JP7205995B2 - 共刺激性tnf受容体に対する二重特異性抗原結合分子 - Google Patents
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Description
(a)抗体軽鎖可変領域(VL)及び抗体重鎖可変領域(VH)を含む、OX40に特異的に結合できる少なくとも1つの部分、並びに
(b)抗体軽鎖可変領域(VL)及び抗体重鎖可変領域(VH)を含む、テネイシンC(TnC)に特異的に結合できる少なくとも1つの部分
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
(c)安定な結合が可能な第1及び第2のサブユニットから構成されるFc領域
を更に含む。
(i)配列番号2及び配列番号3から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H1、
(ii)配列番号4及び配列番号5から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H2、並びに
(iii)配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11及び配列番号12から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H3
を含む重鎖可変ドメイン(VH)と、
(iv)配列番号13、配列番号14及び配列番号15から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L1、
(v)配列番号16、配列番号17及び配列番号18から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L2、並びに
(vi)配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23及び配列番号24から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含む軽鎖可変ドメイン(VL)と
を含む。
(i)配列番号25のアミノ酸配列を含むVHと配列番号26のアミノ酸配列を含むVL、
(ii)配列番号27のアミノ酸配列を含むVHと配列番号28のアミノ酸配列を含むVL、
(iii)配列番号29のアミノ酸配列を含むVHと配列番号30のアミノ酸配列を含むVL、
(iv)配列番号31のアミノ酸配列を含むVHと配列番号32のアミノ酸配列を含むVL、
(v)配列番号33のアミノ酸配列を含むVHと配列番号34のアミノ酸配列を含むVL、
(vi)配列番号35のアミノ酸配列を含むVHと配列番号36のアミノ酸配列を含むVL、又は
(vii)配列番号37のアミノ酸配列を含むVHと配列番号38のアミノ酸配列を含むVL
を含む。
(i)配列番号40及び配列番号41から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H1、
(ii)配列番号42及び配列番号43から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H2、並びに
(iii)配列番号44及び配列番号45から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHと、
(iv)配列番号46及び配列番号47から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L1、
(v)配列番号48及び配列番号49から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L2、並びに
(vi)配列番号50及び配列番号51から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLと
を含む。
(i)配列番号52のアミノ酸配列を含むVH及び配列番号53のアミノ酸配列を含むVL、又は
(ii)配列番号54のアミノ酸配列を含むVH及び配列番号55のアミノ酸配列を含むVL
を含む。
(i)配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35又は配列番号37のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むVH及び配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36又は配列番号38から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むVLを含む、OX40に特異的に結合できる少なくとも1つの部分と、
(ii)配列番号52又は配列番号54から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むVH及び配列番号53又は配列番号55から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むVLを含む、TnCに特異的に結合できる少なくとも1つの部分と
を含む。
(a)配列番号27のアミノ酸配列を含むVH及び配列番号28のアミノ酸配列を含むVLを含む、OX40に特異的に結合できる少なくとも1つの部分と、
(b)
(i)配列番号52のアミノ酸配列を含むVHと配列番号53のアミノ酸配列を含むVL、又は
(ii)配列番号54のアミノ酸配列を含むVH及び配列番号55のアミノ酸配列を含むVL
を含む、TnCに特異的に結合できる少なくとも1つの部分と
を含む。
(a)Fc領域に連結しており、OX40に特異的に結合できる少なくとも2つのFab断片と、
(b)Fc領域のC末端に連結している抗体軽鎖可変領域(VL)及び抗体重鎖可変領域(VH)を含む、TnCに特異的に結合できる少なくとも1つの部分と
を含む。
(a)抗体の2つの軽鎖及び、OX40に特異的に結合できる2つのFab断片とFc領域とを含む2つの重鎖、並びに
(b)TnCに特異的に結合できる部分のVH及びVLであって、VHが(a)の2つの重鎖のうちの一方の重鎖のC末端に連結しており、VLが(a)の2つの重鎖のうちのもう一方のC末端に連結しているVH及びVL
を含む。
(a)抗体の2つの軽鎖及び、OX40に特異的に結合できる2つのFab断片とFc領域とを含む2つの重鎖、並びに
(b)TnCに特異的に結合できる2つのFab断片であって、そのFab断片のうちの一方が(a)の2つの重鎖のうちの一方のC末端に連結しており、Fab断片のうちのもう一方が(a)の2つの重鎖のうちのもう一方のC末端に連結しているFab断片
を含む。
(a1)OX40に特異的に結合できるFab断片のVH及びCH1ドメインと、Fc領域サブユニットとをそれぞれが含む2つの重鎖、
(a2)OX40に特異的に結合できるFab断片のVL及びCLドメインをそれぞれが含む2つの軽鎖、並びに
(b)TnCに特異的に結合できる部分のVH及びVLであって、VHが(a1)の2つの重鎖のうちの一方のC末端に連結し、VLが(a1)の2つの重鎖のうちのもう一方のC末端に連結しているVH及びVL
を含む。
(a1)OX40に特異的に結合できるFab断片のVH及びCH1ドメインと、Fc領域サブユニットとをそれぞれが含む2つの重鎖、
(a2)OX40に特異的に結合できるFab断片のVL及びCLドメインをそれぞれが含む2つの軽鎖、
(b)TnCに特異的に結合できる2つのFab断片であって、そのFab断片のうちの一方が(a1)の2つの重鎖のうちの一方のC末端に連結し、Fab断片のうちのもう一方が(a1)の2つの重鎖のうちのもう一方のC末端に連結しているFab断片
を含む。
123位(EU番号付け)のアミノ酸においてアルギニン(R)を、及び124位(EU番号付け)のアミノ酸においてリジン(K)を含むCLドメイン、並びに
147位(EU番号付け)のアミノ酸においてグルタミン酸(E)を、及び213位(EU番号付け)のアミノ酸においてグルタミン酸(E)を含むCH1ドメイン
を含む。
配列番号213のアミノ酸配列をそれぞれが含む2つの重鎖、
配列番号212のアミノ酸配列をそれぞれが含む2つの軽鎖、及び
配列番号214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2つの軽鎖
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
配列番号215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2つの重鎖、
配列番号212のアミノ酸配列をそれぞれが含む2つの軽鎖、及び
配列番号216のアミノ酸配列をそれぞれが含む2つの軽鎖
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
配列番号222のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、
配列番号223のアミノ酸配列をが含む第2の重鎖、及び
配列番号212のアミノ酸配列をそれぞれが含む4つの軽鎖
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
配列番号225のアミノ酸配列をそれぞれが含む2つの重鎖、
配列番号224のアミノ酸配列をそれぞれが含む4つの軽鎖、及び
配列番号226のアミノ酸配列をそれぞれが含む2つの軽鎖
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
(i)T細胞応答を刺激すること、
(ii)活性化T細胞の生存を維持すること、
(iii)感染症の治療、
(iv)がんの治療、
(v)がんの進行を遅らせること、又は
(vi)がんに罹患している患者の生存を延長させること
における使用のための、本発明の二重特異性抗原結合分子又は本発明の薬学的組成物を提供する。
特に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野において一般的に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書の説明のために、以下の定義を適用し、単数形で用いられる用語は、適切な場合はいつでも複数形も含み、その逆も同じである。
表A:CDRの定義1
1表AのCDR定義の番号付けは全て、Kabatらが定めた番号付け規則に従っている(以下参照)。
2表Aで使用されている、「b」が小文字の「AbM」は、Oxford Molecularの「AbM」抗体モデリングソフトウエアによって定義されているCDRを指す。
分率X/Yの100倍
ここで、Xは、プログラムのアライメントA及びBにおいて、配列アライメントプログラムALIGN-2により完全一致としてスコアされたアミノ酸残基の数であり、Yは、B中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、Bに対するAのアミノ酸配列同一性%は、Aに対するBのアミノ酸配列同一性%とは異なると認識されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性%値は、ALIGN-2コンピュータプログラムを使用して、直前の段落に記載のようにして得られる。
表B
アミノ酸は以下の共通の側鎖特性に従ってグループ化することができる。
(1)疎水性:ノルロイシン,Met,Ala,Val,Leu,Ile;
(2)中性の親水性:Cys,Ser,Thr,Asn,Gln;
(3)酸性:Asp,Glu;
(4)塩基性:His,Lys,Arg;
(5)鎖配向に影響する残基:Gly,Pro;
(6)芳香族:Trp,Tyr,Phe
非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つの要素を別のクラスの要素と交換することを必然的に伴うものである。
本発明は、生産可能性、安定性、結合アフィニティー、生物活性、標的化効率、及び低い毒性等の特に有利な特性を有する新規の二重特異性抗原結合分子を提供する。
(a)抗体軽鎖可変領域(VL)及び抗体重鎖可変領域(VH)を含む、OX40に特異的に結合できる少なくとも1つの部分、並びに
(b)抗体軽鎖可変領域(VL)及び抗体重鎖可変領域(VH)を含む、テネイシンC(TnC)に特異的に結合できる少なくとも1つの部分
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
ある態様では、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、そのOX40に特異的に結合できる部分が、配列番号1のアミノ酸配列を含むか又はそれから成るポリペプチドに結合する二重特異性抗原結合分子を提供する。
(i)配列番号2及び配列番号3から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H1、
(ii)配列番号4及び配列番号5から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H2、並びに
(iii)配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11及び配列番号12から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H3
を含むVHと、
(iv)配列番号13、配列番号14及び配列番号15から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L1、
(v)配列番号16、配列番号17及び配列番号18から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L2、並びに
(vi)配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23及び配列番号24から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含むVLと
を二重特異性抗原結合分子である。
(a)配列番号2のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVH;並びに配列番号13のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLを含むか、
(b)配列番号2のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR-H2、配列番号7のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVH、並びに配列番号13のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号20のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLを含むか、
(c)配列番号2のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR-H2、配列番号8のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVH、並びに配列番号13のアミノ酸配列を含むCDR-L1を含むVL、配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号21のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLを含むか、
(d)配列番号2のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR-H2、配列番号9のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVH、並びに配列番号13のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号22のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLを含むか、
(e)配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号5のアミノ酸配列を含むCDR-H2、配列番号10のアミノ酸配列を含むCDR-H3含むVH、並びに配列番号14のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号23のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLを含むか、
(f)配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号5のアミノ酸配列を含むCDR-H2、配列番号11のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVH、並びに配列番号14のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号23のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLを含むか、又は
(g)配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号5のアミノ酸配列を含むCDR-H2、配列番号12のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVH、並びに配列番号15のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号24のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLを含む
二重特異性抗原結合分子である。
(i)配列番号25のアミノ酸配列を含むVHと配列番号26のアミノ酸配列を含むVL、
(ii)配列番号27のアミノ酸配列を含むVHと配列番号28のアミノ酸配列を含むVL、
(iii)配列番号29のアミノ酸配列を含むVHと配列番号30のアミノ酸配列を含むVL、
(iv)配列番号31のアミノ酸配列を含むVHと配列番号32のアミノ酸配列を含むVL、
(v)配列番号33のアミノ酸配列を含むVHと配列番号34のアミノ酸配列を含むVL、
(vi)配列番号35のアミノ酸配列を含むVHと配列番号36のアミノ酸配列を含むVL、又は
(vii)配列番号37のアミノ酸配列を含むVHと配列番号38のアミノ酸配列を含むVL
を含む二重特異性抗原結合分子である。
ある態様では、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、そのテネイシンC(TnC)に特異的に結合できる部分が、配列番号39のアミノ酸配列を含むか又はそれから成るポリペプチドに結合する二重特異性抗原結合分子を提供する。
(i)配列番号40及び配列番号41から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H1、
(ii)配列番号42及び配列番号43から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H2、並びに
(iii)配列番号44及び配列番号45から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHと、
(iv)配列番号46及び配列番号47から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L1、
(v)配列番号48及び配列番号49から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L2、並びに
(vi)配列番号50及び配列番号51から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLと
を含む。
(a)配列番号40のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号42のアミノ酸配列を含むCDR-H2、配列番号44のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVH、並びに配列番号46のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号48のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号50のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVL、又は
(b)配列番号41のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号43のアミノ酸配列を含むCDR-H2、配列番号45のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVH、並びに配列番号47のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号49のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号51のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLを含む。
(i)配列番号52のアミノ酸配列を含むVH及び配列番号53のアミノ酸配列を含むVL、又は
(ii)配列番号54のアミノ酸配列を含むVH及び配列番号55のアミノ酸配列を含むVL
を含む。
更なる態様において、提供されるのは、
(i)配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35又は配列番号37から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むVH及び配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36又は配列番号38のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むVLを含む、OX40に特異的に結合できる部分と、
(ii)配列番号52又は配列番号54から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むVH及び配列番号53又は配列番号55から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むVLを含む部分とを含む
二重特異性抗原結合分子である。
(a)OX40に特異的に結合できる部分が、配列番号25のアミノ酸配列を含むVHと配列番号26のアミノ酸配列を含むVLとを含み、TnCに特異的に結合できる部分が、配列番号52のアミノ酸配列を含むVHと配列番号53のアミノ酸配列を含むVLとを含むか、
(b)OX40に特異的に結合できる部分が、配列番号25のアミノ酸配列を含むVHと配列番号26のアミノ酸配列を含むVLとを含み、TnCに特異的に結合できる部分が、配列番号54のアミノ酸配列を含むVHと配列番号55のアミノ酸配列を含むVLとを含むか、
(c)OX40に特異的に結合できる部分が、配列番号27のアミノ酸配列を含むVHと配列番号28のアミノ酸配列を含むVLとを含み、TnCに特異的に結合できる部分が、配列番号52のアミノ酸配列を含むVHと配列番号53のアミノ酸配列を含むVLとを含むか、
(d)OX40に特異的に結合できる部分が、配列番号27のアミノ酸配列を含むVHと配列番号28のアミノ酸配列を含むVLとを含み、TnCに特異的に結合できる部分が、配列番号54のアミノ酸配列を含むVHと配列番号55のアミノ酸配列を含むVLとを含むか、
(e)OX40に特異的に結合できる部分が、配列番号29のアミノ酸配列を含むVHと配列番号30のアミノ酸配列を含むVLとを含み、TnCに特異的に結合できる部分が、配列番号52のアミノ酸配列を含むVHと配列番号53のアミノ酸配列を含むVLとを含むか、
(f)OX40に特異的に結合できる部分が、配列番号29のアミノ酸配列を含むVHと配列番号30のアミノ酸配列を含むVLとを含み、TnCに特異的に結合できる部分が、配列番号54のアミノ酸配列を含むVHと配列番号55のアミノ酸配列を含むVLとを含むか、
(g)OX40に特異的に結合できる部分が、配列番号31のアミノ酸配列を含むVHと配列番号32のアミノ酸配列を含むVLとを含み、TnCに特異的に結合できる部分が、配列番号52のアミノ酸配列を含むVHと配列番号53のアミノ酸配列を含むVLとを含むか、
(h)OX40に特異的に結合できる部分が、配列番号31のアミノ酸配列を含むVHと配列番号32のアミノ酸配列を含むVLとを含み、TnCに特異的に結合できる部分が、配列番号54のアミノ酸配列を含むVHと配列番号55のアミノ酸配列を含むVLとを含むか、
(i)OX40に特異的に結合できる部分が、配列番号33のアミノ酸配列を含むVHと配列番号34のアミノ酸配列を含むVLとを含み、TnCに特異的に結合できる部分が、配列番号52のアミノ酸配列を含むVHと配列番号53のアミノ酸配列を含むVLとを含むか、
(j)OX40に特異的に結合できる部分が、配列番号33のアミノ酸配列を含むVHと配列番号34のアミノ酸配列を含むVLとを含み、TnCに特異的に結合できる部分が、配列番号54のアミノ酸配列を含むVHと配列番号55のアミノ酸配列を含むVLとを含むか、
(k)OX40に特異的に結合できる部分が、配列番号35のアミノ酸配列を含むVHと配列番号36のアミノ酸配列を含むVLとを含み、TnCに特異的に結合できる部分が、配列番号52のアミノ酸配列を含むVHと配列番号53のアミノ酸配列を含むVLとを含むか、
(l)OX40に特異的に結合できる部分が、配列番号35のアミノ酸配列を含むVHと配列番号36のアミノ酸配列を含むVLとを含み、TnCに特異的に結合できる部分が、配列番号54のアミノ酸配列を含むVHと配列番号55のアミノ酸配列を含むVLとを含むか、
(m)OX40に特異的に結合できる部分が、配列番号37のアミノ酸配列を含むVHと配列番号38のアミノ酸配列を含むVLとを含み、TnCに特異的に結合できる部分が、配列番号52のアミノ酸配列を含むVHと配列番号53のアミノ酸配列を含むVLとを含むか、又は
(n)OX40に特異的に結合できる部分が、配列番号37のアミノ酸配列を含むVHと配列番号38のアミノ酸配列を含むVLとを含み、TnCに特異的に結合できる部分が、配列番号54のアミノ酸配列を含むVHと配列番号55のアミノ酸配列を含むVLとを含む
二重特異性抗原結合分子である。
OX40に特異的に結合することができる部分が、配列番号27のアミノ酸配列を含むVHと配列番号28のアミノ酸配列を含むVLとを含み、TnCに特異的に結合することができる部分が、配列番号52のアミノ酸配列を含むVHと配列番号53のアミノ酸配列を含むVLとを含むか、又は
OX40に特異的に結合できる部分が、配列番号27のアミノ酸配列を含むVHと配列番号28のアミノ酸配列を含むVLとを含み、TnCに特異的に結合できる部分が、配列番号54のアミノ酸配列を含むVHと配列番号55のアミノ酸配列を含むVLとを含む
二重特異性抗原結合分子を提供する。
ある態様では、本発明は、
(a)抗体軽鎖可変領域(VL)と抗体重鎖可変領域(VH)とを含む、OX40に特異的に結合できる2つの部分、
(b)抗体軽鎖可変領域(VL)と抗体重鎖可変領域(VH)とを含む、TnCに特異的に結合できる2つの部分、並びに
(c)安定な結合が可能な第1及び第2サブユニットから構成されるFc領域
を含む
二重特異性抗原結合分子に関する。
(a)抗体の2つの軽鎖及び、OX40に特異的に結合できる2つのFab断片とFc領域とを含む2つの重鎖、並びに
(b)TnCに特異的に結合できる2つのFab断片であって、そのFab断片のうちの一方が(a)の2つの重鎖のうちの一方のC末端に連結し、Fab断片のうちのもう一方が(a)の2つの重鎖のうちのもう一方のC末端に連結しているFab断片
を含む。
(a)OX40に特異的に結合できるFab断片のVH及びCH1ドメインと、Fc領域サブユニットとをそれぞれが含む2つの重鎖、
(b)OX40に特異的に結合できるFab断片のVL及びCLドメインをそれぞれが含む2つの軽鎖、
(c)TnCに特異的に結合できる2つのFab断片であって、そのFab断片の一方が(a)の2つの重鎖のうちの一方のC末端に連結し、Fab断片のうちのもう一方が(a)の2つの重鎖のうちのもう一方のC末端に連結しているFab断片
を含む。
(a)配列番号213のアミノ酸配列をそれぞれが含む2つの重鎖、配列番号212のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖、及び配列番号214のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖、又は
(b)配列番号215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2つの重鎖、配列番号212のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖、及び配列番号216のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
ある態様では、二重特異性抗原結合分子は、OX40に対して二価で、TnCに対して一価である。
(a)Fc領域に連結している、OX40に特異的に結合できる2つのFab断片、及び
(b)抗体軽鎖可変領域(VL)と、Fc領域のC末端に連結している抗体重鎖可変領域(VH)とを含む、TnCに特異的に結合できる部分
を含む。
(a)抗体の2つの軽鎖及び、OX40に特異的に結合できる2つのFab断片とFc領域とを含む2つの重鎖、並びに
(b)TnCに特異的に結合できる部分のVH及びVLであって、VHが(a)の2つの重鎖のうちの一方のC末端に連結し、VLが(a)の2つの重鎖のうちのもう一方のC末端に連結しているVH及びVL
を含む。
(a)OX40に特異的に結合できるFab断片のVH及びCH1ドメインと、Fc領域サブユニットとをそれぞれが含む2つの重鎖、
(b)OX40に特異的に結合できるFab断片のVL及びCLドメインをそれぞれが含む2つの軽鎖、並びに
(c)TnCに特異的に結合できる部分のVH及びVLであって、VHが(a)の2つの重鎖のうちの一方のC末端に連結し、VLが(a)の2つの重鎖のうちのもう一方のC末端に連結しているVH及びVL
を含む。
(a)OX40に特異的に結合できるFab断片のVH及びCH1ドメインと、Fc領域サブユニットとをそれぞれが含む2つの重鎖、
(b)OX40に特異的に結合できるFab断片のVL及びCLドメインをそれぞれが含む2つの軽鎖、並びに
(c)TnCに特異的に結合できるFab断片であって、そのFab断片のVHCH1鎖又はVLCL鎖が(a)の2つの重鎖のうちの一方のC末端に連結しているFab断片
を含む。
ある態様では、二重特異性抗原結合分子は、OX40に対して四価で、TnCに対して一価である。
(a)Fc領域に連結している、OX40に特異的に結合できる4つのFab断片及び、
(b)抗体軽鎖可変領域(VL)と、Fc領域のC末端に連結している抗体重鎖可変領域(VH)とを含む、TnCに特異的に結合できる部分
を含む。
(a)抗体の2つの軽鎖と、Fc領域及びOX40に特異的に結合できる4つのFab断片を含む2つの重鎖、並びに
(b)TnCに特異的に結合できる部分のVH及びVLであって、VHが(a)の2つの重鎖のうちの一方のC末端に連結し、VLが(a)の2つの重鎖のうちのもう一方のC末端に連結しているVH及びVL
を含む。
(a)OX40に特異的に結合できるFab断片の2つのVHドメイン及び2つのCH1ドメインと、Fc領域サブユニットとをそれぞれが含む2つの重鎖、
(b)OX40に特異的に結合できるFab断片のVL及びCLドメインをそれぞれが含む4つの軽鎖、並びに
(c)TnCに特異的に結合できる部分のVH及びVLであって、VHが(a)の2つの重鎖のうちの一方のC末端に連結し、VLが(a)の2つの重鎖のうちのもう一方のC末端に連結しているVH及びVL
を含む。
(i)第1のポリペプチド鎖は、アミノ(N)末端からカルボキシル(C)末端の方向に、VH(OX40)、CH1、VH(OX40)、CH1、CH2、CH3(Fcノブ)、及びVH(TnC)を含み、
(ii)第2のポリペプチド鎖は、N末端からC末端の方向に、VH(OX40)、CH1、VH(OX40)、CH1、CH2、CH3(Fcホール)、及びVL(TnC)を含み、且つ
(iii)4つの軽鎖は、N末端からC末端の方向に、VL(Ox40)及びCLを含む。
(i)第1のポリペプチド鎖は、アミノ(N)末端からカルボキシル(C)末端の方向に、VH(OX40)、CH1、VH(OX40)、CH1、CH2、CH3(Fcノブ)、及びVL(TnC)を含み、
(ii)第2のポリペプチド鎖は、N末端からC末端の方向に、VH(OX40)、CH1、VH(OX40)、CH1、CH2、CH3(Fcホール)、及びVH(TnC)を含み、且つ
(iii)4つの軽鎖は、N末端からC末端の方向に、VL(Ox40)及びCLを含む。
ある態様では、二重特異性抗原結合分子は、OX40に対して四価で、TnCに対して二価である。
(a)Fc領域に連結している、OX40に特異的に結合できる4つのFab断片、及び
(b)抗体軽鎖可変領域(VL)と、Fc領域のC末端に連結している抗体重鎖可変領域(VH)とを含む、TnCに特異的に結合できる2つの部分
を含む。
(a)抗体の4つの軽鎖と、Fc領域及びOX40に特異的に結合できる4つのFab断片を含む2つの重鎖、並びに、
(b)TnCに特異的に結合できる2つのFab断片であって、そのFab断片のうちの一方が(a)の2つの重鎖のうちの一方のC末端に連結し、Fab断片のうちのもう一方が(a)の2つの重鎖のうちのもう一方のC末端に連結しているFab断片
を含む。
(a)OX40に特異的に結合できるFab断片の2つのVHドメイン及び2つのCH1ドメインと、Fc領域サブユニットとをそれぞれが含む2つの重鎖、
(b)OX40に特異的に結合できるFab断片のVL及びCLドメインをそれぞれが含む4つの軽鎖、並びに
(c)TnCに特異的に結合できる2つのFab断片であって、そのFab断片の一方が(a)の2つの重鎖のうちの一方のC末端に連結し、Fab断片のうちのもう一方が(a)の2つの重鎖のうちのもう一方のC末端に連結しているFab断片
を含む。
(i)第1及び第2のポリペプチド鎖は、アミノ(N)末端からカルボキシル(C)末端の方向に、VH(OX40)、CH1*、VH(OX40)、CH1*、CH2、CH3、VL(TnC)、及びCH1を含み、
(ii)4つの軽鎖は、N末端からC末端の方向に、VL(OX40)及びCL*を含み、且つ
(iii)2つの軽鎖は、N末端からC末端の方向に、VH(TnC)及びCLを含み、ここでCH1*及びCL*は、より良いペアリングを可能にするアミノ酸変異を含む。
本発明の様々な態様による実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、安定に結合することのできる第1及び第2のサブユニットから構成されるFc領域を更に含む。
本発明の二重特異性抗原結合分子は、Fc領域の2つのサブユニットの一方又は他方に融合した異なる抗原結合部位を含み、したがってFc領域の2つのサブユニットは、2つの非同一ポリペプチド鎖に含まれていることがある。これらポリペプチドの組換え共発現とそれに続く二量体化は、2つのポリペプチドの複数の可能な組み合わせをもたらす。したがって、組換え産生における本発明の二重特異性抗体の収率及び純度を高めるために、本発明の二重特異性抗原結合分子のF領域に、所望のポリペプチドの結合を促進する改変を導入することが有利であろう。
ある態様において、本発明は、(a)OX40に特異的に結合できる第1のFab断片、(b)TnCに特異的に結合できる第2のFab断片、並びに(c)安定した結合が可能な第1及び第2のサブユニットから構成されるFc領域を含む二重特異性抗原結合分子に関し、一方のFab断片において、可変ドメインVHとVLが交換されるか、又は定常ドメインCH1とCL交換されるかのいずれかである。二重特異性抗体は、Crossmab技術に従って調製される。
本発明は、本明細書に記載の、本発明の二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを更に提供する。
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、例えば、固相ペプチド合成(例えばメリフィールド固体相合成)又は組換え生成によって得ることができる。組換え生成のために、例えば上述したように、抗体又はそのポリペプチド断片をコードする一又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び/又は発現のために一又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され、シーケンシングされ得る。本発明の一態様において、本発明のポリヌクレオチドの一又は複数を含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者によく知られている方法を使用して、適切な転写/翻訳制御シグナルと共に、二重特異性抗原結合分子(断片)のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。このような方法には、in vitroでの組換えDNA技術、合成技術及びin vivoでの組換え/遺伝子組換えが含まれる。例えば、Maniatisら,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989);及びAusubelら,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1989)に記載の技術を参照。発現ベクターはプラスミド、ウイルスの一部であっても、又は核酸断片であってもよい。発現ベクターには、二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド又はそのポリペプチド断片(すなわちコード領域)が、プロモーター及び/又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと作動可能に結合してクローニングされる発現カセットが含まれる。本発明で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンから成る核酸の一部である。「終止コドン」(TAG、TGA又はTAA)はアミノ酸に翻訳されないが、(存在する場合には)コード領域の一部と考えられる。但し、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、5’及び3’非翻訳領域等の任意の隣接配列はコード領域の一部ではない。2つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト中(例えば単一のベクター上)に、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクト中(例えば別々の(異なる)ベクター上)に存在することができる。更に、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよいし、2つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断によって翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質に分離される1又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド若しくはそのポリペプチド断片又はそのバリアント若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合しているか、又は融合していない異種コード領域をコードすることができる。異種コード領域には、限定されないが、例えば分泌シグナルペプチド又は異種性機能ドメインなどの特殊なエレメント又はモチーフが含まれる。作動可能な結合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード領域が、遺伝子産物の発現を制御配列の影響下又は制御下に置くように、1又は複数の制御配列と結合している場合である。2つのDNA断片(ポリペプチドコード領域とそれに結合するプロモーターなど)は、プロモーター機能の誘導が、所望の遺伝子産物をコードするmRNAの転写をもたらす場合、及び2つのDNA断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を指示する発現制御配列の能力を妨げないか又は転写されるDNAテンプレートの能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合に、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合されているといえる。プロモーターは、所定の細胞においてのみDNAの実質的な転写を指示する、細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーター以外に、他の転写調節エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を指示するポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子は、当技術分野で既知の様々なアッセイによって、その物理的/化学的性質及び/又は生物活性について同定、スクリーニング又は特徴付けすることができる
1.アフィニティーアッセイ
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子のOX40又はTnCに対するアフィニティーは、実施例に記載の方法に従って、BIAcore装置(GEヘルスケア)などの標準的装置と、組換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いる表面プラズモン共鳴(SPR)により決定することができる。結合アフィニティーを測定するための具体的な説明的且つ例示的な実施態様は、実施例4.2に記載されている。一態様によれば、KDは、25 ℃でBIACORE(登録商標)T200装置(GEヘルスケア)を用いる表面プラズモン共鳴により測定される。
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子の、対応するOX40及び/又はTnC発現細胞への結合は、例えばフローサイトメトリー(FACS)によって、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を使用して評価することができる。一態様では、OX40を発現する新鮮な末梢血単核細胞(PBMC)が結合アッセイで使用される。この細胞は、単離後そのまま使用することも(ナイーブPMBC)、刺激後に使用することもできる(活性化PMBC)。別の態様では、活性化されたマウス脾細胞(OX40を発現している)を使用して、本発明の二重特異性抗原結合分子の、対応するOX40発現細胞への結合を実証することができる。
一態様において、TnC及びOX40に結合する、生物活性を有する二重特異性抗原結合分子を同定するためのアッセイが提供される。生物活性には、例えばOX40を発現する細胞での、OX40を介したアゴニストシグナル伝達が含まれる。これらのアッセイによってin vitroでそのような生物活性を有すると認められた二重特異性抗原結合分子も提供される。特に、ヒトOX40を発現し、且つ、TnC発現腫瘍細胞と共培養されたHela細胞内のNF-κB活性化を検出するレポーター細胞アッセイが提供される(例えば実施例5.1参照)。
更なる態様において、本発明は、例えば下記の治療法のいずれかに使用される、本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様において、薬学的組成物は、二重特異性抗原結合分子と、少なくとも1の薬学的に許容される添加剤とを含む。別の他の実施態様において、薬学的組成物は、本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子のいずれかと、少なくとも1種の追加的治療剤を、例えば後述するように含む。
本明細書において提供される二重特異性抗原結合分子のいずれも、治療方法において使用することができる。治療方法において使用される場合、本発明の二重特異性抗原結合分子は、医療実施基準に一致した様式で製剤化、調薬及び投与され得る。この観点において考慮すべき要素には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程、及び医療従事者が知るその他の要素が含まれる。
治療において、本発明の二重特異性抗原結合分子は、1種以上の他の薬剤との併用で投与され得る。例えば、本発明の融合タンパク質は、少なくとも1種の追加の治療剤と共投与され得る。用語「治療剤」は、このような治療を必要とする個体の症状又は疾患を治療するために投与され得る任意の薬剤を包含する。このような追加の治療剤は、治療される特定の適応症に適した活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含んでもよい。特定の実施態様では、追加の治療剤は別の抗がん剤である。
本発明の別の態様では、上述した障害の治療、予防、及び/又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器と、容器に貼られているか又は付随しているラベル又は添付文書とを備える。好適な容器には、例えば瓶、バイアル、シリンジ、IV輸液バッグ等が含まれる。該容器は、例えばガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成され得る。該容器は、該病状の治療、予防及び/又は診断に有効な、単独の又は他の組成物と組み合わされる組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、該容器は皮下注射針で穿孔可能な、ストッパーを有する静脈内溶液のバッグ又はバイアルであってよい)。該組成物中の少なくとも1種の活性剤は、本発明の二重特異性抗原結合分子である。
以下の番号付き項目は、本発明の態様を説明するものである。
1.二重特異性抗原結合分子であって、
(a)OX40に特異的に結合できる少なくとも1つの部分と、
(b)テネイシンC(TnC)に特異的に結合できる少なくとも1つの部分と
を含む二重特異性抗原結合分子。
2.(c)安定な結合が可能な第1及び第2のサブユニットから構成されるFc領域を更に含む、項目1に記載の二重特異性抗原結合分子。
3.OX40に特異的に結合できる部分が、配列番号1のアミノ酸配列を含むか又はそれから成るポリペプチドに結合する、項目1又は2に記載の二重特異性抗原結合分子
4.TnCに特異的に結合できる部分が、配列番号39のアミノ酸配列を含むか又はそれから成るポリペプチドに結合する、項目1から3のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
5.OX40に特異的に結合できる部分が、
(i)配列番号2及び配列番号3から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H1、
(ii)配列番号4及び配列番号5から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H2、並びに
(iii)配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11及び配列番号12から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H3
を含むVHと、
(iv)配列番号13、配列番号14及び配列番号15から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L1、
(v)配列番号16、配列番号17及び配列番号18から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L2、並びに
(vi)配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23及び配列番号24から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含むVLと
を含む、項目1から4のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
6.OX40に特異的に結合できる部分が、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35及び配列番号37から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むVHと、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36及び配列番号38から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むVLとを含む、項目1から5のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
7.OX40に特異的に結合できる部分が、
(i)配列番号25のアミノ酸配列を含むVHと配列番号26のアミノ酸配列を含むVL、
(ii)配列番号27のアミノ酸配列を含むVHと配列番号28のアミノ酸配列を含むVL、
(iii)配列番号29のアミノ酸配列を含むVHと配列番号30のアミノ酸配列を含むVL、
(iv)配列番号31のアミノ酸配列を含むVHと配列番号32のアミノ酸配列を含むVL、
(v)配列番号33のアミノ酸配列を含むVHと配列番号34のアミノ酸配列を含むVL、
(vi)配列番号35のアミノ酸配列を含むVHと配列番号36のアミノ酸配列を含むVL、又は
(vii)配列番号37のアミノ酸配列を含むVHと配列番号38のアミノ酸配列を含むVL
を含む、項目1から6のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
8.TnCに特異的に結合できる部分が、
(i)配列番号40及び配列番号41から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H1、
(ii)配列番号42及び配列番号43から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H2、並びに
(iii)配列番号44及び配列番号45から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-H3を含むVHと、
(iv)配列番号46及び配列番号47から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L1、
(v) 配列番号48及び配列番号49から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L2、並びに
(vi) 配列番号50及び配列番号51から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR-L3を含むVLと
を含む、項目1から7のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
9.TnCに特異的に結合できる部分が、配列番号52及び配列番号54から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むVHと、配列番号53及び配列番号55から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むVLとを含む、項目1から8のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
10.TnCに特異的に結合できる部分が、
(i)配列番号52のアミノ酸配列を含むVH及び配列番号53のアミノ酸配列を含むVL、又は
(ii)配列番号54のアミノ酸配列を含むVH及び配列番号55のアミノ酸配列を含むVL
を含む、項目1から9のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
11.
(i)配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35又は配列番号37から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むVH及び配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36又は配列番号38から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むVLを含む、OX40に特異的に結合できる少なくとも1つの部分と、
(ii)配列番号52又は配列番号54から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むVH及び配列番号53又は配列番号55から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むVLを含む、TnCに特異的に結合できる少なくとも1つの部分と
を含む、項目1から10のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
12.
(i)配列番号27のアミノ酸配列を含むVH及び配列番号28のアミノ酸配列を含むVLを含む、OX40に特異的に結合できる少なくとも1つの部分と、
(ii)TnCに特異的に結合できる少なくとも1つの部分であって以下を含むもの:
●配列番号52のアミノ酸配列を含むVHと配列番号53のアミノ酸配列を含むVL、又は
●配列番号54のアミノ酸配列を含むVH及び配列番号55のアミノ酸配列を含むVL
を含む、項目1から11のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
13.Fc領域がIgG、特にIgG1 Fc領域又はIgG4 Fc領域である、項目2から12のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
14.Fc領域が、抗体のFc受容体への結合アフィニティー及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む、項目2から13のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
15.Fc領域がアミノ酸変異L234A、L235A及びP329G(Kabat EUインデックスによる番号付け)を有するヒトIgG1サブクラスのものである、項目2から14のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
16.Fc領域がFc領域の第1及び第2のサブユニットの結合を促進する改変を含む、項目2から15のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
17.Fc領域の第1のサブユニットがノブ・イントゥ・ホール法によるノブを含み、Fc領域の第2のサブユニットがホールを含む、項目2から16のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
18.Fc領域の第1のサブユニットがアミノ酸置換S354C及びT366W(Kabat EUインデックスによる番号付け)を含み、Fc領域の第2のサブユニットがアミノ酸置換Y349C、T366S及びY407V(Kabat EUインデックスによる番号付け)を含む、項目2から17のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
19.
(a)Fc領域に連結しており、OX40に特異的に結合できる少なくとも2つのFab断片と、
(b)Fc領域のC末端に連結している、TnCに特異的に結合できる少なくとも1つの部分と
を含む、項目1から18のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
20.
(a)抗体の2つの軽鎖及び、OX40に特異的に結合できる2つのFab断片とFc領域とを含む2つの重鎖、並びに
(b)TnCに特異的に結合できる部分のVH及びVLであって、VHが(a)の2つの重鎖のうちの一方のC末端に連結し、VLが(a)の2つの重鎖のうちのもう一方のC末端に連結しているVH及びVL
を含む、項目1から19のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
21.
(a)抗体の2つの軽鎖及び、OX40に特異的に結合できる2つのFab断片とFc領域とを含む2つの重鎖、並びに
(b)TnCに特異的に結合できる2つのFab断片であって、そのFab断片のうちの一方が(a)の2つの重鎖のうちの一方のC末端に連結し、Fab断片のうちのもう一方が(a)の2つの重鎖のうちのもう一方のC末端に連結しているFab断片
を含む、項目1から20のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
22.
(a)OX40に特異的に結合できるFab断片のVH及びCH1ドメインと、Fc領域サブユニットとをそれぞれが含む2つの重鎖、
(b)OX40に特異的に結合できるFab断片のVL及びCLドメインをそれぞれが含む2つの軽鎖、並びに
(c)TnCに特異的に結合できる部分のVH及びVLであって、VHが(a)の2つの重鎖のうちの一方のC末端に連結し、VLが(a)の2つの重鎖のうちのもう一方のC末端に連結しているVH及びVL
を含む、項目1から21のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
23.
(a)OX40に特異的に結合できるFab断片のVH及びCH1ドメインと、Fc領域サブユニットとをそれぞれが含む2つの重鎖、
(b)OX40に特異的に結合できるFab断片のVL及びCLドメインをそれぞれが含む2つの軽鎖、
(c)TnCに特異的に結合できる2つのFab断片であって、そのFab断片の一方が(a)の2つの重鎖のうちの一方のC末端に連結し、Fab断片のうちのもう一方が(a)の2つの重鎖のうちのもう一方のC末端に連結しているFab断片
を含む、項目1から19のいずれか一項又は項目21の二重特異性抗原結合分子。
24.TnCに特異的に結合できる2つのFab断片が、VL-CH1鎖とVH-CL鎖とをそれぞれ含むクロスオーバーFab断片であって、VL-CH1鎖の一方が(a)の2つの重鎖のうちの一方のC末端に連結し、VL-CH1鎖のもう一方が(a)の2つの重鎖のうちのもう一方のC末端に連結している、項目21又は項目23の二重特異性抗原結合分子。
25.OX40に特異的に結合できる4つのFab断片を含む、項目1から24のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
26.(a)の2つの重鎖のそれぞれが、OX40に特異的に結合できるFab断片の2つのVHドメインと2つのCH1ドメインとを含む、項目20から25のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
27.OX40に特異的に結合できる1つ以上のFab断片が、
123位(EU番号付け)のアミノ酸においてアルギニン(R)を、及び124位(EU番号付け)のアミノ酸においてリジン(K)を含むCLドメイン、並びに
147位(EU番号付け)のアミノ酸においてグルタミン酸(E)を、及び213位(EU番号付け)のアミノ酸においてグルタミン酸(E)を含むCH1ドメイン
を含む、項目19から26のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
28.
配列番号213のアミノ酸配列をそれぞれが含む2つの重鎖、
配列番号212のアミノ酸配列をそれぞれが含む2つの軽鎖、及び
配列番号214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2つの軽鎖
を含む二重特異性抗原結合分子。
29.
配列番号215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2つの重鎖、
配列番号212のアミノ酸配列をそれぞれが含む2つの軽鎖、及び
配列番号216のアミノ酸配列をそれぞれが含む2つの軽鎖
を含む二重特異性抗原結合分子。
30.
配列番号222のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、
配列番号223のアミノ酸配列をが含む第2の重鎖、及び
配列番号212のアミノ酸配列をそれぞれが含む4つの軽鎖
を含む二重特異性抗原結合分子。
31.
配列番号225のアミノ酸配列をそれぞれが含む2つの重鎖、
配列番号224のアミノ酸配列をそれぞれが含む4つの軽鎖、及び
配列番号226のアミノ酸配列をそれぞれが含む2つの軽鎖
を含む二重特異性抗原結合分子。
32.項目1から31のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド。
33.項目32のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
34.項目32のポリヌクレオチド又は項目33の発現ベクターを含む宿主細胞。
35.二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で項目34の宿主細胞を培養することと、二重特異性抗原結合分子を単離することとを含む、二重特異性抗原結合分子を製造する方法。
36.項目1から31のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子と、薬学的に許容される少なくとも1種の添加剤とを含む、薬学的組成物。
37.医薬としての使用のための、項目1から31のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は項目36の薬学的組成物。
38.以下のいずれかにおける使用のための、項目1から31のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は項目36の薬学的組成物。
(i)T細胞応答を刺激すること
(ii)活性化T細胞の生存を維持すること
(iii)感染症の治療
(iv)がんの治療
(v)がんの進行を遅らせること
(vi)がんに罹患している患者の生存を延長させること
39.がんの治療における使用のための、項目1から31のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は項目36の薬学的組成物。
40.がんの治療のための医薬の製造における、項目1から31のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は項目36の薬学的組成物の使用。
41.がんを有する個体の治療方法であって、項目1から31のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は項目36の薬学的組成物の有効量を該個体に投与することを含む、方法。
42.細胞傷害性T細胞活性の上方制御又は延長における使用のための、項目1から31のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は項目36の薬学的組成物。
43.細胞傷害性T細胞活性の上方制御又は延長のための医薬の製造における、項目1から31のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は項目36の薬学的組成物の使用。
44.がんを有する個体における細胞傷害性T細胞活性の上方制御又は延長の方法であって、項目1から31のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は項目36の薬学的組成物の有効量を該個体に投与することを含む、方法。
組換えDNA技術
Sambrookら,Molecular cloning:A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989に記載されているように、標準的な方法を使用してDNAを操作した。分子生物学的試薬を製造者の指示書に従って使用した。ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat,E.A.ら,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,NIH Publication No 91-3242に示されている。
DNA配列は、二本鎖シーケンシングにより決定された。
所望の遺伝子セグメントは、適切なテンプレートを用いるPCRによって生成されたか、又は自動遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びPCR産物からGeneart社(ドイツ、レーゲンスブルク)によって合成された。正確な遺伝子配列が入手可能でない場合、最も近いホモログの配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、RT-PCRによって適切な組織を起源とするRNAから遺伝子を単離した。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準的なクローニング/シーケンシングベクター中でクローニングした。形質転換した細菌からプラスミドDNAを精製し、UV分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列を、DNAシーケンシングによって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計された。全てのコンストラクトは、真核細胞における分泌のためのタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする、5’末端DNA配列を含むように設計された。
標準的なプロトコールを参照して、濾過された細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡潔には、Protein A Sepharoseカラム(GEヘルスケア)に抗体を塗布し、PBSで洗浄した。抗体の溶出はpH2.8で達成され、その直後に試料を中和した。凝集したタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィー(Superdex200,GEヘルスケア)により、PBS中又は20mMのヒスチジン(150mMのNaCl、pH6.0)中の単量体抗体から分離させた。単量体抗体画分をプールし、(必要な場合)例えばMILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)遠心濃縮機を使用して濃縮し、-20℃又は-80℃で凍結保存した。これらの試料の一部が、例えばSDS-PAGE、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)又は質量分析によるその後のタンパク質解析及び分析的特徴付けのために提供された。
NuPAGE(登録商標)Pre-Castゲルシステム(Invitrogen)を製造者の指示書に従って使用した。特に、10%若しくは4~12%のNuPAGE(登録商標)Novex(登録商標)Bis-TRIS Pre-Castゲル(pH6.4)及びNuPAGE(登録商標)MES(還元ゲル、NuPAGE(登録商標)抗酸化剤ランニングバッファー添加剤を含む)又はMOPS(非還元ゲル)ランニングバッファーを使用した。
抗体の凝集及びオリゴマー状態の決定のためのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を、HPLCクロマトグラフィーによって実施した。簡潔には、プロテインA精製抗体を、Agilent HPLC 1100システムで300mM NaCl、50mM KH2PO4/K2HPO4(pH7.5)中のTosoh TSKgel G3000SWカラムに、又はDionex HPLC-システムで2倍のPBS中のSuperdex 200カラム(GEヘルスケア)に塗布した。UV吸光度及びピーク面積の積分により、溶出したタンパク質を定量化した。BioRad Gel Filtration Standard 151-1901が標準として機能した。
OX40抗体の生成
1.1 抗原の調製、精製及び特徴付け、並びにファージディスプレイによる新規OX40バインダーの生成のためのスクリーニングツール
ヒト、マウス又はカニクイザルOX40の外部ドメインをコードするDNA配列(表1)は、ノブ上のヒトIgG1重鎖CH2及びCH3ドメインを用いてインフレームでサブクローニングされた(Merchant et al., Nat Biotechnol (1998) 16, 677-681)。AcTEVプロテアーゼ切断部位は、抗原外部ドメインとヒトIgG1のFcの間に導入された。抗原-FcノブのC末端に、定方向(directed)ビオチン化用のAviタグが導入された。S354C/T366W変異を含有する抗原-Fcノブ鎖と、Y349C/T366S/L368A/Y407V変異を含有するFcホール鎖との組み合わせにより、OX40外部ドメイン含有鎖の単一コピーを含むヘテロダイマーの生成が可能になり、それによってFc結合抗原の単量体型を作製する(図1)。表1に、様々なOX40外部ドメインのアミノ酸配列を示す。表2は、図1に示した単量体抗原Fc(kih)融合分子のcDNA及びアミノ酸配列。
表1.抗原外部ドメイン(ECD)のアミノ酸番号付けと及び起源
表2.単量体抗原Fc(kih)融合分子のcDNA及びアミノ酸配列(1つのFcホール鎖と1つの抗原Fcノブ鎖の組み合わせにより生成)
抗OX40抗体は、3つの異なる汎用ファージディスプレイライブラリー、DP88-4(クローン20B7、8H9 1G4及び49B4)、共通軽鎖ライブラリーVk3_20/VH3_23(クローンCLC-563及びCLC-564)、及びラムダDP47(クローン17A9)から選択された。
1. 抗原のFc部分を認識する抗体のライブラリーを枯渇させるための、10μg/mlの無関係なヒトIgGでコーティングされたmaxisorpプレート上のファージミド粒子約1012個のプレクリアリング(pre-clearing)、
2. 総量1mlのFcバインダーのさらなる枯渇のための、100nMの無関係な非ビオチン化Fcノブ・イントゥ・ホールコンストラクトの存在下、0.5時間の非結合ファージミド粒子と100nMビオチン化ヒトOX40とのインキュべーション、
3. ニュートラアビジンプレコートマイクロタイタープレートの4つのウェルに10分間(ラウンド1&3で)移すことによる、ビオチン化hu OX40及び付着した特異的結合ファージの捕捉、
4. 5x PBS/Tween20と5x PBSを使用する、各ウェルの洗浄、
5. 1ウェルあたり250μlの100mM TEA(トリエチルアミン)を10分間添加することによるファージ粒子の溶出及び500μlの1M トリス/HCl(pH7.4)を4ウェルからプールした溶出液に添加することによる中和、
6. Fcバインダーを最終的に除去するための、ニュートラアビジンプレコートマイクロタイタープレート上でのビオチンで捕捉された100nMのFcノブ・イントゥ・ホールコンストラクトとのインキュベーションによる中和溶出液のポストクリアリング(post-clearing)、
7. 溶出したファージ粒子の上清による、対数期大腸菌TG1細胞の再感染、ヘルパーファージVCSM13による感染、30℃で一晩のシェーカーでのインキュベーション、及びそれに続く、次の選択ラウンドにおいて使用するためのファージミド粒子のPEG/NaCl沈殿。
表3.汎用ファージディスプレイ抗体ライブラリーの配列(DP88-4)
表4.ライブラリーDP88-4生殖系列テンプレートのcDNA及びアミノ酸配列
表5.DP88-4ライブラリーの生成に使用されるプライマー配列
表6.PCRに使用される汎用ファージディスプレイ抗体共通軽鎖ライブラリー(Vk3_20/VH3_23)テンプレートの配列
表7.共通軽鎖ライブラリー(Vk3_20/VH3_23)生殖系列テンプレートのcDNA及びアミノ酸配列
表8.共通軽鎖ライブラリー(Vk3_20/VH3_23)作成のために用いられるプライマー配列
表9:PCRに使用される汎用ファージディスプレイ抗体共通軽鎖ライブラリー(Vl3_19/VH3_23)テンプレートの配列
表10.ラムダDP47ライブラリー(Vl3_19/VH3_23)生殖系列テンプレートのcDNA及びアミノ酸配列
表11.ラムダDP47ライブラリー(Vl3_19/VH3_23)作成のために用いられるプライマー配列
表12.ファージ由来抗OX40抗体の可変領域塩基対配列下線部は相補性決定領域(CDR)。
選択された抗OX40バインダーの重及び軽鎖DNA配列の可変領域を、ヒトIgG1の定常重鎖又は定常軽鎖のいずれかとインフレームでサブクローニングした。国際公開第2012/130831号に記載の方法に従って、Fcガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にPro329Gly、Leu234Ala及びLeu235Ala変異を導入した。
表13.P329GLALAヒトIgG1型抗OX40クローンの配列
テネイシンC(TnC)抗体の生成
2.1 ファージディスプレイによる新規TnCバインダーの生成のための抗原の調製、精製及び特徴付け、並びにスクリーニングツール
表15及び表16のコンストラクトをGSTのC末端に融合し、大腸菌BL21(DE3)に発現させた。部位特異的ビオチン化のために、Aviタグをテネイシン配列のC末端に追加し、BirAビオチンリガーゼを別個のプラスミド(米国コロラド州のAvidity)に共発現させた。増殖培地は、100μg/mlアンピシリンと20μg/mlクロラムフェニコールとを含む2YTであった。ビオチンを50μMの最終濃度まで添加した。タンパク質発現を、1mM IPTGで22℃で一晩誘導した。遠心分離により細胞を収集し、B-PER試薬(pierce 78260)及び1mg/mlリゾチーム(シグマ L6876)の存在下での超音波処理により細胞溶解を実施した。ライセートを遠心分離し、透明なライセートをGlutathione Sepharoseカラム(GEヘルスケア;製品番号17-0756-01)に充填した。洗浄後、TnC分子を4℃で一晩、Thrombin(シグマアルドリッチ;製品番号10602400001)でGSTから切断した。溶出は、50mM トリスバッファー(pH8.0;200mM NaCl、5mM MgCl2、1mM DTT及び10%グリセロール)中で実施された。最終精製工程は、ゲル濾過カラム(Superdex 75 16/60;GEヘルスケア)で行った。試料は、処理するまで液体窒素で瞬間凍結させた。
表15:異種間アフィニティー決定に使用されるTnC抗原の配列
表16:アフィニティー決定に使用されるTnC抗原の配列
抗TnC抗体は、DP88-4(クローン18D4)とラムダDP47(クローン11C7)という2つの異なる汎用ファージディスプレイライブラリーから選択された。
DP88-4ライブラリーは、ランダム化した配列空間を軽鎖のCDR3(L3、3つの異なる長さ)と重鎖のCDR3(H3、3つの異なる長さ)に含むVドメインベアリングVk1_5(カッパ軽鎖)及びVH1_69(重鎖)を使用して、ヒトの生殖系列遺伝子に基づいて構築された。ライブラリーの生成は、オーバーラップエクステンションによるスプライシング(SOE)PCRを適用する3つのPCR増幅断片のアセンブリによって実施された。断片1は、ランダム化したL3を含む抗体遺伝子の5’末端を含み、断片2は、L3からH3に及ぶ中央の定常断片であり、断片3は、ランダム化したH3と抗体遺伝子の3’部分とを含む。それぞれ次のプライマーの組み合わせを使用して、DP88-4ライブラリーのためのこれらのライブラリー断片を生成した:断片1(リバースプライマーVk1_5_L3r_S又はVk1_5_L3r_SY又はVk1_5_L3r_SPYと組み合わせたフォワードプライマーLMB3)、断片2(リバースプライマーRJH32と組み合わせたフォワードプライマーRJH31)、及び断片3(リバースプライマーfdseqlongと組み合わせたフォワードプライマーDP88-v4-4又はDP88-v4-6又はDp88-v4-8)。ライブラリーの断片生成のためのPCRパラメーターは、94℃で5分の初期変性、94℃1分、58℃1分、72℃1分の25サイクル、及び72℃で10分間の最終伸長であった。ゲル精製された単一断片の等モル比をテンプレートとして使用するアセンブリPCRの場合、パラメーターは94℃で3分の初期変性と30秒94℃、1分58℃、2分72℃の5サイクルであった。この段階で、外部プライマー(LMB3とfdseqlong)を追加し、72℃で10分間の最終伸長の前に更なる20サイクルを実施した。十分な量の完全長ランダム化Fabコンストラクトをアセンブリした後、それらをNcoI/NheI消化し、同様に処理したアクセプターファージミドベクターにライゲートした。精製されたライゲーションは、エレクトロコンピテント大腸菌TG1への約60回の形質転換に使用された。Fabライブラリーを表示するファージミド粒子をレスキューし、PEG/NaCl精製によって精製し、選択に使用した。こうしたライブラリー構築工程を3回繰り返して、4.4×109の最終ライブラリーサイズを取得した。機能的クローンの割合は、ドットブロットでのC末端タグの検出により決定して、軽鎖で92.6%、重鎖で93.7%であった。
ファージディスプレイ選択の抗原としてのヒトGST融合TnC fn5 A1234 BC fn6は、大腸菌内で発現され、融合タンパク質のC末端に位置するaviタグ認識配列でのBirAビオチンリガーゼの共発現によってin vivoで部位特異的にビオチン化された(実施例2.1による抗原の産生、表14から導かれる配列)。この抗原は、2つのフィブロネクチンタイプIIIドメイン5と6の間に位置する、ヒトTnCエクストラスプライスドメインA1、A2、A3、A4、B及びCを含む。ファージディスプレイの選択は、これらのエクストラスプライスドメインのいずれかへのバインダーを選択することを目的とし、より少ないエクストラスプライスドメインを含む追加の抗原コンストラクトを使用する表面プラズモン共鳴による後続の工程でドメイン特異性を決定する。
選択されたクローンのアフィニティー(KD)は、ニュートラアビジン捕捉によってNLCチップ上に固定化されたビオチン化ヒト及びマウスTnC抗原と共にProteOn XPR36機器(Biorad)を使用する表面プラズモン共鳴(SPR)で測定される。抗原(リガンド)の固定化:組換え抗原をPBST(10mMリン酸塩、150mM塩化ナトリウム(pH7.4)、0.005%Tween20)で10μg/mlに希釈し、その後垂直方向に30μl/分で注入した。分析物の注入:「ワンショットカイネティクス」(‘one-shot kinetics’)測定では、注入方向を水平方向に変更し、精製されたFabの2倍希釈系列を別々のチャネル1-5に沿って同時に注入し、それぞれ結合時間は200秒、解離時間は240秒であった。参照用の「インライン」ブランク(“in-line” blank)を提供するために、バッファー(PBST)を6番目のチャネルに沿って注入した。結合速度(kon)と解離速度(koff)は、ProteOn Manager v3.1ソフトウェアで単純な1対1のラングミュア結合モデルを使用して、結合センサーグラムと解離センサーグラムを同時にフィットさせることにより計算した。平衡解離定数(KD)はkoff/kon比として算出した。表15に、種及びエクストラスプライスドメインの組成が異なるいくつかのTnC抗原の2つの選択されたクローンである18D4及び11C7の平衡解離定数(KD)を示す。
表17:クローン18D4及び11C7の平衡解離定数(KD)
表3は汎用ファージディスプレイDP88-4ライブラリー(Vk1_5/VH1_69)の配列を示し、表4はライブラリーDP88-4生殖系列テンプレートのcDNA及びアミノ酸配列を示し、表5はDP88-4生殖系列テンプレートの生成のために使用されるプライマー配列を示す。
選択された抗TnCバインダーの重及び軽鎖DNA配列の可変領域(表18~表23)を、ヒトIgG1の定常重鎖又は定常軽鎖のいずれかとインフレームでサブクローニングした。これらの抗体は、野生型ヒトIgG1骨格として、又はPro329Gly、Leu234Ala及びLeu235Ala変異(これらはFcガンマ受容体への結合を抑制するために導入されている)を含むバリアントとして、国際公開第2012/130831号に記載の方法に従って調製された。
抗TnCバインダーのCDR配列を表20から表23に示す。
抗TnC IgGの塩基対及びアミノ酸配列を表24と表25に示す。抗TnC P319GLALA IgGの塩基対及びアミノ酸配列を表26と表27に示す。抗体をコードする配列は全て、キメラMPSVプロモーターで挿入物の転写を促進し、且つ、CDSの3’末端に位置する合成ポリAシグナル配列を含む発現ベクター中でクローニングされた。更に、該ベクターには、プラスミドのエピソーム維持のためのEBV OriP配列が含まれている。
ファージディスプレイによって選択されたクローン11C7のLCDR3(NSINSTRNEV(配列番号51))は、潜在的なNグリコシル化部位、つまりNSTを含む。これは、アミノ酸置換によって潜在的に除去することができ、均一な製品の生産を容易にし得る。同時に、標的への結合が保持される必要がある。N(1位)は、優先的にQ、S又はTによって置換され得る。代わりに、S(2位)をPで置き換えることもできる。代わりに、T(3位)をG若しくはNで、又はS若しくはCを除く任意の他のタンパク質構成アミノ酸で優先的に置換することもできる。最適な置換は、当業者が経験的に決定することができる。
表18:ファージ由来抗TnC抗体の可変領域塩基対配列
表19:ファージ由来抗TnC抗体の可変領域ポリペプチド配列
表20:抗TnC抗体軽鎖のCDR塩基対配列
表21:抗TnC抗体軽鎖のCDRポリペプチド配列
表22:抗TnC抗体重鎖のCDR塩基対配列
表23:抗TnC抗体重鎖のCDRポリペプチド配列
表24:野生型ヒトIgG1型抗TnCクローンの塩基対配列
表25:野生型ヒトIgG1型抗TnCクローンのポリペプチド配列
表26:P329GLALAヒトIgG1型抗TnCクローンの塩基対配列
表27:P329GLALAヒトIgG1型抗TnCクローンのポリペプチド配列
OX40及びテネイシンC(TnC)を標的とする二重特異性抗体の生成
3.1 OX40及びテネイシンC(TnC)を標的とする二重特異性抗体の生成
OX40に対する二価結合とTnCに対する二価結合とを有する二重特異性アゴニストOX40コンストラクト(すなわち「2+2」コンストラクト)を調製した。
本実施例において、該コンストラクトの重鎖(HC)は次の構成要素で構成されていた:抗OX40 49B4 Fc(P329G/LALA)のVHCH1、これに続く抗TnCクローン18D4又は11C7の(G4S)4リンカー及びVHCH1。国際公開第2012/130831号に記載の方法に従って、Fcガンマ受容体への結合を無効にするために、重鎖の定常領域にPro329Gly、Leu234Ala及びLeu235Ala変異を導入した。この重鎖融合体は、抗Ox40 49B4の軽鎖(VLCL)及び18D4又は11C7のクロスFab LC(VLCH1)と共発現された。TnC結合部分にクロスマブ(crossmab)技術を使用して、間違ってペアになった軽鎖の形成を減らした(国際公開第2010/145792号参照)。得られた二重特異性二価構コンストラクトを図2に示し、塩基対とアミノ酸の配列をそれぞれ表28と表29に示す。
表28:成熟した二重特異性抗Ox40、抗TnCヒトIgG1 P329GLALA 2+2型の塩基対配列
表29:成熟した二重特異性抗Ox40、抗TnCヒトIgG1 P329GLALA 2+2型のアミノ酸配列
表30.二重特異性抗OX40、抗TnC IgG1 P329G LALA 2+2コンストラクトの生化学分析
OX40に対する四価結合及びTnCに対する一価結合(すなわち「4+1」)又はTnCに対する二価結合(すなわち「4+2」)を有する二重特異性アゴニストOX40コンストラクトを調製した。4+2型のTnC結合部分にクロスマブ技術を適用して、間違ってペアになった軽鎖の形成を減らした(国際公開第2010/145792号参照)。
4+1コンストラクトの場合、コンストラクトのHC1は次の構成要素で構成されていた:抗OX40 49B4_Fcホール(P329G/LALA)のVHCH1_VHCH1、これに続く抗TnCクローン18D4の(G4S)4リンカー及びVL。HC2は、抗OX40 49B4のVHCH1_VHCH1と、それに続く抗TnCクローン18D4のVHに融合したFcノブ(P329G/LALA)_(G4S)4リンカーで構成されていた。ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば米国特許第5731168号及び同第7695936号に記載されており、HC1とHC2のアセンブリが可能になっている。重鎖融合ポリペプチドは、抗OX40クローン49B4の軽鎖(CLVL)と共発現された。
4+2コンストラクトの場合、このコンストラクトのHCは、次の構成要素で構成されている:抗OX40 49B4_Fc(P329G/LALA)のVHCH1_VHCH1、これに続く(G4S)4リンカーと、これに続く、FcのC末端に融合したTnC結合クローン18D4のクロスFabユニット(VLCH1)。重鎖融合ポリペプチドは、抗OX40クローン49B4の軽鎖(LC1)(CLVL)と共発現された。抗OX40 FabのCH及びCLには、ベンス・ジョーンズタンパク質の生成を防ぎ、LC1とHCの正しいペアリング更に安定させるための荷電残基が含まれていた。
具体的には、置換E123R及びQ124K(EU番号付けによる残基)は、OX40(49B4)VLCL軽鎖(配列番号212)のCLドメインでなされ、配列番号224の軽鎖配列をもたらし;また、置換K147E及びK213E(EU番号付けによる残基)は、OX40(49B4)のCH1ドメインでなされ、配列番号220の重鎖配列をもたらした。
この場合、両方のHCに同じドメインが含まれているため、ノブ・イントゥ・ホールの導入は必要なかった。重鎖融合ポリペプチド及びLC1ポリペプチドは、抗TnC結合クローン18D4のVVH及びCLをコードするポリペプチドと共発現された。
国際公開第2012/130831号に記載の方法に従って、Fcガンマ受容体への結合を無効にするために、4+1及び4+2コンストラクトの重鎖の定常領域にPro329Gly、Leu234Ala及びLeu235Ala変異を導入した。
OX40に対する四価結合を有する、得られた二重特異性抗原結合分子を図3に示し、塩基対とアミノ酸の配列をそれぞれ表31と表32に示す。
表31.成熟した二重特異性、四価抗OX40、一価及び二価抗TnC huIgG1 P329GLALA分子の塩基対配列
表32.成熟した二重特異性、四価抗OX40、一価及び二価抗TnC huIgG1 P329GLALA分子のアミノ酸配列
表33.二重特異性四価抗Ox40、抗TnC IgG1 P329G LALA 4+1及び4+2コンストラクトの生化学分析
全ての型を直接比較するために、熱安定性を、静的光散乱(SLS)によって、及び適用した温度ストレスに応答する内在性タンパク質の蛍光発光を測定することによってモニターした。タンパク質濃度1mg/mlの30mgの濾過したタンパク質試料をOptim 2装置(Avacta Analytical社)に2回繰り返して適用した。半径及び全散乱強度を収集しながら、0.1℃/分で25から85℃まで温度を上昇させた。内在性ダンパ質の蛍光発光を決定するために、試料を266nmで励起し、発光を275nmから460nmまでの間で収集した。
表34.二重特異性抗OX40、抗TnC 2+2、4+1及び4+2コンストラクトの凝集温度
OX40及びテネイシンC (TnC)を標的とする二重特異性の結合
4.1 表面プラズモン共鳴分析によるOX40及びTnCへの同時結合の分析
ヒトOx40 Fc(kih)とヒトTnCに同時に結合する能力を表面プラズモン共鳴(SPR)によって評価した。全てのSPR実験は、HBS-EP(0.01M HEPES(pH7.4)、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005%Surfactant P20、ドイツ国フライブルグのBiacore社)をランニングバッファーとして用い、Biacore T200で25℃で実施された。
ビオチン化ヒトTnCは、ストレプトアビジン(SA)センサーチップのフローセルに直接結合させた。最大1000共鳴単位(RU)までの固定化レベルが使用された。
OX40及びTnCを標的とする二重特異性抗体を、濃度250nM、流速30μL/分で90秒間チップ表面を通過させ、解離をゼロ秒に設定した。ヒトOX40を、濃度250nM、流速30μL/分で90秒間、第2の分析物として注入し、解離を120秒間モニターした。タンパク質が全く固定化されていない基準フローセルで得られた応答差し引くことによって、バルク屈折率の差異を補正した。
全ての二重特異性抗原結合分子は、ヒトOX40及びヒトTnCに同時に結合することができた(図4B~4E)。
二重特異性コンストラクトのヒト、マウス及びカニクイザルTnCに結合する能力を表面プラズモン共鳴(SPR)によって分析した。全てのSPR実験は、HBS-EP(0.01M HEPES(pH7.4)、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005%Surfactant P20、ドイツ国フライブルグのBiacore社)をランニングバッファーとして用い、Biacore T200で25 ℃で実施された。
ビオチン化ヒト、マウス又はカニクイザルTnC分子をSAチップに固定化し、10共鳴単位(RU)の固定化レベルに達成した。
固定化後、二重特異性分子又はコントロール分子を、0.05~50nMの範囲の濃度、流速30μL/分で120秒間、及び180秒間の解離相でチップ表面を直ちに通過させた。10mM グリシン(pH2.1)を使用して、表面を再生した。TnCが全く固定化されていない基準フローセルで得られた応答差し引くことによって、バルク屈折率の差異を補正した。これらの実験条件下で、ラングミュア1:1曲線フィッティングを使用してアフィニティー/アビディティーを決定した。二価の結合では、見かけのKD値につながる同じ1:1のフィッティングが使用された。コンストラクト49B4/11C7(2+2)の場合、カニクイザル及びマウスTNCへの結合は非常に弱かったため、「結合なし」と分類された。
表35.ヒト、マウス及びカニクイザルTnCのOX40及びTnCを標的とする示された二重特異性抗体の結合のKD値
バフィーコートはチューリッヒ献血センターから入手した。新鮮な末梢血単核細胞(PBMC)を単離するために、バフィーコートを同量のDPBS(Life Technologies社製のGibco、カタログ番号14190 326)で希釈した。50mLポリプロピレン遠心管(TPP、カタログ番号91050)に、15mLのHistopaque1077(シグマライフサイエンス社、カタログ番号10771、ポリスクロース及びジアトリゾ酸ナトリウム、1.077g/mLの密度に調整)を供給し、バフィーコート溶液をHistopaque1077の上に重ねた。この管を、低加速度、中断なし、室温で、400×gで30分間、遠心分離にかけた。その後、PBMCを相間から収集し、DPBSで3回洗浄し、10%ウシ胎児血清(FBS,ライフテクノロジー製Gibco,カタログ番号16000-044,ロット941273,ガンマ線照射,マイコプラズマ不含,56℃35分で熱不活性化)、1%(v/v)GlutaMAX I(ライフテクノロジー製GIBCO,カタログ番号35050038)、1mM ピルビン酸ナトリウム(Sodium-Pyruvat)(シグマ製,カタログ番号S8636)、1%(v/v)MEM非必須アミノ酸(シグマ製,カタログ番号M7145)及び50μM β-メルカプトエタノール(シグマ製,M3148)を補充したRPMI1640培地(ライフテクノロジー製Gibco,カタログ番号42401-042)から成るT細胞培地に再懸濁させた。
PBMCは、単離直後に(休止ヒトPBMCへの結合の分析用)、又はT細胞の細胞表面でのヒトOX40発現の高発現を得るために刺激後に(活性化ヒトPBMCへの結合の分析用)実験で使用した。刺激のために、ナイーブPBMCを6ウェル組織培養プレート内で、200U/mLプロロイキン(ノバルティス製)及び2μg/mL PHA-L(シグマアルドリッチ製,L2769-10)を入れたT細胞培地中4日間培養し、その後1日、プレコート6ウェル組織培養プレートで[2μg/mL]抗ヒトCD3(クローンOKT3,eBioscience製,カタログ番号16-0037-85)及び[2μg/mL]抗ヒトCD28(クローン28.2,eBioscience製,カタログ番号16-0289-85]を、200U/mLプロロイキンを入れたT細胞培地中、37℃及び5%CO2で培養した。
OX40の検出のために、ナイーブヒトPBMCと活性化ヒトPBMCを混合した。ナイーブと活性化ヒトPBMCの区別を可能にするため、eFluor670細胞増殖色素(eBioscience製,カタログ番号65-0840-85)を使用して、結合アッセイの前にナイーブ細胞を標識した。
標識のために細胞を回収し、予熱した(37℃)DPBSで洗浄し、DPBS中1x107細胞/mLのd細胞密度に調整した。2.5mMの最終濃度及びDPBS中0.5x107個/mLの最終細胞密度で、eFluor670細胞増殖色素(eBioscience製,カタログ番号65-0840-85)をナイーブヒトPBMCの懸濁液に添加した。その後、細胞を暗所で室温で10分間インキュベートした。標識反応を停止させるために、4mLの熱不活性化FBSを加え、細胞をT細胞培地で3回洗浄した。その後、1x105の休止eFluor670標識ヒトPBMCと0.5x105の非標識活性化ヒトPBMCとの2:1混合物を、丸底懸濁細胞96ウェルプレート(グレイナーバイオワン製,cellstar,カタログ番号650185)の各ウェルに添加した。
細胞を、示された抗原結合分子を異なる量含む50μL/ウェル4℃のFACSバッファー中、4℃で120分間、暗所で染色した。4℃のFACSバッファーで3回洗浄した後、細胞を、蛍光標識抗ヒトCD4(クローンRPA-T4,マウスIgG1 k,BioLegend製,カタログ番号300532)、抗ヒトCD8(クローンRPa-T8,マウスIgG1k,BioLegend製,カタログ番号3010441)及びフルオレセインイソチオシアネート(FITC)コンジュゲートAffiniPure抗ヒトIgG Fcγ断片特異的ヤギIgG F(ab`)2断片(Jackson ImmunoResearch製,カタログ番号109-096-098)の混合物を含有する、25μL/ウェル4℃のFACSバッファー中、4℃で45分間、暗所で染色した。
その後細胞を、0.2μg/mL DAPI(Santa Cruz Biotec製,カタログ番号Sc-3598)を含有する85μL/ウェルFACSバッファーに再懸濁させ、5本レーザー搭載LSR-Fortessa(BD Bioscience製、DIVAソフトウェア付き)を使用して、同日に取得した。
図6A~6D及び図7A~7Dに示すように、OX40に特異的な抗原結合分子は、細胞表面でOX40を発現しない休止ヒトCD4+ T細胞又はCD8+ T細胞に結合しなかった。対照的に、二重特異性抗OX40、抗TnC分子は全て、OX40を発現する活性化CD8+又はCD4+ T細胞への結合を示した。CD4+ T細胞への結合は、CD8+ T細胞への結合よりもはるかに強かった。活性化ヒトCD8+ T細胞は、活性化CD4+ T細胞による発現レベルよりもはるかに低いレベルでOX40を発現する。OX40の発現レベルは刺激のカイネティクス及び強さに依存し、ここでは、条件はCD4+ T細胞でのOX40発現に最適化されたが、CD8+ T細胞では最適化されなかった。したがって、少量のOX40発現のみがCD8 + T細胞で誘導された。
二重特異性抗OX40、抗TnC分子は、結合強度が異なることがわかった。図7Aに見られるように、表36に示すように、OX40に4価の結合を持つ4+2分子は、2価の2+2分子よりも強く、より高いアビディティーで結合した。
また、これらの結果は、TnC結合部分の存在が四価のOX40バインダーのOX40への結合に影響を与えなかったことも示唆した(例えば図6A及び図7A参照)。
細胞表面で発現したTnCへの二重特異性抗OX40、抗TnC分子の結合は、TnC発現U87-MG細胞(ATCC HTB-14)と、ヒトTnCを安定して発現するようにトランスフェクトされたCT26細胞株(「CT26huTnC」細胞という)とを用いて分析された。TnC陰性細胞株WM-266-4(ATCC CRL-1676)を使用して、結合の特異性を分析した。
腫瘍細胞を区別できるようにするために、WM266-4細胞をPKH-26 Red Fluorescence Cellリンカーキット(シグマ製,カタログ番号PKH26GL)で事前に標識した。細胞を回収し、RPMI 1640培地で3回洗浄した。その後、これらの細胞を、(最終濃度1nM,希釈液C(PKH-26 Red Fluorescence Cellリンカーキットに付属)中で)新しく調製したPKH26-Red染色溶液中で、最終密度0.5x107細胞で、室温で5分間染色した。過剰のFBSを添加して標識化反応を停止させ、10%(v/v)FBS、1%(v/v)GlutaMAX-Iを補充したRPMI 1640培地で細胞を4回洗浄して、過剰な色素を除去した。
抗原結合分子の様々な細胞型への結合の検出のために、0.5-2x105PkH26標識WM266-4及び/又は非標識U87-MG細胞又はCT26huTnC細胞を、丸底懸濁細胞96ウェルプレート(Greiner bio-one製,cellstar,カタログ番号650185)のウェルに添加した。その後細胞を、滴定された抗原結合分子を含有し、BSA(0.1%v/w,シグマアルドリッチ,カタログ番号A9418)を含む50μL/ウェル4℃のFACSバッファー(DPBS(ライフテクノロジー製Gibco,カタログ番号14190 326)中、4℃で60~120秒間、暗所で染色した。過剰なFACSバッファーで3回洗浄した後、示されているように、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)コンジュゲートAffiniPure抗ヒトIgG Fcγ断片特異的ヤギIgG F(ab`)2断片(Jackson ImmunoResearch製,カタログ番号109-096-098)又はフィコエリトリン(PE)コンジュゲートAffiniPure抗ヒトIgG Fcγ断片特異的ヤギIgG F(ab`)2断片(Jackson ImmunoResearch製,カタログ番号109-116-098)を含有する、25μL/ウェル4℃のFACSバッファー中、4℃で30~60分間、暗所で染色した。腫瘍細胞でのTnC及びFAP発現は、抗FAP抗体(Calbiochem製,moIgG1,OP188)又は抗TnC抗体(US Biological製,moIgG1,T2550-20D)を使用して決定され、二次抗体であるFITC標識抗マウスIgG抗体(Dako製,Code K0078(Quifikit))を使用して検出された。
生細胞と死細胞の識別には、2つの方法が使用された。5本レーザー搭載LSR-Fortessa(BD Bioscience製,DIVA スフトウェア付き)を流れる0.2μg/mLのDAPI(Santa Cruz Biotec製,カタログ番号Sc-3598)を含有する85μL/ウェルFACSバッファー中で、非固定細胞を同日中に取得した。ただし場合によっては、死細胞は、結合アッセイの前に、Fixable Viability Dye eFluor(登録商標)660(eBioscience 65-0864-18)で、又はZombie AquaTM Fixable Viability Kit(BioLegend423102)で、製造業者の指示書に従って標識したことによって、その後のMACS Quant Analyzer 10での、又は5本レーザー搭載LSR_Fortessa(BD Bioscience,DIVAソフトウェア付き)での細胞のホルマリン固定及び一晩取得が可能になった。 簡潔にいうと、細胞をDPBS(ライフテクノロジーズ製Gibco,カタログ番号14190 326)で1回洗浄し、Viability Dye eFluor(登録商標)660[1ug/mL]を含有するDPBSに1x106細胞/mLの細胞濃度で、暗所/4℃で30分間インキュベートした。代替的には、細胞をDPBSで1回洗浄し、Zombie AquaTM Viability Dye[1:800希釈]を含有するDPBSに1x106細胞/mLの細胞濃度で、暗所/4℃で15分間インキュベートした。その後、細胞をDPBSで1回洗浄して過剰な色素を除去した後、一次抗原結合分子を細胞に加え、その細胞を上記のようにインキュベートした。その後、その細胞をホルマリン溶液(DPBS中1~2.5%(v/v),シグマ HT501320)に4℃で15分間固定した後、測定した。
図8に示すように、TnC発現は、U87-MG細胞で(低レベルで)検出され、CT26huTnC細胞では高レベルで検出されたが、WM-266-4細胞では検出されなかった。FAP発現は、WM-266-4及びU87-MG細胞で検出された。
図9に示すように、二重特異性、二価抗OX40(クローン49B4)、二価抗TnC(クローン11C7又はクローン18D4)抗原結合分子は、WM-266-4細胞への結合を示さない(図9A)。二価抗OX40、二価抗TnCクローン18D4抗原結合分子は、TnCへのU87-MG細胞上での結合(図9B)と、CT26huTnC細胞への強い結合(図9C;黒三角)を示した。
図10に示すように、親の二価抗TnC抗体クローン18D4(図10B;×印付き四角)は、TnCへのU87-MG細胞上での強い結合と、CT26huTnC細胞への強い結合(図10C;×印付き四角)とを示した。二価抗OX40、二価抗TnCクローン18D4及び四価抗OX40、二価抗TnCクローン18D4分子は、親の二価抗TnC抗体クローン18D4(図10C;黒三角及び黒丸対×印付き四角)よりも弱くCT26huTnC細胞に結合することが示されたが、これは、抗原結合分子のC末端での該分子の発現がTnCへの結合を減少させることを示唆している。.電荷の導入による安定化により、N末端に発現した二価抗TnCによるTnCへの結合をわずかに増加させることができた(図10C;黒丸対黒三角)。二価抗OX40、二価抗TnCクローン18D4及び四価抗OX40、二価抗TnCクローン18D4分子は、四価抗OX40、一価抗TnCクローン18D4分子よりも強く、CT26huTnC細胞に結合することが示された(図10C;黒四角対黒三角及び黒丸)。抗TnC抗原結合分子は、TnC陰性WM-226-4細胞への結合を示さなかった(図10A)。
表36は、示された抗原結合分子のWM266-4、U87-MG及びCT26huTnC細胞への結合に関するEC50値を示す。
表36.様々な二重特異性ヒトIgG1 P329GLALA型のaOx40バインダー49B9の、細胞表面ヒトTnC及びヒトOx40への結合に関するEC50値
n.c.=曲線フィッティングできず、EC50 値算出不可能
OX40及びTnCを標的とする二重特異性抗原結合分子の生物活性
5.1 ヒトOX40及びレポーター遺伝子NF-κBルシフェラーゼを発現するHeLa細胞
Ox40のそのリガンドに対するアゴニスト結合は、核因子カッパB(NFκB)の活性化を介して下流のシグナル伝達を誘導する(A. D. Weinberg et al., J. Leukoc. Biol. 2004, 75(6), 962-972)。表面にヒトOX40を発現する組換えレポーター細胞株HeLa_hOX40_NFκB_Luc1が生成された。この細胞株は、NFκB感受性エンハンサーセグメントの制御下でルシフェラーゼ遺伝子を含有するレポータープラスミドを保有している。OX40の結合と活性化は、NFκBの用量依存的活性化を誘導し、その後NFκBは核に移行し、そこでレポータープラスミドのNFκB感受性エンハンサーに結合してルシフェラーゼタンパク質の発現を増加させる。ルシフェラーゼは、ルシフェリン酸化を触媒し、オキシルシフェリンを生成し、それが発光する。これは、ルミノメーターを使用して検出及び定量化可能である。したがって、HeLa_hOx40_NFkB_Luc1レポーター細胞を使用して、抗OX40分子が生物活性の尺度としてNFκB活性化を誘導する能力を分析することができる。
付着したHeLa_hOx40_NFkB_Luc1細胞を、細胞解離バッファー(Invitrogen製,カタログ番号13151-014)を使用して37℃で10分間収集した。細胞をDPBSで1回洗浄し、MEM(Invitrogen製,カタログ番号22561-021)、10%(v/v)熱不活性化FBS、1mM ピルビン酸ナトリウム(v/v)、非必須アミノ酸で構成するアッセイ培地で細胞密度を1.33×105に調整した。細胞を、蓋付きの滅菌白色96ウェル平底組織培養プレート(greiner bio-one,カタログ番号655083)にウェルあたり0.2×105細胞の密度で播種し、インキュベーター(Hera Cell 150)内で5%CO2雰囲気中、37℃で一晩インキュベートした。
翌日、OX40を標的とする、滴定されたP329GLALA huIgG1型の様々な二重特異性抗原結合分子を含有するアッセイ培地を添加することにより、HeLa_hOx40_NFkB_Luc1細胞を5~6時間刺激した。生物活性に対する超架橋の効果を分析するために、二次抗体抗ヒトIgGFcγ断片特異的ヤギIgG F(ab`)2断片(Jackson ImmunoResearch、109-006-098)を含有する25μL/ウェルの培地を1:2の比率(一次抗OX40 P329GLALA huIgG1抗原結合分子より2倍多い二次抗体)で加えた。細胞表面TnC+細胞によるコンストラクトの超架橋は、TnC+腫瘍細胞(U87-MG又はCT26huTnC細胞)を含有する培地25μL/ウェルを4対1の比率(ウェルあたりレポーター細胞の4倍多いTnC+腫瘍細胞)で加えることによって試験された。
インキュベーション後、アッセイ上清を吸引し、プレートをDPBSで2回洗浄した。ルシフェラーゼ100アッセイシステムとレポーター溶解バッファー(双方ともPromega製、カタログ番号E4550及びE3971)を製造元の指示書に従って使用して、発光の定量化を実施した。簡潔にいうと、ウェルあたり30μLの1×溶解バッファーを加えることによって、-20℃で10分間細胞を溶解した。細胞を37℃で20分間解凍した後、ウェルごとに90μLのルシフェラーゼアッセイ試薬を添加した。全ての波長を収集するフィルターなしで 500msの積分時間を用いるSpectraMax M5/M5eマイクロプレートリーダー(米国、Molecular Devices)又はSpark(登録商標)10Mマルチモードマイクロプレートリーダー(Tecan trading社)で発光を直ちに定量した。放射相対光単位(RLU)は、HeLa_hOx40_NFkB_Luc1細胞の基底発光によって補正され、Prism4又は6(米国、GraphPad Software)を使用して対数一次抗体濃度に対してプロットされた。組み込みのS字形用量反応を使用して、曲線をデータにフィッティングさせた。
図11に示すように、二価の抗OX40抗原結合2+2分子は全て、限られたNFkB活性化を誘発した(図11A)。抗ヒトFc特異的二次抗体による架橋は、標的化部分とは無関係に生物活性を強力に増強した(図11B)。TnC発現腫瘍細胞は、TnC標的分子を使用した場合、NFkBを介したルシフェラーゼ活性の誘導を増加させた(図11C及び11D;黒四角及び黒三角)。
図12及び図13に示すように、抗OX40抗原結合2分子は全て、限られたNFkB活性化を誘発した(図12A及び図13A)。U87-MG細胞による架橋は、TnC標的抗原結合分子を使用した場合に生物活性を増強した(図12B)。予想した通り、全てのTnC標的分子はCT26huTnC細胞株と架橋した場合に、U87-MG細胞による架橋と比較してはるかに高いNFkBの誘導を引き起こした(図12Bを図13Bと比較せよ)。
それぞれのプロットされた用量反応曲線の曲線下面積は、各抗原結合分子のアゴニスト能力の指標として決定された。
図12Cに示す通り、四価抗OX40、二価抗TnC(クローン18D4)4+2分子は、U87-MG細胞(表面TnCの中間体レベルを発現する)による架橋の存在下で最もNFkBの活性化を誘導し、且つ、低レベルのアゴニズムのみが、同等の四価抗OX40、一価抗TnC(クローン18D4)4+1分子とのU87-MG細胞による架橋によって検出された。この発見は、4+2分子が4+1分子よりもU87-MG細胞に強く結合するという発見と一致している(図10Cを参照)。
ただし、図13B及び13Cに示すように、CT26huTnC細胞株を使用した場合、四価抗OX40、二価抗TnC(クローン18D4)4+2分子と4価抗OX40、1価抗TnC(クローン18D4)4+1分子は双方とも、非常に強く、且つ、同程度のNFkB活性化を誘導した。また、図13B及び13Cから、二価抗OX40、二価抗TnC(クローン18D4)2+2分子は、四価抗OX40、二価抗TnC(クローン18D4)4+2及び四価抗OX40、一価抗,TnC(クローン18D4)4+1分子と比較して、より低いレベルのNFkB活性化を誘導した。
この後者の発見は、OX40の高い結合価と同様に、TnCによる超架橋がOX40抗原結合分子のアゴニスト機能にとって重要であることを示唆している。
OX40のライゲーションは、準最適なT細胞受容体(TCR)刺激後のT細胞の***と生存を促進する相乗的共刺激シグナルを提供する(M. Croft et al., Immunol. Rev. 2009, 229(1), 173-191)。更に、いくつかのサイトカインの産生とT細胞活性化マーカーの表面発現は、OX40のライゲーション後に増加している(I. Gramaglia et al., J. Immunol. 1998, 161(12), 6510-6517; S. M. Jensen et al., Seminars in Oncology 2010, 37(5), 524-532)。
二重特異性抗OX40、抗TnC抗原結合分子を、休止PBMC細胞の準最適なTCR刺激をレスキューする能力について分析した。ヒトPBMC調製物には、(1)休止、OX40陰性CD4+ 及びCD8+ T細胞、並びに(2)細胞表面に種々のFc受容体分子を有する抗原提示細胞(例えばB細胞及び単球)が含まれている。ヒトIgG1アイソタイプの抗ヒトCD3抗体は、そのFcを介してFc-γ受容体分子に結合し、休止OX40陰性CD4+及びCD8+ T細胞で長期TCR活性化を引き起こす。これらの細胞は、数時間以内にOX40を発現し始める。OX40に対する機能的アゴニスト化合物は、活性化CD8+及びCD4+ T細胞に存在するOX40受容体を介してシグナルを伝達し、TCRを介する刺激をサポートする。
休止eFluor670-又はCFSE標識(Cell Trace CFSE増殖キット,Thermo Fischer製,C34554)ヒトPBMCは、照射されたU87-MG又はCT26huTnC細胞及び滴定された抗OX40抗原結合分子の存在下で、準最適な濃度の抗CD3抗体を用いて、4日間刺激された。T細胞の生存、増殖、分化への影響は、フローサイトメトリーにより生細胞の総細胞数とeFluor670/CFSE希釈をモニターすることにより分析した。更に、T細胞活性化マーカーCD25及び成熟マーカーCD127に対する蛍光標識抗体で細胞を共染色した。
U87-MG又はCT26huTnC細胞を、細胞解離バッファー(Invitrogen製,カタログ番号13151-014)を使用して37℃で10分間収集した。細胞を、DPBSで1回洗浄した。U87-MG又はCT26huTnC細胞を、インキュベーター(Hera Cell 150)内37℃及び5%CO2で、滅菌96ウェル丸底接着組織培養プレート(TPP、カタログ番号92097)に入れたT細胞培地中1ウェルあたり0.2x105細胞の密度で一晩培養した。翌日、4500RADの線量を使用してx線照射器で照射し、腫瘍細胞株によるヒトPBMCの過剰増殖を防いだ。
フィコール密度遠心分離によりヒトPBMCを単離し、実施例4.3に記載のようにeFluor670で標識した。代替的に、PBMCをCFSEで標識し、標識のために細胞を回収し、予熱した(37℃)DPBSで洗浄し、DPBS中1×107細胞/mLの細胞密度に調整した。CFSE(Cell Trace CFSE増殖キット、Thermo Fischer、カタログ番号C34554)をナイーブヒトPBMCの懸濁液に、最終濃度0.2μM、DPBS中の最終細胞密度0.5×107細胞/mLで加えました。その後、細胞を暗所で37℃で10分間インキュベートした。標識反応を停止させるために、4mLの熱不活性化FBSを加え、細胞をT細胞培地で3回洗浄した。細胞を各ウェルに0.6×105細胞/ウェルの密度で加えた。10nMの最終濃度の抗ヒトCD3抗体(クローンV9、ヒトIgG1)、及び示された抗OX40抗原結合分子を示された濃度で加えた。細胞を、インキュベーター(Hera Cell 150)内で37℃、5%CO2で4日間活性化させた。続いて、細胞を蛍光色素コンジュゲート抗体抗ヒトCD4(クローンRPA-T4、BioLegend、カタログ番号300532)、CD8(クローンRPa-T8、BioLegend、カタログ番号3010441)、抗CD25(クローンM-A251、BioLegend、カタログ番号356112)及び抗CD127(クローンA019D5、BioLegend、カタログ番号351324)を用い、4℃で20分間表面染色した。細胞ペレットをFACSバッファーで1回洗浄した。最後に細胞を、0.2μg/mL DAPI(Santa Cruz Biotec製,カタログ番号Sc-3598)を含有する85μL/ウェルFACSバッファーに再懸濁させ、5本レーザー搭載LSR-Fortessa(BD Bioscience製、DIVAソフトウェア付き)を使用して、同日に取得した。
場合によって、細胞をDPBSで1回洗浄し、Zombie AquaTM Viability Dye[1:800希釈]を含有するDPBSに1×106細胞/mLの細胞濃度で、暗所/4℃で15分間インキュベートした。細胞をDPBSで1回洗浄して過剰を除去し、上記のように蛍光色素コンジュゲート抗体による表面染色を行った。測定前に、細胞をホルマリン液(DPBS中1%(v/v)、シグマ製HT501320)に4℃で30分間固定した。プレートを最終的に100μL/ウェルFACSバッファーに再懸濁させ、5本レーザー搭載LSR-Fortessa(DIVAソフトウェア付きのBD Bioscience製)を使用して同日に取得した。
U87-MG細胞の存在下での培養によるTnC標的4+2(黒丸)抗OX40抗原結合分子の超架橋は、ヒトCD4+及びCD8+ T細胞において増殖と成熟を強く促進し(図14)、活性化(CD25+)表現型を増強した(図15)。CT26huTnC細胞の存在下での培養によるTnC標的4+2(黒丸)抗OX40抗原結合分子の超架橋は、ヒトCD4+及びCD8+ T細胞において増殖と成熟を強く促進した(図16)。四価抗OX40、二価抗TnC 4+2分子(黒丸)は、二価抗OX40、二価抗TnC 2+2分子(黒三角)及び四価抗OX40、一価抗TnC 4+1分子(黒四角)と比較して、準最適なTCR刺激をレスキューする能力において明らかに優れていた。
四価抗OX40、一価抗TnC 4+1分子(黒四角)は、二価抗OX40、二価抗TnC 2+2分子(黒三角)と比較して、準最適なTCR刺激をレスキューする能力が低下していることが示された。これは、二価分子と比較して、TnCに対する単量体N末端融合抗TnC(18D4)分子のアフィニティーの低下によって説明できる。ただし、細胞表面TnCによるわずかな架橋は、立体障害のためN末端融合抗TnC(18D4)バインダーから予想できる。
これらの結果は、T細胞における最適なOX40アゴニズムには、(例えばOX40の四価による)OX40受容体の十分なオリゴマー化が必要であるだけでなく、OX40受容体オリゴマーの細胞表面の固定化も必要であることを示唆している。
Claims (18)
- 二重特異性抗原結合分子であって、
(a)抗体軽鎖可変領域(VL)及び抗体重鎖可変領域(VH)を含む、OX40に特異的に結合できる少なくとも1つの部分であって、VLが、配列番号13のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号20のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含み、VHが、配列番号2のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号7のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む少なくとも1つの部分;
(b)抗体軽鎖可変領域(VL)及び抗体重鎖可変領域(VH)を含む、テネイシンC(TnC)に特異的に結合できる少なくとも1つの部分であって、VLが、配列番号46のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号48のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号50のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含み、VHが、配列番号40のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号42のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号44のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む少なくとも1つの部分;及び
(c)第1及び第2のサブユニットから構成されるFc領域であって、Fc領域の第1及び第2のサブユニットの結合を促進する改変を含み、抗体のFc受容体への結合アフィニティー及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む、Fc領域
を含み、かつ
(i)
(a)OX40に特異的に結合できるFab断片のVH及びCH1ドメインと、Fc領域サブユニットとをそれぞれが含む2つの重鎖、
(b)OX40に特異的に結合できるFab断片のVL及びCLドメインをそれぞれが含む2つの軽鎖、
(c)TnCに特異的に結合できる2つのFab断片であって、そのFab断片の一方が(a)の2つの重鎖のうちの一方のC末端に連結し、Fab断片のうちのもう一方が(a)の2つの重鎖のうちのもう一方のC末端に連結している2つのFab断片
を含む;又は
(ii)
(a)OX40に特異的に結合できるFab断片の2つのVHドメイン及び2つのCH1ドメインと、Fc領域サブユニットとをそれぞれが含む2つの重鎖、
(b)OX40に特異的に結合できるFab断片のVL及びCLドメインをそれぞれが含む4つの軽鎖、並びに
(c)TnCに特異的に結合できる部分のVH及びVLであって、VHが(a)の2つの重鎖のうちの一方のC末端に連結し、VLが(a)の2つの重鎖のうちのもう一方のC末端に連結しているVH及びVL
を含む;又は
(iii)
(a)OX40に特異的に結合できるFab断片の2つのVHドメイン及び2つのCH1ドメインと、Fc領域サブユニットとをそれぞれが含む2つの重鎖、
(b)OX40に特異的に結合できるFab断片のVL及びCLドメインをそれぞれが含む4つの軽鎖、並びに
(c)TnCに特異的に結合できる2つのFab断片であって、そのFab断片の一方が(a)の2つの重鎖のうちの一方のC末端に連結し、Fab断片のうちのもう一方が(a)の2つの重鎖のうちのもう一方のC末端に連結している2つのFab断片
を含む、
二重特異性抗原結合分子。 - 二重特異性抗原結合分子であって、
(a)抗体軽鎖可変領域(VL)及び抗体重鎖可変領域(VH)を含む、OX40に特異的に結合できる少なくとも1つの部分であって、VLが、配列番号13のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号20のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含み、VHが、配列番号2のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号7のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む少なくとも1つの部分;
(b)抗体軽鎖可変領域(VL)及び抗体重鎖可変領域(VH)を含む、テネイシンC(TnC)に特異的に結合できる少なくとも1つの部分であって、VLが、配列番号47のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号49のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号51のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含み、VHが、配列番号41のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号43のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む少なくとも1つの部分;及び
(c)第1及び第2のサブユニットから構成されるFc領域であって、Fc領域の第1及び第2のサブユニットの結合を促進する改変を含み、抗体のFc受容体への結合アフィニティー及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む、Fc領域
を含み、かつ
(i)
(a)OX40に特異的に結合できるFab断片のVH及びCH1ドメインと、Fc領域サブユニットとをそれぞれが含む2つの重鎖、
(b)OX40に特異的に結合できるFab断片のVL及びCLドメインをそれぞれが含む2つの軽鎖、
(c)TnCに特異的に結合できる2つのFab断片であって、そのFab断片の一方が(a)の2つの重鎖のうちの一方のC末端に連結し、Fab断片のうちのもう一方が(a)の2つの重鎖のうちのもう一方のC末端に連結している2つのFab断片
を含む;又は
(ii)
(a)OX40に特異的に結合できるFab断片の2つのVHドメイン及び2つのCH1ドメインと、Fc領域サブユニットとをそれぞれが含む2つの重鎖、
(b)OX40に特異的に結合できるFab断片のVL及びCLドメインをそれぞれが含む4つの軽鎖、並びに
(c)TnCに特異的に結合できる部分のVH及びVLであって、VHが(a)の2つの重鎖のうちの一方のC末端に連結し、VLが(a)の2つの重鎖のうちのもう一方のC末端に連結しているVH及びVL
を含む;又は
(iii)
(a)OX40に特異的に結合できるFab断片の2つのVHドメイン及び2つのCH1ドメインと、Fc領域サブユニットとをそれぞれが含む2つの重鎖、
(b)OX40に特異的に結合できるFab断片のVL及びCLドメインをそれぞれが含む4つの軽鎖、並びに
(c)TnCに特異的に結合できる2つのFab断片であって、そのFab断片の一方が(a)の2つの重鎖のうちの一方のC末端に連結し、Fab断片のうちのもう一方が(a)の2つの重鎖のうちのもう一方のC末端に連結している2つのFab断片
を含む、
二重特異性抗原結合分子。 - OX40に特異的に結合できる部分が、配列番号27のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むVHと、配列番号28のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むVLとを含む、請求項1又は2に記載の二重特異性抗原結合分子。
- OX40に特異的に結合できる部分が、配列番号27のアミノ酸配列を含むVHと配列番号28のアミノ酸配列を含むVLを含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
- TnCに特異的に結合できる部分が、配列番号52のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むVHと、配列番号53のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むVLとを含む、請求項1に記載の二重特異性抗原結合分子。
- TnCに特異的に結合できる部分が、配列番号54のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むVHと、配列番号55のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むVLとを含む、請求項2に記載の二重特異性抗原結合分子。
- (i)配列番号27のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むVH及び配列番号28のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むVLを含む、OX40に特異的に結合できる少なくとも1つの部分と、
(ii)配列番号52のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むVH及び配列番号53のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むVLを含む、TnCに特異的に結合できる少なくとも1つの部分と
を含む、請求項1に記載の二重特異性抗原結合分子。 - (i)配列番号27のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むVH及び配列番号28のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むVLを含む、OX40に特異的に結合できる少なくとも1つの部分と、
(ii)配列番号54のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むVH及び配列番号55のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むVLを含む、TnCに特異的に結合できる少なくとも1つの部分と
を含む、請求項2に記載の二重特異性抗原結合分子。 - (a)配列番号27のアミノ酸配列を含むVH及び配列番号28のアミノ酸配列を含むVLを含む、OX40に特異的に結合できる少なくとも1つの部分、並びに
(b)配列番号52のアミノ酸配列を含むVH及び配列番号53のアミノ酸配列を含むVLを含む、TnCに特異的に結合できる少なくとも1つの部分
を含む、請求項1に記載の二重特異性抗原結合分子。 - (a)配列番号27のアミノ酸配列を含むVH及び配列番号28のアミノ酸配列を含むVLを含む、OX40に特異的に結合できる少なくとも1つの部分、並びに
(b)配列番号54のアミノ酸配列を含むVH及び配列番号55のアミノ酸配列を含むVLを含む、TnCに特異的に結合できる少なくとも1つの部分
を含む、請求項2に記載の二重特異性抗原結合分子。 - Fc領域がIgG、特にIgG1 Fc領域又はIgG4 Fc領域である、請求項1から10のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
- OX40に特異的に結合できる4つのFab断片を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
- OX40及びTnCに特異的に結合することができる二重特異性抗原結合分子であって、
(i)それぞれが配列番号213のアミノ酸配列を含む2つの重鎖と、それぞれが配列番号212のアミノ酸配列を含む2つの軽鎖と、それぞれが配列番号214のアミノ酸配列を含む2つの軽鎖とを含む二重特異性抗原結合分子、
(ii)それぞれが配列番号215のアミノ酸配列を含む2つの重鎖と、それぞれが配列番号212のアミノ酸配列を含む2つの軽鎖と、それぞれが配列番号216のアミノ酸配列を含む2つの軽鎖とを含む二重特異性抗原結合分子、
(iii)配列番号222のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号223のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、それぞれが配列番号212のアミノ酸配列を含む4つの軽鎖とを含む二重特異性抗原結合分子、及び
(iv)それぞれが配列番号225のアミノ酸配列を含む2つの重鎖と、それぞれが配列番号224のアミノ酸配列を含む4つの軽鎖と、それぞれが配列番号226のアミノ酸配列を含む2つの軽鎖とを含む二重特異性抗原結合分子
から成る群より選択される二重特異性抗原結合分子。 - 請求項1から13のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項14のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項14に記載のポリヌクレオチド又は請求項15に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 二重特異性抗原結合分子を製造する方法であって、二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で請求項16に記載の宿主細胞を培養することと、二重特異性抗原結合分子を単離することとを含む、方法。
- 請求項1から13のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子と薬学的に許容される少なくとも1種の添加剤とを含む薬学的組成物。
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