结合分子置于低钙浓度条件下的步骤、
(d)获得在前述步骤(c)中抗原结合活性弱于前述步骤(b)中选择的基准的抗原结合分子的步骤。
应予说明，这些步骤可以被重复2次以上。因此，本发明提供在上述筛选方法中进一步包括将(a)～(c)或(a)～(d)的步骤重复2次以上的步骤的筛选方法。(a)～(c)或(a)～(d)的步骤重复的次数没有特别限定，通常为10次以内。
本发明的筛选方法中，低钙浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性只要是离子化钙浓度为0.1μM～30μM之间的抗原结合活性则没有特别限定，作为优选的离子化钙浓度，可举出0.5μM～10μM之间的抗原结合活性。作为更优选的离子化钙浓度，可举出机体内的早期内体内的离子化钙浓度，具体可举出1μM～5μM下的抗原结合活性。另外，高钙浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性只要是离子化钙浓度为100μM～10mM之间的抗原结合活性则没有特别限定，作为优选的离子化钙浓度，可举出200μM～5mM之间的抗原结合活性。作为更优选的离子化钙浓度，可举出机体内的血浆中的离子化钙浓度，具体可举出0.5mM～2.5mM时的抗原结合活性。
抗原结合分子的抗原结合活性可通过本领域技术人员公知的方法测定，对于离子化钙浓度以外的条件，本领域技术人员可以适宜决定。抗原结合分子的抗原结合活性可以以KD(Dissociation constant：解离常数)、表观KD(Apparent dissociation constant：表观解离常数)、解离速度kd(Dissociation rate：解离速度常数)、或者表观kd(Apparentdissociation：表观解离速度常数)等形式来进行评价。这些可通过本领域技术人员公知的方法来测定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、斯卡查德图、FACS等。
本发明中，选择高钙浓度条件下的抗原结合活性高于低钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合分子的步骤、与选择低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合分子的步骤含义相同。
只要高钙浓度条件下的抗原结合活性高于低钙浓度条件下的抗原结合活性，则高钙浓度条件下的抗原结合活性与低钙浓度条件下的抗原结合活性之差没有特别限定，优选高钙浓度条件下的抗原结合活性是低钙浓度条件下的抗原结合活性的2倍以上、进一步优选为10倍以上、更优选为40倍以上。
通过本发明的筛选方法筛选的抗原结合分子可以是任意抗原结合分子，例如，可以筛选上述抗原结合分子。例如，可以筛选具有天然序列的抗原结合分子，也可以筛选氨基酸序列被置换的抗原结合分子。
通过本发明的筛选方法筛选的抗原结合分子可用任意方法制备，例如，可以使用预先存在的抗体、预先存在的文库(噬菌体文库等)、由对动物进行免疫得到的杂交瘤或来自免疫动物的B细胞制得的抗体或文库、向这些抗体或文库导入能够螯合钙的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸突变而得的抗体或文库(能够螯合钙的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸的含有率提高的文库、在特定位置导入能够螯合钙的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸突变而成的文库等)等。
通过本发明的筛选方法，在给予人、小鼠、猴等动物后，可以获得具有选自下述中的至少1种功能的抗原结合分子，
(i)促进抗原向细胞内摄入的功能、
(ii)与抗原结合2次以上的功能、
(iii)促进血浆中的抗原浓度的减少的功能、和
(iv)优异的血浆中滞留性功能。
因此，本发明的筛选方法可用作获得具有这些功能中的至少1种功能的抗原结合分子的筛选方法。
另外，通过本发明的筛选方法得到的这些抗原结合分子被认为作为药品特别优异，因为其可以减少对患者的给药量、给药频率，从而可减少总给药量。因此，本发明的筛选方法可以用作筛选作为药物组合物使用的抗原结合分子的方法。
抗原结合分子的制造方法
本发明提供抗原结合分子的低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合分子的制造方法。另外，还提供具有选自下述中的至少1种功能的抗原结合分子的制造方法，
(i)促进抗原向细胞内摄入的功能、
(ii)与抗原结合2次以上的功能、
(iii)促进血浆中的抗原浓度的减少的功能、和
(iv)优异的血浆中滞留性功能。
具体地，本发明提供包括以下步骤(a)～(e)的抗原结合分子的制造方法；
(a)获得低钙浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性的步骤、
(b)获得高钙浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性的步骤、
(c)选择低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合分子的步骤、
(d)获得编码在前述步骤(c)中选择的抗原结合分子的基因的步骤、
(e)使用在前述步骤(d)中所得基因产生抗原结合分子的步骤。
进而，本发明还提供包括以下步骤(a)～(e)的抗原结合分子的制造方法；
(a)在高钙浓度条件下使抗原结合分子或抗原结合分子文库与抗原接触的步骤、
(b)将在前述步骤(a)中与抗原结合了的抗原结合分子置于低钙浓度条件下的步骤、
(c)获得在前述步骤(b)中解离的抗原结合分子的步骤、
(d)获得编码在前述步骤(c)中获得的抗原结合分子的基因的步骤、
(e)使用在前述步骤(d)中所得基因产生抗原结合分子的步骤。
应予说明，(a)～(d)的步骤可以重复2次以上。因此，本发明还提供上述方法中还包括将(a)～(d)的步骤重复2次以上的步骤的方法。(a)～(d)步骤的重复次数没有特别限定，通常为10次以内。
进而，本发明还提供包括以下步骤(a)～(f)的抗原结合分子的制造方法；
(a)在低钙浓度条件下使抗原结合分子或抗原结合分子文库与抗原接触的步骤、
(b)选择在前述步骤(a)中未与抗原结合的抗原结合分子的步骤、
(c)使在前述步骤(b)中选择的抗原结合分子在高钙浓度条件下与抗原接触的步骤、
(d)获得在前述步骤(c)中与抗原结合了的抗原结合分子的步骤、
(e)获得编码在前述步骤(d)中获得的抗原结合分子的基因的步骤、
(f)使用前述步骤(e)中所得基因产生抗原结合分子的步骤。
应予说明，(a)～(e)的步骤可以重复2次以上。因此，本发明还提供上述方法中还包括将(a)～(e)的步骤重复2次以上的步骤的方法。(a)～(e)步骤的重复次数没有特别限定，通常为10次以内。
进而，本发明还提供包括以下步骤(a)～(e)的抗原结合分子的制造方法；
(a)在高钙浓度条件下使抗原结合分子或抗原结合分子文库与固定化有抗原的柱接触的步骤、
(b)将在前述步骤(a)中与柱结合的抗原结合分子在低钙浓度条件下从柱洗脱的步骤、
(c)获得在前述步骤(b)中洗脱的抗原结合分子的步骤、
(d)获得编码在前述步骤(c)中获得的抗原结合分子的基因的步骤、
(e)使用在前述步骤(d)中所得基因产生抗原结合分子的步骤。
应予说明，(a)～(d)的步骤可以重复2次以上。因此，本发明还提供上述方法中还包括将(a)～(d)的步骤重复2次以上的步骤的方法。(a)～(d)步骤的重复次数没有特别限定，通常为10次以内。
进而，本发明还提供包括以下步骤(a)～(f)的抗原结合分子的制造方法；
(a)在低钙浓度条件下使抗原结合分子或抗原结合分子文库通过固定有抗原的柱的步骤、
(b)回收在前述步骤(a)中未与柱结合而洗脱的抗原结合分子的步骤、
(c)使在前述步骤(b)中回收的抗原结合分子在高钙浓度条件下与抗原结合的步骤、
(d)获得在前述步骤(c)中与抗原结合了的抗原结合分子的步骤、
(e)获得编码在前述步骤(d)中获得的抗原结合分子的基因的步骤、
(f)使用在前述步骤(e)中所得基因产生抗原结合分子的步骤。
应予说明，(a)～(e)的步骤可以重复2次以上。因此，本发明还提供上述方法中还包括将(a)～(e)的步骤重复2次以上的步骤的方法。(a)～(e)步骤的重复次数没有特别限定，通常为10次以内。
进而，本发明还提供包括以下步骤(a)～(f)的抗原结合分子的制造方法；
(a)在高钙浓度条件下使抗原结合分子或抗原结合分子文库与抗原接触的步骤、
(b)获得在前述步骤(a)中与抗原结合了的抗原结合分子的步骤、
(c)将在前述步骤(b)中获得的抗原结合分子置于低钙浓度条件下的步骤、
(d)获得在前述步骤(c)中抗原结合活性弱于在前述步骤(b)中选择的基准的抗原结合分子的步骤、
(e)获得编码在前述步骤(d)中获得的抗原结合分子的基因的步骤、
(f)使用在前述步骤(e)中所得基因产生抗原结合分子的步骤。
应予说明，(a)～(e)的步骤可以重复2次以上。因此，本发明还提供上述方法中还包括将(a)～(e)的步骤重复2次以上的步骤的方法。(a)～(e)步骤的重复次数没有特别限定，通常为10次以内。
本发明的制造方法中使用的抗原结合分子可用任意方法制备，例如，可以使用预先存在的抗体、预先存在的文库(噬菌体文库等)、由对动物进行免疫得到的杂交瘤或来自免疫动物的B细胞制得的抗体或文库、向文库导入能够螯合钙的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸突变而得的抗体或文库(能够螯合钙的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸的含有率提高的文库、在特定位置导入能够螯合钙的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸突变而成的文库等)等。
上述制造方法中，低钙浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性只要是离子化钙浓度为0.1μM～30μM之间的抗原结合活性，则没有特别限定，作为优选的离子化钙浓度，可举出0.5μM～10μM之间的抗原结合活性。作为更优选的离子化钙浓度，可举出机体内的早期内体内的离子化钙浓度，具体可举出1μM～5μM下的抗原结合活性。另外，高钙浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性只要是离子化钙浓度为100μM～10mM之间的抗原结合活性则没有特别限定，作为优选的离子化钙浓度，可举出200μM～5mM之间的抗原结合活性。作为更优选的离子化钙浓度，可举出机体内的血浆中的离子化钙浓度，具体可举出0.5mM～2.5mM时的抗原结合活性。
抗原结合分子的抗原结合活性可通过本领域技术人员公知的方法测定，对于离子化钙浓度以外的条件，本领域技术人员可以适宜决定。
选择高钙浓度条件下的抗原结合活性高于低钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合分子的步骤、与选择低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合分子的步骤含义相同。
只要高钙浓度条件下的抗原结合活性高于低钙浓度条件下的抗原结合活性，则高钙浓度条件下的抗原结合活性与低钙浓度条件下的抗原结合活性之差没有特别限定，优选高钙浓度条件下的抗原结合活性是低钙浓度条件下的抗原结合活性的2倍以上、进一步优选为10倍以上、更优选为40倍以上。
上述制造方法中，抗原和抗原结合分子的结合可以在任意状态下进行，没有特别限定。例如，可以使抗原与固定化的抗原结合分子接触，由此使抗原结合分子和抗原结合，也可以抗原结合分子与使固定化的抗原接触，由此使抗原结合分子和抗原结合。另外，也可以通过使抗原结合分子和抗原在溶液中接触来使抗原结合分子和抗原结合。
进而，本发明的制造方法可以用于上述具有中性pH下的人FcRn结合活性的抗原结合分子，也可以与赋予或提高中性pH下的人FcRn结合活性的方法组合。使赋予或提高中性pH下的人FcRn结合活性的方法与本发明的制造方法组合时，可以进一步包括：改变抗原结合分子中的氨基酸、以赋予或提高中性pH条件下的人FcRn结合活性的步骤。另外，作为具有中性pH下的人FcRn结合活性的抗原结合分子的人FcRn结合结构域，作为优选实例可举出上述具有中性pH下的人FcRn结合活性的人FcRn结合结构域。因此，本发明的制造方法中，可以进一步包括：预先选择具有中性pH下的人FcRn结合活性高的人FcRn结合结构域的抗原结合分子、和/或改变抗原结合分子中的氨基酸以赋予或提高中性pH下的人FcRn结合活性的步骤。
进而，本发明的制造方法可以用于上述具有pH依赖性抗原结合活性的抗原结合分子，也可以与赋予pH依赖性抗原结合活性的方法(WO 2009/125825)组合。使赋予pH依赖性抗原结合活性的方法与本发明的制造方法组合时，可以进一步包括；预先选择酸性pH条件下的抗原结合活性低于中性pH条件下的抗原结合活性的抗原结合分子、和/或改变抗原结合分子中的氨基酸以使酸性pH条件下的抗原结合活性低于中性pH条件下的抗原结合活性的步骤。
另外，作为具有pH依赖性抗原结合活性的抗原结合分子，作为优选实例可举出：抗原结合分子的至少1个氨基酸被组氨酸所置换的抗原结合分子、或***有至少1个组氨酸的抗原结合分子。因此，本发明的制造方法中，可进一步包括：使用至少1个氨基酸被组氨酸所置换或***有至少1个组氨酸的抗原结合分子来作为抗原结合分子的步骤、或者将抗原结合分子的至少1个氨基酸置换为组氨酸或***至少1个组氨酸的步骤。
应予说明，本发明的制造方法中可以使用非天然氨基酸来代替组氨酸。因此，将上述组氨酸置换为非天然氨基酸也可以理解本发明。
通过本发明的制造方法，在给予人、小鼠、猴等动物后，可以制造具有选自下述中的至少1种功能的抗原结合分子，
(i)促进抗原向细胞内摄入的功能、
(ii)与抗原结合2次以上的功能、
(iii)促进血浆中的抗原浓度的减少的功能、和
(iv)优异的血浆中滞留性功能。
因此，本发明的制造方法可用作获得具有这些功能中的至少1种功能的抗原结合分子的制造方法。
另外，这些抗原结合分子被认为作为药品特别优异，因为其可以减少对患者的给药量、给药频率，从而可减少总给药量。因此，本发明的制造方法可以用作制造作为药物组合物使用的抗原结合分子的方法。
本发明的制造方法中所得的基因通常被担载(***)于适当的载体、导入宿主细胞。作为该载体，只要将***的核酸稳定地保持则没有特别限制，例如若宿主使用大肠杆菌，则作为克隆用载体优选pBluescript载体(Stratagene社制)等，可以使用市售的各种载体。为了生产本发明的抗原结合分子而使用载体时，表达载体特别有用。作为表达载体，只要是在试验管内、大肠杆菌内、培养细胞内、生物个体内表达抗原结合分子的载体则没有特别限制，例如，若试验管内表达则优选pBEST载体(プロメガ社制)、若大肠杆菌则优选pET载体(Invitrogen社制)、若培养细胞则优选pME18S-FL3载体(GenBank AccessionNo.AB009864)、若生物个体则优选pME18S载体(Mol Cell Biol.8：466-472(1988))等。载体中的本发明DNA的***可通过常法进行，例如，通过使用限制酶位点的连接酶反应来进行行(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.JohnWiley&Sons.Section 11.4-11.11)。
上述宿主细胞没有特别限制，可根据目的使用各种宿主细胞。作为用于表达抗原结合分子的细胞，可例示例如：细菌细胞(如：链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、链霉菌、枯草杆菌)、真菌细胞(如：酵母、曲霉菌)、昆虫细胞(如：果蝇S2、斜纹夜蛾SF9)、动物细胞(如：CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes黑色素瘤细胞)和植物细胞。载体向宿主细胞的导入可通过例如磷酸酸钙沉淀法、电脉冲穿孔法(Current protocols in MolecularBiology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.John Wiley&Sons.Section 9.1-9.9)、脂质体转染法、显微注射法等公知的方法来进行。
宿主细胞的培养可通过公知的方法进行。例如，以动物细胞为宿主时，培养液可使用例如DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM。此时，可以并用FBS、胎牛血清(FCS)等血清补液、也可以通过无血清培养来培养细胞。培养时的pH优选为约6～8。培养通常在约30～40℃进行约15～200小时，根据需要进行培养基的交换、通气、搅拌。
为了使宿主细胞中表达的抗原结合分子分泌至小胞体的内腔、细胞周边腔、或细胞外的环境中，可以将适当的分泌信号整合至目标多肽中。这些信号相对于目标抗原结合分子可以为内源性、也可以为异源信号。
另一方面，作为在体内产生多肽的***，可举出例如，使用动物的产生***或使用植物的产生***。向这些动物或植物中导入目标多核苷酸，在动物或植物的体内产生多肽、并进行回收。本发明中的“宿主”包含这些动物、植物。
使用动物时，有使用哺乳类动物、昆虫的产生体系。作为哺乳类动物，可使用山羊、猪、绵羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser，SPECTRUM Biotechnology Applications(1993))。另外，使用哺乳类动物时，可以使用转基因动物。
例如，以与编码山羊β酪蛋白等固有地在乳汁中产生的多肽的基因的融合基因的形式，制备编码本发明的抗原结合分子的多核苷酸。接着，将含有该融合基因的多核苷酸片段注入山羊胚胎，并将该胚胎移植到母山羊中。由接受胚胎的山羊生出的转基因山羊或其后代产生的乳汁中，可以得到目标抗原结合分子。为了使由转基因山羊产生的含有抗原结合分子的乳汁的量增加，可以适宜地对转基因山羊给予激素(Ebert et al.，Bio/Technology(1994)12：699-702)。
另外，作为产生本发明的抗原结合分子的昆虫，可以使用例如蚕。使用蚕时，用***有编码目标抗原结合分子的多核苷酸的杆状病毒感染蚕，由此可以从该蚕的体液中得到目标抗原结合分子。
进而，将植物用于产生本发明的抗原结合分子时，可以使用例如烟草。使用烟草时，将编码目标抗原结合分子的多核苷酸***植物表达用载体、例如pMON 530中，将该载体导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)等细菌中。用该细菌感染烟草，例如，烟草(Nicotianatabacum)，可以自该烟草的叶子得到所期望的抗原结合分子(Ma et al.，Eur.J.Immunol.(1994)24：131-8)。另外，用同样的细菌感染浮萍(Lemna minor)，进行克隆化后可以由浮萍的细胞获得所期望的抗原结合分子(Cox KM et al.Nat.Biotechnol.2006Dec；24(12)：1591-1597)。
这样得到的抗原结合分子可以从宿主细胞内或细胞外(培养基、乳汁等)分离，并纯化为实质上纯粹且均匀的抗原结合分子。抗原结合分子的分离、纯化可以使用通常的多肽纯化中所使用的分离、纯化方法，并无任何限定。例如，可以适宜选择并组合色谱柱、过滤器、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂萃取、蒸馏、免疫沉降、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳法、透析、重结晶等，对抗原结合分子进行分离、纯化。
作为色谱法，可举出例如亲和色谱法、离子交换色谱法、疏水色谱法、凝胶过滤、反相色谱法、吸附色谱法等(Strategies for Protein Purification andCharacterization：A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al.(1996)Cold Spring Harbor Laboratory Press)。这些色谱法可以使用液相色谱法例如HPLC、FPLC等液相色谱法来进行。作为用于亲和色谱法的柱子，可举出蛋白质A柱、蛋白质G柱。例如，作为使用蛋白质A的柱，可举出Hyper D，POROS，SepharoseF.F.(Pharmacia制)等。
根据需要，在抗原结合分子纯化前或纯化后与适当的蛋白质修饰酶作用，由此可以进行任意的修饰，或将肽部分地除去。作为蛋白质修饰酶，可使用例如，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、赖氨酰内肽酶、蛋白激酶、糖苷酶等。
药物组合物
另外，本发明还涉及药物组合物，其含有本发明的抗原结合分子、由本发明的筛选方法分离得到的抗原结合分子、或由本发明的制造方法制造得到的抗原结合分子。本发明的抗原结合分子、通过本发明筛选方法分离得到的抗原结合分子、或通过本发明的制造方法制造得到的抗原结合分子是具有选自下述中的至少1种功能的抗原结合分子，
(i)促进抗原向细胞内摄入的功能、
(ii)与抗原结合2次以上的功能、
(iii)促进血浆中的抗原浓度的减少的功能、和
(iv)优异的血浆中滞留性功能，其可以期待减少抗原结合分子的给药频率，因而作为药物组合物有用。另外，本发明的药物组合物可以含有药学上可接受的载体。
本发明中，药物组合物通常是指用于疾病的治疗或预防、或检查·诊断的药剂。
本发明的药物组合物可以通过本领域技术人员公知的方法进行制剂。例如，可以以水或与水以外的药学上可接受的液体的无菌性溶液、或者悬浮剂的注射剂形式非口服地使用。例如，可如下进行制剂：与药理学上可接受的载体或介质、具体与灭菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、赋形剂、溶媒、防腐剂、粘合剂等适宜组合，以通常公认的制药实践所要求的单位剂量形式混和。这些制剂中的有效成分量以获得标示范围的适当容量的方式进行设定。
用于注射的无菌组合物可以使用注射用蒸馏水之类的溶媒按照通常的制剂实践来进行配制。
作为注射用水溶液，可举出例如生理盐水、含有葡萄糖或其它佐剂(例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钠)的等渗液。还可以与适当的溶解助剂、例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、聚乙二醇等)、非离子性表面活性剂(聚山梨醇酯80(TM)、HCO-50等)并用。
油性液可举出芝麻油、大豆油，可以并用苯甲酸苄酯和/或苯甲醇作为溶解助剂。另外，还可以与缓冲剂(例如、磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液)、止痛剂(例如、盐酸普鲁卡因)、稳定剂(例如、苯甲醇和苯酚)、抗氧化剂配合。所制备的注射液通常填充于适当的安瓿中。
本发明的药物组合物优选通过非口服给药来给予例如，可以制为注射剂型、经鼻给药剂型、经肺给药剂型、透皮给药型的组合物。例如，可以通过静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等全身给予或局部给予。
给药方法可以根据患者的年龄、症状而适宜选择。对于一次给药，含有抗原结合分子的药物组合物的给药量可以设定为例如每1kg体重为0.0001mg至1000mg的范围。或者，也可以使给药量为例如0.001～100000mg/患者，本发明并不需受这些数值的限制。给药量和给药方法根据患者的体重、年龄、症状等而变化，但只要是本领域技术人员，则可以考虑这些条件设定合适的给药量和给药方法。
另外，本发明的药物组合物可以是用于促进抗原向细胞内摄入、或促进血浆中抗原浓度的减少的药物组合物。
另外，本发明还涉及通过给予本发明的抗原结合分子、或由本发明的制造方法制造得到的抗原结合分子来促进基于抗原结合分子的抗原向细胞内摄入的方法、或促进血浆中抗原浓度的减少的方法。给药可以以体内或体外的任意方式进行。作为给药对象，可举出例如非人动物(小鼠、猴等)、或人等。
另外，本发明还涉及通过使用本发明的抗原结合分子、或由本发明的制造方法制造得到的抗原结合分子来增加1分子的抗原结合分子对抗原的结合次数的方法、或改善抗原结合分子的血浆中滞留性的方法。
应予说明，本发明所记载的氨基酸序列中所含的氨基酸有时也会在翻译后受到修饰(例如，N末端的谷氨酰胺通过焦谷氨酰基化而修饰成为焦谷氨酸是本领域技术人员熟知的修饰)，这种氨基酸经翻译后修饰的情形自然也包含在本发明所记载的氨基酸序列中。
另外，本发明还提供至少含有本发明的抗原结合分子的、用于在本发明的方法中使用的试剂盒。该试剂盒中，另外还可以预先包装有药学上可接受的载体、介质、记载有使用方法的说明书等。
本发明还涉及含有本发明的抗原结合分子或由本发明的制造方法制造得到的抗原结合分子作为有效成分的、基于抗原结合分子的抗原向细胞内摄入的促进剂、血浆中抗原浓度的减少促进剂、1分子的抗原结合分子对抗原的结合次数的增加剂、或抗原结合分子的血浆中滞留性改善剂。
本发明还涉及本发明的抗原结合分子或由本发明的制造方法制造得到的抗原结合分子在制造基于抗原结合分子的抗原向细胞内摄入的促进剂、血浆中抗原浓度的减少促进剂、1分子的抗原结合分子对抗原的结合次数的增加剂、或抗原结合分子的血浆中滞留性改善剂中的用途。
另外，本发明还涉及用于促进基于抗原结合分子的抗原向细胞内摄入的方法、促进血浆中抗原浓度减少的方法、增加1分子的抗原结合分子对抗原的结合次数的方法、或改善抗原结合分子的血浆中滞留性的方法中使用的本发明的抗原结合分子或由本发明的制造方法制造得到的抗原结合分子。
应予说明，本说明书中引用的全部现有技术文献以参照的方式并入本说明书中。
实施例
以下，通过实施例更具体地说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限制。
〔实施例1〕钙依赖性抗原结合抗体的抗原消除加速效果的概念
(1-1)基于pH依赖性结合抗体的抗原结合抗体的抗原消除加速效果
WO 2009/125825中记载的H54/L28-IgG1是人源化抗IL-6受体抗体，Fv4-IgG1是对H54/L28-IgG1赋予pH依赖性地与可溶型人IL-6受体结合的特性(在中性条件下结合、在酸性条件下解离)而成的人源化抗IL-6受体抗体。WO 2009/125825中记载的小鼠体内试验中，和给予了H54/L28-IgG1与抗原可溶型人IL-6受体的混合物的组相比，给予了Fv4-IgG1与抗原可溶型人IL-6受体的混合物的组中显示，可以大幅加速可溶型人IL-6受体的消除。
与通常的可溶型人IL-6受体结合的抗体上结合的可溶型人IL-6受体与抗体一起通过FcRn而被再循环至血浆中，而pH依赖性地与可溶型人IL-6受体结合的抗体在内体内的酸性条件下则会解离与抗体结合的可溶型人IL-6受体。解离的可溶型人IL-6受体被溶酶体分解，因而可以大幅加速可溶型人IL-6受体的消除，进而，pH依赖性地与可溶型人IL-6受体结合的抗体通过FcRn而被再循环至血浆中，被再循环的抗体可以再次与可溶型人IL-6受体结合，通过对其进行重复，一个抗体分子变得可以多次重复与可溶型人IL-6受体结合(图1)。
另外，如WO 2009/125825中所述，通常的人源化抗IL-6受体抗体在与膜型人IL-6受体结合后，在人源化抗IL-6受体抗体和膜型人IL-6受体的复合体的状态下被内化，然后在溶酶体被分解。与之相对，pH依赖性地结合的人源化抗IL-6受体抗体在与膜型人IL-6受体结合而被内化后，在内体内的酸性条件下从膜型人IL-6受体解离，由此被再循环至血浆中。这样经再循环的抗体可以再次与膜型人IL-6受体结合，通过重复该循环，一个抗体分子变得可以多次重复与膜型人IL-6受体结合(图2)。
(1-2)血浆中和内体中的pH和钙浓度
在图1和图2所示的pH依赖性结合抗体的作用中，重要的是利用血浆中和内体内环境的差异、即pH的差异(血浆中：pH7.4、内体内：pH6.0)，在血浆中与抗原强结合，在内体内从抗原解离。为了使pH依赖性结合抗体对抗原的结合能力在血浆中和内体内具有这样的差异，重要的是血浆中和内体内的环境差异的大小。pH的差异即为氢离子浓度的不同。即，pH7.4的血浆中的氢离子浓度为约40nM，pH6.0的内体内的氢离子浓度为约1000nM，在血浆中和内体内，因子(氢离子)的浓度存在约25倍的差异。
为了更容易地实现图1和图2所示的作用、或增强该作用，认为可以使用依赖于与血浆中和内体内的氢离子浓度差异相比浓度差异更大的因子的抗体。对血浆中和内体内浓度差异更大的因子进行了调查，结果发现了钙。血浆中的离子化钙浓度为1.1-1.3mM左右，内体内的离子化钙浓度为3μM左右，在血浆中和内体内，因子(钙)的浓度存在约400倍的差异，发现该差异大于氢离子浓度差异(25倍)。即，认为通过使用在高钙浓度条件下(1.1-1.3mM)与抗原，在低钙浓度条件下(3μM)下从抗原解离这样的离子化钙浓度依赖性结合抗体，可以更容易地实现图1和图2所示的作用、或增强该作用。
另外，在WO 2009/125825中，通过导入组氨酸，制作了在pH7.4和pH6.0下性质发生改变的pH依赖性结合抗体。组氨酸在血浆中的中性条件下为电中性，在内体内的酸性条件下带正电。利用该组氨酸的电荷变化，可以对抗体和抗原的相互作用赋予pH依赖性。另一方面，如图3所示，在使用组氨酸的情形中，为了在血浆中与抗原结合、在内体内从抗原解离，抗体的组氨酸残基需要与抗原的带正电的氨基酸或能够作为氢键供体的氨基酸相互作用，因此用于发挥目标作用的pH依赖性结合抗体所结合的抗原侧的表位需要具有带正电的氨基酸或能够作为氢键供体的氨基酸。
另一方面，如图4所示，认为钙依赖性结合抗体经由钙离子而与抗原结合，因而抗原侧的表位是能够螯合钙离子的带负电的氨基酸或能作为氢键受体的氨基酸，因而可以靶向导入组氨酸制得的pH依赖性结合体所无法靶向的表位。进而，如图5所示，认为通过使用兼具钙依赖性和pH依赖性的抗体，可以靶向具有各种性质的表位。
〔实施例2〕使用噬菌体展示技术从人抗体文库获得Ca依赖性结合抗体
(2-1)naive人抗体噬菌体展示文库的制作
以从人PBMC制成的polyA RNA、或市售人polyA RNA等作为模板，按照(Methods MolBiol.2002；178：87-100.)构建了展示包含人抗体序列的Fab结构域的多个人抗体噬菌体展示文库。
(2-2)通过珠淘选从文库获得Ca依赖性结合抗体片段
从构建的人抗体噬菌体展示文库的最初的挑选如下进行：仅浓缩对抗原具有结合能力的抗体片段、或以Ca依赖性结合能力为指标进行浓缩。浓缩具有Ca依赖性结合能力的抗体片段时，在Ca离子存在下与抗原结合后，利用EDTA螯合Ca离子，由此进行噬菌体的洗脱。抗原使用生物素标记的人IL-6受体。
由携带如上所述构建的噬菌体展示用噬粒的大肠杆菌产生噬菌体，将所得培养液通过2.5M NaCl/10％PEG沉淀后，用TBS稀释，制为噬菌体文库液。向噬菌体文库液添加BSA，CaCl2，制备为终浓度4％BSA，离子化钙浓度1.2mM。淘选参考了作为常规方法的使用固定化于磁珠的抗原的淘选方法(J Immunol Methods.2008Mar 20；332(1-2)：2-9.、J ImmunolMethods.2001Jan 1；247(1-2)：191-203.、Biotechnol Prog.2002 Mar-Apr；18(2)：212-20.、Mol Cell Proteomics.2003 Feb；2(2)：61-9.)。磁珠使用涂布有中和亲和素的珠(Sera-Mag SpeedBeads Neutr Avidin-coated)或涂布有链霉亲和素的珠(Dynabeads M-280 Streptavidin)。
具体地，制备的噬菌体文库液中加入250pmol的生物素标记抗原，在室温与抗原接触60分钟。加入用BSA封闭的磁珠，在室温结合15分钟。将珠用1mL的1.2mM CaCl2/TBS(含有1.2mM CaCl2的TBS)洗涤1次。然后，在浓缩具有结合能力的抗体片段时，通过常规方法进行洗脱，在浓缩具有Ca依赖性结合能力的抗体片段时，将珠悬浮于2mM EDTA/TBS(含有2％EDTA的TBS)中，回收噬菌体。在回收的噬菌体溶液中，添加对数生长期(OD600 0.4-0.5)的大肠杆菌菌株TG1 10mL，在37℃缓慢地进行搅拌培养1hr，由此进行感染。将感染的大肠杆菌接种于225mm x 225mm的板上。再次，由该大肠杆菌开始培养，进行噬菌体的培养。
第2次以后的淘选中，以Ca依赖性结合能力为指标进行浓缩。具体地，制备的噬菌体文库液中加入40pmol的生物素标记抗原，在室温与抗原接触60分钟。加入用BSA封闭的磁珠，在室温结合15分钟。将珠用1mL的1.2mM CaCl2/TBST(含有1.2mM CaCl2，0.1％Tween-20的TBS)和1.2mM CaCl2/TBS各洗涤1次。然后加入0.1mL的2mM EDTA/TBS(含2％EDTA的TBS)将珠在室温下悬浮，立即使用Magnet Stand将珠分离，回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加至对数生长期(OD600 0.4-0.5)的大肠杆菌菌株TG1 10mL中，在37℃缓慢地进行搅拌培养1hr，由此进行感染。将感染的大肠杆菌接种于225mm x 225mm的板上。再次，由该大肠杆菌开始培养，与上述相同地进行噬菌体的培养，重复淘选2次。
(2-3)基于噬菌体ELISA的评价
通过由上述方法得到的大肠杆菌单克隆，按照(Methods Mol Biol.2002；178：133-145.)，回收含有噬菌体的培养上清。
在含有噬菌体的培养上清中加入BSA、CaCl2，以使终浓度为4％BSA，钙离子浓度1.2mM，供于ELISA。将StreptaWell 96微量滴定板(Roche)用含有生物素标记抗原的PBS100μL包被一夜。用PBST(0.1％Tween20を含むPBS)洗涤，除去抗原后，用4％BSA-TBS 250μL封闭1小时以上。除去4％BSA-TBS，加入这里所制备的培养上清在37℃静置1小时，进行噬菌体提示抗体的结合。用1.2mM CaCl2/TBST(含有1.2mM CaCl2，0.1％Tween20的TBS)洗涤后，加入1.2mM CaCl2/TBS或1mM EDTA/TBS，在37℃静置30分钟，进行孵育。用1.2mM CaCl2/TBST洗涤后，将用调整为4％BSA、离子化钙浓度1.2mM的TBS稀释的HRP结合抗M13抗体(AmershamParmacia Biotech)孵育1小时。用1.2mM CaCl2/TBST洗涤后，用TMB single solution(ZYMED)进行检测，通过添加硫酸终止反应后，测定450nm的吸光度。对于判断为具有Ca依赖性结合能力的抗体片段，使用特异性引物进行碱基序列分析。
(2-4)抗体的表达和纯化
将通过噬菌体ELISA判断为具有Ca依赖性结合能力的克隆导入动物细胞表达用质粒。抗体的表达使用以下方法进行。将来源于人胎儿肾细胞的FreeStyle 293-F细胞株(Invitrogen)悬浮于FreeStyle 293 Expression Medium培养基(Invitrogen)中，以1.33×106个/mL的细胞密度向6孔板的各孔接种各3mL，通过脂质体转染法将制备的质粒导入细胞。在CO2培养箱(37度、8％CO2，90rpm)中进行4天培养，使用rProtein A SepharoseTM FastFlow(Amersham Biosciences)，通过本领域技术人员公知方法，从所得培养上清中纯化抗体。纯化抗体浓度使用分光光度计测定280nm下的吸光度。通过PACE法算出吸光系数，使用该吸光系数由所得的值计算抗体浓度(Protein Science 1995；4：2411-2423)。
〔实施例3〕获得的抗体对人IL-6受体的Ca依赖性结合能力的评价
对于实施例2中获得的抗体6RL#9-IgG1(重链序列编号：1、轻链序列编号：2)、6RK#12-IgG1(重链序列编号：66、轻链序列编号：67)和、FH4-IgG1(重链序列编号：3、轻链序列编号：4)，使用Biacore T100(GE Healthcare)，在pH7.4下评价人白介素6受体(hIL6R)结合活性。作为流动缓冲液(running buffer)，使用含有3μM或2mM CaCl2的0.05％表面活性剂P20，10mmol/l ACES 150mmol/l NaCl(pH7.4或pH6.0)进行测定。
在Sensor chip CM4(GE Healthcare)上，以氨基偶联法将适当量的重组型蛋白质A(Thermo Scientific)固定化后，使之与抗体结合。注入作为分析物的适当浓度的hIL-6R，使之与传感器芯片上的抗体相互作用。然后，注入10mmol/L Glycine-HCl(pH1.5)，将传感器芯片再生。测定在37℃下进行。测定结果即所得传感图示于图6。这些结果表明：与在Ca2+浓度为2mM的条件下的情形相比，6RL#9-IgG1、6RK#12-IgG1和FH4-IgG1抗体在Ca2+浓度为3μM的条件下，对hIL6R的结合均弱。
这些抗体中，作为具有Ca依赖性的抗体，对6RL#9-IgG1(重链序列编号：1、轻链序列编号：2)、和FH4-IgG1(重链序列编号：3、轻链序列编号：4)进一步进行了动力学分析。作为不具有Ca依赖性的抗体，使用了WO 2009/125825中记载的H54/L28-IgG1(重链序列编号：5、轻链序列编号：6)。高钙离子浓度使用2mM，低钙离子浓度的条件使用3μM。抗原使用人IL-6受体(IL-6R)。在Sensor chip CM4(GE Healthcare)上，以胺偶联法将适当量的蛋白质A(Invitrogen)固定化，并在其上捕获目标抗体。流动缓冲液使用10mmol/L ACES、150mmol/LNaCl、0.05％(w/v)Tween20、2mmol/L CaCl2、pH7.4或10mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05％(w/v)Tween20、3μmol/L CaCl2、pH7.4这2种。测定均在37℃下实施，IL-6R的稀释也使用了各缓冲液。
关于H54L28-IgG1，以流速20μL/min注入IL-6R稀释液和空白流动缓冲液3分钟，使传感器芯片上捕获的抗体与IL-6R相互作用。然后，以流速20μL/min加载10分钟流动缓冲液，观察IL-6R的解离后，以流速30μL/min注入10mmol/L Glycine-HCl，pH1.5 30秒钟，将传感器芯片再生。由测定所得的传感图，计算作为动力学参数的结合速度常数ka(1/Ms)、和解离速度常数kd(1/s)，基于该值计算各抗体对人IL-6受体的解离常数KD(M)。各参数的计算中使用了Biacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)。
关于FH4-IgG1、6RL#9-IgG1，以流速5μL/min注入IL-6R稀释液和空白流动缓冲液15分钟，使传感器芯片上捕获的抗体与IL-6R相互作用。然后，以流速30μL/min注入10mmol/L Glycine-HCl，pH1.5 30秒钟，将传感器芯片再生。相对于测定中获得的传感图，使用稳态亲和模型计算解离常数KD(M)。各参数的计算中使用了Biacore T100 EvaluationSoftware(GE Healthcare)。
通过该方法求出的2mM CaCl2存在下的各抗体和IL-6R的解离常数KD示于表7。对于H54/L28-IgG1，没有观察到Ca浓度的差异导致的对IL-6R的结合的差异，但对于FH4-IgG1、6RL#9-IgG1，在低浓度的Ca条件下观察到了结合的显著减弱(图7、8、9)。
[表7]
对于H54/L28-IgG1，以与2mM Ca浓度存在下相同的方法，可以计算Ca浓度为3μM的条件下的KD。对于FH4-IgG1、6RL#9-IgG1，Ca浓度为3μM时，基本上未观察到对IL-6R的结合，因而难以通过上述方法计算KD，但可使用下述式1来预测KD(Biacore T100 Software Handbook，BR-1006-48，AE 01/2007)。
〔式1〕
示出上述式1中的各项的含义；
Req(RU)：稳态结合水平(Steady state binding levels)
Rmax(RU)：分析物的表面结合能力(Analyte binding capacity of the surface)
RI(RU)：试样中的体积折射率贡献(Bulk refractive index contribution in thesample)
C(M)：分析物浓度(Analyte concentration)
KD(M)：平衡解离常数(Equilibrium dissociation constant)
使用该式1，Ca浓度为3μmol/L时的预测的各抗体与IL-6R的解离常数KD的估算结果示于表8。
[表8]
上述表8中，Req、Rmax、RI、C是基于测定结果估计的值。
由该结果可预测：通过从2mM CaCl2改变为3μM CaCl2，FH4-IgG1、6RL#9-IgG1对IL-6R的KD各自上升约60倍、约120倍(亲和性降低60倍、120倍以上)。表9中概括了H54/L28-IgG1、FH4-IgG1、6RL#9-IgG1这3种抗体在2mM CaCl2存在下和3μM CaCl2存在下的KD值、以及KD值的Ca依赖性。
[表9]
〔实施例4〕所得抗体的钙离子结合评价
接着，为了进行抗体的钙离子结合评价，通过差示扫描型热量测定(DSC)进行热变性中间温度(Tm值)的评价(MicroCal VP-Capillary DSC、MicroCal制)。热变性中间温度(Tm值)是稳定性的指标，钙离子结合而使蛋白质稳定化时，热变性中间温度(Tm值)与未结合钙离子时相比变高(J Bio Chem.2008 Sep 12；Vol-283；No.37：pp 25140-25149)，利用该原理，对抗体进行钙离子结合的评价。将纯化的抗体相对于20mM Tris-HCl，150mM NaCl，2mMCaCl2，pH7.4、或20mM Tris-HCl，150mM NaCl，3μM CaCl2，pH7.4的溶液进行透析(EasySEP，TOMY)。将蛋白质溶液用透析中使用的溶液制备为0.1mg/mL，从20℃至115℃以240℃/hr的升温速度进行DSC测定。基于所得DSC的变性曲线，计算各抗体的Fab结构域的热变性中间温度(Tm值)，示于表10。
[表10]
由表10的结果表明：显示钙依赖性结合能力的FH4和6RL#9根据钙离子浓度不同，Fab的Tm值发生变化，未显示钙依赖性结合能力的H54/L28的Tm值未变化。FH4和6RL#9中所示的Fab的Tm值的变化表明：钙离子与这些抗体结合，Fab部分发生稳定化。由此表明，FH4和6RL#9与钙离子结合，而H54/L28未与钙离子结合。
〔实施例5〕使用正常小鼠的Ca依赖性结合抗体对抗原的血浆中滞留性的影响评价
(5-1)使用正常小鼠的体内试验
对于正常小鼠(C57BL/6J mouse、Charles River Japan)，单独给予hsIL-6R(可溶型人IL-6受体：参考例1中制作)，或将hsIL-6R和抗人IL-6受体抗体同时给予，然后评价hsIL-6R和抗人IL-6受体抗体的体内动力学。对尾静脉以10mL/kg单次给予hsIL-6R溶液(5μg/mL)、或hsIL-6R和抗人IL-6受体抗体的混合溶液。抗人IL-6受体抗体使用上述H54/L28-IgG1、6RL#9-IgG1、FH4-IgG1。
混合溶液中的hsIL-6R浓度均为5μg/mL，抗人IL-6受体抗体浓度根据每个抗体而有所不同，H54/L28-IgG1为0.1mg/mL、6RL#9-IgG1和FH4-IgG1为10mg/mL，此时，相对于hsIL-6R，由于抗人IL-6受体抗体过量地存在，因而认为hsIL-6R的大部分与抗体结合。在给予后15分钟、7小时、1天、2天、4天、7天、14天、21天、28天进行采血。采集的血液立即在4℃、12,000rpm下离心分离15分钟，得到血浆。分离的血浆直至实施测定为止，保存在设定为-20℃以下的冰箱中。
(5-2)通过ELISA法测定正常小鼠血浆中的抗人IL-6受体抗体浓度
小鼠血浆中的抗人IL-6受体抗体浓度通过ELISA法测定。首先，将抗体的抗人IgG(γ-链特异性)F(ab′)2片段(SIGMA)分配与Nunc-Immuno Plate，MaxiSoup(Nalge nuncInternational)，在4℃静置1晚，制作抗人IgG固定化板。制备血浆中浓度调整为0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01μg/mL的校准曲线试样和稀释了100倍以上的小鼠血浆测定试样，分配于抗人IgG固定化板中，在25℃孵育1小时。然后，与生物素化抗人IL-6R抗体(R&D)在25℃反应1小时，进而与链霉亲和素-PolyHRP80(Stereospecific DetectionTechnologies)在25℃反应0.5小时，使用TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)作为底物进行显色反应，用1N-硫酸(Showa Chemical)终止反应后，用酶标仪测定450nm的吸光度。小鼠血浆中浓度是使用分析软件SOFTmax PRO(MolecularDevices)，根据校准曲线的吸光度算出。通过该方法测定的静脉内给药后的正常小鼠中的H54/L28-IgG1、6RL#9-IgG1、FH4-IgG1的血浆中抗体浓度变化示于图10。
(5-3)通过电化学发光法测定血浆中hsIL-6R浓度
小鼠的血浆中hsIL-6R浓度用电化学发光法测定。制备调整为为2000、1000、500、250、125、62.5、31.25pg/mL的hsIL-6R校准曲线试样和稀释了50倍以上的小鼠血浆测定试样，混合用SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)进行了钌标记的单克隆抗人IL-6R抗体(R&D)、生物素化抗人IL-6R抗体(R&D)以及托珠单抗(tocilizumab)(重链序列编号：13、轻链序列编号：14)溶液，在4℃反应1夜。此时的试验缓冲液中含有10mM EDTA，其目的在于使样品中的游离Ca浓度降低，以使样品中的基本全部的hsIL-6R从6RL#9-IgG1或FH4-IgG1解离，并成为与添加的托珠单抗结合的状态。然后，分配至MA400 PR链霉亲和素板(MesoScale Discovery)中。进一步在25℃反应1小时并洗涤后，分配读数缓冲液T(×4)(MesoScale Discovery)，立即用SECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)进行测定。hSIL-6R浓度是使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)，根据校准曲线的响应算出。通过该方法测定的静脉内给药后的正常小鼠中的血浆中hsIL-6R浓度变化示于图11。
结果，hsIL-6R单独给予显示非常快速地消除，而同时给予hsIL-6R和没有Ca依赖性结合的常规抗体H54/L28-IgG1的情形中，hsIL-6R的消除大幅变慢。与之相对，同时给予hsIL-6R和具有100倍以上的Ca依赖性结合的6RL#9-IgG1或FH4-IgG1的情形中，hsIL-6R的消除大幅加速。与同时给予H54/L28-IgG1的情形相比，同时给予6RL#9-IgG1和FH4-IgG1的情形中，可降低第1天血浆中的hsIL-6R浓度各自39倍和2倍。由此确认，钙依赖性结合抗体可以加速抗原从血浆中的消除。
〔实施例6〕Ca依赖性抗原结合抗体的抗原消除加速效果的提高研究(抗体制作)
(6-1)关于IgG抗体对FcRn的结合
IgG抗体通过与FcRn结合而具有较长的血浆中滞留性。IgG和FcRn的结合仅在酸性条件下(pH6.0)被观察到，而在中性条件下(pH7.4)基本观察不到结合。IgG抗体被非特异性地摄入细胞，但通过在内体内的酸性条件下与内体内的FcRn结合而返回到细胞表面上，在血浆中的中性条件下从FcRn解离。向IgG的Fc区导入突变而丧失在酸性条件下与FcRn的结合时，变得无法从内体内再循环至血浆中，因而抗体的血浆中滞留性显著受损。
作为改善IgG抗体的血浆中滞留性的方法，报道有提高酸性条件下对FcRn的结合的方法。通过向IgG抗体的Fc区导入氨基酸置换，使酸性条件下对FcRn的结合提高，从内体内再循环至血浆中的效率提高，结果血浆中滞留性改善。导入氨基酸置换时重要的是不能提高中性条件下对FcRn的结合。若中性条件下与FcRn结合，则即使在内体内的酸性条件下与FcRn结合而返回到细胞表面上，在中性条件下的血浆中IgG抗体也不会从FcRn解离，此时IgG抗体未被再循环至血浆中，因而反而会损害血浆中滞留性。
例如，如J Immunol.2002；169(9)：5171-80.中所述，将通过对IgG1导入氨基酸置换而在中性条件下(pH7.4)观察到对小鼠FcRn的结合的抗体给予小鼠时，据报道抗体的血浆中滞留性变差。另外，如J Immunol.2009；182(12)：7663-71.、J Biol Chem.2007 Jan19；282(3)：1709-17.和J Immunol.2002 Nov 1；169(9)：5171-80.所述，在对食蟹猴给予通过对IgG1导入氨基酸置换而使酸性条件下(pH6.0)对人FcRn的结合提高、同时还观察到中性条件下(pH7.4)对人FcRn的结合的抗体时，据报道抗体的血浆中滞留性没有发生改善，血浆中滞留性未观察到改变。因此，提高抗体功能的抗体工程技术中，仅仅着眼于通过不使中性条件下(pH7.4)对人FcRn的结合增加而使酸性条件下对人FcRn的结合增加来改善抗体的血浆中滞留性，迄今为止尚未报道向IgG抗体的Fc区导入氨基酸置换以增加中性条件下(pH7.4)对人FcRn的结合的优点。
Ca依赖性地与抗原结合的抗体会加速可溶型抗原的消除，一个抗体分子具有多次重复与可溶型抗原结合的效果，因而极其有用。作为使该抗原消除加速效果进一步提高的方法，验证了增强中性条件下(pH7.4)对FcRn的结合的方法。
(6-2)具有中性条件下对FcRn的结合的Ca依赖性人IL-6受体结合抗体的制备
相对于具有钙依赖性抗原结合能力的FH4-IgG1和6RL#9-IgG1、以及作为对照的不具有钙依赖性抗原结合能力的H54/L28-IgG1，导入使中性条件下(pH7.4)对FcRn的结合增加的氨基酸突变。氨基酸突变的导入通过使用PCR的本领域技术人员公知的方法来进行。具体地，相对于IgG1的重链恒定区，相对于IgG1的重链恒定区，将EU编号的第434位从Asn置换为Trp，从而制作FH4-N434W(重链序列编号：7、轻链序列编号：8)、6RL#9-N434W(重链序列编号：9、轻链序列编号：10)、和H54/L28-N434W(重链序列编号：11、轻链序列编号：12)。作为氨基酸置换的导入方法，使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)，通过所附说明书记载的方法制作变体，将所得质粒片段***动物细胞表达载体，制作目标表达载体。抗体的表达、纯化、浓度测定通过实施例2中记载的方法实施。
〔实施例7〕使用正常小鼠的Ca依赖性结合抗体的消除加速效果的评价
(7-1)使用正常小鼠的体内试验
对于正常小鼠(C57BL/6J mouse、Charles River Japan)，单独给予hsIL-6R(可溶型人IL-6受体：参考例1中制作)或同时给予hsIL-6R和抗人IL-6受体抗体，然后评价hsIL-6R和抗人IL-6受体抗体的体内动力学。对尾静脉以10mL/kg单次给予hsIL-6R溶液(5μg/mL)、或hsIL-6R和抗人IL-6受体抗体的混合溶液。抗人IL-6受体抗体使用上述H54/L28-N434W、6RL#9-N434W、FH4-N434W。
混合溶液中的hsIL-6R浓度均为5μg/mL，抗人IL-6受体抗体浓度根据每个抗体而有所不同，H54/L28-N434W为0.042mg/mL、6RL#9-N434W为0.55mg/mL、FH4-N434W为1mg/mL。此时，相对于hsIL-6R，由于抗人IL-6受体抗体过量地存在，因而认为hsIL-6R大部分与抗体结合。在给予后15分钟、7小时、1天、2天、4天、7天、14天、21天、28天进行采血。采集的血液立即在4℃、12,000rpm下离心分离15分钟，得到血浆。分离的血浆直至实施测定为止，保存在设定为-20℃以下的冰箱中。
(7-2)通过ELISA法测定正常小鼠血浆中的抗人IL-6受体抗体浓度
小鼠血浆中的抗人IL-6受体抗体浓度通过与实施例6相同的ELISA法测定。通过该方法测定的静脉内给药后的正常小鼠中的H54/L28-N434W、6RL#9-N434W、FH4-N434W的血浆中抗体浓度变化示于图12。
(7-3)通过电化学发光法测定血浆中hsIL-6R浓度
小鼠的血浆中hsIL-6R浓度用电化学发光法测定。制备配制为2000、1000、500、250、125、62.5、31.25pg/mL的hsIL-6R校准曲线试样和稀释了50倍以上的小鼠血浆测定试样，混合用SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)进行了钌标记的单克隆抗人IL-6R抗体(R&D)和生物素化抗人IL-6R抗体(R&D)，在4℃反应1夜。此时的试验缓冲液中含有10mMEDTA，其目的在于使样品中的游离Ca浓度降低，以使样品中的基本全部的hsIL-6R从6RL#9-N434W或FH4-N434W解离，并形成以游离体形式存在的状态。然后，分配至MA400 PR链霉亲和素板(Meso Scale Discovery)中。进一步在25℃反应1小时并洗涤后，分配读数缓冲液T(×4)(Meso Scale Discovery)，立即用SECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)进行测定。hsIL-6R浓度是使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)，根据校准曲线的响应算出。通过该方法测定的静脉内给药后的正常小鼠中的血浆中hsIL-6R浓度变化示于图13。
结果，增强了pH7.4下对FcRn的结合，但同时给予hsIL-6R和没有Ca依赖性结合的常规抗体H54/L28-N434W的情形中，与hsIL-6R单独给予的情形相比，hsIL-6R的消除大幅变慢。与之相对，同时给予hsIL-6R和具有100倍以上的Ca依赖性结合、并且增强了pH7.4下对FcRn的结合的抗体6RL#9-N434W或FH4-N434W的情形中，与hsIL-6R单独给予的情形相比，hsIL-6R的消除加速。与hsIL-6R单独给予的情形相比，同时给予6RL#9-N434W和FH4-N434W的情形中，可降低第1天血浆中的hsIL-6R浓度各自3倍和8倍。由此确认：相对于钙依赖性结合抗体，通过增强pH7.4下对FcRn的结合能力，可以进一步加速抗原从血浆中消除。
同hsIL-6R和没有Ca依赖性结合的常规抗体H54/L28-IgG1相比，hsIL-6R和具有100倍以上的Ca依赖性结合的抗体6RL#9-IgG1或FH4-IgG1确认到hsIL-6R消除增大的效果，hsIL-6R和具有100倍以上的Ca依赖性结合、并且增强了pH7.4下对FcRn的结合的抗体6RL#9-N434W或FH4-N434W，与hsIL-6R单独给予相比，确认到可以加速hsIL-6R消除。这些数据暗示，与图1所示pH依赖性地与抗原结合的抗体相同地，Ca依赖性地与抗原结合的抗体也在内体内将抗原解离。如实施例1所述，对于pH依赖性地与抗原结合的抗体来说，能够成为靶的表位有限(图3)，通过使用本研究中发现的Ca依赖性地与抗原结合的抗体(图4、5)，认为可以将能够内体依赖性地解离抗原的抗体所能靶向的表位进一步拓宽。
〔实施例8〕通过X射线晶体结构分析鉴定6RL#9抗体的钙离子结合位点
(8-1)X射线晶体结构分析
如实施例4所示，热变性温度Tm值的测定暗示了6RL#9抗体与钙离子结合。但是，6RL#9抗体的哪个位点与钙离子结合却无法预测，因而通过使用X射线晶体结构分析的方法来确定钙离子发生相互作用的6RL#9抗体的序列中的残基。
(8-2)6RL#9抗体的表达和纯化
对用于X射线晶体结构分析而表达的6RL#9抗体进行了纯化。具体地，将以可以分别表达6RL#9抗体的重链(序列编号：1)和轻链(序列编号：2)的方式制备的动物表达用质粒瞬时地导入动物细胞。在以最终细胞密度为1x 106细胞/mL的方式悬浮于FreeStyle 293Expression Medium培养基(Invitrogen)中的800mL的来源于人胎儿肾细胞的FreeStyle293-F细胞株(Invitrogen)，通过脂质体转染法导入制备的质粒。将导入了质粒的细胞在CO2培养箱(37℃、8％CO2、90rpm)中培养5天。根据使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)的本领域技术人员公知的方法，从如上所述得到的培养上清中纯化出抗体。使用分光光度计测定纯化得到的抗体溶液的280nm下的吸光度。通过PACE法算出吸光系数，使用该吸光系数由测定值计算抗体浓度(Protein Science(1995)4，2411-2423)。
(8-3)从6RL#9抗体纯化Fab片段
使用分子量截留大小10000MWCO的超滤膜，将6RL#9抗体浓缩至21mg/mL。使用L-Cystein 4mM、EDTA 5mM、20mM磷酸钠缓冲液(pH 6.5)，制备稀释到5mg/mL的2.5mL的该抗体的试样。加入0.125mg的木瓜蛋白酶(Roche Applied Science)，将进行了搅拌的该试样在35℃下静置2小时。静置后，进一步向该试样加入溶解有Protease Inhibitor CocktailMini，不含EDTA(Roche Applied Science)1片的10mL的25mM MES缓冲液(pH6)，在冰中静置，由此终止木瓜蛋白酶的蛋白酶反应。接着，将该试样添加至用25mM MES缓冲液pH6进行了平衡的1mL大小的阳离子交换柱HiTrap SP HP(GE Healthcare)，该阳离子交换柱在下游串联连接有1mL大小的ProteinA载体柱HiTrap MabSelect Sure(GE Healthcare)。通过在同一缓冲液中线性地使NaCl浓度提高至300mM进行洗脱，可得到6RL#9抗体的Fab片段的纯化级分。接着，将所得纯化级分通过5000MWCO的超滤膜浓缩至0.8mL左右。向用含有50mMNaCl的100mM HEPES缓冲液(pH 8)进行了平衡的凝胶过滤柱Superdex 200 10/300 GL(GEHealthcare)中添加浓缩液。结晶用的纯化6RL#9抗体的Fab片段使用相同缓冲液从柱上洗脱。应予说明，上述全部柱操作均在6至7.5℃的低温下实施。
(8-4)6RL#9抗体的Fab片段在Ca存在下的结晶化
预先在常规条件设定下得到6RL#9 Fab片段的晶种。接着，将以5mM的方式加入有CaCl2的纯化6RL#9抗体的Fab片段使用5000MWCO的超滤膜浓缩至12mg/mL。接着，通过悬滴气相扩散法，实施如前所述浓缩的试样的结晶。作为贮液，使用含有20-29％的PEG4000的100mMHEPES缓冲液(pH7.5)。在载玻片上，相对于0.8μl的贮液和0.8μl的前述浓缩试样的混合液，加入在含有29％PEG4000和5mM CaCl2的100mM HEPES缓冲液(pH7.5)中进行了破碎的前述晶种被稀释到100-10000倍的稀释系列溶液0.2μl，由此制备晶滴(crystallizationdrop)。将该晶滴在20℃静置2天到3天，对由此得到的薄板状的结晶测定X射线衍射数据。
(8-5)6RL#9抗体的Fab片段在Ca非存在下下的结晶
纯化6RL#9抗体的Fab片段使用5000MWCO的超滤膜浓缩至15mg/ml。接着，通过悬滴气相扩散法，实施如前所述浓缩的试样的结晶。作为贮液，使用含有18-25％的PEG4000的100mMHEPES缓冲液(pH7.5)。在载玻片上，相对于0.8μl的贮液和0.8μl的前述浓缩试样的混合液，加入在含有25％PEG4000的100mM HEPES缓冲液(pH7.5)中进行了破碎的在Ca存在下所得的6RL#9抗体的Fab片段的结晶被稀释到100-10000倍的稀释系列溶液0.2μl，由此制备晶滴。将该晶滴在20℃静置2天到3天，对由此得到的薄板状的结晶测定X射线衍射数据。
(8-6)6RL#9抗体的Fab片段在Ca存在下的结晶的X射线衍射数据的测定
将浸渍于含有35％PEG4000和5mM CaCl2的100mM HEPES缓冲液(pH7.5)的溶液中的、6RL#9抗体的Fab片段的在Ca存在下所得的一个单晶，通过使用带有微小尼龙环的针除去外液，从而将该单晶在液氮中冷冻。使用高能量加速器研究机构的放射光线设施PhotonFactory的光束线BL-17A，测定前述冷冻结晶的X射线衍射数据。应予说明，测定中通过时常将冷冻结晶置于-178℃的氮气流中而维持冷冻状态。使用安装有光束线的CCD探测器Quantum315r(ADSC)，将结晶以每次1°进行旋转的同时，收集总计180幅衍射图像。晶格常数的确定、衍射斑的索引(diffraction spot indexing)、和衍射数据的处理通过程序Xia2(CCP4 Software Suite)、XDS Package(Walfgang Kabsch)以及Scala(CCP4 SoftwareSuite)来进行。最终得到直至分辨率的衍射强度数据。本结晶属于空间群P212121，晶格常数α＝90°、β＝90°、γ＝90°。
(8-7)6RL#9抗体的Fab片段在Ca非存在下的结晶的X射线衍射数据的测定
将浸渍于含有35％PEG4000的100mM HEPES缓冲液(pH7.5)的溶液中的、6RL#9抗体的Fab片段的在Ca非存在下得到的一个单晶，使用带有微小尼龙环的针除去外液，从而将该单晶在液氮中冷冻。使用高能量加速器研究机构的放射光线设施Photon Factory的光束线BL-5A，测定前述冷冻结晶的X射线衍射数据。应予说明，测定中通过时常将冷冻结晶置于-178℃的氮气流中而维持冷冻状态。使用安装有光束线的CCD探测器Quantum210r(ADSC)，将结晶以每次1°进行旋转的同时，收集总计180幅衍射图像。晶格常数的确定、衍射斑的索引(diffraction spot indexing)、和衍射数据的处理通过程序Xia2(CCP4 SoftwareSuite)、XDS Package(Walfgang Kabsch)以及Scala(CCP4 Software Suite)来进行。最终得到直至分辨率的衍射强度数据。本结晶属于空间群P212121，晶格常数 α＝90°、β＝90°、γ＝90°，与Ca存在下的结晶是同型。
(8-8)6RL#9抗体的Fab片段在Ca存在下的结晶的结构解析
通过使用程序Phaser(CCP4 Software Suite)的分子置换法，确定6RL#9抗体的Fab片段在Ca存在下的结晶的结构。基于所得晶格的大小和6RL#9抗体的Fab片段的分子量，预测非对称单元中的分子数目是一个。基于一级序列上的同源性，将从PDB code：1ZA6的结构坐标中取出的A链112-220位和B链116-218位的氨基酸残基部分作为CL和CH1区的考察用模型分子。接着，将从PDB code：1ZA6的结构坐标中取出的B链1-115位的氨基酸残基部分作为VH区的考察用模型分子。最后，将从PDB code 2A9M的结构坐标中取出的轻链3-147位的氨基酸残基作为VL区的考察用模型分子。按照该顺序，由旋转函数和平移函数确定各考察用模型分子的晶格内的取向和位置，由此得到6RL#9抗体的Fab片段的一级结构模型。通过进行相对于该一级结构模型使VH、VL、CH1、CL的各结构域运动的刚体精密化(rigid bodyrefinement)，相对于的反射数据的晶体学可信度因子R值为46.9％、自由R值为48.6％。进而，通过使用程序Refmac5(CCP4 Software Suite)的结构精密化、和参照以使用实验性确定的结构因子Fo和由模型计算得到的结构因子Fc和相位计算得到的2Fo-Fc、Fo-Fc为系数的电子密度图的同时重复模型修正而在程序Coot(Paul Emsley)上进行，由此进行模型的精密化。最后，基于以2Fo-Fc、Fo-Fc为系数的电子密度图，将Ca离子和水分子整合至模型中，由此使用程序Refmac5(CCP4 Software Suite)进行精密化。通过使用分辨率的21020个反射数据，最终相对于3440原子的模型的晶体学可信度因子R值为20.0％、自由R值为27.9％。
(8-9)6RL#9抗体的Fab片段在Ca非存在下的结晶的X射线衍射数据的测定
6RL#9抗体的Fab片段在Ca非存在下的结晶的结构使用作为同型的Ca存在下结晶的结构来确定。从6RL#9抗体的Fab片段在Ca存在下的结晶的结构坐标中除去水分子和Ca离子分子，进行使VH、VL、CH1、CL的各结构域运动的刚体精密化。相对于的反射数据的晶体学可信度因子R值为30.3％、自由R值为31.7％。进而，通过使用程序Refmac5(CCP4Software Suite)的结构精密化、和参照以使用实验性确定的结构因子Fo和由模型计算得到的结构因子Fc和相位计算得到的2Fo-Fc、Fo-Fc为系数的电子密度图的同时重复模型修正而在程序Coot(Paul Emsley)上进行，由此进行模型的精密化。最后，基于以2Fo-Fc、Fo-Fc为系数的电子密度图，将水分子整合至模型中，由此使用程序Refmac5(CCP4 SoftwareSuite)进行精密化。通过使用分辨率的18357个反射数据，最终相对于3351原子的模型的晶体学可信度因子R值为20.9％、自由R值为27.7％。
(8-10)6RL#9抗体的Fab片段在Ca存在或非存在下的结晶的X射线衍射数据的比较
对6RL#9抗体的Fab片段在Ca存在下的结晶和Ca非存在下的结晶的结构进行比较时，在重链CDR3观察到大的变化。通过X射线晶体结构分析确定的6RL#9抗体的Fab片段的重链CDR3的结构示于图14。具体地，在Ca存在下的6RL#9抗体的Fab片段的结晶中，重链CDR3环部分的中心部分存在有钙离子。认为钙离子与重链CDR3的95位、96位和100a位(Kabat编号)发生相互作用。认为在Ca存在下，对于与抗原结合重要的重链CDR3环通过与钙结合而稳定化，成为对于与抗原的结合最优的结构。钙与抗体的重链CDR3结合的实例迄今尚未有报道，钙与抗体的重链CDR3结合的结构是新结构。已知重链CDR3对于与抗原的结合是最重要的，重链CDR3的结构维持需要钙离子的本实施例中发现的模体中，认为钙离子在对抗原的结合中起着重要的作用。即，具有本模体的抗体被认为钙离子依赖性地与抗原结合的可能性极其高，例如，认为只要能够制作具有本模体的合成文库，则可由该文库高效地获得钙依赖性结合抗体。
〔实施例9〕使用噬菌体展示技术从人抗体文库获得Ca依赖性地与IL-6结合的抗体
(9-1)naive人抗体噬菌体展示文库的制作
以从人PBMC制成的poly A RNA、或市售的人poly A RNA等为模板，按照本领域技术人员公知的方法，构建了包含展示相互不同的人抗体序列的Fab结构域的多个噬菌体的人抗体噬菌体展示文库。
(9-2)通过珠淘选从文库获得Ca依赖性地与抗原结合的抗体片段
从构建的naive人抗体噬菌体展示文库的最初的挑选如下实施：仅浓缩对抗原(IL-6)具有结合能力的抗体片段。抗原使用生物素标记的IL-6。
由携带有构建的噬菌体展示用噬粒的大肠杆菌产生噬菌体。向产生噬菌体的大肠杆菌的培养液中添加2.5M NaCl/10％PEG，将由此沉淀的噬菌体团块用TBS稀释，由此获得噬菌体文库液。接着，向噬菌体文库液中添加BSA和CaCl2以使终浓度为4％BSA和1.2mM钙离子浓度。作为淘选方法，参考了作为常规方法的使用固定化于磁珠的抗原的淘选方法(J.Immunol.Methods.(2008)332(1-2)，2-9、J.Immunol.Methods.(2001)247(1-2)，191-203、Biotechnol.Prog.(2002)18(2)212-20、Mol.Cell Proteomics(2003)2(2)，61-9)。作为磁珠，使用涂布有中和亲和素的珠(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或涂布有链霉亲和素的珠(Dynabeads M-280 Streptavidin)。
具体地，制备的噬菌体文库液中加入250pmol的生物素标记抗原，由此使该噬菌体文库液在室温与抗原接触60分钟。加入用BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温下结合15分钟。珠用1.2mM CaCl2/TBST(含有1.2mM CaCl2的TBST)洗涤3次后，进一步用1mL的1.2mM CaCl2/TBS(含有1.2mM CaCl2的TBS)洗涤2次。然后，加入有0.5mL的1mg/mL胰蛋白酶的珠在室温下悬浮15分钟后，立即使用磁力架将珠分离，回收噬菌体溶液。回收的噬菌体溶液添加至对数生长期(OD600为0.4-0.5)的10mL大肠杆菌菌株TG1中。37℃下缓慢进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm x 225mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此制备噬菌体文库液。
第2次以后的淘选中，以Ca依赖性结合能力为指标进行噬菌体的浓缩。具体地，制备的噬菌体文库液中加入40pmol的生物素标记抗原，由此使噬菌体文库在室温下与抗原接触60分钟。加入用BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。将珠用1mL的1.2mM CaCl2/TBST与1.2mM CaCl2/TBS洗涤。然后，加入有0.1mL的2mM EDTA/TBS的珠在室温下悬浮后，立即使用磁力架将珠分离，回收噬菌体溶液。回收的噬菌体溶液中加入100mg/mL胰蛋白酶5μL，由此将未展示Fab的噬菌体的pIII蛋白质(来源于辅助噬菌体的pIII蛋白质)切断，未展示Fab的噬菌体丧失对大肠杆菌的感染能力。从经胰蛋白酶処理的噬菌体溶液回收的噬菌体添加至对数生长期(OD600ガ0.4-0.7)的10mL大肠杆菌菌株TG1中。37℃下缓慢进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm x 225mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此回收噬菌体文库液。以Ca依赖性结合能力为指标的淘选重复3次。
(9-3)基于噬菌体ELISA的评价
通过由上述方法得到的大肠杆菌的单克隆，按照常法(Methods Mol.Biol.(2002)178，133-145)，回收含有噬菌体的培养上清。含有以终浓度4％BSA和1.2mM钙离子浓度的方式加入有BSA和CaCl2的噬菌体的培养上清通过以下步骤供于ELISA。将StreptaWell 96微量滴定板(Roche)用含有生物素标记抗原的100μL的PBS包被一夜。将该板的各孔用PBST洗涤从而除去抗原后，将该孔用250μL的4％BSA-TBS进行1小时以上的封闭。将在除去了4％BSA-TBS的各孔中加入了制备的培养上清的该板在37℃静置1小时，使展示噬菌体的抗体与各孔中存在的抗原结合。在用1.2mM CaCl2/TBST洗涤了的各孔中加入1.2mM CaCl2/TBS或1mMEDTA/TBS，将该板在37℃下静置30分钟进行孵育。用1.2mM CaCl2/TBST洗涤后，将用终浓度为4％的BSA和1.2mM的离子化钙浓度的TBS稀释的HRP结合抗M13抗体(Amersham PharmaciaBiotech)添加至各孔中，将进行了添加的板孵育1小时。用1.2mM CaCl2/TBST洗涤后，添加TMB single溶液(ZYMED)，各孔中溶液的显色反应通过添加硫酸来终止，然后通过450nm的吸光度对该显色进行测定。
使用分离的96个克隆进行噬菌体ELISA，由此得到对IL-6具有Ca依赖性结合能力的6KC4-1#85抗体、6LC4-1#15抗体和6LC4-2#16抗体。以上述噬菌体ELISA的结果判断为对抗原具有Ca依赖性结合能力的抗体片段为模板，通过特异性引物进行扩增，对扩增得到的基因的碱基序列进行分析。6KC4-1#85抗体的重链可变区的序列记载于序列编号：25，轻链可变区的序列记载于序列编号：26。编码6KC4-1#85抗体的重链可变区(序列编号：25)的多核苷酸通过PCR法，与编码来源于IgG1的序列的多核苷酸(序列编号：65)连接，将连接得到的DNA片段整合至动物细胞表达用载体中，构建表达序列编号：27所示重链的载体。编码6KC4-1#85抗体的轻链可变区(序列编号：26)的多核苷酸通过PCR法，与编码天然型Kappa链的恒定区(序列编号：28)的多核苷酸连接，将连接得到的编码序列编号：29所示序列的DNA片段整合至动物细胞表达用载体中。通过同样的方法将6LC4-1#15抗体(重链序列编号68、轻链序列编号69)和6LC4-2#16抗体(重链序列编号70、轻链序列编号71)整合至细胞表达用载体中。制作的改变体的序列通过本领域技术人员公知的方法确认。
(9-4)抗体的表达和纯化
将噬菌体ELISA的结果判断为对抗原具有Ca依赖性结合能力的克隆导入动物细胞表达用质粒中。抗体的表达使用以下方法进行。将来源于人胎儿肾细胞的FreeStyle 293-F细胞株(Invitrogen)在FreeStyle 293 Expression Medium培养基(Invitrogen)中悬浮，以1.33x 106细胞/mL的细胞密度接种于6孔板的各孔各3mL。制备的质粒通过脂质体转染法导入细胞。在CO2培养箱(37度、8％CO2、90rpm)中进行4天培养。使用rProtein A SepharoseTMFast Flow(Amersham Biosciences)，采用本领域技术人员公知的方法，从上述得到的培养上清中纯化抗体。使用分光光度计测定纯化得到的抗体溶液的280nm下的吸光度。通过PACE法算出吸光系数，使用该吸光系数由所得的测定值计算抗体浓度(Protein Science(1995)4，2411-2423)。
(9-5)钙依赖性抗IL6抗体的结合评价
对于获得的抗体，使用Biacore T100(GE Healthcare)，在pH7.4下对人白介素6(hIL6)结合活性(解离常数KD(M))进行评价。作为流动缓冲液，使用含有3μM或1.2mM CaCl2的0.05％Tween20，10mmol/l ACES，150mmol/l NaCl(pH7.4)进行测定。
在Sensor chip CM5(GE Healthcare)上，以氨基偶联法将适当量的重组型蛋白质A/G(Thermo Scientific)固定化后，使之与抗体结合。注入作为分析物的适当浓度的hIL6(人白介素6、鎌倉テクノサイエンス)，使之与传感器芯片上的抗体相互作用。然后，注入10mmol/L Glycine-HCl(pH1.5)，将传感器芯片再生。测定在37℃下进行。测定结果即所得传感图示于图15。这些结果表明：与在Ca2+浓度为1.2mM的条件下的情形相比，6LC4-1#15-IgG1和6LC4-2#16-IgG1、6KC4-1#85-IgG1抗体在Ca2+浓度为3μM的条件下时，对hIL6的结合弱。上述结果中，由于钙依赖性抗原结合的性质不仅体现于实施例3中所示的IL-6R、而且也体现于IL-6，因此表明该方法也能适用于其它抗原。
〔实施例10〕6KC4-1#85抗体的钙离子结合评价
(10-1)6KC4-1#85抗体的钙离子结合评价
评价从人抗体文库获得的钙依赖性抗原结合抗体6KC4-1#85抗体是否与钙结合。在离子化钙浓度不同的条件下，测定的Tm值是否发生变化通过实施例4中所述的方法来评价。
6KC4-1#85抗体的Fab结构域的Tm值示于表11。如表11所示，6KC4-1#85抗体的Fab结构域的Tm值根据钙离子浓度而发生变化，因而可知6KC4-1#85抗体与钙结合。
[表11]
(10-2)6KC4-1#85抗体的钙离子结合位点的鉴定
实施例10的(10-1)中表明6KC4-1#85抗体与钙离子结合，但6KC4-1#85不具有后述hVk5-2序列那样的钙结合模体。因此，为了鉴定钙离子是与6KC4-1#85抗体的哪个残基进行钙离子结合，将存在于6KC4-1#85抗体的CDR中的Asp(D)残基置换为无法参与钙离子的结合或螯合的Ala(A)残基，制得改变重链(6_H1-11(序列编号：30)、6_H1-12(序列编号：31)、6_H1-13(序列编号：32)、6_H1-14(序列编号：33)、6_H1-15(序列编号：34))和改变轻链(6_L1-5(序列编号：35)和6_L1-6(序列编号：36))。从导入了含有改变抗体基因的表达载体的动物细胞的培养液中，按照实施例2所述的方法纯化改变抗体。纯化的改变抗体的钙结合按照实施例4所述的方法进行测定。测定结果示于表12。
[表12]
如表12所示，通过将6KC4-1#85抗体的重链CDR3的95位或101位(Kabat编号)置换为Ala残基，6KC4-1#85抗体丧失钙结合能力，因而认为该残基对于和钙结合是重要的。表明：由6KC4-1#85抗体的改变抗体的钙结合性所明确的6KC4-1#85抗体的重链CDR3的环根部付近存在的钙结合模体，也可以作为本发明的抗原结合分子中所含的抗原结合结构域中的钙结合模体使用。本模体与实施例8中所发现的模体同样为重链CDR3的钙结合模体，因而认为只要能够同样地制作例如具有本模体的合成文库，则可由这样的文库高效地获得钙依赖性结合抗体。
〔实施例11〕与钙离子结合的人生殖细胞系列序列的考察
(11-1)人生殖细胞系列序列的获得
迄今为止尚未报到用含有人生殖细胞系列序列的抗体与钙离子结合。因此，为了判断含有人生殖细胞系列序列的抗体是否与钙离子结合，以由Human Fetal Spreen Poly RNA(Clontech)制备的cDNA为模板，克隆了含有人生殖细胞系列序列的抗体的生殖细胞系列的序列。将克隆的DNA片段***动物细胞表达载体。所得表达载体的碱基序列通过本领域技术人员公知的方法确定，其序列编号示于表13。编码序列编号：37(Vk1)、序列编号：38(Vk2)、序列编号：39(Vk3)、序列编号：40(Vk4)以及序列编号：41(Vk5)的多核苷酸通过PCR法，与编码天然型Kappa链的恒定区(序列编号：28)的多核苷酸连接，将连接得到的DNA片段整合至动物细胞表达用载体中。另外，编码序列编号：42(Vk1)、序列编号：43(Vk2)、序列编号：44(Vk3)、序列编号：45(Vk4)以及序列编号：46(Vk5)的多核苷酸通过PCR法，与编码IgG1的C末端2氨基酸缺失的多肽(序列编号：65)的多核苷酸连接，将连接得到的DNA片段整合至动物细胞表达用载体中。制作的改变体的序列通过本领域技术人员公知的方法确认。
[表13]
(11-2)抗体的表达和纯化
将获得的5种***了含有人生殖细胞系列序列的DNA片段的动物细胞表达载体导入动物细胞。抗体的表达使用以下方法进行。将来源于人胎儿肾细胞的FreeStyle 293-F细胞株(Invitrogen)在FreeStyle 293 Expression Medium培养基(Invitrogen)中悬浮，以1.33x106细胞/mL的细胞密度接种于6孔板的各孔各3mL。制备的质粒通过脂质体转染法导入细胞。在CO2培养箱(37度、8％CO2、90rpm)中进行4天培养。使用rProtein A SepharoseTMFast Flow(Amersham Biosciences)，采用本领域技术人员公知的方法，从上述得到的培养上清中纯化抗体。使用分光光度计测定纯化得到的抗体溶液的280nm下的吸光度。通过PACE法算出吸光系数，使用该吸光系数由所得的测定值计算抗体浓度(Protein Science(1995)4，2411-2423)。
(11-3)含有人生殖细胞系列序列的抗体的钙离子结合活性的评价
对纯化的抗体的钙离子结合活性进行评价。将纯化的抗体用以20mM Tris-HCl、150mMNaCl、2mM CaCl2(pH7.4)或20mM Tris-HCl、150mM NaCl，3μM CaCl2(pH7.4)的溶液为外液的透析(EasySEP、TOMY)进行处理。将使用透析所用的溶液制备为大致0.1mg/mL的抗体溶液作为被测物质，从20℃至115℃以240℃/hr的升温速度进行DSC测定。基于所得DSC的变性曲线计算得到的各抗体的Fab结构域的热变性中间温度(Tm值)示于表14。
[表14]
结果，含有hVk1、hVk2、hVk3、hVk4序列的抗体的Fab结构域的Tm值未根据含有该Fab结构域的溶液中的钙离子浓度而发生改变。而含有hVk5序列的抗体的Fab结构域的Tm值却根据含有该Fab结构域的抗体溶液中的钙离子浓度而发生了改变，结果表明hVk5序列与钙离子结合。
〔实施例12〕人Vk5(hVk5)序列的评价
(12-1)hVk5序列
Kabat数据库中作为hVk5序列仅登录有hVk5-2序列。以下，hVk5和hVk5-2以同义地使用。
(12-2)糖链非添加型hVk5-2序列的构建、表达和纯化
hVk5-2序列具有在20位(Kabat编号)的氨基酸添加N型糖链的序列。蛋白质中添加的糖链存在异源性，因而从物质的同源性观点出发，期望不添加糖链。因此，制作将20位(Kabat编号)的Ash(N)残基置换为Thr(T)残基的改变体hVk5-2_L65(序列编号：47)。氨基酸的置换通过使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)的本领域技术人员公知的方法进行。将编码改变体hVk5-2_L65的DNA整合至动物表达用载体中。整合有所制作改变体hVk5-2_L65的DNA的动物表达用载体，与按作为重链表达CIM_H(序列编号：48)的方式整合得到的动物表达用载体一起，通过实施例2中记载的方法一同导入动物细胞中。导入的动物细胞中表达的含有hVk5-2_L65和CIM_H的抗体通过实施例2所述的方法进行纯化。
(12-3)含有糖链非添加型hVk5-2序列的抗体的物性评价
获得的含有改变序列hVk5-2_L65的抗体与含有改变之前的hVk5-2序列的抗体相比，其异源性减少与否使用离子交换色谱法进行分析。离子交换色谱法的方法示于表15。分析结果表明，如图16所示糖链添加位点被改变的hVk5-2_L65与原本的hVk5-2序列相比，异源性减少。
[表15]
接着，含有异源性减少的hVk5-2_L65序列的抗体与钙离子结合与否通过使用实施例4所述的方法来评价。结果，如表16所示，含有糖链添加位点被改变的hVk5-2_L65的抗体的Fab结构域的Tm值也根据抗体溶液中的钙离子浓度的变化而发生改变。即，表明含有糖链添加位点被改变的hVk5-2_L65的抗体的Fab结构域与钙离子结合。
[表16]
〔实施例13〕含有hVk5-2序列的CDR序列的抗体分子的钙离子结合活性的评价
(13-1)含有hVk5-2序列的CDR序列的改变抗体的制作、表达和纯化
hVk5-2_L65序列是存在于人Vk5-2序列的框架中的糖链添加位点的氨基酸被改变的序列。
实施例12表明即使改变糖链添加位点也结合钙离子，但从免疫原性观点出发，通常期望框架序列是生殖细胞系列的序列。因此，研究了是否可以在维持该抗体的钙离子结合活性的同时，将抗体的框架序列置换为不添加糖链的生殖细胞系列序列的框架序列。
编码化学合成的hVk5-2序列的框架序列被改变为hVk1、hVk2、hVk3和hVk4序列的序列(分别为CaVk1(序列编号：49)、CaVk2(序列编号：50)、CaVk3(序列编号：51)、CaVk4(序列编号：52)多核苷酸通过PCR法，与编码天然型Kappa链的恒定区(序列编号：28)的多核苷酸连接，将连接得到的DNA片段整合至动物细胞表达用载体中。制作的改变体的序列通过本领域技术人员公知的方法确认。如上所述制作的各质粒、与整合有编码CIM_H(序列编号：48)的多核苷酸的质粒一起通过实施例2所述的方法导入动物细胞。从如上所述导入的动物细胞的培养液中纯化表达的所期望的抗体分子。
(13-2)含有hVk5-2序列的CDR序列的改变抗体的钙离子结合活性的评价
钙离子与含有hVk5-2序列以外的生殖细胞系列序列(hVk1、hVk2、hVk3、hVk4)的框架序列和hVK5-2序列的CDR序列的改变抗体结合与否，通过实施例4所述的方法进行评价。评价结果示于表17。表明各改变抗体的Fab结构域的Tm值根据抗体溶液中的钙离子浓度变化而发生改变。所以，表明含有hVk5-2序列的框架序列以外的框架序列的抗体也与钙离子结合。即，表明hVk5-2序列的CDR序列所具有的模体对于与钙离子结合是重要的，确认框架序列可以为任意的框架。
[表17]
进而，以含有hVk5-2序列以外的生殖细胞系列序列(hVk1、hVk2、hVk3、hVk4)的框架序列和hVK5-2序列的CDR序列的方式进行改变的各抗体的Fab结构域的热稳定性的指标，即热变性温度(Tm值)与含有改变前的hVk5-2序列的抗体的Fab结构域的Tm值相比，显示有所增加。由该结果发现：含有hVk1、hVk2、hVk3、hVk4的框架序列和hVk5-2序列的CDR序列的抗体不仅具有与钙离子结合的性质，而且在热稳定性的观点上也是优异的分子。
〔实施例14〕人生殖细胞系列hVk5-2序列中存在的钙离子结合位点的鉴定
(14-1)hVk5-2序列的CDR序列中的突变位点的设计
如实施例13所述，含有将hVk5-2序列的CDR部分导入其它生殖细胞系列的框架序列中而得的轻链的抗体也显示与钙离子结合。该结果暗示hVk5-2中存在的钙离子结合位点存在于CDR中。作为与钙离子结合、即、螯合钙离子的氨基酸，可举出带负电的氨基酸或能够成为氢键受体的氨基酸。因此，评价含有hVk5-2序列的CDR序列中存在的Asp(D)残基或Glu(E)残基被置换为Ala(A)残基的突变hVk5-2序列的抗体是否与钙离子结合。
(14-2)hVk5-2序列的Ala置换体的制作以及抗体的表达和纯化
制作含有轻链的抗体分子，该轻链中，hVk5-2序列的CDR序列中存在的Asp和/或Glu残基被改变为Ala残基。如实施例12所述，不添加糖链的改变体hVk5-2_L65维持了钙离子结合，因而从钙离子结合性的观点出发，认为与hVk5-2序列等同。本实施例中，以hVk5-2_L65为模板序列进行氨基酸置换。制作的改变体示于表18。氨基酸的置换通过QuikChangeSite-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)、PCR或In fusion Advantage PCRcloning kit(TAKARA)等本领域技术人员公知的方法来进行，构建氨基酸被置换的改变轻链的表达载体。
[表18]
所得表达载体的碱基序列通过本领域技术人员公知的方法确定。将制得的改变轻链的表达载体，与重链CIM_H(序列编号：48)的表达载体一起瞬时地导入来源于人胎儿肾癌细胞的HEK293H细胞株(Invitrogen)、或FreeStyle293细胞(Invitrogen)中，由此表达抗体。从所得培养上清中，使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(GEヘルスケァ)，通过本领域技术人员公知方法纯化出抗体。使用分光光度计，测定纯化得到的抗体溶液的280nm下的吸光度。通过PACE法算出吸光系数，使用该吸光系数由所得的测定值计算抗体浓度(ProteinScience(1995)4，2411-2423)。
(14-3)含有hVk5-2序列的Ala置换体的抗体的钙离子结合活性评价
判断所得纯化抗体与钙离子是否结合。具体地，纯化的抗体用以20mM Tris-HCl、150mMNaCl、2mM CaCl2(pH7.5)或20mM Tris-HCl、150mM NaCl(pH7.5)的溶液(表19中记为钙离子浓度0μM)为外液的透析(EasySEP、TOMY)进行处理。将使用透析所用的溶液制备为大致0.1mg/mL的抗体溶液作为被测物质，从20℃至115℃以240℃/hr的升温速度进行DSC测定。基于所得DSC的变性曲线计算得到的各抗体的Fab结构域的热变性中间温度(Tm值)示于表19。通过将hVk5-2序列的CDR序列中存在的Asp或Glu残基置换为无法参与钙离子的结合或螯合的Ala残基，存在其Fab结构域的Tm值不会根据抗体溶液的钙离子浓度变化而改变的抗体。Tm值不因Ala置换而变化的置换位点(32位和92位(Kabat编号))显示对于钙离子和抗体的结合特别重要。
[表19]
〔实施例15〕含有具有钙离子结合模体的hVk1序列的抗体的钙离子结合活性的评价
(15-1)具有钙离子结合模体的hVk1序列的制作以及抗体的表达和纯化
实施例14所述的Ala置换体的钙结合活性的结果表明，hVk5-2序列的CDR序列中，Asp或Glu残基对于钙结合是重要的。因此，评价仅将30位、31位、32位、50位和92位(Kabat编号)的残基导入其它生殖细胞系列的可变区序列是否也能够与钙离子结合。具体地，将人生殖细胞系序列hVk1序列的30位、31位、32位、50位和92位(Kabat编号)的残基置换为hVk5-2序列的30位、31位、32位、50位和92位(Kabat编号)的残基，制作改变体LfVk1_Ca(序列编号：61)。即，判断含有仅导入了hVk5-2序列中的上述5个残基的hVk1序列的抗体能否与钙结合。改变体制作与实施例2相同地进行。使所得轻链改变体LfVk1_Ca和含有轻链hVk1序列的LfVk1(序列编号：62)与重链CIM_H(序列编号：48)一起表达。抗体的表达和纯化通过与实施例14相同的方法实施。
(15-2)含有具有钙离子结合模体的人hVk1序列的抗体的钙离子结合活性的评价
如上所述得到的纯化抗体是否与钙离子结合通过实施例4所述的方法来判断。其结果示于表20。含有具有hVk1序列的LfVk1的抗体的Fab结构域的Tm值未根据抗体溶液中的钙浓度变化而改变，而含有LfVk1_Ca的抗体序列的、Tm值根据抗体溶液中的钙浓度变化而改变1℃以上，因而表明含有LfVk1_Ca的抗体与钙结合。上述结果表明，钙离子的结合中，hVk5-2的全部CDR序列并不是必须的，仅构建LfVk1_Ca序列时导入的残基即足够。
[表20]
(15-3)分解抑制型LfVk1 Ca序列的构建、表达和纯化
实施例15的(15-2)中，将人生殖细胞系序列hVk1序列的30位、31位、32位、50位和92位(Kabat编号)的残基置换为hVk5-2序列的30位、31位、32位、50位和92位(Kabat编号)的残基，制作改变体LfVk1_Ca(序列编号：61)，其显示与钙离子结合。因此，可考虑含有LfVk1_Ca序列的Ca依赖性抗体(Ca结合抗体)，作为新序列的LfVk1_Ca序列在制为药品时的保存稳定性并不清楚，因而其作为药品的应用可能性不明。因此，通过LfVk1_Ca的热加速试验来评价稳定性。将具有LfVk1_Ca作为L链的抗体在20 mM Histidine-HCl、150 mM NaCl、pH6.0的溶液中在4℃条件下透析一夜。透析的抗体制备为0.5 mg/mL，在5℃或50℃保存3天。对于保存后的各抗体，通过实施例12所述的方法进行离子交换色谱。结果如图17所示，LfVk1_Ca在50℃保存3天时确认到显著分解。LfVk1_Ca序列中，Asp存在于30位、31位和32位(Kabat编号)，据报道在酸性条件下分解的Asp-Asp序列存在于CDR1序列中(J.Pharm.Biomed.Anal.(2008)47(1)，23-30)，因而认为30位、31位和32位(Kabat编号)可能是分解位置。因此，为了避免LfVk1_Ca的分解，将存在分解可能性的3个位置的Asp(D)残基置换为Ala(A)残基，制作改变体LfVk1_Ca1(序列编号：72)、LfVk1_Ca2(序列编号：73)和LfVk1_Ca3(序列编号：74)。氨基酸的置换通过使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)的本领域技术人员公知的方法进行。将编码改变体的DNA整合至动物表达用载体中。整合有所制作改变体的DNA的动物表达用载体，与按作为重链表达GCH(序列编号：102)的方式整合得到的动物表达用载体一起，通过实施例14中记载的方法一同导入动物细胞中。导入的动物细胞中表达的抗体通过实施例14所述的纯化。
(15-4)含有分解抑制型LfVk1 Ca序列的抗体的稳定性评价
实施例15的(15-3)中获得的抗体与含有改变之前的LfVk1_Ca序列的抗体相比，pH6.0溶液中的分解受到抑制与否通过比较热加速后的各抗体的异源性来进行评价。与上述相同地将抗体在5℃或50℃下保存3天。对于保存后的各抗体，通过实施例12所述的方法进行离子交换色谱。如图17所示，分析结果表明第30位(Kabat编号)位点被改变的LfVk1_Cal与原本的LfVk1_Ca序列相比异源性少，热加速导致的分解显著受到抑制。即，表明存在于LfVk1_Ca序列中的30位的Asp(D)残基发生分解，而且表明Asp残基的分解可以通过氨基酸改变来避免。
(15-5)轻链30位Asp残基分解抑制型LfVk1 Ca序列的制作以及抗体的表达和纯化
实施例15的(15-4)所述的Ala置换体的分解抑制结果表明：LfVk1_Ca序列的CDR序列中，30位(Kabat编号)的Asp(D)残基在酸性条件下分解，通过将30位(Kabat编号)置换为其它氨基酸((15-4)中是置换为Ala(A)残基)，可以抑制分解。因此，将30位(Kabat编号)的残基置换为能够螯合钙离子的残基之一的Ser(S)残基，评价所得的序列(称为LfVk1_Ca6，序列编号：75)是否在维持钙结合能力的同时抑制分解。改变体制作与实施例14相同地进行。使所得轻链改变体LfVk1_Ca6和轻链LfVk1_Ca序列与重链CrC_H(序列编号：102)一起表达。抗体的表达和纯化通过与实施例14相同的方法实施。
(15-6)轻链30位Asp残基分解抑制型LfVk1 Ca序列的评价
如上所述得到的纯化抗体在酸性条件下的保存稳定性通过实施例15的(15-4)所述的方法来判断。如图18所示，结果表明含有LfVk1_Ca6序列的抗体与含有原本LfVk1_Ca序列的抗体相比，分解受到抑制。
进而，含有LfVk1_Ca序列的抗体和含有LfVk1_Ca6序列的抗体是否与钙离子结合通过实施例15所述的方法来判断。结果示于表21。含有LfVk1_Ca序列的抗体和含有分解抑制型LfVk1_Ca6序列的抗体的Fab结构域的Tm值分别根据抗体溶液中的钙浓度变化而发生1℃以上改变。
[表21]
若考虑稳定性，则以上结果表明对于钙离子与抗体结合重要的是：30位是Asp以外的能与钙离子相互作用的氨基酸(Asn、Glu、Gln、Ser、Thr、His、Tyr等)、并且31位、32位、50位和92位(Kabat编号)的序列的全部或一部分是hVk5-2的氨基酸或能够与钙相互作用的氨基酸(Asp、Asn、Glu、Gln、Ser、Thr、His、Tyr等)。例如，只要可制作具有这种模体的合成文库，则认为可以从这种文库高效地获得钙依赖性结合抗体。
〔实施例16〕通过NMR评价含有具有钙离子结合模体的人hVk1序列的抗体的钙离子结合活性
(16-1)抗体的表达和纯化
纯化用于NMR测定而表达的含有LfVk1_Ca的抗体和含有LfVk1的抗体。具体地，将以可以分别表达含有LfVk1_Ca的抗体的重链(序列编号：13)和轻链(序列编号：61)的方式制备的动物表达用质粒瞬时地导入动物细胞。另外，将以可以分别表达含有LfVk1的抗体的重链(序列编号：13)和轻链(序列编号：62)的方式制备的动物表达用质粒瞬时地导入动物细胞。在以最终细胞密度为1x106细胞/mL的方式悬浮于FreeStyle 293 Expression Medium培养基(Invitrogen)的100mL来源于人胎儿肾细胞的FreeStyle 293-F细胞株(Invitrogen)的细胞悬浮液中，加入标记氨基酸。具体地，对于Asp/Glu/Gln/Asn标记体，加入将L-天冬氨酸-13C4，15N(10mg)、L-谷氨酸-13C5，15N(2.5mg)、L-谷氨酰胺-13C5，15N2(60mg)、L-天冬酰胺-13C4，15N2·H2O(2.5mg)、β-氯-L-丙氨酸(6mg)悬浮于10mL的水中、并将所得溶液用0.22μm过滤器过滤而得的液体。对于Leu标记体，加入将L-亮氨酸-15N(30mg)、β-氯-L-丙氨酸(6mg)悬浮于10mL水中、并将所得溶液用0.22μm过滤器过滤而得的液体。通过脂质体转染法将制备的质粒导入细胞。将导入了质粒的细胞在CO2培养箱(37℃、8％CO2、90rpm)中培养5天。根据使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)的本领域技术人员公知的方法，从如上所述得到的培养上清中纯化出抗体。使用分光光度计测定纯化得到的抗体溶液的280nm下的吸光度。通过PACE法算出吸光系数，使用该吸光系数由测定值计算抗体浓度(Protein Science(1995)4，2411-2423)。
(16-2)Fab片段的制备
使用分子量截留大小30,000MWCO的超滤膜，将各种抗体浓缩至8.2-11.8mg/mL。使用L-Cystein 1mM、EDTA 2mM、50mM乙酸/125mM Tris缓冲液(pH 6.8)，制备稀释到8mg/mL的该抗体的试样。对各抗体加入1/240量的木瓜蛋白酶(Roche Applied Science)，将经搅拌的该试样在37℃静置1小时。静置后，将它们分别添加至用50mM乙酸/125mM Tris缓冲液(pH6.8)进行了平衡的结合有Gly-Gly-Tyr-Arg(Sigma)肽的1mL大小的HiTrap NHS-activatedHP(GE Healthcare)，该HiTrap NHS-activated HP在下游串联连接有1mL大小的ProteinA载体柱HiTrap MabSelect Sure(GE Healthcare)。通过上游的Gly-Gly-Tyr-Arg肽除去活化木瓜蛋白酶，同时通过下游的ProteinA载体柱除去Fc片段和未消化抗体，可以得到Fab片段的纯化级分。为了防止Fab级分中所含的非活性木瓜蛋白酶活化，在Fab级分中添加10μM的半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64(Sigma)。应予说明，上述全部柱操作均在20至25℃的室温下实施。
(16-3)LfVk1 Ca抗体和LfVk1抗体的Fab片段的NMR试样制备
使用MWCO 5000的超滤器Vivaspin(Sartorius)，将抗体溶液通过离心浓缩至0.5mL。接着，将透析过滤杯设置于上述超滤器，将缓冲液置换为NMR用缓冲液：5mM d-BisTris，20 mMNaCl，0.001％(w/v)NaN3，5％(v/v)2H2O，pH 7.0(使用NaOH、HCl调节pH)(在透析过滤杯中添加上述缓冲液5mL，离心浓缩至0.5mL，该重复3次)，最后浓缩至0.25mL。最后，用NMR缓冲液洗涤超滤器，合并浓缩液，对于LfVk1_Ca抗体得到抗体溶液420μL，对于LfVk1抗体得到抗体溶液270μL。此时再次确认pH，根据需要通过NaOH、HCl调节为pH 7.0。使用UV测定器Nanodrop(Thermo Fisher Scientific)测定280nm下的吸光度，将280nm下的摩尔吸光系数设为70000 M-1·cm-1，对Fab片段进行定量。Leu标记LfVk1_Ca抗体、Leu标记LfVk1抗体は0.12mM、Asp、Glu、Ash、Gln标记LfVk1_Ca抗体、Asp、Glu、Ash、Gln标记LfVk1抗体为0.24mM。这些试样中，使用巴斯德吸管，将LfVk1_Ca抗体填充于直径5mm的NMR试样管(shigemi)中，将LfVk1抗体填充于直径5mm的水溶液用对称形微量试样管(shigemi)中。LfVk1_Ca抗体的Ca2+滴定实验中，向抗体溶液中依次添加相对于抗体使Ca2+为1、2、5、10、20摩尔的等量的CaCl2溶液。添加中使用的CaCl2溶液准备了溶解于NMR缓冲液的10、20、50、100mM CaCl2溶液。通过由现成制品将注射器部分延长而订制的微量注射器(ITO)，以添加容量为3-10μL范围的方式，将需要量的CaCl2溶液直接添加至填充于NMR试样管中的抗体溶液中，将试样管通过旋涡混合器搅拌后，通过手动离心器(Shimadzu)进行离心分离。
(16-4)用于观测LfVk1 Ca抗体和LfVk1 Ca抗体的Fab片段的酰胺基信号的NMR测 定
NMR测定中使用设置有TCI CryoProbe的NMR分光器DRX750(Bruker Biospin)。使设定温度为307K(GasFlow 535L/h)。用于观测酰胺基信号的NMR测定中使用1H-15N HSQC。作为测定方法，使用伴有用于在15N展开期将α碳和羰基碳同时13C去耦、和溶剂水信号消去的3-9-19脉冲列的1H-15N FHSQC，作为对其进行控制的脉冲程序，使用厂商(Bruker Biospin)准备的标准程序。NMR测定条件如下所述设定。谱宽：12019Hz(f2)，1976Hz(f1)、数据点数：2048(f2)，128(f1)。数据处理使用Topspin 3.0(Bruker Biospin)。数据处理条件如下所述设定。f2、f1均乘以作为窗函数的位移平方正弦(QSINE)，以为2倍数据点数的方式进行零填充后，进行傅里叶变换。信号的化学位移使用NMR分析软件Sparky(UCSF)来计算。
(16-5)主链酰胺基的NMR信号的归属
迄今为止，托珠单抗(重链序列编号：13、轻链序列编号：14)的Fab片段的主链酰胺基的NMR信号中，已归属了80％(数据未公开)。LfVk1_Ca抗体的Fab片段的氨基酸序列中，除去轻链CDR1、CDR2、CDR3的一部分、和轻链73、83位的氨基酸残基，与托珠单抗的Fab片段的氨基酸序列相同。对于两抗体中氨基酸序列相同的部分，其NMR信号具有相同的化学位移、或化学位移相近，因而可以转用托珠单抗的归属信息。对于Leu标记试样，轻链11、(33)、(46)、(47)、(54)、(78)、125、135、136、154、175、179、181、201、重链18、46、64、71、81、83、114、144、147、165、176、181、184、195的归属可以转用。上述、未带括号的编号由于与托珠单抗为相同化学位移因此为归属可转用的残基编号；带括号的编号为与托珠单抗具有相近化学位移、且除此以外不存在具有相近化学位移的信号因而是可归属的残基编号。另一方面，对于Asp、Glu、Ash、Gln标记试样，对LfVk1_Ca抗体和LfVk1抗体的光谱进行比较，在LfVk1_Ca中新观测到4个信号。它们可以分类为：在这两抗体间，Asp、Glu、Asn、Gln残基中，导入作为Ca2+结合模体的序列不同的轻链Asp30、31、32、92、Glu50这5个残基中的任意4个残基来源。
(16-6)Ca2+的LfVk1 Ca抗体上的结合位点的鉴定
对LfVk1_Ca抗体的Fab片段的Ca2+未添加状态、和20摩尔当量添加的1H-15N HSQC光谱进行比较，提取化学位移发生变化的信号。由来自Leu标记试样的结果可知，轻链Leu33参与结合，除此以外的Leu残基未参与结合。另外，由Asp、Glu、Asn、Gln标记试样可知，轻链Asp30、31、32、92、Glu50这5个残基中的任意4个残基参与结合，其以外的Asp、Glu、Asn、Gln残基中除了1个残基之外全部未参与结合。由以上结果鉴定，作为Ca2+结合模体导入的氨基酸序列中，至少轻链CDR1、除此此外轻链CDR2、CDR3的两者或任一者氨基酸参与Ca2+结合。该结果与实施例15中确认到的对钙离子结合是重要的是30位、31位、32位、50位和92位(Kabat编号)中的4个是hVk5-2序列的氨基酸的结果一致。
(16-7)滴定实验中的Ca2+解离常数的计算
利用Ca2+浓度相对于LfVk1_Ca抗体的Fab片段为0、1、2、5、10、20摩尔当量时的1H-15NHSQC光谱。以鉴定为结合位点的轻链Leu33的信号的1H或15N化学位移为纵轴，以上述Ca2+的摩尔当量为横轴进行描点，使用作图软件Gnuplot，进行下述式2所示的函数的拟合。
〔式2〕
式2所示的函数中，s、t分别表示Ca2+非结合时的化学位移[ppm]、Ca2+饱和结合时的推测化学位移[ppm]、a表示抗体Fab片段浓度[M]、Kd表示解离常数、x表示对抗体Fab片段添加的Ca2+的摩尔当量。拟合时将s，t，Kd作为拟合参数。结果，由1H化学位移预测Kd＝7.1×10-5[M]，由15N化学位移预测Kd＝5.9×10-5[M]。
〔实施例17〕hVk5-2变体序列的钙结合评价
除Vk5-2(序列编号：41)之外，得到了也分类为Vk5-2的Vk5-2变体1(序列编号：63)和Vk5-2变体2(序列编号：64)。对于这些变体也进行钙结合评价。将Vk5-2、Vk5-2变体1和Vk5-2变体2的DNA片段分别整合至动物细胞用表达载体中。所得表达载体的碱基序列通过本领域技术人员公知的方法确定。分别整合有Vk5-2、Vk5-2变体1和Vk5-2变体2的DNA片段的动物细胞用表达载体，与按作为重链表达CIM_H(序列编号：48)的方式整合得到的动物表达用载体一起，通过实施例13所述的方法一同导入动物细胞中，并纯化抗体。评价纯化的抗体的钙离子结合活性。纯化的抗体用以20mM Tris-HCl、150mM NaCl、2mM CaCl2(pH7.5)或20mMTris-HCl、150mM NaCl(pH7.5)的溶液(表22中记为钙离子浓度0mM)为外液的透析(EasySEP、TOMY)进行处理。将使用透析所用的溶液制备为大致0.1mg/mL的抗体溶液作为被测物质，从20℃至115℃以240℃/hr的升温速度进行DSC测定。基于所得DSC的变性曲线计算得到的各抗体的Fab结构域的热变性中间温度(Tm值)示于表22。
[表22]
结果，含有Vk5-2、Vk5-2变体1和Vk5-2变体2的序列的抗体的Fab结构域的Tm值根据含有该Fab结构域的抗体溶液中的钙离子浓度而发生了改变，表明具有分类为Vk5-2的序列的抗体与钙离子结合。
〔实施例18〕钙依赖性地与人CD4结合的抗体
(18-1)可溶型人CD4的制备
可溶型人CD4如下所述制备。将编码在跨膜区缺失的人CD4氨基酸序列中添加Myc标签而成的序列(序列编号：76)的DNA序列整合至动物细胞表达用载体中。制作的重组人CD4序列通过本领域技术人员公知的方法确认。
(18-2)与可溶型人CD4结合的抗体的表达和纯化
TNX355-IgG1(重链序列编号：77、轻链序列编号：78)和Q425(重链序列编号：79、轻链序列编号：80)为抗人CD4抗体。进而Q425L9(重链序列编号：81、轻链序列编号：82)是Q425的L链改变体。将编码TNX355-IgG1(重链序列编号：77、轻链序列编号：78)、Q425(重链序列编号：79、轻链序列编号：80)和Q425L9(重链序列编号：81、轻链序列编号：82)的氨基酸的DNA序列导入动物细胞表达用质粒中。抗体的表达使用以下方法进行。将来源于人胎儿肾细胞的FreeStyle 293-F细胞株(Invitrogen)在FreeStyle 293 Expression Medium培养基(Invitrogen)中悬浮，以1.33x 106细胞/mL的细胞密度接种于6孔板的各孔各3mL。制备的质粒通过脂质体转染法导入细胞。在CO2培养箱(37℃、8％CO2、90rpm)中进行4天培养。使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，采用本领域技术人员公知的方法，从上述得到的培养上清中纯化抗体。使用分光光度计测定纯化得到的抗体溶液的280nm下的吸光度。通过PACE法算出吸光系数，使用该吸光系数由所得的测定值计算抗体浓度(Protein Science(1995)4，2411-2423)。
(18-3)获得的抗体对人CD4的钙依赖性结合能力评价
获得的抗体对可溶型人CD4的钙依赖性结合能力使用Biacore T100(GE Healthcare)进行评价。高钙离子浓度使用1.2mM，低钙离子浓度的条件使用3μM。抗原使用可溶型人CD4(18-1中制备)。在Sensor chip CM4(GE Healthcare)上，以胺偶联法将适当量的蛋白质G(Invitrogen)固定化，并在其上捕获目标抗体。流动缓冲液使用含有1.2mmol/L CaCl2或3μmol/L CaCl2的10mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05％(w/v)Tween20、1.2mmol/L CaCl2、pH7.4或pH6.0。测定均在37℃下实施，人CD4的稀释也使用了各缓冲液。抗体的传感图示于图19。如图19所示，对于TNX355-IgG1抗体，即使流动缓冲液的条件发生变化，传感图的形状也未变化，因此确认TNX355-IgG1是对人CD4不显示钙依赖性结合活性的普通抗体。另一方面，对于Q425抗体和Q425L9抗体，钙离子浓度为3μM(低钙离子浓度)时的抗原结合量均少于钙离子浓度为1.2mM(高钙离子浓度)时的抗原结合量，均显示出Ca依赖性结合能力。特别是Q425L9抗体，在钙离子浓度为3μM时，即使用200nM的分析物(可溶性人CD4)进行测定时也完全没有观测到结合相。即，确认Q425抗体和Q425L9抗体是对人CD4显示钙依赖性结合活性的钙依赖性结合。
〔实施例19〕使用正常小鼠评价Ca依赖性结合抗体对抗原的血浆中滞留性的影响
(19-1)使用正常小鼠的体内试验
实施例18中制备的Q425和Q425L9是钙依赖性地与可溶型人CD4结合的抗体。但是，迄今为止，对于实施例5和实施例6所示的IL6R来说，已经明确了同时给予具有钙依赖性地与抗原结合的性质的抗体与抗原的情形，与同时给予没有钙依赖性地与抗原结合的性质的抗体和抗原的情形相比，具有使抗原的消除加速的性质，而对于其它抗原是否也具有加速抗原消除的性质尚不清楚。
因此，对正常小鼠(C57BL/6J mouse、Charles River Japan)单独给予可溶型人CD4(实施例18中制备)或同时给予可溶型人CD4和抗人CD4抗体，然后评价可溶型人CD4和抗人CD4抗体的体内动力学。对尾静脉以10mL/kg单次给予可溶型人CD4溶液(50μg/mL)、或可溶型人CD4和抗人CD4抗体的混合溶液。作为抗人CD4抗体，使用上述TNX355-IgG1、Q425-IgG1、Q425L9-IgG1。
混合溶液中的可溶型人CD4浓度均为50μg/mL，但抗人CD4抗体浓度根据每个抗体而有所不同，TNX355-IgG1为0.264mg/mL、Q425-IgG1为0.197mg/mL、和Q425L9-IgG1为2.594mg/mL，此时，相对于可溶型人CD4，由于抗人CD4抗体过量存在，因而认为可溶型人CD4大部分与抗体结合。给予后，单独给予可溶型人CD4的组在2分钟、5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时进行采血。同时给予可溶型人CD4和没有钙依赖性抗原结合能力的TNX355-IgG1的组在给予后5分钟、2小时、7小时、1天、3天、7天、14天、28天进行采血。同时给予可溶型人CD4和具有钙依赖性抗原结合能力的Q425-IgG1和Q425L9-IgG1的组在给予后5分钟、30分钟、2小时、7小时、1天、3天、8天、14天、28天进行采血。采集的血液立即在4℃、12,000rpm下离心分离15分钟，得到血浆。分离的血浆直至实施测定为止，保存在设定为-20℃以下的冰箱中。
(19-2)通过ELISA法测定正常小鼠血浆中的抗人CD4抗体浓度
小鼠血浆中的抗人CD4抗体浓度通过ELISA法进行测定。首先，将抗体的抗人IgG-(γ-链特异性)F(ab′)2片段(SIGMA)分配与Nunc-Immuno Plate，MaxiSoup(Nalge nuncInternational)，在4℃静置1晚，制作抗人IgG固定化板。制备血浆中浓度调整为0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01μg/mL的校准曲线试样和稀释100倍以上的小鼠血浆测定试样，分配于抗人IgG固定化板，在25℃孵育1小时。然后，与生物素化抗人IL-6R抗体(R&D)在25℃反应1小时，进而与链霉亲和素-PolyHRP80(Stereospecific DetectionTechnologies)在25℃反应0.5小时，使用TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)作为底物进行显色反应，用1N-硫酸(Showa Chemical)终止反应后，用酶标仪测定450nm的吸光度。小鼠血浆中浓度是使用分析软件SOFTmax PRO(MolecularDevices)，根据校准曲线的吸光度算出。
通过该方法测定的静脉内给药后的正常小鼠中TNX355-IgG1、Q425-IgG1和Q425L9-IgG1的血浆中抗体浓度变化示于图20。
(19-3)通过电化学发光法测定血浆中可溶型人CD4浓度
小鼠的血浆中可溶型人CD4浓度通过ELISA法进行测定。
对于sCD4单独给予组和与Q425、Q425_L9同时给予的组，将TNX分配于Nunc-ImmunoPlate，MaxiSoup(Nalge nunc International)中，在4℃静置1晚，制作TNX固定化板。作为血浆中浓度，用加入有10mM EDTA的Buffer制备10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156μg/mL的校准曲线试样和稀释100倍以上的小鼠血浆测定试样，分配于TNX固定化板中，在25℃孵育3小时。然后，与Anti-c-myc-HRP(Miltenyi Biotech)在25℃反应1小时，使用TMB OneComponent HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)作为底物进行显色反应，用1N-硫酸(Showa Chemical)终止反应后，用酶标仪测定450nm的吸光度。小鼠血浆中浓度是使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)，根据校准曲线的吸光度算出。
对于与TNX同时给予的组，将Q425分配于Nunc-Immuno Plate，MaxiSoup(Nalgenunc International)中，在4℃静置1晚，制作Q425固定化板。作为血浆中浓度，用加入有2mM Ca2+的Buffer制备20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μg/mL的校准曲线试样和稀释100倍以上的小鼠血浆测定试样，分配于TNX固定化板中，在25℃孵育3小时。然后，与Anti-c-myc-HRP(Miltenyi Biotech)在25℃反应1小时，使用TMB One Component HRP MicrowellSubstrate(BioFX Laboratories)作为底物进行显色反应，用1N-硫酸(Showa Chemical)终止反应后，用酶标仪测定450nm的吸光度。小鼠血浆中浓度是使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)，根据校准曲线的吸光度算出。
通过该方法测定的静脉内给予后的正常小鼠中的血浆中可溶型人CD4浓度变化示于图21。
结果，可溶型人CD4单独给予显示非常快速的消除，而同时给予可溶型人CD4和没有Ca依赖性结合的普通抗体TNX355-IgG1时，可溶型人CD4的消除大幅变慢。与之相对，同时给予可溶型人CD4和具有Ca依赖性结合的Q425-IgG1或Q425L9-IgG1时，可溶型人CD4的消除大幅加速。与同时给予TNX355-IgG1的情形相比，同时给予Q425-IgG1或Q425L9-IgG1的情形可以促进可溶型人CD4的消除。由此，对于IL-6R和人CD4均确认到，钙依赖性结合抗体可以实现抗原从血浆中的消除。
〔实施例20〕钙依赖性地与人IgA结合的抗体
(20-1)人IgA(hIgA)的制备
抗原人IgA的重组人IgA(以下为hIgA)如下所述制备。使含有H(WT)-IgA1(序列编号：83)和L(WT)(序列编号：14)的hIgA表达，通过本领域技术人员公知方法，使用离子交换色谱法和凝胶过滤色谱法进行纯化。
(20-2)与人IgA结合的抗体的表达和纯化
GAl-IgG1(重链序列编号：84、轻链序列编号：85)、GA2-IgG1(重链序列编号：86、轻链序列编号：87)、GA3-IgG1(重链序列编号：88、轻链序列编号：89)和GA4-IgG1(重链序列编号：90、轻链序列编号：91)是与人IgA结合的抗体。进而，与实施例6和实施例7相同地，为了进一步增大抗原(hIgA)从血浆中的消除，对GA2-IgG1导入N434W的氨基酸置换以增强pH7.4下对小鼠FcRn的结合，从而制得GA2-N434W(重链序列编号：92、轻链序列编号：87)。将编码GAl-IgG1(重链序列编号：84、轻链序列编号：85)、GA2-IgG1(重链序列编号：86、轻链序列编号：87)、GA3-IgG1(重链序列编号：88、轻链序列编号：89)、GA4-IgG1(重链序列编号：90、轻链序列编号：91)和GA2-N434W(重链序列编号：92、轻链序列编号：87)的DNA序列通过本领域技术人员公知的方法整合至动物表达用质粒中。抗体的表达使用以下方法进行。将来源于人胎儿肾细胞的FreeStyle 293-F细胞株(Invitrogen)悬浮于FreeStyle 293 ExpressionMedium培养基(Invitrogen)中，以1.33×106个/mL的细胞密度向6孔板的各孔接种各3mL，通过脂质体转染法将制备的质粒导入细胞。在CO2培养箱(37℃、8％CO2，90rpm)中进行4天培养，使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，通过本领域技术人员公知的方法从所得培养上清中纯化抗体。纯化抗体浓度使用分光光度计测定280nm下的吸光度。通过PACE法算出吸光系数，使用该吸光系数由所得的值计算抗体浓度(ProteinScience 1995，4：2411-2423)。
(20-3)获得的抗体对人IgA的Ca依赖性结合能力评价
对于获得的抗体，使用Biacore T200(GE Healthcare)，对人IgA结合活性(解离常数KD(M))进行评价。作为流动缓冲液，使用含有3μM或1.2mM CaCl2的0.05％tween20，20mmol/lACES，150mmol/lNaCl(pH7.4和pH5.8)、含有0.1μM或10mM CaCl2的0.05％tween20，20mmo1/l ACES，150mmol/l NaCl、pH8.0，进行测定。
在Sensor chip CM5(GE Healthcare)上，以氨基偶联法将适当量的重组型蛋白质A/G(Thermo Scientific)固定化后，使之与抗体结合。注入作为分析物的适当浓度的hIgA((20-1)中记载)，使之与传感器芯片上的抗体相互作用。然后，注入10mmol/L Glycine-HCl，pH1.5，将传感器芯片再生。测定在37℃下进行。测定结果使用Biacore T200Evaluation Software(GE Healthcare)，通过基于曲线拟合的解析和平衡值分析，计算解离常数KD(M)。结果示于表23。另外，所得传感图示于图22。清楚表明，GA2-IgG1、GA3-IgG1、GA4-IgG1在Ca2+浓度为1.2mM时与人IgA强结合，在Ca2+浓度为3μM时与人IgA弱结合。
[表23]
〔实施例21〕使用正常小鼠评价Ca依赖性人IgA结合抗体对抗原的血浆中滞留性的影响
(21-1)使用正常小鼠的体内试验
对于正常小鼠(C57BL/6J mouse、Charles River Japan)，单独给予人IgA(人IgA：实施例20中制作)或同时给予人IgA和抗人IgA抗体，然后评价人IgA和抗人IgA抗体的体内动力学。对尾静脉以10mL/kg单次给予人IgA溶液(80μg/mL)、或人IgA和抗人IgA抗体的混合溶液。抗人IgA抗体使用上述GA1-IgG1、GA2-IgG1、GA3-IgG1和GA2-N434W。
混合溶液中的人IgA浓度均为80μg/mL，但抗人IgA抗体浓度则根据各抗体对hIgA的亲和性而每个抗体有所不同，GA1-IgG1为100mg/mL、GA2-IgG1为28.9mg/mL、GA3-IgG1为53.8mg/mL、GA2-N434W为1mg/mL。此时，相对于人IgA，由于抗人IgA抗体过量地存在，因而认为人IgA的大部分与抗体结合。在给予后5分钟、7小时、1天、2天、3天、7天进行采血。采集的血液立即在4℃、12,000rpm下离心分离15分钟，得到血浆。分离的血浆直至实施测定为止，保存在设定为-20℃以下的冰箱中。
(21-2)通过ELISA法测定正常小鼠血浆中的抗人IgA抗体浓度
小鼠血浆中的抗人IgA抗体浓度通过ELISA法测定。首先，将抗人IgG(γ-chainspecific)F(ab′)2Fragment of Antibody(SIGMA)分配于Nunc-Immuno Plate，MaxiSoup(Nalge nunc International)中，在4℃静置1晚，制作抗人IgG固定化板。制备血浆中浓度调整为0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.01563、0.07813μg/mL的校准曲线试样和稀释了100倍以上的小鼠血浆测定试样，分配于抗人IgG固定化板中，在25℃孵育1小时。然后，与山羊抗人IgG(γ链特异性)Biotin(BIOT)Conjugate(Southern Biotechnology AssociatsInc.)在25℃反应1小时，进而与链霉亲和素-PolyHRP80(Stereospecific DetectionTechnologies)在25℃反应1小时，使用TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)作为底物进行显色反应，用1N-硫酸(Showa Chemical)终止反应后，用酶标仪测定450nm的吸光度。小鼠血浆中浓度是使用分析软件SOFTmax PRO(MolecularDevices)，根据校准曲线的吸光度算出。通过方法测定的静脉内给药后的正常小鼠中的GA1-IgG1、GA2-IgG1、GA3-IgG1和GA2-N434W的血浆中抗体浓度变化示于图23。
(21-3)通过ELISA法测定血浆中人IgA浓度
小鼠的血浆中人IgA浓度通过ELISA法进行测定。首先，将山羊抗人IgA抗体(BETHYL)分配于Nunc-Immuno Plate，MaxiSoup(Nalge nunc International)中，在4℃下静置1晚，制作抗人IgA固定化板。制备血浆中浓度调整为0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625μg/mL的人IgA校准曲线试样和稀释100倍以上的小鼠血浆测定试样，在这些校准曲线试样和血浆测定试样100μL中加入200μL的500ng/mL的hsIL-6R，在室温静置1小时。然后，分配于抗人IgA固定化板中，进而在室温静置1小时。然后，与生物素化抗人IL-6R抗体(R&D)在室温反应1小时，进而与链霉亲和素-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)在室温反应1小时，使用TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)作为底物进行显色反应，用1N-硫酸(Showa Chemical)终止反应后，用酶标仪测定450nm的吸光度。小鼠血浆中浓度是使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)，根据校准曲线的吸光度算出。通过该方法测定的静脉内给药后的正常小鼠中的血浆中人IgA浓度变化示于图24。
结果，相对于单独给予人IgA时的消除，同时给予与人IgA的Ca依赖性结合弱(依赖性程度小)的抗体GA1-IgG1时，人IgA的消除变慢。与之相对，同时给予与人IgA具有100倍以上的Ca依赖性结合的GA2-IgG1时，人IgA的消除大幅加速。基于图23所示的血浆中抗体浓度、图24所示的血浆中人IgA浓度和表23所示的各抗体的KD值，求出血浆中存在的非结合型的人IgA浓度。其结果示于图25。如图25所示，与GA1-IgG1给药组的非结合型抗原(人IgA)的浓度相比，GA2-IgG1或GA3-IgG1给药组的非结合型抗原(人IgA)的浓度较低，因而表明，通过使用钙依赖性结合抗体来加速抗原的消除，可以使非结合型抗原(人IgA)降低。进而，增强了pH7.4时的FcRn结合的GA2-N434W与GA2-IgG1相比，更快地将抗原消除，给予7小时后达到检测限以下。
以上结果确认，钙依赖性结合抗体与并不pH或钙依赖性地结合的普通抗体相比，可加速抗原从血浆中的消除，明确了该现象不仅对实施例5所示的人IL6R、实施例19所示的人CD4，而且对人IgA也发生。另外，与实施例6和实施例7的人IL6R相同地，对人IgA也确认到，通过增强钙依赖性结合抗体在pH7.4下的FcRn结合，可进一步加速抗原的消除。
如参考实施例31所示，pH依赖性地与人IL-6受体结合的Fv4-IgG1与非pH依赖性地与人IL-6受体结合的H54/L28-IgG1相比，虽然可加速人IL-6受体的消除，但与单独给予人IL-6受体相比，并不能加速消除。为了与单独给予人IL-6受体相比能加速消除，需要使用增强了中性区域下对FcRn的结合的Fv4-IgG1-v1或Fv4-IgG1-v2。
另一方面，令人惊讶地发现，Ca依赖性地与人IgA结合的GA2-IgG1，尽管含有中性区域下对FcRn的结合未增强的天然型IgG1的恒定区，但与单独给予人IgA相比，却加速人IgA的消除。该现象在GA2-IgG1中发生的原因认为是下述机理。
人IL-6受体等单价抗原的情形中，相对于2价抗体，抗原会结合2个，形成由3分子的抗原抗体构成的抗原抗体复合体。另一方面，人IgA为二价抗原，由于抗体也为2价，因而认为两者的抗原抗体复合体会形成由4分子以上的抗原抗体构成的抗原抗体复合体(免疫复合体)。
针对多价抗原的天然IgG1型普通抗体形成大的免疫复合体时，该免疫复合体可通过多价的Fc区介导的亲和力与FcgR、FcRn、补体受体等结合，因而被摄入表达这些受体的细胞中，而不具有pH/Ca依赖性的针对单价抗原的普通抗体由于对天然IgG1型等受体的亲和性不足，因而被摄入细胞的效率低。FcRn原本具有将被摄入细胞内的抗体从内体再循环至血浆中的作用，但能够以多价与这种FcRn结合的大的免疫复合体却被已知会经由FcRn而从内体转移至溶酶体并被分解。即，如图26所示，相对于多价抗原而形成大的免疫复合体的普通抗体虽然可以可以加速该抗原的消除，但由于即使在内体内、抗原也不从抗体解离，因而抗体会与抗原一起消除，所以每1分子抗体的抗原消除效率差。即，不具有pH/Ca依赖性的针对单价抗原的普通抗体虽然可以加速抗原的消除，但认为其效率差。
与之相对，含有针对多价抗原的天然型IgG1的恒定区的pH/Ca依赖性抗体在形成大免疫复合体时，如图27所示，该免疫复合体通过多价的Fc区介导的亲和力而与FcgR、FcRn、补体受体等结合，从而被摄入表达这些受体的细胞中。然后，在内体内通过抗原从pH/Ca依赖性抗体解离，免疫复合体的形成被取消。抗原不能与FcRn结合，因而被转移至溶酶体而分解，与之相对，抗体由于没有形成免疫复合体，因而认为会被FcRn再循环至血浆中。
即，含有针对多价抗原的天然IgG1型的恒定区的pH/Ca依赖性抗体形成大免疫复合体，只要可通过亲和力与FcgR、FcRn、补体受体等结合，则认为可以选择性地仅大幅加速抗原的消除。认为该现象对于针对人IgA的GA2-IgG1也会发生。认为这可用作大幅加速多价抗原的消除的方法，而不需使用如参考实施例31所示的通过氨基酸置换来增强中性区域下FcRn对天然型IgG1的结合的方法。
为了发挥这种作用，认为需要抗原抗体形成大免疫复合体，即使是IgG1也需要通过亲和力与FcgR/FcRn强结合。抗原若为二价以上的抗原，只要能够筛选形成大免疫复合体、并且通过亲和力与上述受体结合的pH/Ca依赖性抗体，则通过使用天然型IgG1的恒定区即可高效地加速抗原的消除，而不需进行氨基酸置换。另外，通常认为，为了抗原和抗体形成大免疫复合体，抗原需要为多价抗原(例如IgA，IgE等免疫球蛋白或TNF、CD154等TNF超级家族)，但即使是单价抗原时，认为通过使用识别该单价抗原中存在的2个以上表位的合适的2种以上的pH/Ca依赖性抗体的混合物，也可以形成大免疫复合体。另外，认为通过使用识别单价抗原中存在的2个以上表位的合适的多特异性pH/Ca依赖性抗体(例如，如图28所示的包含天然型IgG的恒定区的双特异性抗体，该天然型IgG的恒定区含有识别表位A的右臂与识别表位B的左臂)，也可以形成大免疫复合体。即，认为即使是针对单价抗原，只要可以筛选合适的pH/Ca依赖性抗体，则通过使用含有天然型IgG1的恒定区的抗体的混合物、或多特异性的含有天然型IgG1的恒定区的抗体，也可以高效地加速抗原的消除，而不需使用其氨基酸被置换得到的突变型IgG1。
〔实施例22〕钙依赖性地与人磷脂酰肌醇聚糖3结合的抗体
(22-1)人磷脂酰肌醇聚糖3(GPC3)的制备
用作抗原的重组人磷脂酰肌醇聚糖3(以下GPC3)如下所述制备。将表达人磷脂酰肌醇聚糖3的不含跨膜区的氨基酸序列与6个组氨酸残基连接而成的序列(序列编号：93)的质粒稳定地导入CHO细胞，培养该细胞，回收培养上清。对所得培养上清进行离子交换色谱纯化后，进行使用His标签的亲和性纯化和凝胶过滤色谱纯化，得到GPC3。
(22-2)与人GPC3结合的抗体的表达和纯化
将作为抗人磷脂酰肌醇聚糖3抗体的CSCM-01_005(重链序列：94、轻链序列：95)、CSCM-01_009(重链序列：96、轻链序列：97)、CSCM-01_015(重链序列：98、轻链序列：99)、CSCM-01_023(重链序列：100、轻链序列：101)和GC-IgG1(重链序列：102、轻链序列：103)分别***动物表达用质粒中。抗体的表达使用以下方法进行。将来源于人胎儿肾细胞的FreeStyle293-F细胞株(Invitrogen)悬浮于FreeStyle 293 Expression Medium培养基(Invitrogen)中，以1.33×106个/mL的细胞密度向6孔板的各孔接种各3mL，通过脂质体转染法将制备的质粒导入细胞。在CO2培养箱(37℃、8％CO2，90rpm)中进行4天培养，使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，通过本领域技术人员公知的方法从所得培养上清中纯化抗体。纯化抗体浓度使用分光光度计测定280nm下的吸光度。通过PACE法算出吸光系数，使用该吸光系数由所得的值计算抗体浓度(Protein Science1995；4：2411-2423)。应予说明，对于GC-IgG1抗体，从稳定表达GC-IgG1抗体的CHO细胞培养上清中，通过同样的方法纯化抗体，计算浓度。
(22-3)获得的抗体对人GPC3的Ca依赖性结合能力评价
获得的抗体通过以下步骤供ELISA。将StreptaWell 96微量滴定板(Roche)用含有生物素标记抗原的100μL的PBS包被一夜。将该板的各孔用ACES缓冲液(10mM ACES，150mM NaCl，100mM CaCl2，0.05％Tween20，pH7.4)洗涤，由此除去抗原后，将该孔用含有2％BSA的ACES缓冲液250μL封闭1小时以上。在除去了含有2％BSA的ACES缓冲液的各孔中，加入预先从10μg/mL起以4倍稀释比率进行了系列稀释的纯化IgG各100μL，将该板静置一小时，由此使IgG与各孔中存在的抗原结合。用ACES缓冲液洗涤各孔，向其中加入“10mM ACES，150mM NaCl，1.2mN CaCl2，pH7.4”、“10mM ACES，150mM NaCl，3μM CaCl2，pH7.4”、“10mM ACES，150mMNaCl，1.2mM CaCl2，pH5.8”或“10mM ACES，150mM NaCl，3μM CaCl2，pH5.8”，将该板在37℃静置30分钟进行孵育。用ACES缓冲液洗涤后，向各孔中添加通过含有2％BSA的ACES缓冲液稀释的HRP结合抗人IgG抗体(BIOSOURCE)，将板孵育1小时。用ACES缓冲液洗涤后，添加TMBsingle溶液(ZYMED)，各孔中溶液的显色反应通过添加硫酸终止后，通过450nm的吸光度对该显色进行测定。
测定结果示于图29。结果，对于GC-IgG1，吸光度并未根据钙离子浓度发生改变，对于CSCM-01_005、CSCM-01_009、CSCM-01_015和CSCM-01_023，与1.2mM钙离子浓度(高钙离子浓度)下的吸光度相比，3μM钙离子浓度(低钙离子浓度)下的吸光度显著地低。由该结果表明，CSCM-01_005、CSCM-01_009、CSCM-01_015和CSCM-01_023具有根据钙离子浓度而改变与抗原的结合的性质，表明即使是对人磷脂酰肌醇聚糖3，也可以获得钙依赖性抗体。这些钙依赖性抗人磷脂酰肌醇聚糖3抗体与普通的抗人磷脂酰肌醇聚糖3抗体相比，认为与上述实施例中的人IL-6R、人CD4、人IgA相同地，可以加速人磷脂酰肌醇聚糖3的消除。进而，相对于这些钙依赖性抗人抗磷脂酰肌醇聚糖3抗体，通过增强pH7.4下对FcRn的结合，认为可以进一步加速人磷脂酰肌醇聚糖3的消除。
〔实施例23〕钙依赖性地与IgE结合的抗体
(23-1)生物素化人IgE的制备
作为抗原的人IgE如下所述制备。制作***了编码IgE-H(序列编号：104、C末端连接有生物素添加序列)和L(WT)(序列编号：14)的DNA序列的动物细胞表达载体，使用该表达载体和FreeStyle293(Invitrogen)，使C末端结合有生物素添加序列的全长人IgE蛋白质表达于培养上清中。进行离子交换色谱、使用亲和素的亲和性纯化以及凝胶过滤色谱纯化，从所得培养上清中获得生物素化人IgE。
(23-2)与人IgE结合的抗体的表达和纯化
GEB0100(重链序列编号：105、轻链序列编号：106)、GEB0220(重链序列编号：107、轻链序列编号：108)、GEB0230(重链序列编号：109、轻链序列编号：110)和Xolair(重链序列编号：111、轻链序列编号：112)是与人IgE结合的抗体。将GEB0100(重链序列编号：105、轻链序列编号：106)、GEB0220(重链序列编号：107、轻链序列编号：108)、GEB0230(重链序列编号：109、轻链序列编号：110)和Xolair(通用名Omalizumab)(重链序列编号：111、轻链序列编号：112)通过本领域技术人员公知的方法分别整合至动物表达用质粒中。抗体的表达使用以下方法进行。向来源于人胎儿肾细胞的FreeStyle 293-F细胞株(Invitrogen)，通过脂质体转染法将制备的质粒导入细胞。在CO2培养箱(37℃、8％CO2，90rpm)中进行4至7天培养，使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，通过本领域技术人员公知的方法，从所得培养上清纯化抗体。纯化抗体浓度使用分光光度计测定280nm下的吸光度。通过PACE法算出吸光系数，使用该吸光系数由所得的值计算抗体浓度(ProteinScience 1995；4：2411-2423)。
(23-3)获得的抗体对人IgE的Ca依赖性结合能力的评价
获得的抗体对人IgE的Ca依赖性结合能力的评价使用ELISA法进行。具体地，在NUNCImmuno 384孔板MaxiSorp(Thermo fisher scientific社制464718)中加入1μg/mL的山羊抗兔IgG-Fc多克隆抗体(Bethyl laboratory社制A120-111A)或1μg/mL的山羊抗人IgG-Fc多克隆抗体(ICN biomedicals社制55071)40μL。在室温孵育1小时后，除去溶液，加入稀释至20％的Blocking One试剂(ナカライテスク社制03953-95)50μL。在室温孵育1小时后，除去溶液，加入用含有1.2mM氯化钙的Tris缓冲液稀释的纯化抗体40μL。在4℃孵育一夜后，用含有1.2mM氯化钙和0.05％(w/v)Tween-20的Tris缓冲液80μL洗涤3次，加入用含有1.2mM氯化钙的Tris缓冲液稀释至500ng/mL的生物素化人IgE((23-1)中制作)40μL。在室温孵育1小时后，用含有1.2mM氯化钙和0.05％(w/v)Tween-20的Tris缓冲液80μL洗涤3次，加入含有2mM氯化钙的ACES缓冲液(pH7.4)或含有3μM氯化钙的ACES缓冲液(pH7.4)80μL，立即除去溶液后，再次加入含有2mM氯化钙的ACES缓冲液(pH7.4)或含有3μM氯化钙的ACES缓冲液(pH7.4)80μL。在37℃孵育1小时后，用含有1.2mM氯化钙和0.05％(w/v)Tween-20的Tris缓冲液80μL洗涤3次，加入用含有1.2mM氯化钙的Tris缓冲液稀释至25ng/mL的HRP标记链霉亲和素(Thermo fisher scientific社制21132)40μL。在室温孵育1小时后，用含有1.2mM氯化钙和0.05％(w/v)Tween-20的Tris缓冲液80μL洗涤3次，加入显色底物(KPL社制50-66-06：ABTS peroxidase substrate system 1 component)40μL。在室温孵育15分或30分后，测定405nm的吸光度(Molecular devices社制SpectraMax Plus384)。
测定结果示于图30。结果，对于Xolair，吸光度并未根据钙离子浓度发生改变，对于GEB0100、GEB0220和GEB0230，与2mM钙离子浓度(高钙离子浓度)下的吸光度相比，3μM钙离子浓度(低钙离子浓度)下的吸光度显著地低。由该结果表明，GEB0100、GEB0220和GEB0230具有根据钙离子浓度而改变与抗原的结合的性质。上述现象表明，即使是对于人IgE，也可以获得钙依赖性抗体。这些钙依赖性抗人IgE抗体与Xolair等普通的抗人IgE抗体相比，认为与上述实施例中的人IL-6R、人CD4、人IgA相同地，可以加速人IgE的消除。进而，相对于这些钙依赖性抗人IgE抗体，通过增强pH7.4下对FcRn的结合，认为可以进一步加速人IgE的消除。
〔参考例1〕可溶型人IL-6受体(hsIL-6R)的制备
抗原人IL-6受体的重组人IL-6受体如下所述制备。通过本领域技术人员公知的方法构建、培养包含J.Immunol.152，4958-4968(1994)中报道的N末端侧第1位至第357位的氨基酸序列的可溶型人IL-6受体(以下，称为hsIL-6R)的CHO稳定表达株，使hsIL-6R表达。通过Blue Sepharose 6FF柱色谱、凝胶过滤柱色谱这2个步骤，从所得培养上清中纯化hsIL-6R。将最终步骤中作为主峰洗脱出的级分作为最终纯化品。
〔参考例2〕人FcRn的制备
FcRn是FcRn和β2-微球蛋白的复合体。基于公布的人FcRn基因序列，制备寡聚DNA引物(J Exp Med.1994Dec 1；180(6)：2377-81)。使用制备得到的引物和作为模板的人cDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA，Clontech)，通过PCR来制备编码整个基因的DNA片段。使用所得DNA片段作为模板，通过PCR来扩增编码含有信号区(Met1～Leu290)的细胞外结构域的DNA片段，并***哺乳动物细胞表达载体中。同样地，基于公布的人β2-微球蛋白基因序列(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26)：16899-16903(2002))来制备寡聚DNA引物。使用制备得到的引物和作为模板的人cDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA，Clontech)，通过PCR来制备编码整个基因的DNA片段。使用所得DNA片段作为模板，通过PCR来扩增编码含有信号区(Met1～Met119)的整个蛋白质的DNA片段，并***哺乳动物细胞表达载体中。
通过以下步骤使可溶型人FcRn表达。构建用于表达人FcRn(序列编号：17)和β2-微球蛋白(序列编号：18)的质粒，将该质粒使用PEI(Polyscience)通过脂质体转染法导入来源于人胎儿肾癌的细胞株HEK293H(Invitrogen)的细胞中。回收所得培养上清，使用IgGSepharose 6 Fast Flow(Amersham Biosciences)进行纯化，然后通过使用HiTrap Q HP(GE Healthcare)(J Immunol.2002 Nov 1；169(9)：5171-80)进一步纯化FcRn。
〔参考例3〕pH依赖性抗原结合抗体的抗原消除加速效果的提高研究(体内试验)
(3-1)具有中件条件下对FcRn的结合的pH依赖件人IL-6受体结合抗体的制备
对于含有VH3-IgG1(序列编号：19)和VL3-CK(序列编号：20)的Fv4-IgG1，导入突变以增加中性条件下(pH7.4)对FcRn的结合。具体地，相对于IgG1的重链恒定区，将EU编号的第252位由Met置换为Tyr、将第254位由Ser置换为Thr、将第256位由Thr置换为Glu而制备VH3-IgG1-v1(序列编号：21)，并且相对于IgG1的重链恒定区，将EU编号的第434位由Asn置换为Trp而制备VH3-IgG1-v2(序列编号：22)。氨基酸置换的导入中，使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)或In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech)，通过所附说明书记载的方法制作突变体，将所得质粒片段***动物细胞表达载体中，制作目标H链表达载体和L链表达载体。所得表达载体的碱基序列通过本领域技术人员公知的方法确定。
含有H54(序列编号：5)和L28(序列编号：6)的H54/L28-IgG1、含有VH3-IgG1(序列编号：19)和VL3-CK(序列编号：20)的Fv4-IgG1、含有VH3-IgG1-v1(序列编号：21)和VL3-CK(序列编号：20)的Fv4-IgG1-v1、以及含有VH3-IgG1-v2(序列编号：22)和VL3-CK(序列编号：20)的Fv4-IgG1-v2的表达和纯化使用以下方法进行。如制造商提供的方案所述，通过FreestyleHEK293(Invitrogen)、或通过HEK293H细胞株(Invitrogen)来表达抗体。将来源于人胎儿肾癌细胞的HEK293H细胞株(Invitrogen)悬浮于含有10％胎牛血清(Invitrogen)的DMEM培养基(Invitrogen)中，以5～6×105个/mL的细胞密度向黏附细胞用培养皿(直径10cm，CORNING)各皿中各接种10mL，在CO2培养箱(37℃、5％CO2)内培养一昼夜后，吸除培养基，添加CHO-S-SFM-II(Invitrogen)培养基6.9mL。将制备的质粒通过脂质体转染法导入细胞。回收所得培养上清后，进行离心分离(约2000g、5分钟、室温)除去细胞，进而通过0.22μm过滤器MILLEX(注册商标)-GV(Millipore)进行灭菌，得到培养上清。使用rProtein ASepharose(商標)Fast Flow(Amersham Biosciences)，通过本领域技术人员公知的方法，从所得培养上清中进行纯化。纯化抗体浓度使用分光光度计测定280nm下的吸光度。通过Protein Science 1995；4：2411-2423中记载的方法算出吸光系数，使用该吸光系数由所得的值计算抗体浓度。通过本领域技术人员公知的方法进行表达并纯化。
(3-2)使用人FcRn转基因小鼠和正常小鼠的体内试验
向人FcRn转基因小鼠(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg品系276+/+小鼠、JacksonLaboratories、Methods Mol Biol.2010；602：93-104.)和正常小鼠(C57BL/6J小鼠、Charles River Japan)中单独给予hsIL-6R(可溶型人IL-6受体：参考例1中制备)或同时给予hsIL-6R和抗人IL-6受体抗体，然后对hsIL-6R和抗人IL-6受体抗体在机体内的动力学进行评价。对尾静脉以10mL/kg单次给予hsIL-6R溶液(5μg/mL)或hsIL-6R和抗人IL-6受体抗体的混合溶液(分别为5μg/mL、0.1mg/mL)。此时，相对于hsIL-6R，由于抗人IL-6受体抗体过量存在，因而认为hsIL-6R基本全部与抗体结合。在给予15分后、7小时后、1天后、2天后、3天后、4天后、7天后、14天后、21天后、28天后进行采血。采集的血液立即在4℃、15,000rpm下离心分离15分钟，得到血浆。分离的血浆直至实施测定为止，保存在设定为-20℃以下的冰箱中。作为抗人IL-6受体抗体，人FcRn转基因小鼠中使用上述H54/L28-IgG1、Fv4-IgG1、和Fv4-IgG1-v2，正常小鼠中使用上述H54/L28-IgG1、Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-v1、和Fv4-IgG1-v2。
(3-3)通过ELISA法测定血浆中抗人IL-6受体抗体浓度
小鼠血浆中的抗人IL-6受体抗体浓度通过ELISA法测定。首先，将抗人IgG(γ链特异性)F(ab′)2抗体片段(Sigma)分配于Nunc-ImmunoPlate，MaxiSorp(Nalge NuncInternational)中，在4℃下静置一夜，制作抗人IgG固定化板。制备血浆中浓度调整为0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125μg/mL的校准曲线试样和稀释100倍以上的小鼠血浆测定试样，在这些校准曲线试样和血浆测定试样100μL中加入200μL的20ng/mL的hsIL-6R，在室温静置1小时。然后，分配于抗人IgG固定化板中，进而在室温静置1小时。然后，与生物素化抗人IL-6R抗体(R&D)在室温反应1小时，进而与链霉亲和素-PolyHRP80(StereospecificDetection Technologies)在室温反应1小时，使用TMB One Component HRP MicrowellSubstrate(BioFX Laboratories)作为底物进行显色反应，用1N硫酸(Showa Chemical)终止反应后，用酶标仪测定450nm的吸光度。小鼠血浆中浓度是使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)，根据校准曲线的吸光度算出。通过该方法测定的静脉内给药后的人FcRn转基因小鼠中的血浆中抗体浓度变化示于图31，正常小鼠中的血浆中抗体浓度变化示于图33。
(3-4)通过电化学发光法测定血浆中hsIL-6R浓度
小鼠的血浆中hsIL-6R浓度用电化学发光法测定。制备调整为2000、1000、500、250、125、62.5、和31.25pg/mL的浓度的hsIL-6R校准曲线试样以及稀释50倍以上的小鼠血浆测定试样。将试样与用SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)进行了钌标记的单克隆抗人IL-6R抗体(R&D)、生物素化抗人IL-6R抗体(R&D)、和WT-IgG1溶液混合，在37℃反应一夜。此时，作为抗人IL-6受体抗体，含有H(WT)(序列编号：13)和L(WT)(序列编号：14)的WT-IgG1的终浓度为333μg/mL，其相较于试样中所含的抗人IL-6受体抗体浓度为过量，其目的是形成使试样中几乎全部hsIL-6R都与WT-IgG1结合的状态。然后，分配至MA400PR链霉亲和素板(Meso Scale Discovery)中。进一步在室温反应1小时并洗涤后，分配读数缓冲液T(×4)(Meso Scale Discovery)，立即通过SECTOR PR 400 reader(Meso ScaleDiscovery)进行测定。hsIL-6R浓度是使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)，根据校准曲线的响应算出。通过该方法测定的静脉内给药后的人FcRn转基因小鼠中的血浆中hsIL-6R浓度变化示于图32，正常小鼠中的血浆中hsIL-6R浓度变化示于图34。
(3-5)通过电化学发光法测定血浆中游离hsIL-6R浓度
为了评价可溶型人IL-6受体在血浆中受到何种程度中和，通过电化学发光法测定小鼠血浆中未被抗人IL-6受体抗体结合(中和)的可溶型人IL-6受体浓度(游离hsIL-6R浓度)。通过将调整为10000、5000、2500、1250、625、312.5、或156.25pg/mL的hsIL-6R校准曲线试样和小鼠的血浆试样12μL添加至0.22μm过滤杯(Millipore)中干燥的适量rProtein ASepharose Fast Flow(GE Healthcare)树脂中，使血浆中存在的全部IgG型抗体(小鼠IgG、抗人IL-6受体抗体和抗人IL-6受体抗体-可溶型人IL-6受体复合体)吸附于蛋白质A。然后，通过高速离心机进行离心，回收穿流(passed through)溶液。穿流溶液中不含与蛋白质A结合的抗人IL-6受体抗体-可溶型人IL-6受体复合体，因而通过测定穿流溶液中的hsIL-6R浓度，可以测定血浆中的游离hsIL-6R浓度。接着，将穿流溶液与用SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)进行了钌标记的单克隆抗人IL-6R抗体(R&D)和生物素化抗人IL-6 R抗体(R&D)混合，在室温反应1小时。然后，分配至MA400 PR链霉亲和素板(Meso ScaleDiscovery)中。进一步在室温反应1小时并洗涤后，分配读数缓冲液T(×4)(Meso ScaleDiscovery)，立即通过SECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)进行测定。hsIL-6R浓度是使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)，根据校准曲线的响应算出。通过该方法测定的静脉内给药后的正常小鼠中的血浆中游离hsIL-6R浓度变化示于图35。
(3-6)pH依赖性人IL-6受体结合的效果
对H54/L28-IgG1和具有pH依赖性人IL-6受体结合的Fv4-IgG1的体内试验结果进行比较。如图31和图33所示，确认到两者的抗体血浆中滞留性大致等同，但如图32和图34所示，确认到相比于与H54/L28-IgG1同时给予的hsIL-6R一方，与具有pH依赖性人IL-6受体结合的Fv4-IgGI同时给予的hsIL-6R一方加快hsIL-6R的消除。该倾向在人FcRn转基因小鼠和正常小鼠两者中均确认到，通过赋予pH依赖性人IL-6受体结合能力，发现4天后的血浆中hsIL-6R浓度可各自降低约17倍和约34倍。
(3-7)中性条件下(pH7.4)与FcRn结合的效果
据报道，天然型人IgG1在中性条件下(pH7.4)基本不与人FcRn结合(亲和性极弱)。据报道，相对于天然型人IgG1，通过将EU编号的第434位由Asn置换为Trp，会增强中性条件下(pH7.4)对人FcRn的结合(J Immunol.2009；182(12)：7663-71.)。对将该氨基酸置换导入Fv4-IgG1、和Fv4-IgG1导入而得的Fv4-IgG1-v2在人FcRn转基因小鼠中的体内试验结果进行了比较。如图31所示，确认到两者的抗体血浆中滞留性大致等同，但如图32所示，确认到相比于与Fv4-IgG1同时给予的hsIL-6R一方，与增加了中性条件下(pH7.4)对人FcRn的结合的Fv4-IgG1-v2同时给予的hsIL-6R一方加快了hsIL-6R的消除。通过赋予在中性条件下(pH7.4)与人FcRn的结合，发现4天后的血浆中hsIL-6R浓度可以降低约4倍。
根据人FcRn和小鼠FcRn的同源性，认为将EU编号中的第434位Asn置换为Trp也会增加中性条件下(pH7.4)与小鼠FcRn的结合。另外，据报道，通过将EU编号中的第252位由Met置换为Tyr，将254位由Ser置换为Thr，将第256位由Thr置换为Glu，增加中性条件下(pH7.4)与小鼠FcRn的结合(J Immunol.2002；169(9)：5171-80.)。对将该氨基酸置换分别导入Fv4-IgG1、和Fv4-IgG1而得的Fv4-IgG1-v1和Fv4-IgG1-v2在正常小鼠中的体内试验结果进行了比较。如图33所示，与Fv4-IgG1相比，中性条件下(pH7.4)与小鼠FcRn的结合也增加了的Fv4-IgG1-v1和Fv4-IgG1-v2的血浆中滞留性稍微降低(1天后的血浆中抗体浓度分别降低约1.5倍和约1.9倍)。
如图34所示，确认到相比于与Fv4-IgG1同时给予的hsIL-6R相比，和中性条件下(pH7.4)与小鼠FcRn的结合增加了的Fv4-IgG1-v1或Fv4-IgG1-v2同时给予的hsIL-6R一方显著加快hsIL-6R的消除。通过赋予在中性条件下(pH7.4)下与小鼠FcRn的结合，发现Fv4-IgG1-v1和Fv4-IgG1-v2的1天后的血浆中hsIL-6R浓度分别可以降低约32倍和约80倍。通过赋予在中性条件下(pH7.4)与小鼠FcRn的结合，如上所述，虽然抗体的血浆中浓度也稍微降低，但发现显示出大幅高于抗体浓度的降低的血浆中hsIL-6R浓度降低效果。进而，与hsIL-6R单独给药组相比，与Fv4-IgG1-v1或Fv4-IgG1-v2同时给予的hsIL-6R一方加快hsIL-6R的消除。如图34所示，发现与hsIL-6R单独给予相比，通过与Fv4-IgG1-v1或Fv4-IgG1-v2同时给予hsIL-6R，1天后的血浆中hsIL-6R浓度可以各自降低约4倍和约11倍。即，这意味着通过给予pH依赖性地与可溶型IL-6受体结合、且赋予了中性条件下(pH7.4)下与小鼠FcRn的结合的抗体，可以通过抗体加速可溶型IL-6受体的消除。即，通过将这种抗体给予机体内，可以在机体内降低血浆中的抗原浓度。
如图35所示，直到H54/L28-IgG1的给予7天后，游离hsIL-6R浓度仍可检出，Fv4-IgG1的给予后1天以后也未检出游离hsIL-6R，Fv4-IgG1-v1或Fv4-IgG1-v2的给予后7小时以后未检出游离hsIL-6R。即，对hsIL-6R具有pH依赖性结合的Fv4-IgG1与H54/L28-IgG1相比，表现出低游离hsIL-6R浓度，因而确认到通过赋予对hsIL-6R的pH依赖性结合，可发挥更高的hsIL-6R的中和效果，进而由于使Fv4-IgG1增加了pH7.4下与FcRn的结合的Fv4-IgG1-v1和Fv4-IgG1-v2显示更低的游离hsIL-6R浓度，因而确认到通过增加pH7.4下与FcRn的结合，可以发挥更高的hsIL-6R的中和效果。
在给予抗体时，H54/L28-IgG1等普通的中和抗体会使要结合的抗原的清除率降低，使得抗原在血浆中滞留更久。通过给予抗体，导致抗原(想要中和其作用)的血浆中滞留性延长并不是优选的。通过对与抗原的结合赋予pH依赖性(在中性条件下结合、在酸性条件下解离)，可以缩短抗原的血浆中滞留性。本发明中，进而通过赋予中性条件下(pH7.4)下与人FcRn的结合，可以进一步缩短抗原的血浆中滞留性。进而表明，通过给予pH依赖性地与抗原结合且赋予了在中性条件下(pH7.4)与FcRn结合的抗体，与抗原单独的清除率相比，可以增大清除率。迄今为止，尚无相对于抗原单独的清除率而言，通过给予抗体来增大清除率的方法，本研究中发现的方法作为通过给予抗体来从血浆中消除抗原的方法是极其有用的。另外，根据本研究，首次发现了增加中性条件下(pH7.4)与FcRn的结合的优点。另外，具有使中性条件下(pH7.4)与FcRn的结合增加的不同氨基酸置换的Fv4-IgG1-v1和Fv4-IgG1-v2两者均确认到同样的效果，因而认为与氨基酸置换的种类无关，只要是使中性条件下(pH7.4)与人FcRn的结合增加的氨基酸置换，就具有加速抗原消除的效果。即，通过使用J BiolChem.2007；282(3)：1709-17中报道的将EU编号第257位的Pro置换为Ile的氨基酸置换、将EU编号第311位的Gln置换为Ile的氨基酸置换、J Immunol.2009；182(12)：7663-71.中报道的将EU编号第434位的Asn置换为Ala、Tyr或Trp的氨基酸置换、将EU编号第252位的Met置换为Tyr的氨基酸置换、将EU编号第307位的Thr置换为Gln的氨基酸置换、将EU编号第308位的Val置换为Pro的氨基酸置换、将EU编号第250位的Thr置换为Gln的氨基酸置换、将EU编号第428位的Met置换为Leu的氨基酸置换、将EU编号第380位的Glu置换为Ala的氨基酸置换、将EU编号第378位的Ala置换为Val的氨基酸置换、将EU编号第436位的Tyr置换为Ile的氨基酸置换、J Biol Chem.2006 Aug 18；281(33)：23514-24中报道的将EU编号第252位的Met置换为Tyr的氨基酸置换、将EU编号第254位的Ser置换为Thr的氨基酸置换、将EU编号第256位的Thr置换为Glu的氨基酸置换、Nat Biotechnol.2005 Oct；23(10)：1283-8.中报道的将第433位的His置换为Lys的氨基酸置换、将第434位的Asn置换为Phe的氨基酸置换、将第436位的Tyr置换为His的氨基酸置换等、以及这些氨基酸置换的组合，可以制作通过给予而使抗原从血浆中消除的抗体分子。
〔参考例4〕对人FcRn的结合活性的评价
作为使用Biacore来评价抗体和FcRn的相互作用的测定***，报道有将抗体固定化于JImmunol.2009；182(12)：7663-71.中记载的传感器芯片、并以人FcRn作为分析物的***。为了该目的，如参考例4所述制备了人FcRn。使用本***，对Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-v1和Fv4-IgG1-v2在pH6.0和pH7.4时与人FcRn的结合活性(解离常数KD)进行评价。被测物质抗体直接固定化在Series S传感器芯片CM5上，供试验。抗体在传感器芯片上的固定化是使用作为流动缓冲液的50mmol/L磷酸钠/150mmol/L NaCl，0.05％(v/v％)表面活性剂P20 pH6.0，使用胺偶联试剂盒，按照厂商的操作说明书来实施，以确保固定化量为500RU。
作为流动缓冲液，使用50mmol/L磷酸钠/150mmol/L NaCl，0.05％表面活性剂P20pH6.0、或50mmol/L磷酸钠/150mmol/LNaCl，0.05％表面活性剂P20 pH7.4，使用制成的传感器芯片来实施测定。测定均在25℃下进行。以流速5μL/min注入人FcRn稀释液与流动缓冲液(作为参照溶液)10分钟，使人FcRn与传感器芯片上的抗体相互作用。然后，以流速5μL/min通入流动缓冲液1分钟，观察FcRn的解离，然后以流速30μL/min注入20mmol/L Tris-HCl/150mmol/LNaCl，pH8.1达15秒钟，重复2次以将传感器芯片再生。
测定结果的分析通过Biacore T100 Evaluation Software(Ver.2.0.1)来进行。由至少6个不同浓度FcRn的测定结果，通过稳态亲和力法(steady-state affinitymethod)进行分析，计算解离常数(KD)。Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-v1和Fv4-IgG1-v2在pH6.0和pH7.4下与人FcRn的结合活性(解离常数KD)的结果示于下表24。
[表24]
Fv4-IgG1在pH7.4时与人FcRn的结合非常弱，无法算出KD值(NA)。与之相对，观察到Fv4-IgG1-v1和Fv4-IgG1-v2在pH7.4时与人FcRn的结合，KD值分别计算为36.55μM和11.03μM。另外，pH6.0下与人FcRn的KD值分别计算为1.99μM、0.32μM和0.11μM。如图31所示，在人FcRn转基因小鼠中，与Fv4-IgG1相比，Fv4-IgG1-v2加速hsIL-6R的消除，因此认为通过改变人IgG1以使pH7.4下与人FcRn的结合至少强于11.03μM，可以加速抗原的消除。另外，如J Immunol.2002；169(9)：5171-80.所示，人IgG1与小鼠FcRn的结合是与人FcRn的结合的10倍左右强，因而预测Fv4-IgG1-v1和Fv4-IgG1-v2在pH7.4下与小鼠FcRn的结合也是与人FcR的结合的10倍左右强。图34所示正常小鼠中的Fv4-IgG1-v1和Fv4-IgG1-v2对hsIL-6R的消除加速大于图32所示人FcRn转基因小鼠中的Fv4-IgG1-v2对hsIL-6R的消除加速，因而认为对应于pH7.4下与FcRn的结合强度，hsIL-6R的消除加速变大。
〔参考例5〕中性条件下下与人FcRn的结合增强了的pH依赖性人IL-6受体结合抗体的制备
(5-1)Fv4-IgG1的重链恒定区改变体的制作
为了使人FcRn转基因小鼠中pH依赖性人IL-6受体结合抗体的抗原消除效果进一步增大，对Fv4-IgG1导入各种用于增强中性条件下与人FcRn的结合的改变。具体地，将表25-1和25-2中记载的氨基酸改变导入Fv4-IgG1的重链恒定区，由此制作各种变体(突变位置的氨基酸编号基于EU编号)。应予说明，氨基酸置换的导入按照参考例3所述的本领域技术人员公知的方法实施。
[表25-1]
表25-2是表25-1的续表。
[表25-2]
将含有制备的重链和L(WT)(序列编号：14)的变体通过参考例3所述的本领域技术人员公知的方法进行表达并纯化。
(5-2)对人FcRn的结合评价
使用Biacore T100(GE Healthcare)，进行人FcRn和抗体的动力学分析。为了该目的，如参考例2所述制备了人FcRn。在传感器芯片CM4(GE Healthcare)上，以胺偶联法将适当量的蛋白质L(ACTIGEN)固定化，并在其上捕获目标抗体。接着，注入FcRn稀释液和流动缓冲液(作为参照溶液)，使人FcRn与传感器芯片上捕获的抗体相互作用。流动缓冲液使用50mmol/L磷酸钠、150mmol/L NaCl、0.05％(w/v)Tween20、pH7.0，FcRn的稀释也使用各缓冲液。芯片的再生使用10mmol/L甘氨酸-HCl，pH1.5。测定均在25℃下实施。由测定所得的传感图，计算作为动力学参数的结合速度常数ka(1/Ms)、和解离速度常数kd(1/s)，基于该值计算各抗体对人FcRn的KD(M)。各参数的计算中使用了Biacore T100 Evaluation Software(GEHealthcare)。
通过Biacore评价中性条件下(pH7.0)与人FcRn的结合的结果示于表6-1和6-2。这里，天然型IgG1的结合非常弱，KD无法算出，因而在表6-1中标记为ND。
〔参考例6〕中性条件下与人FcRn的结合增强了的pH依赖性人IL-6受体结合抗体的体内试验
使用参考例4中制备的赋予了中性条件下与人FcRn的结合能力的重链，制作具有中性条件下与人FcRn的结合能力的pH依赖性人IL-6受体结合抗体，对机体内的抗原消除效果进行了研究。具体地，通过参考例3所述的本领域技术人员公知的方法表达并纯化了下列抗体：
含有VH3-IgG1和VL3-CK的Fv4-IgG1、
含有VH3-IgG1-v2和VL3-CK的Fv4-IgG1-v2、
含有VH3-IgG1-F14和VL3-CK的Fv4-IgG1-F14、
含有VH3-IgG1-F20和VL3-CK的Fv4-IgG1-F20、
含有VH3-IgG1-F21和VL3-CK的Fv4-IgG1-F21、
含有VH3-IgG1-F25和VL3-CK的Fv4-IgG1-F25、
含有VH3-IgG1-F29和VL3-CK的Fv4-IgG1-F29、
含有VH3-IgG1-F35和VL3-CK的Fv4-IgG1-F35、
含有VH3-IgG1-F48和VL3-CK的Fv4-IgG1-F48、
含有VH3-IgG1-F93和VL3-CK的Fv4-IgG1-F93、
含有VH3-IgG1-F94和VL3-CK的Fv4-IgG1-F94。
对于制备的pH依赖性人IL-6受体结合抗体，与参考例3的方法相同地实施使用人FcRn转基因小鼠(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg品系276+/+小鼠、Jackson Laboratories、Methods Mol Biol.2010；602：93-104.)的体内试验。
所得的静脉内给药后的人FcRn转基因小鼠中的血浆中可溶型人IL-6受体浓度变化示于图36。试验结果表明，与在中性条件下基本不具有与人FcRn的结合能力的Fv4-IgG1相比，使中性条件下与人FcRn的结合增强了的pH依赖性人IL-6受体结合抗体中的任一种，均将血浆中可溶型人IL-6受体浓度的随时间推移维持较低。其中，作为显示特别显著效果的实例，可举出：相比于与Fv4-IgG1同时给予，与Fv4-IgG1-F14同时给予的可溶型人IL-6受体的1天后的血浆中浓度显示降低约54倍。另外，相比于与Fv4-IgG1同时给予，与Fv4-IgG1-F21同时给予的可溶型人IL-6受体的7小时后的血浆中浓度显示降低约24倍。进而，与Fv4-IgG1-F25同时给予的可溶型人IL-6受体的7小时后的血浆中浓度在检测限(1.56ng/mL)以下，相比于与Fv4-IgG1同时给予的可溶型人IL-6受体的7小时后的血浆中浓度，认为可以实现200倍以上的显著的抗原浓度降低。上述事实表明，为了增强抗原消除效果，非常有效的是使pH依赖性抗原结合抗体在中性条件下与人FcRn的结合增强。另外，为增强抗原消除效果而导入的、使中性条件下与人FcRn的结合增强的氨基酸改变的种类包括但不限于表6-1、表6-2中记载的改变，认为可通过导入任意改变增强机体内的抗原消除效果。
进而，与可溶型人IL-6受体的单独给药组相比，与Fv4-IgG1-F14、Fv4-IgG1-F21、Fv4-IgG1-F25、Fv4-IgG1-F48这4种pH依赖性人IL-6受体结合抗体同时给予的可溶型人IL-6受体显示更低的血浆中浓度变化。通过将这种pH依赖性人IL-6受体结合抗体给予处于血浆中的可溶型人IL-6受体浓度维持恒定浓度状态(稳态)的机体内，可以维持血浆中的可溶型人IL-6受体浓度低于稳态时的血浆中浓度。即，通过将这种抗体给予机体内，可以在机体内降低血浆中的抗原浓度。
〔参考例7〕低用量(0.01mg/kg)的Fv4-IgG1-F14的有效性研究
使用参考例6中制备的Fv4-IgG1-F14，与参考例6的方法相同地进行低用量(0.01mg/kg)下的体内试验，与参考例6中所得的Fv4-IgG1和Fv4-IgG1-F14的1mg/kg给予时的结果进行比较(结果示于图37和38)。
结果表明，尽管Fv4-IgG1-F14的0.01mg/kg给药组的血浆中抗体浓度与1mg/kg给药组相比低100倍左右(图38)，但可溶型人IL-6受体浓度变化大致等同(图37)。另外，Fv4-IgG1-F14的0.01mg/kg给药组的7小时后的血浆中可溶型人IL-6受体浓度与Fv4-IgG1的1mg/kg给药组的7小时后的血浆中可溶型人IL-6受体浓度相比，降低约3倍。进而，相比于可溶型人IL-6受体单独给药组，Fv4-IgG1-F14的任意用量的给药组均显示较低的血浆中可溶型人IL-6受体浓度变化(图37)。
上述事实表明，使Fv4-IgG1在中性条件下与人FcRn的结合增强了的Fv4-IgG1-F14即使是Fv4-IgG1的1/100的给药量，也会有效地使血浆中可溶型人IL-6受体浓度低下。即，认为通过使pH依赖性抗原结合抗体在中性条件下与FcRn的结合能力增强，即使是更低的给药量，也可以有效地将抗原消除。
〔参考例8〕使用正常小鼠的基于稳态模型的体内试验
(8-1)中性条件下与小鼠FcRn的结合评价
对于参考例5中制备的
含有VH3-IgG1(序列编号：19)和L(WT)(序列编号：14)的VH3/L(WT)-IgG1、
含有VH3-IgG1-v2(序列编号：22)和L(WT)(序列编号：14)的VH3/L(WT)-IgG1-v2、含有VH3-IgG1-F20(序列编号：23)和L(WT)(序列编号：14)的VH3/L(WT)-IgG1-F20，通过以下方法，对中性条件下(pH7.4)与小鼠FcRn的结合进行评价。
使用Biacore T100(GE Healthcare)，进行小鼠FcRn和抗体的动力学分析。在传感器芯片CM4(GE Healthcare)上，以胺偶联法将适当量的蛋白质L(ACTIGEN)固定化，并在其上捕获目标抗体。接着，注入FcRn稀释液和流动缓冲液(作为参照溶液)，使小鼠FcRn与传感器芯片上捕获的抗体相互作用。流动缓冲液使用50mmol/L磷酸钠、150mmol/LNaCl、0.05％(w/v)Tween20、pH7.4，FcRn的稀释也使用各缓冲液。芯片的再生使用10mmol/L甘氨酸-HCl，pH1.5。测定均在25℃下实施。由测定所得的传感图，计算作为动力学参数的结合速度常数ka(1/Ms)、和解离速度常数kd(1/s)，基于该值计算各抗体对小鼠FcRn的KD(M)。各参数的计算中使用了Biacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)。
结果示于表26(pH7.4下的小鼠FcRn亲和性)。这里，恒定区是天然型IgG1的VH3/L(WT)-IgG1(表26中的IgG1)对小鼠FcRn的结合非常弱，KD无法算出，因而在表26中标记为ND。测定结果表明，中性条件下与人FcRn的结合增强了的这些改变体即使对于小鼠FcRn也同样增强中性条件下的结合。
[表26]
(8-2)以血浆中可溶型人IL-6受体浓度为稳态的正常小鼠的体内试验
使用实施例3和参考例5中制备的H54/L28-IgG1、Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-v2和Fv4-IgG1-F20，通过下述方法进行体内试验。
在正常小鼠(C57BL/6J小鼠、Charles River Japan)的背部皮下植入填充有可溶型人IL-6受体的注入泵(MINI-OSMOTIC PUMP MODEL2004、alzet)，由此制作血浆中可溶型人IL-6受体浓度维持稳态的动物模型。对动物模型给予抗人IL-6受体抗体，对给予后的可溶型人IL-6受体的机体内动力学进行评价。为了抑制针对可溶型人IL-6受体的中和抗体的产生，对尾静脉以20mg/kg单次给予单克隆抗小鼠CD4抗体(R&D)。然后，将填充有92.8μg/mL可溶型人IL-6受体的注入泵植入小鼠背部皮下。注入泵植入3天后，对尾静脉以1mg/kg单次给予抗人IL-6受体抗体。在给予抗人IL-6受体抗体15分后、7小时后、1天后、2天后、3天后、4天后、7天后、14天后、21天后、28天后进行采血。采集的血液立即在4℃、15,000rpm下离心分离15分钟，得到血浆。分离的血浆直至实施试验为止，保存在设定为-20℃以下的冰箱中。
(8-3)通过ELISA法测定血浆中抗人IL-6受体抗体浓度
通过与参考例3相同的方法实施。
(8-4)通过电化学发光法测定血浆中hsIL-6R浓度
通过与实施例5相同的方法实施。
如图39所示，对于血浆中可溶型人IL-6受体浓度维持在约40ng/mL的稳态的正常小鼠(hsIL-6R群)，若给予作为可溶型人IL-6受体的中和抗体的H54/L28-IgG1，则血浆中可溶型人IL-6受体浓度上升至650ng/mL(给予前的15倍)。另一方面，对H54/L28-IgG1赋予了pH依赖性抗原结合能力的Fv4-IgG1的给药组中，血浆中可溶型人IL-6受体浓度维持在70ng/mL左右。该现象表明，普通的中和抗体H54/L28-IgG1的给予所引起的血浆中可溶型人IL-6受体浓度的上升，通过赋予pH依赖性结合能力，可以抑制到1/10左右。
进而表明，通过给予导入了使pH依赖性人IL-6受体结合抗体在中性条件下与FcRn的结合增强的改变的Fv-IgG1-v2和Fv-IgG1-F20，可维持将血浆中可溶型人IL-6受体浓度降低至稳态的1/10以下的状态。这里，在给予Fv-IgG1-v2起14天后的血浆中可溶型人IL-6受体浓度为约2ng/mL，可以降低至给予前的1/20。另外，在给予Fv-IgG1-F20起7小时后、1天后、2天后、4天后的血浆中可溶型人IL-6受体浓度在检测限(1.56ng/mL)以下，表明降低至给予前的1/25以下。
以上事实表明，对于血浆中的抗原浓度维持稳态的动物模型，通过给予兼具pH依赖性抗原结合能力和中性条件下与FcRn的结合能力的抗体，可以增加血浆中的抗原消除速度，可以显著降低血浆中抗原浓度。
普通的抗体如H54/L28-IgG1那样，只能通过与靶抗原结合而中和靶抗原的作用，甚至更坏地引起血浆中抗原浓度的上升。另一方面，发现兼具pH依赖性抗原结合能力和中性条件下与FcRn的结合能力的抗体不仅能中和靶抗原，而且可以降低血浆中靶抗原的浓度。通过将抗原从血浆中除去，可以期待具有中和以上的更高效果。另外，认为对于仅靠中和而效率不足的靶抗原也能显示出效果。
〔参考例9〕增强抗原消除所需的在pH中性范围下与人FcRn的结合亲和性的阈值的确定、以及抗原消除与pH中性范围下对人FcRn的结合亲和性的关系
(9-1)用于体内试验的抗体制备
制作了含有pH中性范围下与FcRn的结合增加了的VH3-IgG1(序列编号：19)和VL3-CK(序列编号：20)的Fv4-IgG1的Fc变体。具体地，制备了VH3-M73(序列编号：24)和VH3-IgG1-v1(序列编号：21)。氨基酸置换的导入按照参考例3所述的本领域技术人员公知的方法实施。
通过参考例3所述的本领域技术人员公知的方法表达并纯化了：含有H54(序列编号：5)和L28(序列编号：6)的H54/L28-IgG1、含有VH3-IgG1(序列编号：19)和VL3-CK(序列编号：20)的Fv4-IgG1、含有VH3-M73(序列编号：24)和VL3-CK(序列编号：20)的Fv4-M73、含有VH3-IgG1-v1(序列编号：21)和VL3-CK(序列编号：20)的Fv4-IgG1-v1、和含有VH3-IgG1-v2(序列编号：22)和VL3-CK(序列编号：20)的Fv4-IgG1-v2。
(9-2)pH中性条件下抗体与人FcRn的结合亲和性的评价
含有VH3-IgG1(序列编号：19)和L(WT)(序列编号：14)的VH3/L(WT)-IgG1、含有VH3-M73(序列编号：24)和L(WT)(序列编号：14)的VH3/L(WT)-M73、含有VH3-IgG1-v1(序列编号：21)和L(WT)(序列编号：14)的VH3/L(WT)-IgG1-v1、和含有VH3-IgG1-v2(序列编号：22)和L(WT)(序列编号：14)的VH3/L(WT)-IgG1-v2均如参考例3所述制备，对于中性pH(pH7.0)与人FcRn的结合进行评价。
VH3/L(WT)-IgG1-v1和VH3/L(WT)-IgG1-v2对人FcRn的结合活性使用参考例5所述的方法进行测定。VH3/L(WT)-IgG1和VH3/L(WT)-M73对人FcRn的结合活性低，因而无法通过实施例5所述的方法测定对人FcRn的结合活性，因此，这些抗体通过以下所述方法进行评价。使用Biacore T100(GE Healthcare)对抗体与人FcRn结合的动力学进行分析。在传感器芯片CM4(GE Healthcare)上，以胺偶联法将适当量的蛋白质L(ACTIGEN)固定化，并在芯片上捕获目标抗体。接着，注入进行了稀释的FcRn溶液和流动缓冲液(作为参照溶液)，使人FcRn与传感器芯片上捕获的抗体相互作用。作为流动缓冲液，使用了50mmol/l磷酸钠、150mmol/l NaCl、0.05％(w/v)Tween 20、pH7.0。使用各缓冲液对FcRn进行稀释。使用10mmol/l甘氨酸-HCl(pH1.5)将芯片再生。测定在25℃下进行。
使用同时拟合传感图的结合和解离相、并整体地拟合工作组中全部曲线的Biacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)，由传感图数据导出各抗体的KD(M)。使传感图与由Biacore T100 Evaluation Software给出的1∶1结合模型即“Langmuir结合”模型拟合。对于一些结合相互作用，采用基于平衡的方法，相对于分析物浓度的对数，对平衡结合响应Req进行描点，通过非线性回归分析导出KD。
对于中性条件下(pH7.0)下与人FcRn的结合，基于Biacore的结果示于表27。
[表27]
(9-3)使用人FcRn转基因小鼠品系276的同时给予模型中抗体的抗原消除效果的 体内试验
使用同时给予模型的抗体的体内试验如参考例3所述进行。本试验中使用的抗人IL-6受体抗体是之前所述的H54/L28-IgG1、Fv4-IgG1、Fv4-M73、Fv4-IgG1-v1、和Fv4-IgG1-v2。该试验中使用的小鼠是人FcRn转基因小鼠(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg品系276+/+小鼠、Jackson Laboratories；Methods Mol Biol.(2010)602：93-104)。
如图40所示，H54/L28-IgG1、Fv4-IgG1、Fv4-M73、Fv4-IgG1-v1、和Fv4-IgG1-v2的药代动力学等同，这些抗体在试验期间维持了类似的血浆中浓度。
血浆中hsIL-6浓度变化示于图41。相比于与Fv4-IgG1一起给予的hsIL-6R，与Fv4-IgG1-v2一起给予的hsIL-6R显示清除率增大，但与Fv4-M73和Fv4-IgG1-v1一起给予的hsIL-6R显示清除率降低。虽然全部Fc变体M73、v1和v2在pH中性条件下(pH7.0)与人FcRn的结合亲和性增大，但显示hsIL-6R清除率增大的仅为Fv4-IgG1-v2，Fv4-M73和Fv4-IgG1-v1并未显示增大。该事实表明，为了增大抗原的清除率，与pH7.0下与人FcRn的结合亲和性为KD 3.2μM或为天然型人IgG1(对人FcRn的结合亲和性为KD 88μM)的28倍高的IgG1-v1相比，pH7.0下抗体对人FcRn的结合亲和性至少要比其高。
图42示出pH7.0下Fc变体对人FcRn的结合亲和性、和同时给予hsIL-6R和Fc变体1天后的血浆中hsIL-6R浓度的关系。对本实施例和参考例6中所述的Fc变体(Fv4-IgG1、Fv4-M73、Fv4-IgG1-v1、Fv4-IgG1-v2、Fv4-IgG1-F14、Fv4-IgG1-F20、Fv4-IgG1-F21、Fv4-IgG1-F25、Fv4-IgG1-F29、Fv4-IgG1-F35、Fv4-IgG1-F48、Fv4-IgG1-F93、和Fv4-IgG1-F94)进行了描点。增大pH7.0下抗体与人FcRn的结合亲和性时，反映抗原清除率的血浆中hsIL-6R浓度在最初增加后，急剧降低。该现象表明，为了增大与天然型人IgG1相比的抗原清除率，pH7.0下抗体与人FcRn的结合亲和性需要优选强于KD 2.3μM(图42的曲线拟合得到的值)。抗体与人FcRn的结合亲和性为KD 88μM～KD 2.3μM时，认为可降低抗原清除率(更高的hsIL-6R浓度)。换而言之，为了增强抗原的消除，pH7.0下抗体与人FcRn的结合亲和性需要优选38倍高于天然型人IgG1，否则认为抗原清除率会降低。
图43示出pH7.0下Fc变体对人FcRn的结合亲和性、和同时给予hsIL-6R和Fc变体1天后的血浆中抗体浓度的关系。对本实施例和参考例6中所述的Fc变体(Fv4-IgG1、Fv4-M73、Fv4-IgG1-v1、Fv4-IgG1-v2、Fv4-IgG1-F14、Fv4-IgG1-F20、Fv4-IgG1-F21、Fv4-IgG1-F25、Fv4-IgG1-F29、Fv4-IgG1-F35、Fv4-IgG1-F48、Fv4-IgG1-F93、和Fv4-IgG1-F94)进行了描点。增大pH7.0下抗体与人FcRn的结合亲和性时，反映抗体的药代动力学(清除率)的血浆中抗体浓度最初得到维持，但之后急剧降低。该现象表明，为了维持与天然型人IgG1(对人FcRn的结合亲和性为KD 88μM)类似的抗体的药代动力学，pH7.0下抗体对人FcRn的亲和性需要弱于KD 0.2μM(图43的曲线拟合所得的值)。抗体对人FcRn的结合亲和性强于KD 0.2μM时，抗体的清除率增大(即，抗体从血浆中更急剧地消除)。换而言之，为了显示与天然型人IgG1类似的抗体药代动力学，pH7.0下抗体对人FcRn的结合亲和性需要为天然型人IgG1的440倍以内，否则认为会造成抗体从血浆急剧消除。
考虑图42和43两者，为了维持与天然型人IgG1类似的抗体药代动力学，同时增大相比于IgG1的抗原清除率(即，减少血浆中抗原浓度)，pH7.0下抗体对人FcRn的结合亲和性需要为2.3μM至0.2μM，或者换而言之，pH7.0下抗体对人FcRn的结合亲和性需要为天然型人IgG1的38倍至440倍高的范围。具有与IgG1类似的药代动力学、有长期抗原消除活性的这类抗体，由于长期作用性，因而认为对于慢性疾病等需要较长给药间隔的抗体治疗是有益的。
另一方面，认为通过使pH7.0下抗体对人FcRn的结合亲和性增大而强于KD 0.2μM，或换而言之，通过使pH7.0下抗体对人FcRn的结合亲和性相比于天然型人IgG1增大高于440倍，虽然抗体与天然型人IgG1相比快速地从血浆中消除，但可在短期内大幅增强抗原清除率。能够诱导抗原浓度的急剧且大幅减少的这类抗体由于其速效性，因而认为对于需要将疾病相关抗原从血浆中除去的急性疾病等的抗体治疗而言是有益的。
每1分子抗体从血浆中消除的抗原的量是通过给予pH7.0下与人FcRn的结合亲和性增大了的抗体Fc变体来评价抗原消除效率时的重要因素。为了评价每1分子抗体的抗原消除效率，在本实施例和参考例6所述的体内试验的各个时刻进行以下计算。
A值：各时刻的抗原的摩尔浓度
B值：各时刻的抗体的摩尔浓度
C值：相对于抗体摩尔浓度的抗原摩尔浓度(抗原/抗体摩尔比)
C＝A/B
各抗体的C值(抗原/抗体摩尔比)的变化记载于图44中。C值越小，表示每1分子抗体的抗原消除效率越高，而C值越大，则表示每1分子抗体的抗原消除效率越低。与IgG1相比，C值越小则表示通过Fc变体可获得更高的抗原消除效率，与IgG1相比，C值越大则表示Fc变体对于抗原消除效率具有负作用。与Fv4-IgG1相比，除Fv4-M73和Fv4-IgG1-v1之外的全部Fc变体均显示抗原消除效率的增大。Fv4-M73和Fv4-IgG1-v1对抗原消除效率显示负影响，这与图42一致。
图45示出pH7.0下Fc变体对人FcRn的结合亲和性、和同时给予hsIL-6R和Fc变体1天后的C值(抗原/抗体摩尔比)的关系。对本实施例和参考例6中所述的Fc变体(Fv4-IgG1、Fv4-M73、Fv4-IgG1-v1、Fv4-IgG1-v2、Fv4-IgG1-F14、Fv4-IgG1-F20、Fv4-IgG1-F21、Fv4-IgG1-F25、Fv4-IgG1-F29、Fv4-IgG1-F35、Fv4-IgG1-F48、Fv4-IgG1-F93、和Fv4-IgG1-F94)进行了描点。这表明，为了实现与天然型人IgG1相比的更高抗原消除效率，pH7.0下抗体对人FcRn的亲和性需要强于KD 3.0μM(图45的曲线拟合所得的值)。换而言之，为了实现相比于天然型人IgG1的更高抗原消除效率，pH7.0下抗体对人FcRn的结合亲和性需要为天然型人IgG1的至少29倍高。
作为结论，在pH7.0下具有KD 3.0μM至0.2μM的与FcRn的结合亲和性的抗体变体组、或换而言之，在pH7.0下具有天然型人IgG1的29倍至440倍高的范围的与FcRn的结合亲和性的抗体变体组，具有与IgG1类似的抗体药代动力学，但具有增大的血浆中抗体消除能力。所以，相比于IgG1，这类抗体显示增大的抗原消除效率。通过与IgG1类似的药代动力学，可以从血浆中长期消除抗原(长期作用性的抗原消除)、因而可以为长给药间隔，认为这对慢性疾病相关的抗体治疗物质来说是优选的。在pH7.0下具有强于KD 0.2μM的与FcRn的结合亲和性的抗体变体组、或换而言之，在pH7.0下具有天然型人IgG1的440倍高的与FcRn的结合亲和性的抗体变体组具有急剧的抗体清除(短期的抗体消除)。尽管如此，由于这类抗体可以将抗原进一步更急剧地清除(速效性的抗原消除)，因此这类抗体与IgG1相比还显示增大的抗原消除效率。如参考例8所示，正常小鼠中的Fv4-IgG1-F20诱导在非常短期内将抗原从血浆中大幅消除，但抗原消除效果不持续。认为这种特征对需要将疾病相关抗原在极短时期迅速且大幅地从血浆中消耗的急性疾病的情形是优选的。
〔参考例10〕使用人FcRn转基因小鼠品系276的基于稳态注入模型的Fv4-IgG1-F14的体内试验
使用人FcRn转基因小鼠品系276，基于下述稳态注入模型进行Fv4-IgG1-F14的体内试验。试验组包括：对照组(无抗体)、1mg/kg的用量的Fv4-IgG1、以及1mg/kg、0.2mg/kg、和0.01mg/kg的用量的Fv4-IgG1-F14。
在人FcRn转基因小鼠品系276(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg品系276+/+小鼠(B6.mFcRn-/-hFCRN Tg276 B6.Cg-Fcgrt＜tmlDcr＞Tg(FCGRT)276Dcr(Jackson#4919))、Jackson Laboratories；Methods Mol Biol.(2010)602：93-104)的背部皮下植入填充有可溶型人IL-6受体的注入泵(MINI-OSMOTIC PUMP MODEL 2004；alzet)，由此制作血浆中可溶型人IL-6受体浓度维持恒定的模型动物。对模型动物给予抗人IL-6受体抗体，对给予后的可溶型人IL-6受体的机体内动力学进行评价。为了抑制针对可溶型人IL-6受体的中和抗体的产生，在植入注入泵前和尾静脉给予抗体14天后，以20mg/kg给予单克隆抗小鼠CD4抗体(R&D)。接着，将填充有92.8μg/ml可溶型人IL-6受体的注入泵植入小鼠的背部皮下。注入泵植入3天后，对尾静脉以1mg/kg单次给予抗人IL-6受体抗体(H54/L28-IgG1和H54/L28-IgG1-F14)。在给予抗人IL-6受体抗体15分后、7小时后、1天后、2天后、3天后、4天后、7天后、14天后、21天后、和28天后进行采血。采集的血液立即在4℃、15,000rpm下离心分离15分钟，得到血浆。分离的血浆直至实施测定为止，保存在设定为-20℃以下的冰箱中。
小鼠血浆中的hsIL-6R浓度通过电化学发光进行测定。制备调整为2,000、1,000、500、250、125、62.5、和31.25pg/ml浓度的hsIL-6R校准曲线试样以及稀释50倍以上的小鼠血浆试样。将试样与用SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)进行了钌标记的单克隆抗人IL-6R抗体(R&D)、生物素化抗人IL-6R抗体(R&D)、和WT-IgG1溶液混合，在37℃反应一夜。作为抗人IL-6受体抗体，含有托珠单抗(重链序列编号：13、轻链序列编号：14)的WT-IgG1的终浓度为333μg/ml，其相较于试样中所含的抗人IL-6受体抗体浓度为过量，其目的是形成使试样中几乎全部hsIL-6R分子都与WT-IgG1结合的状态。然后，将试样分配于MA400PR链霉亲和素板(Meso Scale Discovery)，在室温反应1小时，进行洗涤。分配读数缓冲液T(×4)(Meso Scale Discovery)，立即通过Sector PR 400 Reader(Meso ScaleDiscovery)进行测定。hsIL-6R浓度是使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)，根据校准曲线的响应算出。
图46示出给予抗体后的血浆中hsIL-6R浓度的时间曲线。与未给予抗体的基线的hsIL-6R水平相比，1mg/kg Fv4-IgG1的给予使得血浆中hsIL-6R浓度数倍增加。另一方面，与Fv4-IgG1组和基线组相比时，1mg/kg的Fv4-IgG1-F14的给予使得血浆中浓度产生显著性降低。第2天未检测出血浆中hsIL-6R浓度(血浆中hsIL-6R浓度的定量限在该测定***中为1.56ng/mL)，这持续直到第14天。
与H54/L28-IgG1相比，H54/L28-IgG1-F14显示出血浆中hsIL-6R浓度的减少，但减少的程度小。对于与hsIL-6R具有pH依赖性结合特性的Fv4可变区，减少程度大得多。该现象表明，使pH7.0下对人FcRn的结合亲和性增大虽然对于减少血浆中抗原浓度有效，但通过组合pH依赖性抗原结合和pH中性范围下对人FcRn的结合亲和性的增大，抗原消除显著增大。
使用了较低用量的Fv4-IgG1-F14的试验表明，即使是1mg/kg的1/100的0.01mg/kg，也使血浆中抗原浓度较基线减少，分子从血浆中消耗抗原的效率显著。
〔参考例11〕同时给予模型中人FcRn转基因小鼠品系276和品系32的比较
迄今为止的体内试验是使用人FcRn转基因小鼠品系276(Jackson Laboratories)进行。为了比较人FcRn转基因小鼠品系276和不同转基因品系品系32的差异，本发明人使用人FcRn转基因小鼠品系32(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg品系32+/+小鼠(B6.mFcRn-/-hFCRN Tg32；B6.Cg-Fcgrt＜tmlDcr＞Tg(FCGRT)32Dcr)(Jackson #4915))、Jackson Laboratories；Methods Mol Biol.(2010)602：93-104)，进行了H54/L28-IgG1、Fv4-IgG1、和Fv4-IgG1-v2的同时给予试验。除了使用人FcRn转基因小鼠品系32来代替人FcRn转基因小鼠品系276以外，试验方法与参考例3的试验方法相同。
图47示出在人FcRn转基因小鼠品系276和品系32两者中的血浆中hsIL-6R浓度变化。H54/L28-IgG1、Fv4-IgG1、和Fv4-IgG1-v2示出类似的血浆中hsIL-6R浓度-时间曲线。每种小鼠中，增大pH7.0下与人FcRn的结合亲和性时，则血浆中的抗原消除被增强至相同程度(比较Fv4-IgG1与Fv4-IgG1-v2)。
图48示出在人FcRn转基因小鼠品系276和品系32两者中的血浆中抗体浓度变化。H54/L28-IgG1、Fv4-IgG1、和Fv4-IgG1-v2示出类似的血浆中抗体浓度-时间曲线。
作为结论，品系276和品系32之间未观察到显著性差异，使pH7.0下与人FcRn的结合亲和性增大的Fc变体在增强血浆中抗原浓度的消除方面，对于表达人FcRn的2个不同转基因小鼠品系均有效。
〔参考例12〕中性pH下与人FcRn的结合亲和性增大了的各种抗体Fc变体的制作
(12-1)Fc变体的制作
为了进一步改善抗原消除曲线，以增大pH中性范围下与人FcRn的结合亲和性为目的，对Fv4-IgG1导入各种突变。具体地，将表15所示的氨基酸突变导入Fv4-IgG1的重链恒定区，制作Fc变体(突变位点的氨基酸编号按照EU编号进行记载)。氨基酸置换的导入按照参考例3所述的本领域技术人员公知的方法实施。
将分别含有所制备重链和L(WT)(序列编号：14)的进一步的变体(IgG1-F100至IgG1-F1052)通过参考例3所述的本领域技术人员公知的方法进行表达并纯化。
(12-2)人FcRn结合的评价
对于IgG1-v1、IgG1-v2、和IgG1-F2至IgG1-F1052，如参考例5所述分析抗体与人FcRn结合的动力学，或对于IgG1和M73，如参考例9所述分析抗体与人FcRn结合的动力学。对于中性条件下(pH7.0)与人FcRn结合，基于Biacore的结果示于表28-1至28-21。
[表28-1]
表28-2是表28-1的续表。
[表28-2]
表28-3是表28-2的续表。
[表28-3]
表28-4是表28-3的续表。
[表28-4]
表28-5是表28-4的续表。
[表28-5]
表28-6是表28-5的续表。
[表28-6]
表28-7是表28-6的续表。
[表28-7]
表28-8是表28-7的续表。
[表28-8]
表28-9是表28-8的续表。
[表28-9]
表28-10是表28-9的续表。
[表28-10]
表28-11是表28-10的续表。
[表28-11]
表28-12是表28-11的续表。
[表28-12]
表28-13是表28-12的续表。
[表28-13]
表28-14是表28-13的续表。
[表28-14]
表28-15是表28-14的续表。
[表28-15]
表28-16是表28-15的续表。
[表28-16]
表28-17是表28-16的续表。
[表28-17]
表28-18是表28-17的续表。
[表28-18]
表28-19是表28-18的续表。
[表28-19]
表28-20是表28-19的续表。
[表28-20]
表28-21是表28-20的续表。
[表28-21]
〔参考例13〕使用人FcRn转基因小鼠品系32的基于稳态注入模型的各种Fc变体抗体的体内试验
对于参考例12中制作的Fc变体，在使用人FcRn转基因小鼠品系32的稳态注入模型中，关于血浆中抗原消除能力进行试验。稳态注入模型体内试验，除了使用人FcRn转基因小鼠品系32来代替品系276，给予单克隆抗小鼠CD4抗体2次(植入注入泵之前、和给予抗体14天后)或3次(植入注入泵之前、和给予抗体10天后和20天后)以外，如实施例1所述进行。
通过参考例3所述的本领域技术人员公知的方法表达并纯化选自表28-1至28-21中记载的Fc变体中的以下所述的抗体Fc变体：
含有VH3-IgG1和VL3-CK的Fv4-IgG1；
含有VH3-IgG1-F11和VL3-CK的Fv4-IgG1-F11；
含有VH3-IgG1-F14和VL3-CK的Fv4-IgG1-F14；
含有VH3-IgG1-F39和VL3-CK的Fv4-IgG1-F39；
含有VH3-IgG1-F48和VL3-CK的Fv4-IgG1-F48；
含有VH3-IgG1-F140和VL3-CK的Fv4-IgG1-F140；
含有VH3-IgG1-F157和VL3-CK的Fv4-IgG1-F157；
含有VH3-IgG1-F194和VL3-CK的Fv4-IgG1-F194；
含有VH3-IgG1-F196和VL3-CK的Fv4-IgG1-F196；
含有VH3-IgG1-F198和VL3-CK的Fv4-IgG1-F198；
含有VH3-IgG1-F262和VL3-CK的Fv4-IgG1-F262；
含有VH3-IgG1-F264和VL3-CK的Fv4-IgG1-F264；
含有VH3-IgG1-F393和VL3-CK的Fv4-IgG1-F393；
含有VH3-IgG1-F434和VL3-CK的Fv4-IgG1-F424；和
含有VH3-IgG1-F447和VL3-CK的Fv4-IgG1-F447。
将这些抗体以1mg/kg的用量给予人FcRn转基因小鼠品系32。
图49示出小鼠中的血浆中hsIL-6R浓度变化。与Fv4-IgG1相比，pH7.0向与人FcRn的结合亲和性增大了的Fc变体均显示血浆中hsIL-6R浓度减少，因而增大了抗原从血浆中的消除。虽然抗原浓度减少的程度和持续在Fc变体间不同，但相比于IgG1，全部变体均一致地减少了血浆中hsIL-6R浓度。这表明，通过增大pH7.0下与人FcRn的结合亲和性，抗原从血浆中的消除通常增大。图50示出小鼠中的血浆中抗体浓度变化。抗体的药代动力学在Fc变体间不同。
如参考例9所述，每1分子抗体从血浆中消除的抗原的量是通过给予pH7.0下与人FcRn的结合亲和性增大了的抗体Fc变体来评价抗原消除效率时的重要因素。因而，针对各抗体的C值(抗原/抗体摩尔比)的变化示于图51。图52示出pH7.0下Fc变体对人FcRn的结合亲和性、与给予抗体1天后的C值(抗原/抗体摩尔比)的关系。其表明与Fv4-IgG1相比，该试验中试验的全部抗体Fc变体都具有较小的C值。本试验中试验的全部Fc变体在pH7.0下具有强于KD 3.0μM的与人FcRn的结合亲和性，因而它们与天然型人IgG1相比，实现了更高的抗原消除效率。这与参考例9中所得结果一致(图42)。
图53示出本试验中试验的Fc变体中，具有F11、F39、F48、和F264的Fc变体的抗体显示出与IgG1类似的药代动力学。该试验是使用人FcRn转基因小鼠进行的，因而预测这些Fc变体在人中也具有类似于IgG1的长半衰期。图54示出给予了与天然型人IgG1具有类似药代动力学的抗体(F11、F39、F48、和F264)的小鼠的血浆中hsIL-6R浓度变化。相比于IgG1，这些变体使血浆中hsIL-6R浓度降低约10倍。此外，这些抗体还使hsIL-6R浓度减少至低于基线hsIL-6R浓度(无抗体的浓度)。因此，认为这些抗体可以从血浆中长期消除抗原，因而对于用于慢性疾病的抗体治疗来说，可实现优选的长的给药间隔。
图55和56分别示出IgG1、以及Fc变体F157、F196、和F262的血浆中抗体浓度和血浆中hsIL-6R浓度变化。令人惊讶的是，F157和F262的抗体药代动力学与天然型IgG1相比，显示出显著较快的血浆中的清除率，但F157和F262显示出从血浆中大幅且持续的hsIL-6R消除。具体地，从第1天至第28天(第14天除外)，F157的血浆中hsIL-6R浓度低于检测限(1.56ng/ml)，从第14天至第28天，F262的血浆中hsIL-6R浓度低于检测限(1.56ng/ml)。另一方面，与F157相比，对于抗体的清除率更慢的F196，抗原浓度在第14天开始增加，在第28天返回基线。本试验中试验的Fc变体中，F157和F262是在第28天的时刻能够使血浆中hsIL-6R浓度减少至低于1.56mg/ml的唯一的Fc变体。
与天然型人IgG1相比，抗体非常急剧地从血浆中消除，因而F157和F262中得到的这种持续的长期效果是根据抗体的药代动力学未曾预料到的。特别地，F157的血浆中抗体浓度在第21天未检测到。尽管如此，血浆中hsIL-6R浓度在第21天和第28天的时刻也持续减少至低于检测限1.56ng/ml的水平。本发明并不受特定理论的束缚，但认为这种意料之外的效果是由于抗体以FcRn结合型形式存在于血管内皮细胞表面所致。虽然这些抗体在血浆中显示为低浓度，但这些抗体仍以FcRn结合型(作为血浆中抗体浓度无法测定)形式存在于血管腔隙中。这些FcRn结合抗体仍能与血浆中的抗原结合，抗原/抗体复合体通过FcRn被摄入后，抗原在内体内游离，被溶酶体分解，但抗体却以FcRn结合型形式返回到细胞表面而被再循环。这样，这些FcRn结合抗体有助于抗原的消除。由此，说明了抗体浓度在血浆中变低后这些抗体仍维持抗原消除能力的原因。
产业实用性
通过本发明，提供了促进基于抗原结合分子的抗原向细胞内摄入的方法、增加1分子的抗原结合分子对抗原的结合次数的方法、促进通过给予抗原结合分子来减少血浆中抗原浓度的方法、改善抗原结合分子的血浆中滞留性的方法。通过促进基于抗原结合分子的抗原向细胞内摄入，使得可以通过给予抗原结合分子来促进抗原的血浆中抗原浓度的减少，同时可以改善抗原结合分子的血浆中滞留性，可以增加通过1分子的抗原结合分子结合抗原的次数，从而可以在体内比通常的抗原结合分子发挥更优异的效果。

Claims (41)

1.抗原结合分子，其含有抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，其在2个不同钙浓度条件下的抗原结合活性不同，且抗原结合分子在低钙浓度条件下的抗原结合活性低于在高钙浓度条件下的抗原结合活性，且其在中性pH条件下具有对人FcRn的结合活性。
2.权利要求1所述的抗原结合分子，其中所述低钙浓度是0.1μM至30μM的离子化钙浓度。
3.权利要求1所述的抗原结合分子，其中所述高钙浓度是100μM至10mM的离子化钙浓度。
4.权利要求1或2所述的抗原结合分子，其中所述低钙浓度是内体内的离子化钙浓度。
5.权利要求1或3所述的抗原结合分子，其中所述高钙浓度是血浆中的离子化钙浓度。
6.权利要求1～5中任一项所述的抗原结合分子，其中所述FcRn结合结构域是Fc区。
7.权利要求1～6中任一项所述的抗原结合分子，其中进一步地在酸性pH条件下的抗原结合活性低于在中性pH条件下的抗原结合活性。
8.权利要求7所述的抗原结合分子，其中至少1个氨基酸被组氨酸所置换，或者至少1个组氨酸被***到所述抗原结合分子中。
9.权利要求1～8中任一项所述的抗原结合分子，其与膜抗原或者可溶性抗原结合。
10.权利要求1～9中任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原是选自由IL-6R、IL-6、IgA、人磷脂酰肌醇聚糖3和IgE组成的组的抗原。
11.抗原结合分子，其含有抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，其在2个不同钙浓度条件下的抗原结合活性不同，且抗原结合分子在低钙浓度条件下的抗原结合活性低于在高钙浓度条件下的抗原结合活性，且其中抗原结合结构域的轻链或重链含有来源于人抗体的钙结合基序。
12.权利要求11所述的抗原结合分子，其中所述钙结合基序包括在抗原结合结构域的轻链CDR1、CDR2和域CDR3中。
13.权利要求12所述的抗原结合分子，其中所述钙结合基序包含在轻链CDR1的以Kabat编号表示的30位、31位和/或32位。
14.权利要求12或13所述的抗原结合分子，其中所述钙结合基序包含在轻链CDR2的以Kabat编号表示的50位。
15.权利要求12～14中任一项所述的抗原结合分子，其中所述钙结合基序包含在轻链CDR3的以Kabat编号表示的92位。
16.权利要求12～15中任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子是IgA或人磷脂酰肌醇聚糖3中的任一者。
17.权利要求11所述的抗原结合分子，其中所述钙结合基序包含在抗原结合结构域的重链CDR1、CDR2和/或CDR3中。
18.权利要求16所述的抗原结合分子，其中所述钙结合基序包含在重链CDR3的以Kabat编号表示的95位、96位、100a位和/或101位。
19.权利要求17或18所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子是IL-6R或IL-6中的任一者。
20.权利要求11～19中任一项所述的抗原结合分子，其含有FcRn结合结构域，该FcRn结合结构域在pH中性范围下具有FcRn结合活性。
21.权利要求20所述的抗原结合分子，其中所述FcRn结合结构域为Fc区。
22.权利要求1～10、20或21中任一项所述的抗原结合分子，其中Fc区的氨基酸序列中以EU编号表示的248、250、252、254、255、256、257、258、265、286、289、297、303、305、307、308、309、311、312、314、315、317、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、428、433、434和436位上的一个或多个氨基酸与天然Fc区的氨基酸不同。
23.权利要求22所述的抗原结合分子，其包含在Fc区中以EU编号表示的下述任一者或其组合：
237位的氨基酸为Met；
248位的氨基酸为Ile；
250位的氨基酸为Ala、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp、或Tyr；
252位的氨基酸为Phe、Trp、或Tyr；
254位的氨基酸为Thr；
255位的氨基酸为Glu；
256位的氨基酸为Asp、Glu、或Gln；
257位的氨基酸为Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr或Val；
258位的氨基酸为His；
265位的氨基酸为Ala；
286位的氨基酸为Ala或Glu；
289位的氨基酸为His；
297位的氨基酸为Ala；
303位的氨基酸为Ala；
305位的氨基酸为Ala；
307位的氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr；
308位的氨基酸为Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln或Thr；
309位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro或Arg；
311位的氨基酸为Ala、His或Ile；
312位的氨基酸为Ala或His；
314位的氨基酸为Lys或Arg；
315位的氨基酸为Ala、Asp或His；
317位的氨基酸为Ala；
332位的氨基酸为Val；
334位的氨基酸为Leu；
360位的氨基酸为His；
376位的氨基酸为Ala；
380位的氨基酸为Ala；
382位的氨基酸为Ala；
384位的氨基酸为Ala；
385位的氨基酸为Asp或His；
386位的氨基酸为Pro；
387位的氨基酸为Glu；
389位的氨基酸为Ala或Ser；
424位的氨基酸为Ala；
428位的氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；
433位的氨基酸为Lys；
434位的氨基酸为Ala、Phe、His、Ser、Trp或Tyr；或
436位的氨基酸为His、Ile、Leu或Val。
24.权利要求1～23中任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子是抗体。
25.通过抗原结合分子促进抗原向细胞内摄入的方法，其是通过施用权利要求1～24中任一项所述的抗原结合分子来进行的。
26.促进血浆抗原浓度的减少的方法，其是通过施用权利要求1～24中任一项所述的抗原结合分子来进行的。
27.增加1个抗原结合分子对抗原的结合次数的方法，其是通过使用权利要求1～24中任一项所述的抗原结合分子来进行的。
28.改善抗原结合分子的血浆滞留的方法，其是通过使用权利要求1～24中任一项所述的抗原结合分子来进行的。
29.通过抗原结合分子促进抗原向细胞内摄入的方法，其是通过施用抗原结合分子来进行的，该抗原结合分子含有抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，该抗原结合分子在2个不同钙浓度条件下的抗原结合活性不同，且抗原结合分子在低钙浓度条件下的抗原结合活性低于在高钙浓度条件下的抗原结合活性。
30.促进血浆抗原浓度的减少的方法，其是通过施用抗原结合分子来进行的，该抗原结合分子含有抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，该抗原结合分子在2个不同钙浓度条件下的抗原结合活性不同，且抗原结合分子在低钙浓度条件下的抗原结合活性低于在高钙浓度条件下的抗原结合活性。
31.增加1个抗原结合分子对抗原的结合次数的方法，其是通过使用抗原结合分子来进行的，该抗原结合分子含有抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，该抗原结合分子在2个不同钙浓度条件下的抗原结合活性不同，且抗原结合分子在低钙浓度条件下的抗原结合活性低于在高钙浓度条件下的抗原结合活性。
32.改善抗原结合分子的血浆滞留的方法，其是通过使用抗原结合分子来进行的，该抗原结合分子含有抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，该抗原结合分子在2个不同钙浓度条件下的抗原结合活性不同，且抗原结合分子在低钙浓度条件下的抗原结合活性低于在高钙浓度条件下的抗原结合活性。
33.权利要求29至32中任一项所述的方法，其中所述低钙浓度是0.1μM至30μM的离子化钙浓度。
34.权利要求29至32中任一项所述的方法，其中所述高钙浓度是100μM至10mM的离子化钙浓度。
35.权利要求29至33中任一项所述的方法，其中所述低钙浓度是内体内的离子化钙浓度。
36.权利要求29至32或34中任一项所述的方法，其中所述高钙浓度是血浆中的离子化钙浓度。
37.权利要求29至36中任一项所述的方法，其中所述抗原结合分子的FcRn结合结构域是Fc区。
38.权利要求29至37中任一项所述的方法，其中另外地，所述抗原结合分子在酸性pH条件下的抗原结合活性低于在中性pH条件下的抗原结合活性。
39.权利要求38所述的方法，其中抗原结合分子中的氨基酸修饰是通过用组氨酸置换至少1个氨基酸的修饰，或者通过将至少1个组氨酸***到所述抗原结合分子中的修饰。
40.权利要求29至39中任一项所述的方法，其中与所述抗原结合分子结合的抗原是选自由IL-6R、IL-6、IgA、人磷脂酰肌醇聚糖3和IgE组成的组的抗原。
41.权利要求29至40中任一项所述的方法，其中所述抗原结合分子是抗体。
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