KR20130098161A - 인간에서 감소된 면역원성을 갖는 항체 - Google Patents

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러셀 피. 로더
폴 피. 탐부리니
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알렉시온 파마슈티칼스, 인코포레이티드
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Abstract

본 개시는 인간에게 투여시, 인간에서 낮은 수준의 면역원성을 나타내는 조작된 항체에 관한 것이다. 또한 본 개시는 항체를 발생시키는 방법에 관한 것이다. 조작된 항체는 가령, 비-인간 (가령, 쥐과) 공여자 항체로부터 또는 키메라 또는 인간화 항체로부터 파생될 수 있으며, 이는 인간에게 만성적으로 투여될 때, 인간에서 중화 항-항체 반응을 유도하는 것으로 알려져 있고, 예측되고, 또는 예상된다.

Description

인간에서 감소된 면역원성을 갖는 항체{ANTIBODIES HAVING REDUCED IMMUNOGENICITY IN A HUMAN}
관련된 출원
본 출원은 2010년 4월 30일에 제출된 미국 가출원 제 61/330,261의 이익을 주장한다. 상기-인용된 출원의 모든 교시는 참조로서 본 명세서에 편입된다.
서열 리스트
본 출원은 EFS-웹을 통해 제출되었던 서열 리스트를 포함하고 이의 전체로 참조로서 본 명세서에 편입된다. 2011년 4월 29일자로 생성된 상기 ASCII 카피(copy)는 ALXN155W.txt로 명명되고, 29,908 바이트 크기이다.
기술 분야
본 발명의 분야는 의학, 면역학, 분자 생물학, 및 단백질 화학이다.
배경기술
인간에게 설치류 항체 (가령, 생쥐, 쥐, 또는 토끼)의 투여는 인간의 항-설치류 면역글로불린 항체의 생성을 일반적으로 야기한다. 항-설치류 항체는 치료용 항체의 임의의 잠재적인 치료적 혜택을 중화시킬 수 있다. 동일한 과정이 인간에게 투여된 비-인간 항체 (가령, 원숭이(simian) 항체)의 다른 유형에 대해 발생한다. 이러한 문제점을 극복하기 위해, 비-인간 항체는 가령, 키메라 인간 항체 또는 CDR-이식(CDR-grafted) 항체로 재-조작(re-engineered)될 수 있다. 인간 키메라 항체에서, 가변 영역(variable region)은 비-인간 기원 (가령, 생쥐 기원)의 것이고 불변 영역(constant region)은 인간 기원의 것이다. 인간화 항체로서 종종 언급되는 CDR-이식 항체의 발생은 더 복잡한 과정이며, 여기서 완전 인간 수용자 항체(acceptor antibody)의 CDR은 비-인간 공여자 항체의 CDR로 교체된다. 하지만, 인간 항-인간 항체 (HAHA) 반응이 이들의 재-조작된 항체 변이체 각각에 대해 여전히 보고된다. 예를 들어, Welt et al. [(2003) Clin Cancer Res 9:1338-1346]은 인간화 항-A33 항체가, 인간 결장암(colon cancer) 환자에게 투여될 ?, 73%의 상기 환자에서 HAHA 반응을 유도한다는 것을 설명한다. 또 다른 예시에서, 키메라 항-TNF 항체 Remicade® (Johnson & Johnson)는 단일요법(monotherapy) 중인 류마티스 관절염 환자의 최대 53%까지에서 그리고 메토트렉사트(methotrexate)와 병용 요법으로 투여될 때 환자의 많게는 15%에서 HAHA 반응을 야기하는 것을 나타내었다 (가령, Aarden et al. (2008) Curr Opin Immunol 20:431-435를 참고.). 강직성 척추염을 앓는 환자의 많게는 26%는 약물의 반복된 투여시 Remicade®에 대한 항체를 발달시키는 것으로 밝혀졌다. Anderson [(2005) Semin Arthritis Rheum 34:19-22]은 완전 인간화 항체인, 아달리무맙(adalimumab, HUMIRA®)을 받은 환자에서, 인간 항-아달리무맙 항체의 발생도는 약 6%라는 점을 보고하였다. Remicade®과 마찬가지로, 아달리무맙에 대항한 HAHA 반응의 더 낮은 발생도는 항체가 메토트렉사트와 조합하여 투여될 때 관찰되었다 (Aarden et al. (2008), supra 참고). 하지만, Aarden et al.은 아달리무맙에 대한 거의 20%의 HAHA 반응이 중화되었다는 것을 알아내었다. 따라서, 인간 환자에서 면역원성을 감소시키기 위해 인간화 치료용 항체에 대한, 특히 만성적으로 투여되어야하는 치료용 항체에 대한 향상된 방법의 필요성이 명백하게 남아있다.
요약
본 개시는 적어도 부분적으로, 발명자에 의해 인간화 항-C5 항체 에쿨리주맙(eculizumab)은 인간에서 매우 낮은 수준의 면역원성을 나타낸다는 발견에 기초한다. 동반한 작업 실시예에서 상세히 설명된 바와 같이, 130회 이상의 치료 분량의 에쿨리주맙이 여러 해동안 발작성 야간혈색소 요증 (PNH)을 앓는 각 환자에게 투여되었다. 상기 환자에게 메토트렉사트와 같은 면역억제제가 동시에 투여되지는 않았다. 혈액 샘플이 상기 환자로부터 얻어졌고 상기 샘플이 에쿨리주맙에 결합하는 항체를 포함하였는지 안 하였는지 확인하기 위해 분석되었다. 이러한 항체의 존재는 에쿨리주맙에 대항하는 인간 항-인간 항체 반응을 명시한다. 단지 1.2%의 환자 (161명 중 2명)만이 에쿨리주맙에 결합하는 낮은, 하지만 검출가능한 수준의 항체를 가졌다는 것으로 밝혀졌다. 하지만, 추가적인 분석은 두개의 혈액 샘플 중 어떠한 것도 에쿨리주맙의 치료적 효능을 중화시킬 수 있는 항체를 포함하지 않았다는 것을 확인하였다. 따라서, 발명자는 에쿨리주맙이 인간에서 낮은 수준의 면역원성을 또한 나타내는 추가적, 치료용 항체를 생성하기 위해 스캐폴드(scaffold)로서 이용될 수 있다는 것을 도출하였다. 따라서, 본 개시는 조작된 항체의 특징을 이루며, 이는 감소된 면역원성 수용자 항체 스캐폴드 상으로 이식된 공여자 항체의 CDR을 포함하고 인간에서의 공여자 항체의 면역원성과 비교하여 인간에서 더 적은 면역성이라는 점이다. 조작된 항체는 특히 이들이 만성적으로 투여될 때, 인간에서 중화 항-항체 반응을 유도하는 것으로 알려져 있고, 예측되고, 또는 예상되는 공여자 항체로부터 파생될 수 있다. 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 공여자 항체는 가령, 비-인간 항체 (가령, 설치류 항체 또는 비-인간 영장류 항체) 또는 인간화 또는 완전 인간 항체가 될 수 있고, 이는 인간 항-인간 항체 (HAHA) 반응 (가령, 인간에서 공여자 항체의 치료적 효능을 중화시키는 HAHA 반응)을 발생시킨다는 것으로 밝혀진다. 공여자 항체 및/또는 결과로 얻은 조작된 항체는 암, 감염, 대사 장애, 염증 질환, 자가면역 질환, 신경 장애, 혈액학적 장애, 및 심혈관 질환을 제한없이 포함한, 인간 피험자에서 임의의 여러 가지 질병을 치료 또는 진단하는데 유용한 항체일 수 있다.
작업 실시예에서 논의된 바와 같이, 에쿨리주맙은 I.23 Ig 경쇄 분자로부터 파생된 경쇄 프레임워크(framework) 영역의 세트 및 H20C3 Ig 중쇄 분자로부터 파생된 중쇄 프레임워크 영역의 세트를 갖는 인간화 항체이다. H20C3 중쇄 폴리펩티드의 아미노산 서열은 Weng et al. (1992) J Immunol 149(7):2518-2529에서 제공되고 또한 NCBI 기탁번호 AAA52985 하에 이용가능하다. H20C3을 암호화하는 핵산 서열은 인간 생식세포 중쇄 면역글로불린 유전자의 핵산 서열과 대략 98% 유사하다. I.23 경쇄 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열은 특히 Klein et al. (1993) Eur J Immunol 23(12):3248-3262에서 제시되고 완전한 서열은 NCBI 기탁번호 CAA51145.1 하에 또한 공개적으로 이용가능하다. I.23 암호화 서열은 인간 생식세포 Vκ 및 Jκ 유전자로부터 파생되었지만 위치 38에서 생식세포 서열로부터의 단일 아미노산 변화를 포함한다. 따라서, 에쿨리주맙 (에쿨리주맙의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역), I.23, 및/또는 H20C3으로부터의 프레임워크 영역은 인간에서 낮은 수준의 면역원성을 나타내는 조작된 항체의 발생에 이용될 수 있다. 작업 실시예는 에쿨리주맙으로부터 경쇄 프레임워크 영역 1 내지 3 및 중쇄 프레임워크 영역 1 내지 3을 포함하는 추가적, 기능적, 인간화 항체의 제조를 설명한다. 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의, 하지만 모두는 아닌, 에쿨리주맙, I.23, 및/또는 H20C3의 CDR은 조작된 항체의 발생에서 또한 이용될 수 있다.
한가지 측면에서, 본 개시는 다음의 아미노산 서열 조각을 순서대로 포함하는 폴리펩티드 (가령, 경쇄 폴리펩티드): LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4의 특징을 이룬다. 경쇄 프레임워크 영역 LFR1, LFR2, 및 LFR3 중 하나 이상은 서열번호:2 또는 서열번호:8에서 도시된 아미노산을 갖는 경쇄 가변 영역으로부터 얻으며, 그리고 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 중 하나 이상은 공여자 항체로부터 얻는데, 단서 조항으로, 상기 폴리펩티드는 서열번호:2 또는 서열번호:8에서 도시된 완전한 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 몇몇 실시양태에서, LFR4는 서열번호:2 또는 서열번호:8에서 도시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역으로부터 얻을 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 하나의 CDR은 서열번호:2 또는 서열번호:8에서 도시된 아미노산을 갖는 경쇄 가변 영역으로부터 얻을 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 두개의 CDR은 서열번호:2 또는 서열번호:8에서 도시된 아미노산을 갖는 경쇄 가변 영역으로부터 얻을 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 최소 두개의 CDR은 동일한 공여자 항체로부터 얻을 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 모든 CDR은 동일한 공여자 항체로부터 얻을 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 프레임워크 영역 및 CDR은 카밧(Kabat)에 따라서 정의된다. 몇몇 실시양태에서, 프레임워크 영역 및 CDR은 초티아(Chothia)에 따라서 정의된다. 몇몇 실시양태에서, 프레임워크 영역 및 CDR은 결합된 카밧(Kabat)-초티아(Chothia) 정의에 따라서 정의된다.
몇몇 실시양태에서, LFR1은 서열번호:9에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성된다. 몇몇 실시양태에서, LFR2는 서열번호:10 또는 서열번호:18에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성된다. 몇몇 실시양태에서, LFR3은 서열번호:11에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성된다. 몇몇 실시양태에서, LFR4는 서열번호:12에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성된다.
몇몇 실시양태에서, LFR1은 서열번호:9에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성되고; LFR2는 서열번호:10에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성되고; LFR3은 서열번호:11에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성되고; 및 LFR4는 서열번호:12에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성된다.
몇몇 실시양태에서, LFR1은 서열번호:9에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성되고; LFR2는 서열번호:18에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성되고; LFR3은 서열번호:11에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성되고; 및 LFR4는 서열번호:12에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성된다.
몇몇 실시양태에서, LFR1은 서열번호:20 또는 서열번호:24에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성된다. 몇몇 실시양태에서, LFR2는 서열번호:21 또는 서열번호:25에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성된다. 몇몇 실시양태에서, LFR3은 서열번호:22 또는 서열번호:26에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성된다. 몇몇 실시양태에서, LFR4는 서열번호:23에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성된다.
몇몇 실시양태에서, LFR1은 서열번호:20에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성되고; LFR2는 서열번호:21에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성되고; LFR3은 서열번호:22에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성되고; 및 LFR4는 서열번호:23에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성된다.
몇몇 실시양태에서, LFR1은 서열번호:24에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성되고; LFR2는 서열번호:25에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성되고; LFR3은 서열번호:26에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성되고; 및 LFR4는 서열번호:23에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성된다.
몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드 (가령, 경쇄 폴리펩티드)는 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드 불변 영역 모두 또는 일부를 포함한다, 가령, 폴리펩티드는 서열번호:3에서 도시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 경쇄 폴리펩티드 불변 영역은 인간 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 경쇄 불변 영역은 λ 경쇄 불변 영역 또는 κ 경쇄 불변 영역이다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 다음의 아미노산 서열 조각을 순서대로 포함하고: HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4, 또는 이로 구성하는 폴리펩티드의 특징을 이룬다. 중쇄 프레임워크 영역 HFR1, HFR2, 및 HFR3 중 하나 이상은 서열번호:5 또는 서열번호:7에서 도시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역으로부터 얻을 수 있고, 또는 얻으며, 그리고 중쇄 상보성 결정 영역은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 중 하나 이상은 공여자 항체로부터 얻는데, 단서 조항으로, 상기 폴리펩티드는 서열번호:5 또는 서열번호:7에서 도시된 완전한 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 몇몇 실시양태에서, HFR4는 서열번호:5 또는 서열번호:7에서 도시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역으로부터 얻을 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 하나의 CDR은 서열번호:5 또는 서열번호:7에서 도시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역으로부터 얻을 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 두개의 CDR은 서열번호:5 또는 서열번호:7에서 도시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역으로부터 얻을 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 최소 두개의 CDR은 동일한 공여자 항체로부터 얻을 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 모든 CDR은 동일한 공여자 항체로부터 얻을 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 프레임워크 영역 및 CDR은 카밧(Kabat)에 따라서 정의된다. 몇몇 실시양태에서, 프레임워크 영역 및 CDR은 초티아(Chothia)에 따라서 정의된다. 몇몇 실시양태에서, 프레임워크 영역 및 CDR은 결합된 카밧(Kabat)-초티아(Chothia) 정의에 따라서 정의된다.
몇몇 실시양태에서, HFR1은 서열번호:13, 17, 또는 19 중 임의의 하나에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성된다. 몇몇 실시양태에서, HFR2는 서열번호:14에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성된다. 몇몇 실시양태에서, HFR3은 서열번호:15에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성된다. 몇몇 실시양태에서, HFR4는 서열번호:16에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성된다.
몇몇 실시양태에서, HFR1은 서열번호:13에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성되고; HFR2는 서열번호:14에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성되고; HFR3은 서열번호:15에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성되고; 및 HFR4는 서열번호:16에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성된다.
몇몇 실시양태에서, HFR1은 서열번호:17에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성되고; HFR2는 서열번호:14에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성되고; HFR3은 서열번호:15에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성되고; 및 HFR4는 서열번호:16에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성된다.
몇몇 실시양태에서, HFR1은 서열번호:19에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성되고; HFR2는 서열번호:14에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성되고; HFR3은 서열번호:15에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성되고; 및 HFR4는 서열번호:16에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성된다.
몇몇 실시양태에서, HFR1은 서열번호:17에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성된다. 몇몇 실시양태에서, HFR2는 서열번호:27 또는 서열번호:30에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성된다. 몇몇 실시양태에서, HFR3은 서열번호:28 또는 서열번호:31에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성된다. 몇몇 실시양태에서, HFR4는 서열번호:29 또는 서열번호:32에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성된다.
몇몇 실시양태에서, HFR1은 서열번호:17에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성되고; HFR2는 서열번호:27에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성되고; HFR3은 서열번호:28에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성되고; 및 HFR4는 서열번호:29에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성된다.
몇몇 실시양태에서, HFR1은 서열번호:17에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성되고; HFR2는 서열번호:30에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성되고; HFR3은 서열번호:31에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성되고; 및 HFR4는 서열번호:32에서 도시된 아미노산 서열을 포함, 또는 이로 구성된다.
몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드 (가령, 중쇄 폴리펩티드)는 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 불변 영역 모두 또는 일부를 포함한다, 가령, 폴리펩티드는 서열번호:6에서 도시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드 (가령, 중쇄 폴리펩티드)는 면역글로불린 분자의 Fc 일부를 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 불변 영역은 IgG, IgA, IgE, IgD, 또는 IgM 중쇄 폴리펩티드 불변 영역이다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 (i) 경쇄 폴리펩티드 및 (ii) 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 조작된 항체의 특징을 이루며, 여기서 경쇄 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열 조각을 순서대로 포함하고: LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4, 여기서 경쇄 프레임워크 영역 LFR1, LFR2, 및 LFR3은 서열번호:2 또는 서열번호:8에서 도시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역으로부터 얻으며, 그리고 여기서 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 중 하나 이상은 공여자 항체로부터 얻는데, 단서 조항으로, 상기 경쇄 폴리펩티드는 서열번호:2 또는 서열번호:8에서 도시된 완전한 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 중쇄 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열 조각을 순서대로 포함하고: HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4, 여기서 중쇄 프레임워크 영역 HFR1, HFR2, 및 HFR3은 서열번호:5 또는 서열번호:7에서 도시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역으로부터 얻으며, 그리고 여기서 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 중 하나 이상은 공여자 항체로부터 얻는데, 단서 조항으로 상기 중쇄 폴리펩티드는 서열번호:5 또는 서열번호:7에서 도시된 완전한 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
몇몇 실시양태에서, 경쇄 프레임워크 영역, 중쇄 프레임워크 영역, 경쇄 CDR, 및 중쇄 CDR은 카밧(Kabat) 정의에 따라서 정의된다. 몇몇 실시양태에서, 경쇄 프레임워크 영역, 중쇄 프레임워크 영역, 경쇄 CDR, 및 중쇄 CDR은 초티아(Chothia) 정의에 따라서 정의된다. 몇몇 실시양태에서, 경쇄 프레임워크 영역, 중쇄 프레임워크 영역, 경쇄 CDR, 및 중쇄 CDR은 결합된 카밧(Kabat)-초티아(Chothia) 정의에 따라서 정의된다.
몇몇 실시양태에서, LFR1은 서열번호:9에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR2는 서열번호:10에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR3은 서열번호:11에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR4는 서열번호:12에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고, HFR1은 서열번호:13에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR2는 서열번호:14에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR3은 서열번호:15에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 HFR4는 서열번호:16에서 도시된 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, LFR1은 서열번호:9에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR2는 서열번호:18에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR3은 서열번호:11에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR4는 서열번호:12에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고, HFR1은 서열번호:19에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR2는 서열번호:14에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR3은 서열번호:15에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 HFR4는 서열번호:16에서 도시된 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, LFR1은 서열번호:9에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR2는 서열번호:18에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR3은 서열번호:11에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR4는 서열번호:12에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고, HFR1은 서열번호:13에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR2는 서열번호:14에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR3은 서열번호:15에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 HFR4는 서열번호:16에서 도시된 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, LFR1은 서열번호:9에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR2는 서열번호:10에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR3은 서열번호:11에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR4는 서열번호:12에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고, HFR1은 서열번호:19에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR2는 서열번호:14에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR3은 서열번호:15에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 HFR4는 서열번호:16에서 도시된 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, LFR1은 서열번호:9에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR2는 서열번호:10에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR3은 서열번호:11에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR4는 서열번호:12에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고, HFR1은 서열번호:17에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR2는 서열번호:14에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR3은 서열번호:15에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 HFR4는 서열번호:16에서 도시된 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, LFR1은 서열번호:9에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR2는 서열번호:18에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR3은 서열번호:11에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR4는 서열번호:12에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고, HFR1은 서열번호:17에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR2는 서열번호:14에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR3은 서열번호:15에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 HFR4는 서열번호:16에서 도시된 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, LFR1은 서열번호:20에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR2는 서열번호:21에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR3은 서열번호:22에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR4는 서열번호:23에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고, HFR1은 서열번호:17에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR2는 서열번호:27에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR3은 서열번호:28에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 HFR4는 서열번호:29에서 도시된 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, LFR1은 서열번호:20에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR2는 서열번호:21에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR3은 서열번호:22에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR4는 서열번호:23에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고, HFR1은 서열번호:17에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR2는 서열번호:30에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR3은 서열번호:31에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 HFR4는 서열번호:32에서 도시된 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, LFR1은 서열번호:24에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR2는 서열번호:25에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR3은 서열번호:26에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR4는 서열번호:23에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고, HFR1은 서열번호:17에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR2는 서열번호:27에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR3은 서열번호:28에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 HFR4는 서열번호:29에서 도시된 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, LFR1은 서열번호:24에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR2는 서열번호:25에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR3은 서열번호:26에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR4는 서열번호:23에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고, HFR1은 서열번호:17에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR2는 서열번호:30에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR3은 서열번호:31에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 HFR4는 서열번호:32에서 도시된 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 조작된 항체는 표 5에서 도시된 중쇄 프레임워크 영역 및 경쇄 프레임워크 영역의 쌍으로 된 세트를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 조작된 항체는 가령, 항체 단편, 가령, Fd 단편, Fab 항체 단편, Fab' 단편, 및 F(ab')2 단편으로 구성된 그룹에서 선택된 항체 단편일 수 있다.
명세서에서 설명된 임의의 조작된 함체의 몇몇 실시양태에서, 경쇄 폴리펩티드 및 중쇄 폴리펩티드는 공유결합으로 서로 결합할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 조작된 항체는 보체 성분 단백질에 결합한다. 보체 성분 단백질은 C1q, C1r, C1s, C4, C4a, C4b, C3, C3a, C3b, C2, C2a, C2b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, 프로퍼딘(properdin), 보체 인자 D, 보체 인자 B, MBL, MASP1, MASP2, 및 MASP3으로 구성된 그룹에서 선택된 하나일 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 조작된 항체는 세포 표면 수용체, 가령, G 단백질 결합 수용체, 케모카인 수용체, 사이토카인 수용체, 또는 수용체 타이로신 키나아제에 결합한다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 (i) 본 명세서에서 설명된 임의의 폴리펩티드 (가령, 경쇄 폴리펩티드 또는 중쇄 폴리펩티드) 또는 (ii) 본 명세서에서 설명된 임의의 조작된 항체를 암호화하는 핵산의 특징을 이룬다. 또한 상기 핵산을 포함하는 벡터의 특징을 이룬다. 상기 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 추가로, 본 개시는 상기 핵산 또는 상기 벡터를 포함하는 세포의 특징을 이룬다. 또 다른 측면에서, 본 개시는 폴리펩티드 또는 조작된 항체를 생성하기 위한 방법의 특징을 이룬다. 상기 방법은 벡터 내에 포함된 핵산에 의해 암호화된 세포의 폴리펩티드 또는 조작된 항체에 의해 발현을 허용하는데 적합한 조건하에 벡터를 포함하는 전술한 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 폴리펩티드 또는 조작된 항체를 배양된 세포로부터 또는 상기 세포가 배양된 배지로부터 단리시키는 단계를 또한 포함한다. 또한 전술한 방법에 의해 생성된 단리된 폴리펩티드 또는 단리된 조작된 항체의 특징을 이룬다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 공여자 경쇄 가변 영역의 면역원성과 비교하여 인간에서 더 적은 면역성인 조작된 경쇄 항체 가변 영역을 발생시키기 위한 방법의 특징을 이룬다. 상기 방법은 (i) 서열번호:2 또는 서열번호:8에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 수용자 경쇄 항체 가변 영역 아미노산 서열 또는 (ii) 수용자 경쇄 항체 가변 영역 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 정보를 제공하는 단계; (iii) 최소 하나의 공여자 항체 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 또는 (iv) 공여자 항체 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 정보를 제공하는 단계; 수용자 경쇄 항체 가변 영역의 하나 이상의 CDR을 공여자 항체 경쇄 가변 영역으로부터 얻은 하나 이상의 CDR로 교체하고 그렇게 함으로써 공여자 항체 경쇄 가변 영역의 면역원성과 비교하여 인간에서 더 적은 면역성인 조작된 경쇄 가변 영역을 발생시키는 단계를 포함하는데, 단서 조항으로, 상기 조작된 경쇄 가변 영역은 서열번호:2 또는 서열번호:8에서 도시된 완전한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 포함하지 않는다. 상기 방법은 중쇄 항체 가변 영역, 또는 중쇄 항체 가변 영역을 암호화하는 핵산을 얻고, 이는 조작된 경쇄 항체 가변 영역과 상보적이며 그렇게 함으로써 조작된 항체를 발생시키는 단계를 포함할 수 있다.
전술한 방법의 몇몇 실시양태에서, 유도된 선택(guided selection)은 중쇄 항체 가변 영역을 얻는데 이용된다.
전술한 방법의 몇몇 실시양태에서, 중쇄 항체 가변 영역은 조작된 중쇄 항체 가변 영역이다.
전술한 방법의 몇몇 실시양태에서, 조작된 중쇄 항체 가변 영역의 발생은 (i) 서열번호:5 또는 서열번호:7에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 수용자 중쇄 항체 가변 영역 아미노산 서열 또는 (ii) 수용자 중쇄 항체 가변 영역 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 정보를 제공하는 단계; (iii) 최소 하나의 공여자 항체 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 또는 (iv) 공여자 항체 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 정보를 제공하는 단계; 수용자 중쇄 항체 가변 영역의 하나 이상의 CDR을 공여자 항체 중쇄 가변 영역으로부터 얻은 하나 이상의 CDR로 교체하고 그렇게 함으로써 공여자 항체 중쇄 가변 영역의 면역원성과 비교하여 인간에서 더 적은 면역성인 조작된 중쇄 가변 영역을 발생시키는 단계를 포함하는데, 단서 조항으로, 상기 조작된 중쇄 가변 영역은 서열번호:5 또는 서열번호:7에서 도시된 완전한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드를 포함하지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 공여자 항체 중쇄 가변 영역의 면역원성과 비교하여 인간에서 더 적은 면역성인 조작된 중쇄 항체 가변 영역을 발생시키기 위한 방법의 특징을 이룬다. 상기 방법은 (i) 서열번호:5 또는 서열번호:7에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 수용자 중쇄 항체 가변 영역 또는 (ii) 수용자 중쇄 항체 가변 영역 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 제공하는 단계; (iii) 최소 하나의 공여자 항체 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 또는 (iv) 공여자 항체 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 정보를 제공하는 단계; 수용자 중쇄 항체 가변 영역의 하나 이상의 CDR을 공여자 항체 중쇄 가변 영역으로부터 얻은 하나 이상의 CDR로 교체하고 그렇게 함으로써 공여자 항체 중쇄 가변 영역의 면역원성과 비교하여 인간에서 더 적은 면역성인 조작된 중쇄 가변 영역을 발생시키는 단계를 포함하는데, 단서 조항으로, 상기 조작된 중쇄 가변 영역은 서열번호:5 또는 서열번호:7에서 도시된 완전한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드 가변 영역을 포함하지 않는다. 상기 방법은 조작된 중쇄 항체 가변 영역과 상보적인 경쇄 항체 가변 영역을 얻고 그렇게 함으로써 조작된 항체를 발생시키는 단계를 포함할 수 있다.
전술한 방법의 몇몇 실시양태에서, 유도된 선택은 조작된 경쇄 항체 가변 영역을 얻는데 이용된다.
전술한 방법의 몇몇 실시양태에서, 경쇄 항체 가변 영역은 조작된 경쇄 항체 가변 영역이다.
전술한 방법의 몇몇 실시양태에서, 조작된 경쇄 항체 가변 영역의 발생은 (i) 서열번호: 2 또는 서열번호:8에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 수용자 경쇄 항체 가변 영역 아미노산 서열 또는 (ii) 수용자 경쇄 항체 가변 영역 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 정보를 제공하는 단계; (iii) 최소 하나의 공여자 항체 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 또는 (iv) 공여자 항체 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 정보를 제공하는 단계; 수용자 경쇄 항체 가변 영역의 하나 이상의 CDR을 공여자 항체 경쇄 가변 영역으로부터 얻은 하나 이상의 CDR로 교체하고 그렇게 함으로써 공여자 항체 경쇄 가변 영역의 면역원성과 비교하여 인간에서 더 적은 면역성인 조작된 경쇄 가변 영역을 발생시키는 단계를 포함하는데, 단서 조항으로, 상기 조작된 경쇄 가변 영역은 서열번호:2 또는 서열번호:8에서 도시된 완전한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 포함하지 않는다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 조작된 항체 경쇄 가변 영역 및/또는 조작된 항체 중쇄 가변 영역 (경쇄 및 중쇄 가변 영역은, 몇몇 실시양태에서, 본 명세서에서 설명된 바와 같은 불변 영역을 포함할 수 있다)를 생성하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 조작된 항체 경쇄 가변 영역은 세포에서 또는 무세포계(cell-free system)을 이용하여 생성된다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 조작된 항체 경쇄 가변 영역 및/또는 조작된 중쇄 가변 영역을 세포 또는 상기 세포가 배양된 배지로부터 단리시키는 단계를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 조작된 항체를 생성하는 단계를 포함한다. 조작된 항체는 세포에서 또는 무세포계를 이용하여 생성될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 조작된 항체를 세포 또는 상기 세포가 배양된 배지로부터 단리시키는 단계를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 조작된 항체가 공여자 항체에 결합하는 항원과 동일한 항원에 결합하는지 안하는지 확인하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 조작된 항체는 표적 항원에 대한 공여자 항체의 친화성과 비교하여 상기 표적 항원에 대해 더 큰 친화성을 가질 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 조작된 항체가 인간에게 투여된 후 조작된 항체에 결합하는 항체를 생성하는지 안하는지 결정하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 조작된 항체를 재형성하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 재형성은 프레임워크 영역의 최소 하나의 아미노산을 치환하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 프레임워크 영역의 최소 두개의 아미노산을 치환하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 재형성은 최소 두개의 상이한 프레임워크 영역내 최소 하나의 아미노산을 치환하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 재형성은 프레임워크 영역내 하나 이상의 아미노산을 치환하는 단계를 포함하지 않는다.
몇몇 실시양태에서, 재형성은 최소 하나의 CDR의 최소 하나의 아미노산 위치를 치환하는 단계를 포함한다, 재형성은, 몇몇 실시양태에서, 최소 하나의 CDR의 최소 두개의 아미노산을 치환하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 재형성은 CDR의 최소 하나의 아미노산 위치를 치환하는 단계를 포함하며, 여기서 CDR은 카밧(Kabat) 또는 결합된 카밧(Kabat)-초티아(Chothia) 정의에 따라서 정의된다.
몇몇 실시양태에서, 재형성은 중쇄 가변 영역의 위치 28 및 30 중 하나 또는 둘 모두(카밧(Kabat) 넘버링(numbering)에 따라서)에서 아미노산을 치환하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 재형성은 최소 두개의 상이한 CDR내 최소 하나의 아미노산을 치환하는 단계를 포함한다. 재형성은 중쇄 가변 영역의 위치 27, 28, 30, 71, 또는 78 (카밧(Kabat) 넘버링에 따라서)에서 최소 하나의 아미노산을 치환하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 재형성은 조작된 항체의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 중 하나 또는 둘 모두 내로 최소 하나의 스페이서(spacer) 아미노산 서열을 도입하는 단계를 포함한다.
전술한 방법의 몇몇 실시양태에서, 프레임워크 또는 CDR의 하나 이상의 아미노산은 교체에 앞서 치환된다. 몇몇 실시양태에서, 프레임워크 또는 CDR의 하나 이상의 아미노산은 교체 후 치환된다.
몇몇 실시양태에서, 수용자 항체 경쇄 가변 영역 본 명세서에서 설명된 임의의 경쇄 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 수용자 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 본 명세서에서 설명된 임의의 중쇄 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다. 전술한 방법의 몇몇 실시양태에서, 수용자 항체 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 본 명세서에서 설명된 임의의 경쇄 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하고 수용자 항체 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 본 명세서에서 설명된 임의의 중쇄 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시는 (i) 경쇄 폴리펩티드 및 (ii) 중쇄 폴리펩티드를 포함한 조작된 항체의 특징을 이루며, 여기서 경쇄 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열 조각을 순서대로 포함한다: LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4. 몇몇 실시양태에서, LFR1은 서열번호:9에서 도시된 아미노산 서열을 포함하지만, 0 내지 3개의 아미노산 치환을 갖고; LFR2는 서열번호:10 또는 서열번호:18에서 도시된 아미노산 서열을 포함하지만, 0 내지 3개의 아미노산 치환을 갖고; LFR3은 서열번호:11에서 도시된 아미노산 서열을 포함하지만, 0 내지 3개의 아미노산 치환을 갖고; 및 LFR4는 서열번호:12에서 도시된 아미노산 서열을 포함하지만, 0 내지 3개의 아미노산 치환을 갖고; LCDR1은 공여자 항체로부터 얻은 경쇄 CDR1의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 공여자 항체로부터 얻은 경쇄 CDR2의 아미노산 서열을 포함하고, 및 LCDR3은 공여자 항체로부터 얻은 경쇄 CDR3의 아미노산 서열을 포함한다. 경쇄 폴리펩티드는 서열번호:2 또는 서열번호:8에서 도시된 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 중쇄 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열 조각을 순서대로 포함하고: HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4, 여기서 HFR1은 서열번호:13, 17, 또는 19에서 도시된 아미노산 서열을 포함하지만, 0 내지 3개의 아미노산 치환을 갖고; HFR2는 서열번호:14에서 도시된 아미노산 서열을 포함하지만, 0 내지 3개의 아미노산 치환을 갖고; HFR3은 서열번호:15에서 도시된 아미노산 서열을 포함하지만, 0 내지 3개의 아미노산 치환을 갖고; 및 HFR4는 서열번호:16에서 도시된 아미노산 서열을 포함하지만, 0 내지 3개의 아미노산 치환을 갖고, 여기서 HCDR1은 공여자 항체로부터 얻은 중쇄 CDR1의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 공여자 항체로부터 얻은 중쇄 CDR1의 아미노산 서열을 포함하고, 및 HCDR3은 공여자 항체로부터 얻은 중쇄 CDR1의 아미노산 서열을 포함한다. 중쇄 폴리펩티드는 서열번호:5 또는 서열번호:7에서 도시된 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 조작된 항체는 공여자 항체 또는 항체들과 비교하여 인간에서 더 적은 면역원성이고 상기 조작된 항체는 공여자 항체 또는 항체들에 결합하는 항원과 동일한 항원에 결합한다.
몇몇 실시양태에서, 다음 중 하나 또는 둘 모두를 특징으로 한다: (a) LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 단일 공여자 항체에서 얻고; 및 (b) HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 단일 공여자 항체에서 얻는다. 몇몇 실시양태에서, 모든 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR은 상기 동일한 공여자 항체로부터 얻는다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 이용된 모든 기술 및 과학적 용어는 본 개시와 관련있는 당업계에서 숙련자에게 일반적으로 이해되는 바와 같은 동등한 의미를 갖는다. 상충의 경우, 본 문서는 정의를 포함하여, 조절될 것이다. 본 명세서에서 설명된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 자료가 현재 개시된 방법 및 조성물의 실시 또는 검사에 또한 이용될 수 있을지라도, 바람직한 방법 및 자료가 하기 설명된다. 모든 공개 공보, 특허 출원, 특허, 및 본 명세서에서 언급된 다른 참조는 이들의 전체에서 참조로서 편입된다.
본 개시의 다른 특징 및 이점, 가령, 인간에서 감소된 면역원성을 갖는 치료용 항체를 발생시키기 위한 방법은 다음의 설명, 실시예, 및 청구항으로부터 분명해질 것이다.
상세한 설명
본 개시는 조작된 항체를 파생시켰던 공여자 항체 각각의 면역원성을 비교하여 인간에서 더 적은 면역원성을 나타내는 조작된 항체를 제공한다. 어떠한 방식으로도 제한될 의도 없이, 예시적인 조성물, 그리고 이들의 제조 및 이용을 위한 방법이 하기 상술된다.
조작된 항체
본 명세서에서 이용된 바와 같이, "조작된 항체"는 수용자 항체 스캐폴드의 가변 영역 상에 이식된 공여자 항체의 하나 이상(가령, 2, 3, 4, 5, 또는 6개) CDR을 포함하는 항체이며, 여기서 조작된 항체는 인간에서의 공여자 항체의 면역원성과 비교하여 인간에서 더 적은 면역원성을 갖는다. 조작된 항체의 구조는 다음과 같다.
조작된 항체는 다음의 아미노산 서열 조각을 순서대로 포함하는: LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4 또는 이로 구성된 서열을 갖는 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. LFR1은 경쇄 가변 영역의 프레임워크 1 (FR1)의 아미노산 서열과 상응하고; LFR2는 경쇄 가변 영역의 프레임워크 2 (FR2)의 아미노산 서열과 상응하고; LFR3은 경쇄 가변 영역의 프레임워크 3 (FR3)의 아미노산 서열과 상응하고; 및 LFR4는 경쇄 가변 영역의 프레임워크 4 (FR4)의 아미노산 서열과 상응한다. LCDR1은 경쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역 1 (CDR1)의 아미노산 서열과 상응하고; LCDR2는 경쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역 2 (CDR2)의 아미노산 서열과 상응하고; 및 LCDR3은 경쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역 3 (CDR3)의 아미노산 서열과 상응한다. 조작된 항체의 LFR1, LFR2, LFR3, 및 LFR4 아미노산 서열 중 하나 이상(가령, 1, 2, 3, 또는 4개 모두)은 수용자 항체에 의해 부여된다. 몇몇 실시양태에서, 단지 LFR1, LFR2, 또는 LFR3만이 수용자 항체에 의해 부여된다. 몇몇 실시양태에서, LFR1 및 LFR2는 수용자 항체에 의해 부여된다. 몇몇 실시양태에서, LFR2 및 LFR3은 수용자 항체에 의해 부여된다. 몇몇 실시양태에서, LFR1 및 LFR3은 수용자 항체에 의해 부여된다. 몇몇 실시양태에서, LFR4는 수용자 항체에 의해 부여되지 않는다. LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 아미노산 서열 중 하나 이상(가령, 1, 2, 또는 3개)은 최소 하나의 공여자 항체로부터 부여된다. 예를 들어, 경쇄 CDR은 단일 공여자 항체로부터 얻을 수 있고, 또는 몇몇 실시양태에서, CDR은 두개 이상의 상이한 공여자 항체(가령, 동일한 항원에 결합하지만, 상이한 경쇄 CDR 서열을 갖는 두개의 항체)로부터 얻을 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 하나 이상(가령, 1, 2, 또는 심지어 3개 모두)의 LCDR은 수용자 항체로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어, 조작된 항체는 공여자 항체로부터 얻은 LCDR3 및 수용자 항체로부터 얻은 LCDR1 및 LCDR2를 가질 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 조작된 항체는 공여자 항체로부터 얻은 LCDR2 및 수용자 항체로부터 얻은 LCDR1 및 LCDR3을 가질 수 있다. 적합한 수용자 항체 및 공여자 항체는 본 명세서에서 상술된다.
CDR 및 프레임워크 영역의 정확한 경계는 상이한 방법에 따라서 상이하게 정의되었다. 몇몇 실시양태에서, 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인 내에 CDR 또는 프레임워크 영역의 위치는 Kabat et al. [(1991) "Sequences of Proteins of Immunological Interest." NIH 공개 공보 제 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda, MD]에 의해 정의된 바와 같을 수 있다. 이러한 경우, CDR은 "카밧(Kabat) CDR" (가령, "카밧(Kabat) LCDR2" 또는 "카밧(Kabat) HCDR1")으로서 언급될 수 있고 그리고 프레임워크 영역은 "카밧(Kabat) 프레임워크 영역" (가령, "카밧(Kabat) LFR1" 또는 "카밧(Kabat) HFR3")으로서 언급될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 CDR 또는 프레임워크 위치의 위치는 Chothia et al. (1989) Nature 342:877-883에 의해 정의된 바와 같을 수 있다. 따라서, 이들 영역은 각각, "초티아(Chothia) CDR" (가령, "초티아(Chothia) LCDR2" 또는 "초티아(Chothia) HCDR3") 또는 "초티아(Chothia) 프레임워크 영역" (가령, "초티아(Chothia) LFR1" 또는 "초티아(Chothia) LFR3")으로서 언급될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 CDR 또는 프레임워크 영역의 위치는 카밧(Kabat)-초티아(Chothia) 결합된 정의에 의해 정의된 바와 같을 수 있다. 이러한 실시양태에서, 이들 영역은 각각, "결합된 카밧(Kabat)-초티아(Chothia) CDR" 또는 "결합된 카밧(Kabat)-초티아(Chothia) 프레임워크 영역"으로서 언급될 수 있다. Thomas et al. [(1996) Mol Immunol 33(17/18):1389-1401]은 카밧(Kabat) 및 초티아(Chothia) 정의에 따라서 CDR 및 프레임워크 영역 경계의 식별을 예시화한다. CDR 및 프레임워크의 식별은 전술한 3가지 정의의 각각을 이용하여 도 1 및 2에서 또한 보여준다.
몇몇 실시양태에서, 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인을 갖는 CDR 및/또는 프레임워크 영역의 위치는 Honnegger 및 Pluckthun [(2001) J Mol Biol 309: 657-670]에 의해 정의된 바와 같을 수 있다.
본 명세서에서 설명되고 작업 실시예에서 예시화된 바와 같이, 에쿨리주맙의 경쇄 가변 영역은 I.23 Ig 카파(kappa) 경쇄 분자의 프레임워크 영역 스캐폴드 상에 쥐과 항-C5 항체의 LCDR을 이식함으로써 발생되었다. 에쿨리주맙의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 다음과 같다: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCGASENIYGALNWYQQKPGKAPKLLIYGATNLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQNVLNTPLTFGQGTKVEIK (서열번호:2). I.23의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 다음과 같다: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQRKPGKAPK
LLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYNTPWTFGQGTKVEIK (서열번호:8). 에쿨리주맙의 LFR2 아미노산 서열은 하나의 아미노산: 아르기닌 대신 위치 38에서의 글루타민에 의해 상응하는 I.23 LFR2의 아미노산 서열과 상이하다.
임의의 특정 이론 또는 수행의 메카니즘(mechanism)에 제한됨 없이, 에쿨리주맙 또는 I.23 중 하나로부터 경쇄 프레임워크 영역 서열 (즉, LFR1, LFR2, LFR3, 및/또는 LFR4)은 공여자 항체의 면역원성 수준과 비교하여 인간에서 감소된 수준의 면역원성을 나타내는 조작된 항체의 제조에 유용할 것으로 여겨진다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, LFR1, LFR2, LFR3, 및/또는 LFR4는 에쿨리주맙 및/또는 I.23으로부터 파생된 상응하는 경쇄 프레임워크 영역일 수 있다. 에쿨리주맙 및 I.23 경쇄 프레임워크 영역에 대한 아미노산 서열은 카밧(Kabat), 초티아(Chothia), 또는 카밧(Kabat)-초티아(Chothia)에 의해 정의된 바와 같이, 표 1에서 제시된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
따라서, 몇몇 실시양태에서, 조작된 항체의 경쇄 폴리펩티드는 서열번호:9에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 LFR1 요소; 서열번호:10에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 LFR2 요소; 서열번호:11에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 LFR3 요소; 및 서열번호:12에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 LFR4 요소를 포함하거나, 또는 이들로 구성된다.
몇몇 실시양태에서, 조작된 항체의 경쇄 폴리펩티드는 서열번호:9에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 LFR1 요소; 서열번호:18에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 LFR2 요소; 서열번호:11에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 LFR3 요소; 및 서열번호:12에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 LFR4 요소를 포함하거나, 또는 이들로 구성된다.
몇몇 실시양태에서, 조작된 항체의 경쇄 폴리펩티드는 서열번호:20에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 LFR1 요소; 서열번호:21에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 LFR2 요소; 서열번호:22에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 LFR3 요소; 및 서열번호:23에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 LFR4 요소를 포함하거나, 또는 이들로 구성된다.
몇몇 실시양태에서, 조작된 항체의 경쇄 폴리펩티드는 서열번호:24에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 LFR1 요소; 서열번호:25에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 LFR2 요소; 서열번호:26에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 LFR3 요소; 및 서열번호:23에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 LFR4 요소를 포함하거나, 또는 이들로 구성된다.
몇몇 실시양태에서, 경쇄 폴리펩티드는 서열번호:2 또는 서열번호:8에서 도시된 아미노산 서열을 포함하지 않거나 또는 이로 구성되지 않는다.
경쇄 폴리펩티드는 불변 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 경쇄 불변 영역은 λ 경쇄 폴리펩티드 불변 영역 또는 κ 경쇄 불변 영역일 수 있다. 다수의 인간 λ 및 κ 경쇄 불변 영역에 대한 아미노산 서열은 당업계에서 알려져 있고 그리고 가령, Kabat et al. (1991); supra에서 설명된다. 조작된 항체의 경쇄 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다: RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열번호:3). 서열번호:3은 에쿨리주맙의 경쇄 불변 영역이다.
조작된 항체는 다음의 아미노산 서열 조각을 순서대로 포함하는: HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4 또는 이로 구성된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. HFR1은 중쇄 가변 영역의 프레임워크 1 (FR1)의 아미노산 서열과 상응하고; HFR2는 중쇄 가변 영역의 프레임워크 2 (FR2)의 아미노산 서열과 상응하고; HFR3은 중쇄 가변 영역의 프레임워크 3 (FR3)의 아미노산 서열과 상응하고; 및 HFR4는 중쇄 가변 영역의 프레임워크 4 (FR4)의 아미노산 서열과 상응한다. HCDR1은 중쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역 1 (CDR1)의 아미노산 서열에 상응하고; HCDR2는 중쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역 2 (CDR2)의 아미노산 서열에 상응하고; 및 HCDR3은 중쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역 3 (CDR)의 아미노산 서열에 상응한다. HFR1, HFR2, HFR3, 및 HFR4 아미노산 서열은 수용자 항체로부터 부여되고, 반면에 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 아미노산 서열은 최소 하나(가령, 1, 2, 또는 3개)의 공여자 항체로부터 부여될 수 있다. 예를 들어, 중쇄 CDR은 단일 공여자 항체로부터 얻을 수 있고 또는, 몇몇 실시양태에서, CDR은 두개 이상의 상이한 공여자 항체(가령, 공여자 항체에 결합하는 항원과 동일한 항원에 결합하지만, 상이한 중쇄 CDR 서열을 갖는 두개의 항체)로부터 얻을 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 최소 하나의 HCDR은 수용자 항체로부터 보유 (또는 부여)된다. 예를 들어, HCDR3은 공여자 항체 (가령, HCDR3이 공여자 항체에 결합하는 항원에 대한 최대 결합 에너지를 공여자 항체에 부여하는 것으로 확인된 경우)로부터 얻을 수 있고 HCDR1 및 HCDR2는 수용자 항체로부터 보유될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 단일 공여자 항체로부터 각각 부여된다. 적합한 수용자 항체 및 공여자 항체는 본 명세서에서 상술된다.
본 명세서에서 설명되고 작업 실시예에서 예시화된 바와 같이, 에쿨리주맙의 중쇄 가변 영역은 H20C3 Ig 분자의 중쇄 프레임워크 영역 스캐폴드 상에 쥐과 항-C5 항체의 HCDR을 이식함으로써 발생되었다. 에쿨리주맙의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 다음과 같다: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFSNYWIQWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTEYTENFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARYFFGSSPNWYFDVWGQGTLVTVSS (서열번호:5). H20C3의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 다음과 같다: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARAPHQRTRIAARPGEGDSWGQGTLVTVSS (서열번호:7). 카밧(Kabat)에 의해 정의된 바와 같이, 에쿨리주맙의 HFR1의 아미노산 서열은 두개의 아미노산에 의해 H20C3의 HFR1의 상응하는 아미노산 서열과 상이하다. 구체적으로, H20C3 VH 영역 (카밧(Kabat) FR1)의 위치 28에서의 트레오닌 및 위치 30에서의 트레오닌은 에쿨리주맙 카밧(Kabat) FR1 서열에서 각각 이소류신 및 세린이다. 남아있는 프레임워크 영역 (HFR2, HFR3, 및 HFR4)은 카밧(Kabat) 정의 하에 에쿨리주맙 및 H20C3 사이에서 동일하다. 결합된 카밧(Kabat)-초티아(Chothia) 정의하에, 임의의 프레임워크 영역에 대해 에쿨리주맙의 아미노산 서열 및 H20C3의 아미노산 서열 사이에 차이가 없다 (도 2를 참고.).
임의의 특정 이론 또는 수행의 메카니즘(mechanism)에 제한됨 없이, 에쿨리주맙 또는 H20C3 중 하나로부터 중쇄 프레임워크 영역 서열은 공여자 항체의 면역원성 수준과 비교하여 인간에서 감소된 수준의 면역원성을 나타내는 조작된 항체의 제조에 유용할 것으로 여겨진다. 따라서, 몇몇 실시양태에서 HFR1, HFR2, HFR3, 및/또는 HFR4는 에쿨리주맙 및/또는 H20C3으로부터 파생된 상응하는 중쇄 프레임워크 영역일 수 있다. 에쿨리주맙 및 H20C3 중쇄 프레임워크 영역에 대한 아미노산 서열은 카밧(Kabat), 초티아(Chothia), 또는 카밧(Kabat)-초티아(Chothia)에 의해 정의된 바와 같이, 표 2에서 제시된다.
Figure pct00003
Figure pct00004
따라서, 몇몇 실시양태에서, 조작된 항체의 HFR1은 가령, 서열번호:13, 17, 또는 19에서 도시된 아미노산 서열이거나 또는 이를 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 조작된 항체의 HFR2는 가령, 서열번호:14에서 도시된 아미노산 서열이거나 또는 이를 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 조작된 항체의 HFR3은 서열번호:15에서 도시된 아미노산 서열이거나 또는 이를 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 조작된 항체의 HFR4는 서열번호:16에서 도시된 아미노산 서열이거나 또는 이를 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 조작된 항체의 중쇄 폴리펩티드는 서열번호:13에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 HFR1 요소; 서열번호:14에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 HFR2 요소; 서열번호:15에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 HFR3 요소; 및 서열번호:16에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 HFR4 요소를 포함하거나, 또는 이들로 구성된다.
몇몇 실시양태에서, 조작된 항체의 중쇄 폴리펩티드는 서열번호:19에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 HFR1 요소; 서열번호:14에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 HFR2 요소; 서열번호:15에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 HFR3 요소; 및 서열번호:16에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 HFR4 요소를 포함하거나, 또는 이들로 구성된다.
몇몇 실시양태에서, 조작된 항체의 중쇄 폴리펩티드는 서열번호:17에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 HFR1 요소; 서열번호:14에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 HFR2 요소; 서열번호:15에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 HFR3 요소; 및 서열번호:16에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 HFR4 요소를 포함하거나, 또는 이들로 구성된다.
몇몇 실시양태에서, 조작된 항체의 중쇄 폴리펩티드는 서열번호:17에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 HFR1 요소; 서열번호:27에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 HFR2 요소; 서열번호:28에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 HFR3 요소; 및 서열번호:29에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 HFR4 요소를 포함하거나, 또는 이들로 구성된다.
몇몇 실시양태에서, 조작된 항체의 중쇄 폴리펩티드는 서열번호:17에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 HFR1 요소; 서열번호:30에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 HFR2 요소; 서열번호:31에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 HFR3 요소; 및 서열번호:32에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 HFR4 요소를 포함하거나, 또는 이들로 구성된다.
몇몇 실시양태에서, 중쇄 폴리펩티드는 서열번호:5 또는 서열번호:7에서 도시된 아미노산 서열을 포함하지 않거나 또는 이로 구성되지 않는다.
중쇄 폴리펩티드는 불변 영역(가령, 중쇄 불변 영역 1 (CH1), 중쇄 불변 영역 2 (CH2), 중쇄 불변 영역 3 (CH3), 중쇄 불변 영역 4 (CH4), 또는 전술한 것의 임의의 조합)를 포함할 수 있다. 중쇄 폴리펩티드는 면역글로불린 분자의 Fc 일부를 포함할 수 있다. Fc 영역은 가령, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, 또는 IgD 면역글로불린 분자 또는 이들 일부 각각의 조합으로부터의 Fc 영역일 수 있다. 다수의 인간 중쇄 불변 영역에 대한 아미노산 서열은 당업계에서 알려져 있고 그리고 가령, Kabat et al. (1991), supra에서 설명된다.
몇몇 실시양태에서, 중쇄 폴리펩티드는 G2/G4 혼성체 불변 영역과 같은, 혼성체(hybrid) 불변 영역, 또는 이의 일부를 포함할 수 있다 (가령, Burton et al. (1992) Adv Immun. 51:1-18; Canfield et al. (1991) J Exp Med 173:1483-1491; 및 Mueller et al. (1997) Mol . Immunol. 34(6):441-452를 참고). 예를 들어, (및 카밧(Kabat) 넘버링에 따라서) IgGl 및 IgG4 불변 영역은 G249G250 잔기를 포함하고 반면에 IgG2 불변 영역은 잔기 249를 포함하지 않지만, G250은 포함한다. 249-250 영역이 G2서열에서부터 비롯한 G2/G4 혼성체 불변 영역에서, 불변 영역은 G249/G250을 갖는 G2/G4 융합을 생성하기 위한 위치 249에서 글라이신 잔기를 도입하기 위해 추가로 변경될 수 있다. G249/G250을 포함하는 다른 불변 도메인 혼성체는 또한 본 개시에 따라서 조작된 항체의 일부일 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 중쇄 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열을 포함하는, 또는 이로 구성된 불변 영역을 포함한다: ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(서열번호:6). 서열번호:6은 에쿨리주맙의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 도시한다.
본 명세서에서 설명된 조작된 항체는, 몇몇 실시양태에서, 경쇄 프레임워크 영역 및 중쇄 프레임워크 영역의 특정 예시적인 쌍을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 설명된 조작된 항체는 에쿨리주맙으로부터 파생된 "카밧(Kabat)" 경쇄 프레임워크 영역을 포함하는 경쇄 폴리펩티드 및 에쿨리주맙으로부터 파생된 "카밧(Kabat)" 중쇄 프레임워크 영역을 포함하는 중쇄 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 명세서에서 설명된 조작된 항체는 I.23 경쇄로부터 파생된 "카밧(Kabat)-초티아(Chothia)" 경쇄 프레임워크 영역을 포함하는 경쇄 폴리펩티드 및 H20C3 중쇄로부터 파생된 "카밧(Kabat)-초티아(Chothia)" 중쇄 프레임워크 영역을 포함하는 중쇄 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 명세서에서 설명된 조작된 항체는 I.23 경쇄로부터 파생된 "카밧(Kabat)" 경쇄 프레임워크 영역을 포함하는 경쇄 폴리펩티드 및 에쿨리주맙으로부터 파생된 "카밧(Kabat)" 중쇄 프레임워크 영역을 포함하는 중쇄 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 조작된 항체의 제조에 이용하기 위해, 카밧(Kabat) 또는 카밧(Kabat)-초티아(Chothia) 결합된 정의하에 정의되는 영역인, 경쇄 및 중쇄 프레임워크 영역의 예시적인 쌍은 표 3에서 제시된다.
예시적인 중쇄 및 경쇄 프레임워크 영역 쌍.
쌍 조합:
중쇄 / 경쇄
프레임워크 영역 정의
카밧( Kabat ) 카밧 ( Kabat )-초티아( Chothia )
경쇄 서열 중쇄 서열 경쇄 서열 중쇄 서열
Ecu 경쇄/ Ecu 중쇄 FR1 서열번호: 9 서열번호: 13 서열번호: 9 서열번호: 17
FR2 서열번호: 10 서열번호: 14 서열번호: 10 서열번호: 14
FR3 서열번호: 11 서열번호: 15 서열번호: 11 서열번호: 15
FR4 서열번호: 12 서열번호: 16 서열번호: 12 서열번호: 16
I.23 경쇄/ H20C3 중쇄 FR1 서열번호: 9 서열번호: 19 서열번호: 9 서열번호: 17
FR2 서열번호: 18 서열번호: 14 서열번호: 18 서열번호: 14
FR3 서열번호: 11 서열번호: 15 서열번호: 11 서열번호: 15
FR4 서열번호: 12 서열번호: 16 서열번호: 12 서열번호: 16
I.23 경쇄/ Ecu 중쇄 FR1 서열번호: 9 서열번호: 13 서열번호: 9 서열번호: 17
FR2 서열번호: 18 서열번호: 14 서열번호: 18 서열번호: 14
FR3 서열번호: 11 서열번호: 15 서열번호: 11 서열번호: 15
FR4 서열번호: 12 서열번호: 16 서열번호: 12 서열번호: 16
Ecu 경쇄/ H20C3 중쇄 FR1 서열번호: 9 서열번호: 19 서열번호: 9 서열번호: 17
FR2 서열번호: 10 서열번호: 14 서열번호: 10 서열번호: 14
FR3 서열번호: 11 서열번호: 15 서열번호: 11 서열번호: 15
FR4 서열번호: 12 서열번호: 16 서열번호: 12 서열번호: 16
* 표 3에서 인용된 "서열번호(SEQ ID)"은 "서열번호(SEQ ID NO.)"를 의미한다.
조작된 항체의 제조에 이용하기 위해, 초티아(Chothia) 하에 정의되는 영역인, 경쇄 및 중쇄 프레임워크 영역의 예시적인 쌍은 표 4에서 제시된다.
예시적인 중쇄 및 경쇄 프레임워크 영역 쌍, 초티아 ( Chothia ) 방법 ( 파트 I)에 의해 정의되는 영역.
쌍 조합:
중쇄 / 경쇄
프레임워크 영역 경쇄 서열 중쇄 서열
Ecu 경쇄/ Ecu 중쇄 FR1 서열번호: 20 서열번호: 17
FR2 서열번호: 21 서열번호: 27
FR3 서열번호: 22 서열번호: 28
FR4 서열번호: 23 서열번호: 29
Ecu 경쇄/ H20C3 중쇄 FR1 서열번호: 20 서열번호: 17
FR2 서열번호: 21 서열번호: 30
FR3 서열번호: 22 서열번호: 31
FR4 서열번호: 23 서열번호: 32
I.23 경쇄/ Ecu 중쇄 FR1 서열번호: 24 서열번호: 17
FR2 서열번호: 25 서열번호: 27
FR3 서열번호: 26 서열번호: 28
FR4 서열번호: 23 서열번호: 29
I.23 경쇄/ H20C3 중쇄 FR1 서열번호: 24 서열번호: 17
FR2 서열번호: 25 서열번호: 30
FR3 서열번호: 26 서열번호: 31
FR4 서열번호: 23 서열번호: 32
조작된 항체의 제조에 이용하기 위해, 초티아(Chothia) 하에 정의되는 영역인, 경쇄 및 중쇄 프레임워크 영역의 추가적 예시적인 쌍은 표 5에서 제시된다.
예시적인 중쇄 및 경쇄 프레임워크 영역 쌍, 초티아 ( Chothia ) 방법 ( 파트 II)에 의해 정의되는 영역.
원천 서열
경쇄 중쇄 프레임워크 영역 경쇄 서열 중쇄 서열
Ecu Ecu* FR1 서열번호: 20 서열번호: 17
I.23 Ecu FR2 서열번호: 25 서열번호: 27
Ecu Ecu FR3 서열번호: 22 서열번호: 28
Ecu** Ecu FR4 서열번호: 23 서열번호: 29
Ecu Ecu* FR1 서열번호: 20 서열번호: 17
I.23 H20C3 FR2 서열번호: 25 서열번호: 30
Ecu H20C3 FR3 서열번호: 22 서열번호: 31
Ecu** H20C3 FR4 서열번호: 23 서열번호: 32
Ecu Ecu* FR1 서열번호: 20 서열번호: 17
I.23 H20C3 FR2 서열번호: 25 서열번호: 30
Ecu Ecu FR3 서열번호: 22 서열번호: 28
Ecu** Ecu FR4 서열번호: 23 서열번호: 29
Ecu Ecu* FR1 서열번호: 20 서열번호: 17
I.23 Ecu FR2 서열번호: 25 서열번호: 27
Ecu H20C3 FR3 서열번호: 22 서열번호: 31
Ecu** Ecu FR4 서열번호: 23 서열번호: 29
Ecu Ecu* FR1 서열번호: 20 서열번호: 17
I.23 Ecu FR2 서열번호: 25 서열번호: 27
Ecu Ecu FR3 서열번호: 22 서열번호: 28
Ecu** H20C3 FR4 서열번호: 23 서열번호: 32
Ecu Ecu* FR1 서열번호: 20 서열번호: 17
I.23 H20C3 FR2 서열번호: 25 서열번호: 30
Ecu Ecu FR3 서열번호: 22 서열번호: 28
Ecu** H20C3 FR4 서열번호: 23 서열번호: 32
Ecu Ecu* FR1 서열번호: 20 서열번호: 17
I.23 H20C3 FR2 서열번호: 25 서열번호: 30
Ecu H20C3 FR3 서열번호: 22 서열번호: 31
Ecu** Ecu FR4 서열번호: 23 서열번호: 29
Ecu Ecu* FR1 서열번호: 20 서열번호: 17
I.23 Ecu FR2 서열번호: 25 서열번호: 27
Ecu H20C3 FR3 서열번호: 22 서열번호: 31
Ecu** H20C3 FR4 서열번호: 23 서열번호: 32
Ecu Ecu* FR1 서열번호: 20 서열번호: 17
Ecu Ecu FR2 서열번호: 21 서열번호: 27
I.23 Ecu FR3 서열번호: 26 서열번호: 28
Ecu** Ecu FR4 서열번호: 23 서열번호: 29
Ecu Ecu* FR1 서열번호: 20 서열번호: 17
Ecu H20C3 FR2 서열번호: 21 서열번호: 30
I.23 H20C3 FR3 서열번호: 26 서열번호: 31
Ecu** H20C3 FR4 서열번호: 23 서열번호: 32
Ecu Ecu* FR1 서열번호: 20 서열번호: 17
Ecu H20C3 FR2 서열번호: 21 서열번호: 30
I.23 Ecu FR3 서열번호: 26 서열번호: 28
Ecu** Ecu FR4 서열번호: 23 서열번호: 29
Ecu Ecu* FR1 서열번호: 20 서열번호: 17
Ecu Ecu FR2 서열번호: 21 서열번호: 27
I.23 H20C3 FR3 서열번호: 26 서열번호: 31
Ecu** Ecu FR4 서열번호: 23 서열번호: 29
Ecu Ecu* FR1 서열번호: 20 서열번호: 17
Ecu Ecu FR2 서열번호: 21 서열번호: 27
I.23 Ecu FR3 서열번호: 26 서열번호: 28
Ecu** H20C3 FR4 서열번호: 23 서열번호: 32
Ecu Ecu* FR1 서열번호: 20 서열번호: 17
Ecu H20C3 FR2 서열번호: 21 서열번호: 30
I.23 Ecu FR3 서열번호: 26 서열번호: 28
Ecu** H20C3 FR4 서열번호: 23 서열번호: 32
Ecu Ecu* FR1 서열번호: 20 서열번호: 17
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I.23 H20C3 FR3 서열번호: 26 서열번호: 31
Ecu** Ecu FR4 서열번호: 23 서열번호: 29
Ecu Ecu* FR1 서열번호: 20 서열번호: 17
Ecu Ecu FR2 서열번호: 21 서열번호: 27
I.23 H20C3 FR3 서열번호: 26 서열번호: 31
Ecu** H20C3 FR4 서열번호: 23 서열번호: 32
I.23 Ecu* FR1 서열번호: 24 서열번호: 17
Ecu Ecu FR2 서열번호: 21 서열번호: 27
Ecu Ecu FR3 서열번호: 22 서열번호: 28
Ecu** Ecu FR4 서열번호: 23 서열번호: 29
I.23 Ecu* FR1 서열번호: 24 서열번호: 17
Ecu H20C3 FR2 서열번호: 21 서열번호: 30
Ecu H20C3 FR3 서열번호: 22 서열번호: 31
Ecu** H20C3 FR4 서열번호: 23 서열번호: 32
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Ecu H20C3 FR2 서열번호: 21 서열번호: 30
Ecu Ecu FR3 서열번호: 22 서열번호: 28
Ecu** Ecu FR4 서열번호: 23 서열번호: 29
I.23 Ecu* FR1 서열번호: 24 서열번호: 17
Ecu Ecu FR2 서열번호: 21 서열번호: 27
Ecu H20C3 FR3 서열번호: 22 서열번호: 31
Ecu** Ecu FR4 서열번호: 23 서열번호: 29
I.23 Ecu* FR1 서열번호: 24 서열번호: 17
Ecu Ecu FR2 서열번호: 21 서열번호: 27
Ecu Ecu FR3 서열번호: 22 서열번호: 28
Ecu** H20C3 FR4 서열번호: 23 서열번호: 32
I.23 Ecu* FR1 서열번호: 24 서열번호: 17
Ecu H20C3 FR2 서열번호: 21 서열번호: 30
Ecu Ecu FR3 서열번호: 22 서열번호: 28
Ecu** H20C3 FR4 서열번호: 23 서열번호: 32
I.23 Ecu* FR1 서열번호: 24 서열번호: 17
Ecu H20C3 FR2 서열번호: 21 서열번호: 30
Ecu H20C3 FR3 서열번호: 22 서열번호: 31
Ecu** Ecu FR4 서열번호: 23 서열번호: 29
I.23 Ecu* FR1 서열번호: 24 서열번호: 17
Ecu Ecu FR2 서열번호: 21 서열번호: 27
Ecu H20C3 FR3 서열번호: 22 서열번호: 31
Ecu** H20C3 FR4 서열번호: 23 서열번호: 32
I.23 Ecu* FR1 서열번호: 24 서열번호: 17
Ecu Ecu FR2 서열번호: 21 서열번호: 27
I.23 Ecu FR3 서열번호: 26 서열번호: 28
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Ecu H20C3 FR2 서열번호: 21 서열번호: 30
I.23 H20C3 FR3 서열번호: 26 서열번호: 31
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I.23 Ecu* FR1 서열번호: 24 서열번호: 17
Ecu Ecu FR2 서열번호: 21 서열번호: 27
I.23 H20C3 FR3 서열번호: 26 서열번호: 31
Ecu** Ecu FR4 서열번호: 23 서열번호: 29
I.23 Ecu* FR1 서열번호: 24 서열번호: 17
Ecu Ecu FR2 서열번호: 21 서열번호: 27
I.23 Ecu FR3 서열번호: 26 서열번호: 28
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Ecu H20C3 FR2 서열번호: 21 서열번호: 30
I.23 Ecu FR3 서열번호: 26 서열번호: 28
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Ecu** Ecu FR4 서열번호: 23 서열번호: 29
Ecu Ecu* FR1 서열번호: 20 서열번호: 17
I.23 H20C3 FR2 서열번호: 25 서열번호: 30
I.23 H20C3 FR3 서열번호: 26 서열번호: 31
Ecu** H20C3 FR4 서열번호: 23 서열번호: 32
Ecu Ecu* FR1 서열번호: 20 서열번호: 17
I.23 H20C3 FR2 서열번호: 25 서열번호: 30
I.23 Ecu FR3 서열번호: 26 서열번호: 28
Ecu** Ecu FR4 서열번호: 23 서열번호: 29
Ecu Ecu* FR1 서열번호: 20 서열번호: 17
I.23 Ecu FR2 서열번호: 25 서열번호: 27
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Ecu** Ecu FR4 서열번호: 23 서열번호: 29
Ecu Ecu* FR1 서열번호: 20 서열번호: 17
I.23 Ecu FR2 서열번호: 25 서열번호: 27
I.23 Ecu FR3 서열번호: 26 서열번호: 28
Ecu** H20C3 FR4 서열번호: 23 서열번호: 32
Ecu Ecu* FR1 서열번호: 20 서열번호: 17
I.23 H20C3 FR2 서열번호: 25 서열번호: 30
I.23 Ecu FR3 서열번호: 26 서열번호: 28
Ecu** H20C3 FR4 서열번호: 23 서열번호: 32
Ecu Ecu* FR1 서열번호: 20 서열번호: 17
I.23 H20C3 FR2 서열번호: 25 서열번호: 30
I.23 H20C3 FR3 서열번호: 26 서열번호: 31
Ecu** Ecu FR4 서열번호: 23 서열번호: 29
Ecu Ecu* FR1 서열번호: 20 서열번호: 17
I.23 Ecu FR2 서열번호: 25 서열번호: 27
I.23 H20C3 FR3 서열번호: 26 서열번호: 31
Ecu** H20C3 FR4 서열번호: 23 서열번호: 32
I.23 Ecu* FR1 서열번호: 24 서열번호: 17
I.23 Ecu FR2 서열번호: 25 서열번호: 27
Ecu Ecu FR3 서열번호: 22 서열번호: 28
Ecu** Ecu FR4 서열번호: 23 서열번호: 29
I.23 Ecu* FR1 서열번호: 24 서열번호: 17
I.23 H20C3 FR2 서열번호: 25 서열번호: 30
Ecu H20C3 FR3 서열번호: 22 서열번호: 31
Ecu** H20C3 FR4 서열번호: 23 서열번호: 32
I.23 Ecu* FR1 서열번호: 24 서열번호: 17
I.23 H20C3 FR2 서열번호: 25 서열번호: 30
Ecu Ecu FR3 서열번호: 22 서열번호: 28
Ecu** Ecu FR4 서열번호: 23 서열번호: 29
I.23 Ecu* FR1 서열번호: 24 서열번호: 17
I.23 Ecu FR2 서열번호: 25 서열번호: 27
Ecu H20C3 FR3 서열번호: 22 서열번호: 31
Ecu** Ecu FR4 서열번호: 23 서열번호: 29
I.23 Ecu* FR1 서열번호: 24 서열번호: 17
I.23 Ecu FR2 서열번호: 25 서열번호: 27
Ecu Ecu FR3 서열번호: 22 서열번호: 28
Ecu** H20C3 FR4 서열번호: 23 서열번호: 32
I.23 Ecu* FR1 서열번호: 24 서열번호: 17
I.23 H20C3 FR2 서열번호: 25 서열번호: 30
Ecu Ecu FR3 서열번호: 22 서열번호: 28
Ecu** H20C3 FR4 서열번호: 23 서열번호: 32
I.23 Ecu* FR1 서열번호: 24 서열번호: 17
I.23 H20C3 FR2 서열번호: 25 서열번호: 30
Ecu H20C3 FR3 서열번호: 22 서열번호: 31
Ecu** Ecu FR4 서열번호: 23 서열번호: 29
I.23 Ecu* FR1 서열번호: 24 서열번호: 17
I.23 Ecu FR2 서열번호: 25 서열번호: 27
Ecu H20C3 FR3 서열번호: 22 서열번호: 31
Ecu** H20C3 FR4 서열번호: 23 서열번호: 32
Ecu Ecu* FR1 서열번호: 20 서열번호: 17
Ecu H20C3 FR2 서열번호: 21 서열번호: 30
Ecu Ecu FR3 서열번호: 22 서열번호: 28
Ecu** Ecu FR4 서열번호: 23 서열번호: 29
Ecu Ecu* FR1 서열번호: 20 서열번호: 17
Ecu Ecu FR2 서열번호: 21 서열번호: 27
Ecu H20C3 FR3 서열번호: 22 서열번호: 31
Ecu** Ecu FR4 서열번호: 23 서열번호: 29
Ecu Ecu* FR1 서열번호: 20 서열번호: 17
Ecu Ecu FR2 서열번호: 21 서열번호: 27
Ecu Ecu FR3 서열번호: 22 서열번호: 28
Ecu** H20C3 FR4 서열번호: 23 서열번호: 32
Ecu Ecu* FR1 서열번호: 20 서열번호: 17
Ecu H20C3 FR2 서열번호: 21 서열번호: 30
Ecu Ecu FR3 서열번호: 22 서열번호: 28
Ecu** H20C3 FR4 서열번호: 23 서열번호: 32
Ecu Ecu* FR1 서열번호: 20 서열번호: 17
Ecu H20C3 FR2 서열번호: 21 서열번호: 30
Ecu H20C3 FR3 서열번호: 22 서열번호: 31
Ecu** Ecu FR4 서열번호: 23 서열번호: 29
Ecu Ecu* FR1 서열번호: 20 서열번호: 17
Ecu Ecu FR2 서열번호: 21 서열번호: 27
Ecu H20C3 FR3 서열번호: 22 서열번호: 31
Ecu** H20C3 FR4 서열번호: 23 서열번호: 32
I.23 Ecu* FR1 서열번호: 24 서열번호: 17
I.23 H20C3 FR2 서열번호: 25 서열번호: 30
I.23 Ecu FR3 서열번호: 26 서열번호: 28
Ecu** Ecu FR4 서열번호: 23 서열번호: 29
I.23 Ecu* FR1 서열번호: 24 서열번호: 17
I.23 Ecu FR2 서열번호: 25 서열번호: 27
I.23 H20C3 FR3 서열번호: 26 서열번호: 31
Ecu** Ecu FR4 서열번호: 23 서열번호: 29
I.23 Ecu* FR1 서열번호: 24 서열번호: 17
I.23 Ecu FR2 서열번호: 25 서열번호: 27
I.23 Ecu FR3 서열번호: 26 서열번호: 28
Ecu** H20C3 FR4 서열번호: 23 서열번호: 32
I.23 Ecu* FR1 서열번호: 24 서열번호: 17
I.23 H20C3 FR2 서열번호: 25 서열번호: 30
I.23 Ecu FR3 서열번호: 26 서열번호: 28
Ecu** H20C3 FR4 서열번호: 23 서열번호: 32
I.23 Ecu* FR1 서열번호: 24 서열번호: 17
I.23 H20C3 FR2 서열번호: 25 서열번호: 30
I.23 H20C3 FR3 서열번호: 26 서열번호: 31
Ecu** Ecu FR4 서열번호: 23 서열번호: 29
I.23 Ecu* FR1 서열번호: 24 서열번호: 17
I.23 Ecu FR2 서열번호: 25 서열번호: 27
I.23 H20C3 FR3 서열번호: 26 서열번호: 31
Ecu** H20C3 FR4 서열번호: 23 서열번호: 32
Ecu* 는 초티아(Chothia) 하에 정의된 바와 같은 에쿨리주맙 중쇄 폴리펩티드의 FR1 아미노산 서열 또는 초티아(Chothia) 하에 정의된 바와 같은 H20C3 중쇄 폴리펩티드의 FR1 아미노산 서열을 의미하며, 여기서 FR1 영역은 서로 동일하다.
Ecu**는 초티아(Chothia) 하에 정의된 바와 같은 에쿨리주맙 경쇄 폴리펩티드의 FR4 아미노산 서열 또는 초티아(Chothia) 하에 정의된 바와 같은 I.23 경쇄 폴리펩티드의 FR4 아미노산 서열을 의미하며, 여기서 FR4 영역은 서로 동일하다.
몇몇 실시양태에서, 상기 조작된 항체의 하나 이상(가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개, 또는 8개 모두)의 상기 프레임워크 영역은 하나 이상(가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개, 또는 10개 이상)의 아미노산 치환을 포함하기 위해 변형될 수 있다. 이들 하나 이상의 치환을 포함하는 조작된 항체는 때로는 "변이 조작된 항체(variant engineered antibody)"로서 언급된다. 가령, 조작된 항체가 항원에 대한 공여자 항체의 친화성과 비교하여 더 낮은 친화성을 갖는 공여자 항체에 의해 인식된 항원에 결합한다면, 이러한 치환이 도입될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 변이 조작된 항체의 하나 이상의 프레임워크 영역은 10개보다 적은 (가령, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개보다 적은) 치환을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 단지 하나의 프레임워크 영역은 아미노산 치환을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 프레임워크 영역은 아미노산 치환을 포함한다. 요구되는 모든 것은 결과로 얻은 조작된 항체가, 인간에게 투여될 때, 인간에서의 상응하는 공여자 항체보다 더 적은 면역성이어야 한다는 것이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 프레임워크 영역 아미노산 서열은 치환되지 않는다.
아미노산 서열은 보존적 치환 또는 비-보존적 치환일 수 있다. 보존적 치환은 다음 그룹 내에서 치환을 전형적으로 포함한다: 글라이신 및 알라닌; 발린, 이소류신 및 류신; 아스파르트산 및 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민, 세린 및 트레오닌; 라이신, 히스티딘 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 타이로신.
경쇄 및 중쇄 폴리펩티드의 아미노산 서열은 여러 가지 조각 사이(가령, 조작된 항체의 공여자 CDR 및 수용자 프레임워크 영역 사이)에 "스페이서"로서 삽입된 하나 이상(가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개, 또는 10개 이상)의 아미노산을 포함할 수 있다. 가령, CDR 이식 과정 동안 손실되었을 수도 있는 항원-결합 치환성을 회복하기 위해, 스페이서 서열의 삽입은 유용할 수 있다 (하기 참고). 가령, Maynard and Georgiou (2001) Ann Rev Biomed Engineering 2:339-376을 참고. 예를 들어, 스페이서 아미노산 서열은 LFR1 및 LCDR1 사이에 삽입될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 스페이서 아미노산 서열은 LCDR1 및 LFR2 사이에 삽입된다. 몇몇 실시양태에서, 스페이서 아미노산 서열은 LFR2 및 LCDR2 사이에 삽입된다. 몇몇 실시양태에서, 스페이서 아미노산 서열은 LCDR2 및 LFR3 사이에 삽입된다. 몇몇 실시양태에서, 스페이서 아미노산 서열은 LFR3 및 LCDR3 사이에 삽입된다. 몇몇 실시양태에서, 스페이서 아미노산 서열은 LCDR3 및 LFR4 사이에 삽입된다. 몇몇 실시양태에서, 스페이서 아미노산 서열은 HFR1 및 HCDR1 사이에 삽입된다. 몇몇 실시양태에서, 스페이서 아미노산 서열은 HCDR1 및 HFR2 사이에 삽입된다. 몇몇 실시양태에서, 스페이서 아미노산 서열은 HFR2 및 HCDR2 사이에 삽입된다. 몇몇 실시양태에서, 스페이서 아미노산 서열은 HCDR2 및 HFR3 사이에 삽입된다. 몇몇 실시양태에서, 스페이서 아미노산 서열은 HFR3 및 HCDR3사이에 삽입된다. 몇몇 실시양태에서, 스페이서 아미노산 서열은 HCDR3 및 HFR4 사이에 삽입된다. 몇몇 실시양태에서, 스페이스 서열은 경쇄 폴리펩티드의 모든 조각 및/또는 중쇄 폴리펩티드의 모든 조각 사이에 삽입된다. 몇몇 실시양태에서, 스페이서가 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 임의의 성분 요소 사이에 도입되지 않았다. 하나 이상의 스페이서 서열을 포함한 조작된 항체의 요구되는 모든 것은 항체가: (a) 공여자 항체에 결합하는 항원과 동일한 항원에 결합하는 능력을 보유하고 (b) 인간에서의 공여자 항체의 면역원성과 비교하여 인간에서 더 적은 면역원성이어야 한다는 것이다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "항체"는 전체 또는 완전한 항체 분자(가령, IgM, IgG (IgGl, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함하여), IgA, IgD, 또는 IgE) 또는 이의 임의의 항원-결합 단편을 나타낸다. 용어 항체는 가령, 키메라화 또는 키메라 항체, 인간화 항체, 탈면역화(deimmunized) 항체, 및 완전히 인간 항체를 포함한다. 항체의 항원-결합 단편은 가령, 단쇄 항체, 단쇄 Fv 단편 (scFv), Fd 단편, Fab 단편, Fab' 단편, 또는 F(ab')2 단편을 포함한다. scFv 단편은 scFv를 파생시키는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 모두를 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄이다. 게다가, 인트라바디(intrabody), 미니바디(minibody), 트리아바디(triabody), 및 디아바디(diabody) (가령, Todorovska et al. (2001) J Immunol Methods 248(1):47-66; Hudson and Kortt (1999) J Immunol Methods 231(1):177-189; Poljak (1994) Structure 2(12):1121-1123; Rondon and Marasco (1997) Annual Review of Microbiology 51:257-283을 참고, 이들 각각의 개시는 이들 전체에서 참조로서 본 명세서에 편입된다)가 항체의 정의내 또한 포함되고 그리고 본 명세서에서 설명된 방법에 이용하기 위해 상용된다. 이중특이성 항체는 용어 "항체"에 의해 또한 포괄된다. 이중특이성 항체는 단일클론성, 바람직하게는 인간 또는 인간화, 항체이며 이는 최소 두개의 상이한 항체에 대해 결합 특이성을 갖는다.
본 개시는 Wu et al. (2007) Nat Biotechnol 25(11):1290-1297에서 설명된 4가 이중 가변 도메인 면역글로불린 (DVD-Ig) 분자와 같은 이중특이성 항체의 변이 형태를 또한 포괄한다. DVD-Ig 분자는 두개의 상이한 모체 항체로부터의 두개의 상이한 경쇄 가변 도메인 (VL)이 재조합 DNA 기술에 의해 직접적으로 또는 짧은 연결자를 통하여 직렬로 연결되고, 그 뒤에 경쇄 불변 도메인이 오도록 설계된다. 두개의 모체 항체로부터 DVD-Ig 분자를 발생시키기 위한 방법은 가령, PCT 공개 공보 제 WO 08/024188 및 WO 07/024715에서 추가로 설명되고, 이들 각각의 개시는 이들의 전체에서 참조로서 본 명세서에 편입된다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, "공여자 항체"는 본 명세서에서 설명된 방법을 이용하여, 숙련자들이 (i) 공여자 항체에 결합하는 항원과 동일한 항원에 결합하는; 및 (ii) 공여자 항체와 비교하여 하나 이상 (가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개 이상)의 향상된 특징 - 특히 공여자 항체의 면역원성과 비교하여 인간에서 감소된 수준의 면역원성을 갖는 항체(조작된 항체)의 변이를 얻고자하는 항체이다. 공여자 항체는 임의의 여러 가지 종, 가령, 비-인간 영장류 (가령, 원숭이, 개코원숭이(baboon), 마카크(macaque), 여우원숭이(lemur), 유인원, 오랑우탄, 고릴라, 또는 침팬지), 말, 소, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이, 토끼, 기니피그, 게르빌루스 쥐, 햄스터, 쥐, 및 생쥐와 같은 포유류에서 생성 또는 파생될 수 있다. 몇몇 예에서, 공여자 항체는 인간에게 투여될 때, 인간에서 중화 HAHA 반응을 유도하는 인간화 또는 완전 인간 항체일 수 있다. 인간화 항체는 하나 이상의 비-인간 생식세포 프레임워크를 포함하는 변형된 항체일 수 있다. 완전 인간 항체는 하나 이상의 비-생식세포 인간 프레임워크 영역을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 인간 공여자 항체는, 체세포 초돌연변이의 대상이고 따라서 생식세포 그 자체가(per se) 더 이상 아닌 하나 이상의 프레임워크 영역을 포함할 수 있다. (가령, Abbas, Lichtman, and Pober (2000) "Cellular and Molecular Immunology", 4th Edition, W.B. Saunders Company (ISBN:0721682332)를 참고). 몇몇 실시양태에서, 공여자 항체는 인간화 또는 완전 인간 항체가 아니다.
조작된 항체는 특이적으로 항원에 결합하는 임의의 공여자 항체로부터 파생될 수 있고 이의 항원으로의 이러한 공여자 항체의 결합은 인간에서 치료학적 효과를 야기하는 것으로 발생하거나 또는 예상된다. 예를 들어, 공여자 항체는 가령, 파상풍 독소; 디프테리아 독소; 또는 임의의 여러 가지 바이러스성 표면 단백질 (가령, 거대세포바이러스 (CMV) 당단백질 B, H 및 gCIII; 인간 면역 결핍바이러스 1 (HIV-I) 외막 당단백질; 라우스(Rous) 육종 바이러스(RSV) 외막 당단백질; 단순 헤프페스 바이러스 (HSV) 외막 당단백질; 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스 (EBV) 외막 당단백질; 베리셀라-조스터 바이러스 (VZV) 외막 당단백질; 인간 육두종 바이러스 (HPV) 외막 당단백질; 인플루엔자 바이러스 당단백질; 및 간염 바이러스 과(family) 표면 항원)과 같은 미생물성 병원체 (가령, 바이러스, 박테리아, 원생동물, 또는 기생동물) 단백질에 결합할 수 있다. 이러한 공여자 항체로부터 생성된 조작된 항체는 인간에서 미생물성 감염을 치료하는데 유용할 것으로 예상된다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 프로테아제 내성 단백질(Protease Resistant Protein, PrPSc)과 같은, 하지만 이에 제한되지 않는 전염성 단백질에 결합할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 공여자 항체는 성장 인자, 사이토카인, 또는 케모카인에 결합할 수 있다. 성장 인자는 가령, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 뼈 형성 단백질 (BMP), 과립구-집락 자극 인자 (G-CSF), 과립구-대식세포 집락 자극 인자 (GM-CSF), 신경 성장 인자(NGF); 뉴로트로핀(neurotrophin), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 에리스로포이에틴(erythropoietin, EPO), 트롬보포이에틴(thrombopoietin, TPO), 미오스타틴(myostatin, GDF-8), 성장 분화 인자-9 (GDF9), 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF 또는 FGF2), 표피 성장 인자 (EGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 및 뉴레귤린(neuregulin, 가령, NRG1, NRG2, NRG3, 또는 NRG4)을 포함할 수 있다. 사이토카인은 가령, 인터페론 (가령, IFNγ), 종양 괴사 인자 (가령, TNFα 또는 TNFβ), 및 인터루킨 (가령, IL-1 내지 IL-33 (가령, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, 또는 IL-15))을 포함한다. 케모카인은 가령, I-309, TCA-3, MCP-I, MIP-1α, MIP-lβ, RANTES, Cl0, MRP-2, MARC, MCP-3, MCP-2, MRP-2, CCF18, 에오탁신(Eotaxin), MCP-5, MCP-4, NCC-I, HCC-I, 루코탁틴(leukotactin)-1, LEC, NCC-4, CCL21, TARC, PARC, 또는 에오탁신(Eotaxin)-2을 포함한다. 몇몇 실시양태에서 공여자 항체는 가령, C1, C1q, C1r, C1s, C4, C4a, C4b, C3, C3a, C3b, C2, C2a, C2b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, 프로퍼딘, 보체 인자 B, 보체 인자 D, MBL, MASP1, MASP2, 또는 MASP3과 같은 인간 보체 단백질에 결합할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 공여자 항체는 가령, IgM, IgG (IgGl, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함하여), IgA, IgD, 또는 IgE의 Fc 일부와 같은 항체의 Fc 일부에 결합한다. 공여자 항체는 세포 표면 단백질에 결합할 수 있다. 세포 표면 단백질은 가령, G 단백질 결합 수용체 (GPCR), 케모카인 수용체, 사이토카인 수용체, 또는 수용체 타이로신 키나아제 (RTK)를 포함한다. 케모카인 수용체는 가령, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, 또는 CCX-CKR2일 수 있다. 사이토카인 수용체는 가령, IL-1R, IL-2R, IL-3R, IL-4R, IL-5R, IL-6R, IL-8R, TNFβR1, TNFβR2, c-kit 수용체, 인터페론 (IFNα 또는 IFNβ) 수용체, IFN 감마 수용체, 과립구 대식세포 집락 자극 인자 (GM-CSF) 수용체, 과립구 집락 자극 인자 (G-CSF) 수용체, 및 프로락틴(prolactin) 수용체를 포함한다. RTK는 가령, EGF 수용체, 인슐린 수용체, PDGF 수용체, FGF 수용체, VEGF 수용체, 및 HGF 수용체를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 공여자 항체는 HER2/neu/ErbB2, HER3, 또는 HER4에 결합한다.
몇몇 실시양태에서, 공여자 항체는 MART-1/Melan-A, gpl00, 아데노신 디아미나제-결합 단백질 (ADAbp), FAP, 사이클로필린(cyclophilin) b, 대장 연관 항원 (CRC) C017-lA/GA733, 암배아 항원 (CEA), CAP-I, CAP-2, etv6, AMLI, 전립선 특이 항원(PSA), PSA-1, PSA-2, PSA-3, 전립성-특이성 막 항원 (PSMA), T-세포 수용체/CD3-제타 사슬, CD20, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, 및 GAGE-9와 같은, 하지만 이에 제한되지 않는 암 항원(가령, 암 항원의 돌연변이 형태)에 결합한다.
몇몇 실시양태에서, 공여자 항체는 다음으로 구성된 그룹에서 선택된 인간 단백질에 결합할 수 있다: ABCFl; ACVRl; ACVRlB; ACVR2; ACVR2B; ACVRLl; ADORA2A; 아그레칸(Aggrecan); AGR2; AICDA; AIF1; AIGl; AKAPl; AKAP2; AMH; AMHR2; ANGPTl; ANGPT2; ANGPTL3; ANGPTL4; ANPEP; APC; APOCl; AR; AZGPl (징크-α-당단백질); B7.1; B7.2; BAD; BAFF; BAGl; BAIl; BCL2; BCL6; BDNF; BLNK; BLRl (MDR15); BIyS; 뼈 형성 단백질(BMP) l; BMP2; BMP3B (GDFl0); BMP4; BMP6; BMP8; BMPRlA; BMPRlB; BMPR2; BPAGl (플렉틴(plectin)); BRCAl; BRCA2; C19orfl0 (IL27w); 보체 성분 C3; 보체 성분 C3a; 보체 성분 C3b; 보체 성분 C4a; 보체 성분 C4b; 보체 성분 C5; 보체 성분 C5a; 보체 성분 C5b; 보체 성분 C6; 보체 성분 C7; 보체 성분 C8; 보체 성분 C9; 보체 인자 D; 보체 인자 B; C5aR1; CANTl; CASPl; CASP4; CAVl; CCBP2 (D6/JAB61); CCLl (1-309); CCL11 (에오탁신(Eotaxin)); CCL13 (MCP-4); CCL15 (MIP-1d); CCL16 (HCC-4); CCL17 (TARC); CCL18 (PARC); CCL19 (MIP-3b); CCL2 (MCP-1); MCAF; CCL20 (MIP-3a); CCL21 (MEP-2); SLC; 엑소더스(exodus)-2; CCL22 (MDC/STC-I); CCL23 (MPIF-1); CCL24 (MPIF-2/에오탁신(Eotaxin)-2); CCL25 (TECK); CCL26 (에오탁신(Eotaxin)-3); CCL27 (CTACK/ILC); CCL28; CCL3 (MIP-1a); CCL4 (MIP-1b); CCL5 (RANTES); CCL7 (MCP-3); CCL8 (mcp-2); CCNAl; CCNA2; CCNDl; CCNEl; CCNE2; CCRl (CKRl/HM145); CCR2 (mcp-lRB); CCR3 (CKR3/CMKBR3); CCR4; CCR5 (CMKBR5/ChemR13); CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6); CCR7 (CKR7/EB11); CCR8 (CMKBR8/TER1/CKR-Ll); CCR9 (GPR-9-6); CCRLl (VSHKl); CCRL2 (L-CCR); CD164; CD19; CDlC; CD20; CD200(OX-2); CD200R; CD-22; CD24; CD28; CD3; CD37; CD38; CD3E; CD3G; CD3Z; CD4; CD40; CD40L; CD44; CD45RB; CD52; CD69; CD72; CD74; CD79A; CD79B; CD8; CD80; CD81; CD83; CD86; CDHl (E-카데린(cadherin)); CDHl0; CDH12; CDH13; CDH18; CDH19; CDH20; CDH5; CDH7; CDH8; CDH9; CDK2; CDK3; CDK4; CDK5; CDK6; CDK7; CDK9; CDKNlA (p21Wapl/Cipl); CDKNlB (p27Kipl); CDKNlC; CDKN2A (pl6INK4a); CDKN2B; CDKN2C; CDKN3; CEBPB; CERl; CHGA; CHGB; 키티나아제(chitinase); CHSTl0; CKLFSF2; CKLFSF3; CKLFSF4; CKLFSF5; CKLFSF6; CKLFSF7; CKLFSF8; CLDN3; CLDN7 (클라우딘(claudin)-7); CLN3; CLU (클러스터린(clusterin)); CMKLRl; CMKORl (RDCl); CNRl; COL18A1; COLlAl; COL4A3; COL6A1; CR2; CRP; CSFl (M-CSF); CSF2 (GM-CSF); CSF3 (GCSF); CTLA4; CTNNBl (β-카테닌(catenin)); CTSB (카텝신(cathepsin) B); CX3CL1 (SCYDl); CX3CR1 (V28); CXCLl (GROl); CXCLl0; CXCL1l (I-TAC/IP-9); CXCL12 (SDFl); CXCL13; CXCL14; CXCL16; CXCL2 (GRO2); CXCL3 (GRO3); CXCL5 (ENA-78/LIX); CXCL6 (GCP-2); CXCL9 (MIG); CXCR3 (GPR9/CKR-L2); CXCR4; CXCR6 (TYMSTR /STRL33/Bonzo); CYB5; CYCl; CYSLTRl; DAB2IP; DES; DKFZp451J0118; DNCLl; DPP4; DR6; E2F1; ECGFl; EDGl; EFNAl; EFNA3; EFNB2; EGF; EGFR; ELAC2; 엔도칸(endocan); ENG; ENOl; ENO2; ENO3; EPHB4; EPG; EPO; ERBB2 (Her-2); EREG; ERK8; ESRl; ESR2; F3 (TF); FADD; FasL; FASN; fFCERlA; FCER2; FCGR3A; FGF; FGFl (aFGF); FGFl0; FGFl1; FGF12; FGF12B; FGF13; FGF14; FGF16; FGF17; FGF18; FGF19; FGF2 (bFGF); FGF20; FGF21; FGF22; FGF23; FGF3 (int-2); FGF4 (HST); FGF5; FGF6 (HST-2); FGF7 (KGF); FGF8; FGF9; FGFR3; FIGF (VEGFD); FILl (EPSILON); FILl (ZETA); FLJ12584; FLJ25530; FLRTl (피브로넥틴(fibronectin)); FLTl; FOS; FOSLl (FRA-I); FY (DARC); GABRP (GABAa); GAGEBl; GAGECl; GALNAC4S-6ST; GATA3; GDF5; GFIl; GGTl; GM-CSF; GNASl; GNRHl; GPR2 (CCRl0); GPR31; GPR44; GPR81 (FKSG80); GRCCl0 (Cl0); GRP; GSN (겔솔린(Gelsolin)); GSTPl; HAVCR1; HAVCR2; HDAC4; HDAC5; HDAC7A; HDAC9; HGF; HIFlA; HIPl; 히스타민 및 히스타민 수용체; HLA-A; HLA-DRA; HM74; HMOXl; HUMCYT2A; ICEBERG; ICOSL; ID2; IFN-α; IFNAl; IFNA2; IFNA4; IFNA5; IFNA6; IFNA7; IFNBl; IFNγ; IFNWl; IGBPl; IGFl; IGFlR; IGF2; IGFBP2; IGFBP3; IGFBP6; IL-1; IL-l0; IL-10RA; IL-10RB; IL1l; IL11RA; IL-12; IL12A; IL12B; IL12RB1; IL12RB2; DL13; IL13RA1; IL13RA2; IL14; IL15; IL15RA; IL16; IL17; IL17B; IL17C; IL17R; IL18; IL18BP; IL18R1; IL18RAP; IL19; IL1A; ILlB; IL1F10; IL1F5; IL1F6; IL1F7; IL1F8; IL1F9; ILlHYl; ILlRl; IL1R2; ILlRAP; ILlRAPLl; IL1RAPL2; IL1RL1; IL1RL2; ILlRN; IL2; IL20; IL20RA; IL21R; IL22; IL22R; IL22RA2; IL23; IL24; IL25; IL26; IL27; IL28A; IL28B; IL29; IL2RA; IL2RB; IL2RG; IL3; IL30; IL3RA; IL4; IL4R; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; IL6ST (당단백질 130); IL7; IL7R; IL8; IL8RA; IL8RB; IL8RB; IL9; IL9R; ILK; INHA; INHBA; INSL3; INSL4; IRAKI; IRAK2; ITGAl; ITGA2; ITGA3; ITGA6 (α6 인테그린); ITGAV; ITGB3; ITGB4 (β4 인테그린); JAGl; JAKl; JAK3; JUN; K6HF; KAIl; KDR; KITLG; KLF5 (GC Box BP); KLF6; KLKl0; KLK12; KLK13; KLK14; KLK15; KLK3; KLK4; KLK5; KLK6; KLK9; KRTl; KRT19 (Keratin 19); KRT2A; KRTHB6 (헤어(hair)-특이적 유형 II 케라틴(keratin)); LAMA5; LEP (렙틴(leptin)); Lingo-p75; Lingo-Troy; LPS; LTA (TNF-β); LTB; LTB4R (GPR16); LTB4R2; LTBR; MACMARCKS; MAG 또는 Omgp; MAP2K7 (c-Jun); MDK; MIBl; 미드카인(midkine); MIF; MIP-2; MKI67 (Ki-67); MMP2; MMP9; MS4A1; MSMB; MT3 (메탈로티오넥틴(metallothionectin)-III); MTSSl; MUCl (뮤신(mucin)); MYC; MYD88; NCK2; 뉴로칸(neurocan); NFKBl; NFKB2; NGFB (NGF); NGFR; NgR-Lingo; NgR-Nogo66 (Nogo); NgR-p75; NgR-Troy; NMEl (NM23A); NOX5; NPPB; NR0Bl; NR0B2; NRlDl; NR1D2; NR1H2; NR1H3; NR1H4; NR1I2; NR1I3; NR2C1; NR2C2; NR2E1; NR2E3; NR2F1; NR2F2; NR2F6; NR3C1; NR3C2; NR4A1; NR4A2; NR4A3; NR5A1; NR5A2; NR6A1; NRPl; NRP2; NT5E; NTN4; ODZl; OPRDl; P2RX7; PAP; PARTl; PATE; PAWR; PCA3; PCNA; PDGFA; PDGFB; PECAMl; PF4 (CXCL4); PGF; PGR; 포스포칸(phosphacan); PIAS2; PIK3CG; PLAU (uPA); PLG; PLXDCl; PPBP (CXCL7); PPID; PRl; PRKCQ; PRKDl; PRL; PROC; PROK2; 프로퍼딘(properdin); PSAP; PSCA; PTAFR; PTEN; PTGS2 (COX-2); PTN; RAC2 (P21Rac2); RARB; RGSl; RGS13; RGS3; RNF110 (ZNF144); ROBO2; S100A2; SCGB1D2 (리포필린(lipophilin) B); SCGB2A1 (맘마글로빈(mammaglobin) 2); SCGB2A2 (맘마글로빈(mammaglobin) 1); SCYEl (내피세포 단핵구-활성 사이토카인); SDF2; SERPINA1; SERPINA3; SERPINB5 (마스핀(maspin)); SERPINEl (PAI-1); SERPINFl; SHBG; SfcAZ; SLA2; SLC2A2; SLC33A1; SLC43A1; SLIT2; SPPl; SPRRlB (Sprl); ST6GAL1; STABl; STAT6; STEAP; STEAP2; TB4R2; TBX21; TCPl0; TDGFl; TEK; TGFA; TGFBl; TGFBlIl; TGFB2; TGFB3; TGFBI; TGFBRl; TGFBR2; TGFBR3; THlL; THBSl (트롬보스폰딘(thrombospondin)-1); THBS2; THBS4; THPO; TIE (Tie-1); TIMP3; 조직 인자; TLRl0; TLR2; TLR3; TLR4; TLR5; TLR6; TLR7; TLR8; TLR9; TNF; TNF-α; TNFAIP2 (B94); TNFAIP3; TNFRSF1lA; TNFRSFlA; TNFRSFlB; TNFRSF21; TNFRSF5; TNFRSF6 (Fas); TNFRSF7; TNFRSF8; TNFRSF9; TNFSFl0 (TRAIL); TNFSF11 (TRANCE); TNFSF12 (APO3L); TNFSF13 (April); TNFSF13B; TNFSF14 (HVEM-L); TNFSF15 (VEGI); TNFSF18; TNFSF4 (OX40 리간드); TNFSF5 (CD40 리간드); TNFSF6 (FasL); TNFSF7 (CD27 리간드); TNFSF8 (CD30 리간드); TNFSF9 (4-1BB 리간드); TOLLIP; Toll-유사 수용체; TOP2A (토포이소머라아제(topoisomerase) IIa); p53; TPMl; TPM2; TRADD; TRAFl; TRAF2; TRAF3; TRAF4; TRAF5; TRAF6; TREMl; TREM2; TRPC6; TSLP; TWEAK; VEGF; VEGFB; VEGFC; 베르시칸(versican); VHL C5; VLA-4; XCLl (림포탁틴(lymphotactin)); XCL2; XCRl (GPR5/CCXCRl); YYl; 및 ZFPM2.
접합한 공여자 항체는 임상 시험, 또는 진단용을 위한 개발에 이용하기 위해 승인된 여러 가지 치료용 항체를 또한 포함한다. 이러한 항체는 가령, 리투시맙(rituximab) (Rituxan® IDEC/Genentech/Roche), 비 호지킨 림프종을 치료하는데 승인된 키메라 항-CD20 항체; Genmab에 의해 현재 개발되고 있는 HuMax-CD20, 항-CD20; AME-133 (Applied Molecular Evolution); hA20 (Immunomedics, Inc.); HumaLYM (Intracel); PRO70769 (국제 특허 출원 제 PCT/US2003/040426); 트라스투주맙(trastuzumab) (Herceptin® Genentech), 유방암을 치료하는데 승인된 인간화 항-Her2/neu 항체; Genentech에 의해 현재 개발되고 있는 페르투주맙(pertuzumab) (rhuMab-2C4, Omnitarg®); 세툭시맙(cetuximab) (Erbitux® Imclone); Abgenix-Immunex-Amgen에 의해 현재 개발되고 있는 ABX-EGF; Genmab 에 의해 현재 개발되고 있는 HuMax-EGFr; 425, EMD55900, EMD62000, 및 EMD72000 (Merck KGaA) (미국 특허 제 5,558,864; Murthy et al. (1987) Arch Biochem Biophys 252(2):549-60; Rodecket al. (1987) J Cell Biochem 35(4):315-20; 및 Kettleborough et al. (1991) Protein Eng 4(7):773-83을 참고); ICR62 (Institute of Cancer Research) (국제 공개 공보 제 WO 95/20045; Modjtahedi et al. (1993) J Cell Biophys 22(1-3):129-46; Modjtahedi et al. (1993) Br J Cancer 67(2):247-53; Modjtahedi et al. (1996) Br J Cancer 73(2):228-35; Modjtahedi et al. (2003) Int J Cancer 105(2):273-80); TheraCIM hR3 (YM Biosciences, Canada 및 Centro de Immunologia Molecular, Cuba (미국 특허 제 5,891,996; 미국 특허 제 6,506,883; Mateo et al. (1997) Immunotechnology 3(1):71-81)); mAb-806 (Ludwig Institute for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering) (Jungbluth et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100(2):639-44); KSB-102 (KS Biomedix); MRl-I (IVAX, National Cancer Institute) (PCT WO 0162931A2); 알렘투주맙(alemtuzumab) (Campath® Millenium), B-세포 만성 림프성 백혈병의 치료를 위해 현재 승인된 인간화 단일클론 항체; 무로모납(muromonab)-CD3 (Orthoclone OKT3®), Ortho Biotech/Johnson & Johnson에 의해 개발된 항-CD3 항체; 이브리투모맙 티욱세탄(ibritumomab tiuxetan) (Zevalin®), IDEC/Schering AG에 의해 개발된 항-CD20 항체; 젬투주맙 오조가마이신(gemtuzumab ozogamicin) (Mylotarg®), Celltech/Wyeth에 의해 개발된 항-CD33 (p67 단백질) 항체; 알레파셉트(alefacept) (Amevive®), Biogen에 의해 개발된 항-LFA-3 Fc 융합체; Centocor/Lilly에 의해 개발된 앱식시맙(abciximab) (ReoPro®); Novartis에 의해 개발된 바실릭시맙(basiliximab) (Simulect®); Medimmune에 의해 개발된 팔리비주맙(palivizumab) (Synagis®); 인플릭시맙(infliximab) (Remicade®), Centocor에 의해 개발된 항-TNFα 항체; 아달리무맙(adalimumab) (Humira®), Abbott에 의해 개발된 항-TNFα 항체; Humicade®, Celltech에 의해 항-TNFα 항체; 골리무맙(golimumab) (CNTO-148), Centocor에 의해 개발된 완전 인간 항-TNF 항체; Abgenix에 의해 개발되고 있는 항-CD147 항체; ABX-IL8, Abgenix에 의해 개발되고 있는 항-IL8 항체; ABX-MAl, Abgenix에 의해 개발되고 있는 항-MUC18 항체; 펨투모맙(pemtumomab) (Rl 549, 90Y-muHMFGl), Antisoma에 의한 항-MUCl 개발; 테렉스(Therex) (R155O), Antisoma에 의해 개발되고 있는 항-MUCl 항체; Antisoma에 의해 개발되고 있는 앤지오맙(AngioMab) (AS1405); Antisoma에 의해 개발되고 있는 HuBC-I; Antisoma에 의해 개발되고 있는 티오플라틴(Thioplatin) (AS 1407); Biogen Idec 및 Elan에 의해 개발되고 있는 Antegren® (나탈리주맙(natalizumab)); CAT-152, Cambridge Antibody Technology에 의해 개발되고 있는 항-TGF-β2 항체; ABT 874 (J695), Abbott에 의해 개발되고 있는 항-IL-12 p40 항체; CAT-192, Cambridge Antibody Technology 및 Genzyme에 의해 개발되고 있는 항-TGFβl 항체; CAT-213, Cambridge Antibody Technology에 의해 개발되고 있는 항-에오탁신(Eotaxin)l 항체; LymphoStat-B® Cambridge Antibody Technology 및 Human Genome Sciences Inc.에 의해 개발되고 있는 항-Blys 항체; TRAIL-RI mAb, Cambridge Antibody Technology 및 Human Genome Sciences Inc.에 의해 개발되고 있는 항-TRAIL-Rl 항체; Avastin® (베박시주맙(bevacizumab), rhuMAb-VEGF), Genentech에 의해 개발되고 있는 항-VEGF 항체; Xolair® (오말리주맙(Omalizumab)), Genentech에 의해 개발되고 있는 항-IgE 항체; Raptiva® (Efalizumab), Genentech 및 Xoma에 의해 개발되고 있는 항-CD11a 항체; Genentech 및 Millennium Pharmaceuticals에 의해 개발되고 있는 MLN-02 항체 (이전에 LDP-02); HuMax CD4, Genmab에 의해 개발되고 있는 항-CD4 항체; HuMax-EL15, Genmab 및 Amgen에 의해 개발되고 있는 항-IL-15 항체; Genmab 및 Medarex, HuMax-Cancer에 의해 개발되고 있는 휴맥스-인플람(HuMax-Inflam); Genmab 및 Amgen에 의해 개발되고 있는 휴맥스-림포마(HuMax-Lymphoma); Genmab에 의해 개발되고 있는 휴맥스-TAC(HuMax-TAC); DDEC-131, IDEC Pharmaceuticals에 의해 개발되고 있는 항-CD40L 항체; IDEC-151 (클레놀릭시맙(Clenoliximab)), IDEC Pharmaceuticals에 의해 개발되고 있는 항-CD4 항체; BDEC-114, IDEC Pharmaceuticals에 의해 개발되고 있는 항-CD80 항체; IDEC-152, IDEC Pharmaceuticals에 의해 개발되고 있는 항-CD23; BEC2, Imclone에 의해 개발되고 있는 항-유전자형 항체; IMC-1Cl1, Imclone에 의해 개발되고 있는 항-KDR 항체; DCl01, Imclone에 의해 개발되고 있는 항-flk-1 항체; Imclone에 의해 개발되고 있는 항-VE 카데린(cadherin) 항체; CEA-Cide® (라베투주맙(labetuzumab)), Immunomedics에 의해 개발되고 있는 항-암배아 항원 (CEA) 항체; LymphoCide® (에프라투주맙(Epratuzumab)), Immunomedics에 의해 개발되고 있는 항-CD22 항체; Immunomedics에 의해 개발되고 있는 AFP-Cide; Immunomedics에 의해 개발되고 있는 마이엘로마사이드(MyelomaCide); Immunomedics에 의해 개발되고 있는 르코사이드(LkoCide); Immunomedics에 의해 개발되고 있는 프로스타사이드(ProstaCide); MDX-010, Medarex에 의해 개발되고 있는 항-CTLA4 항체; MDX-060, Medarex에 의해 개발되고 있는 항-CD30 항체; Medarex에 의해 개발되고 있는 MDX-070; Medarex에 의해 개발되고 있는 MDX-018; Osidem® (IDM-I), Medarex 및 Immuno-Designed Molecules에 의해 개발되고 있는 항-Her2 항체; HuMax® CD4, Medarex 및 Genmab에 의해 개발되고 있는 항-CD4 항체; HuMax-IL15, Medarex 및 Genmab에 의해 개발되고 있는 항-EL15 항체; CNTO 148, Medarex 및 Centocor/Johnson & Johnson에 의해 개발되고 있는 항-TNFα 항체; CNTO 1275, Medarex 및 Centocor/Johnson & Johnson에 의해 개발되고 있는 항-cytokine 항체; MOR101 및 MOR102, MorphoSys에 의해 개발되고 있는 항-세포간 부착 분자-1 (ICAM-I) (CD54) 항체; MOR201, MorphoSys에 의해 개발되고 있는 항-섬유아세포 성장 인자 수용체 3 (FGFR-3) 항체; Nuvion® (비실리주맙(visilizumab)), Protein Design Labs에 의해 개발되고 있는 항-CD3 항체; HuZAF® Protein Design Labs에 의해 개발되고 있는 항-감마 인터페론 항체; Protein Design Labs에 의해 개발되고 있는 항-α5β1 인테그린 항체; ING-I, Xoma에 의해 개발되고 있는 항-EpCAM 항체; Xolair® (오말리주맙(Omalizumab)), Genentech 및 Novartis에 의해 개발된 인간화 항-IgE 항체; 및 MLNOl, Xoma에 의해 개발되고 있는 항-β2 인테그린 항체를 포함한다.
공여자 항체의 형태 및 이의 상응하는 조작된 항체는 동일하거나 상이할 수 있다는 것으로 이해한다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, 공여자 항체 및 이의 상응하는 조작된 항체는 전체 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 공여자 항체는 항체 단편 (가령, 항체의 Fab 또는 scFv 단편)이고 이의 상응하는 조작된 항체도 또한 항체의 단편 (가령, 항체의 Fab 또는 scFv 단편)이다. 하지만, 몇몇 실시양태에서, 공여자 항체는 전체 항체이고 이의 상응하는 조작된 항체는 항체의 단편이고 또는 그 반대가 된다.
조작된 항체를 발생시키기 위한 방법이 하기 설명된다.
조작된 항체를 발생시키기 위한 방법
조작된 항체를 발생시키기 위한 방법은 공여자 항체의 CDR 아미노산 서열 및 수용자 항체의 최소 가변 영역 프레임워크 영역을 요구한다. 상기 설명된바 같이, 선택적으로, 조작된 항체는 하나 이상의 불변 영역(가령, 서열번호:6에서 도시된 중쇄 아미노산 서열의 Fc 영역과 같은 수용자 항체의 불변 영역)을 포함할 수 있다. 수용자 항체는 다음의 아미노산 서열 조각을 순서대로 갖는: LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4 경쇄 가변 도메인을 포함한다. LFR1, LFR2, LFR3, 및 LFR4는 서열번호:2 또는 서열번호:8에서 도시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인으로부터 얻은 프레임워크 영역이 될 수 있다. 경쇄 프레임워크 영역에 대한 예시적인 아미노산 서열 그리고 프레임워크의 예시적인 세트가 본 명세서에서 설명된다. (가령, 표 1 및 3-5를 참고.)
수용자 항체 중쇄 가변 도메인은 다음의 아미노산 서열 조각을 순서대로 가질 수 있다: HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4. HFR1, HFR2, HFR3, 및 HFR4는 서열번호:5 또는 서열번호:7에서 도시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 폴리펩티드로부터 얻은 프레임워크 영역이 될 수 있다. 중쇄 프레임워크 영역에 대한 예시적인 아미노산 서열 그리고 프레임워크 영역의 예시적인 세트가 명세서에서 설명된다. (가령, 표 2-5를 참고.)
상기 방법은 수용자 항체의 CDR (가령, LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3)을 공여자 항체로부터 얻은 CDR의 세트로 교체하는 단계를 포함한다. 항체 조작의 당업계에서 숙련자는 공여자 및 수용자 항체 각각의 CDR 및 프레임워크 영역의 위치 및 아미노산 서열을 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 상기 설명된 바와 같이, 항체의 CDR 및 프레임워크 영역은 가령, Kabat et al. (1991), supra, Chothia et al. (1989), supra, 또는 결합된 카밧(Kabat)-초티아(Chothia) 정의에 대해 참조로서 기술될 수 있다. 카밧(Kabat), 초티아(Chothia), 및 결합된 카밧(Kabat)-초티아(Chothia) 정의 하에 항체의 CDR 및 프레임워크 영역의 식별은 도 1 및 2 그리고 Thomas et al. (1996, supra)에서 또한 예시화된다.
공여자 항체에서 수용자 항체의 프레임워크 영역으로 CDR 서열을 이식하기 위한 방법은 당업계에서 알려져 있고 가령, Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Verhoeyen et al. (1988) Science 239(4847):1534-1536; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Queen et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:10029-10033; PCT 공개 공보 제 WO 93/011237; Kettleborough et al. (1991) Protein Engineering , Design and Selection 4:773-783; Benny K. C. Lo (2004) "Antibody Engineering: Methods and Protocols", Humana Press (ISBN: 1588290921); Borrebaek (1992) "Antibody Engineering, A Practical Guide," W.H. Freeman and Co., NY; 및 Borrebaek (1995) "Antibody Engineering," 2nd Edition, Oxford University Press, NY, Oxford에서 설명된다. 공여자 항체로부터 얻은 CDR은 가령, Daugherty et al. (1991) Nucleic Acids Res 19(9):2471-2476; Roguska et al. (1996) Protein Engineering 9(10):895-904; 및 Yazaki et al. (2004) Protein Engineering , Design & Selection 17(5):481-489에서 설명된 바와 같은 중복 신장 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기술을 이용하여 수용자 항체의 프레임워크 영역 상으로 이식될 수 있다. 공여자 CDR의 세트를 수용자 항체로 이식하기 위한 적합한 방법이 Thomas et al. (1996), supra에서 또한 설명된다.
몇몇 실시양태에서, 선택된 CDR 아미노산 서열이 짧은 서열(가령, 10-15개보다 적은 아미노산 길이)인 경우, CDR을 암호화하는 핵산은 가령, Shiraishi et al. (2007) Nucleic Acids Symposium Series 51(1):129-130 및 미국 특허 제 6,995,259에서 설명된 바와 같이 화학적으로 합성될 수 있다. 수용자 항체를 암호화하는 주어진 핵산 서열에 대해, CDR을 암호화하는 핵산 서열의 영역은 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 화학적으로 합성된 핵산으로 교체될 수 있다. 화학적으로 합성된 핵산의 5' 및 3' 끝점은 상기 핵산을 공여자 항체의 가변 영역을 암호화하는 핵산으로 클로닝(cloning)하는데 이용을 위해 접착 말단 제한 효소 부위를 포함하는 것으로 합성될 수 있다. 조작된 항체를 발현 및 정제하기 위한 방법이 당업계에서 알려져 있고 본 명세서에서 설명된다.
조작된 항체의 CDR 이식 및 발현 (하기 참고)후, 조작된 항체는 공여자 항체에 확인하는 항원과 동일한 항원에 결합하는 이의 능력에 대해 분석될 수 있다. 항체가 단백질에 결합하는지 안하는지 확인하기 위한 적합한 방법이 당업계에서 알려져 있다. 예를 들어, 단백질 항원에 항체의 결합은 웨스턴 블롯(Western blot), 점 블롯(dot blot), 표면 플라스몬 공명(SPR) 방법 (가령, BIAcore 시스템; Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden 및 Piscataway, N.J.), 옥텟(Octet), 또는 효소-결합 면역흡착 측정법 (ELISA)와 같은, 하지만 이에 제한되지 않는, 여러 가지 기술을 이용하여 검출 및/또는 정량화될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 조작된 항체 및 이의 동족 항원 사이의 결합 친화성이 확인할 수 있다. 단백질 항원에 대한 조작된 항체의 친화성을 확인하기 위한 방법이 당업계에서 알려져 있다, 단백질 항원에 항체의 결합은 웨스턴 블롯, 점 블롯, SPR, 옥텟, 또는 ELISA 기술과 같은, 하지만 이에 제한되지 않는, 여러 가지 기술을 이용하여 정량화될 수 있다. 가령, Harlow and Lane (1988), supra; Benny K. C. Lo (2004), supra; Borrebaek (1992), supra; Johne et al. (1993) J Immunol Meth 160:191-198; Jonsson et al. (1993) Ann Biol Clin 51:19-26; 및 Jonsson et al. (1991) Biotechniques 11:620-627을 참고.
바람직하게는, 조작된 항체는 공여자 항체에 결합하는 항원과 동일한 항원에 특이적으로 결합할 것이다. 항원에 항체의 결합은 결합 상수 (Ka)가 106 M-1보다 더 높을 때 특이적인 것으로 간주된다. 따라서, 항체는 최소 106 (또는 이보다 큰) (가령, 최소 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 또는 1015 또는 그 이상 (또는 이보다 큰)) M-1의 Ka를 갖는 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다.
CDR 이식은 종종 조작된 항체가 항원에 대한 공여자 항체의 친화성과 비교하여 상기 동일한 항원에 대해 대략적으로 동일한 친화성을 가지도록 수행될 수 있다. 가령, Jones et al. (1986), supra; Verhoeyen et al. (1988), supra; 및 Yazaki et al. (2004), supra 참고. 몇몇 실시양태에서, 조작된 항체는 항원에 대한 공여자 항체의 친화성과 비교하여 상기 항원에 대한 친화성을 향상시켰다.
몇몇 실시양태에서, 조작된 항체는 공여자 항체의 친화성과 비교하여 상기 동일한 항원에 대해 낮은 친화성을 가질 수 있다. 이러한 경우, 손실된 친화성은 가령, Gram et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89(8):3576-3580; 미국 특허 제 7,432,063; 및 PCT 공개 공보 제 WO 02/036738 및 WO 04/055182에서 설명된 바와 같이 부분적으로 또는 전체적으로 회복될 수 있다.
또한 손실된 친화성은 가령, Kettleborough et al. (1991) Protein Engineering 4(7):773-783; Tempest et al. (1991) BioTechnol 9:266-271; Hale et al. (1988) Lancet 2:1394-1399; 및 Gorman et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:4181-4185에서 설명된 바와 같이, 항체 재형성 기술을 이용하여 부분적으로 또는 전체적으로 회복(또는 심지어 때로는 능가)될 수 있다. 항체 재형성에 대한 컴퓨터를 이용한 방법은 가령, Padlan (1991) Mol Immunol 28:489-498에서 설명되었다. 하나의 중쇄 가변 프레임워크 잔기는 - 위치 71 (Kabat et al.에 의해 정의된 바와 같은) - 항원 결합에 대해 중요한 것으로서 식별되었다. 가령, Tramontano et al. (1990) J Mol Biol 215:175-182를 참고. 일련의 면역글로불린 분자로부터 구조적 데이터를 이용하여, 저자는 CDR2의 구조는 잔기 71과의 상호작용에 부분적으로 의존하였다는 것을 관찰하였다. 잔기 71의 보유가 재형성된 항-EGF 수용체 항체에서의 허용할 수 있는 친화성을 얻는 것에 있어서 중요한 것으로 나타났다 (Kettleborough et al. (1991), supra 및 Krauss et al. (2004) Br J Cancer 90:1863-1870). 중쇄 가변 영역 프레임워크 잔기 48, 66, 및 67 (Kabat et al.에 의해 정의된 바와 같은)은 CDR 이식 및 재형성 동안 항체 친화성의 보유에 있어서 중요한 것으로 또한 나타났다 (Id.). 더욱이, Riechmann et al. (1988; supra)은 CDR-이식된 항-CAMPATH-1 항체의 친화성을 회복시키기 위한 중쇄 가변 영역 프레임워크 잔기 27 및 30 (Kabat et al.에 의해 정의된 바와 같은)의 부여를 개시한다. Saldanha et al. ((1999) Mol Immunol 36(11-12):709-719)은 인간 카파 IV 경쇄 FR1의 위치 9에 도입된 복귀 돌연변이가 이전에 비성공적으로 인간화된 항체의 결합 친화성을 회복시켰다는 것을 증명하였고 상기 돌연변이가 또한 COS 세포에서 항체의 분비 수준을 향상시켰다는 것을 발견하였다. Thomas et al. (1996), supra는 인간 항체의 기능을 유지하기 위한 VH 프레임워크 영역 위치 78의 중요성을 논의한다. 가령, Foote and Winter (1992) J Mol Biol 224:487-499를 또한 참고. 작업 실시예 및 Thomas et al. (1996), supra에서 설명된 바와 같이, VH 위치 28 및 30은 항체 안정성 및 기능에 있어서 또한 중요할 수 있다. 따라서, 조작된 항체가 인간에서의 본래 공여자 항체의 면역원성과 비교하여 인간에서 더 적은 면역성으로 남아있는 한, 본 명세서에서 설명된 조작된 항체에 임의의 전술된 변경이 가해지거나, 존재할 수 있음이 이해된다.
항체의 재형성 동안 손실된 항원-결합 친화성을 회복시키기 위한 적합한 방법은 가령, 미국 특허 제 6,180,370; 6,350,861; 및 5,693,762에 또한 개시되고, 이들 각각의 개시는 이들 전체에서 참조로서 편입된다. 예를 들어, 미국 특허 제 6,180,370 (Queen et al.에 의해 발행)은 조작된 항체 가변 영역 (가령, 조작된 항체 프레임워크 영역)의 최소 하나 (가령, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 이상)의 아미노산을 공여자 항체 가변 영역에 존재하는 상응하는 아미노산으로 교체함으로써 조작된 항체의 친화성을 회복시키기 위한 방법을 설명한다 (소위 "복귀 돌연변이"). 상기 방법은 가령, 조작된 항체의 프레임워크 영역을 공여자 항체에서 상응하는 프레임워크 영역과 비교(정렬)하는 단계 및 (a) 그 위치에서는 드문, (b) CDR에 바로 인접한, 및/또는 (c) 삼차원 공간에서 CDR의 약 3Å 이내인 것으로 예상되는 아미노산(들)인 아미노산을 식별하는 단계를 포함한다. 식별된 아미노산은 조작된 항체에 대한 손실된 친화성을 회복시키기 위해 특히 복귀 돌연변이가 될 수 있다. 한번 이상 (가령, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6번 이상)의 복귀 돌연변이가 조작된 항체의 단일 프레임워크 영역 또는 조작된 항체의 하나 이상(가령, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개)의 프레임워크 영역에 도입될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 복귀 돌연변이는 상응하는 공여자 항체 프레임워크 영역과 65 초과 (가령, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 또한 95 이상)% 동일한 조작된 항체 프레임워크 영역을 만들기 위해 충분한 수로 도입될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 복귀-돌연변이는 공여자 항체의 상응하는 가변 영역과 65 초과 (가령, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 또는 95 또는 이상)% 동일한 조작된 항체 가변 영역 (가령, 경쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역)을 만들기 위해 충분한 수로 도입될 수 있다. 복귀 돌연변이(들)를 포함한 조작된 항체가 요구되는 모든 것은 조작된 항체가 인간에서의 공여자 항체의 면역원성과 비교하여 인간에서 더 적은 면역성이어야하 한다는 것이다.
상기 논의된 바와 같이, 재형성 또는 친화성 성숙 기술이 하나 이상 (가령, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상)의 아미노산 치환 (가령, 보존 또는 비-보존 치환)을 하나 이상(가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 모두)의 조작된 항체 프레임워크 영역 (가령, HFR1, HFR2, HFR3, HFR4, LFR1, LFR2, LFR3, 또는 LFR4) 내로 도입하는데 이용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 전체에서 프레임워크 영역은 10 (가령, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개보다 적은)개보다 적은 치환을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 단지 하나의 프레임워크 영역만이 재형성 과정 동안 변형된다 (가령, 하나 이상의 아미노산 치환을 영역 내로 도입하기 위해). 몇몇 실시양태에서, 하나 이상 (가령, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 모두)의 프레임워크 영역(들)은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하기 위해 변형된다. 요구되는 모든 것은 결과로 얻은 조작된 항체가 인간에게 투여될 때 상응하는 인간에서의 상응하는 공여자 항체보다 더 적은 면역성이어야 하는 것이다. 몇몇 실시양태에서, 아미노산 치환은 이식 과정에 앞서 수행된다. 몇몇 실시양태에서, 아미노산 치환은 이식 과정 후에 수행된다.
상기 논의된 바와 같이, 당업계에서 숙련자는 가변 도메인 CDR 및 프레임워크 영역의 정확한 경계는 이들이 어떻게 정의되는지에 따라서 달라질 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 초티아(Chothia) 정의 또는 결합된 카밧(Kabat)-초티아(Chothia) 정의 하에, VH 위치 28 및 30은 중쇄 CDR1 영역 내에 포함된다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 조작된 항체 VH 영역 및/또는 VL 영역의 CDR 내로 도입될 수 있지만 항체의 프레임워크 영역 내로는 도입될 수 없다. 이러한 치환은 항체 재형성 또는 친화성 성숙에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 항체 재형성 또는 성숙 기술은 가령, 카밧(Kabat), 초티아(Chothia), 또는 결합된 카밧(Kabat)-초티아(Chothia) 정의에 의해 정의된 바와 같이, 하나 이상 (가령, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상)의 아미노산 치환 (가령, 보존적 또는 비-보존적 치환)을 하나 이상 (1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 모두)의 조작된 항체 CDR 영역 (가령, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 또는 LCDR3) 내로 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 전체에서 CDR은 10 (가령, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개보다 적은)개보다 적은 치환을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 공여자 CDR의 어떠한 것도 수용자 스캐폴드에 이식하는 것에 앞서, 또는 그 후에 아미노산 치환의 대상이되지 않는다. 상기 치환이 요구되는 모든 것은 (a) 결과로 얻은 조작된 항체는 인간에게 투여될 때 인간에서의 상응하는 공여자 항체보다 더 적은 면역성이고; 그리고 (b) 치환은 치환에 앞서 표적 항원에 대한 조작된 항체의 친화성과 비교하여 상기 표적 항원에 대한 조작된 항체의 친화성을 향상시켜야 한다는 것이다.
몇몇 실시양태에서, 조작된 경쇄 폴리펩티드 및 조작된 중쇄 폴리펩티든 본 명세서에서 설명된 방법을 이용하여 발생될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 숙련자는 단지 조작된 경쇄 폴리펩티드 또는 조작된 중쇄 폴리펩티드만 발생시키기 위해 선택할 수 있고 상보적인 폴리펩티드 쇄 (경쇄 또는 중쇄 폴리펩티드)를 식별하기 위해 가령, 유도된 선택을 이용할 수 있고 그렇게 함으로써 인간에서 감소된 면역원성을 갖는 조작된 항체를 생성한다. 예를 들어, 조작된 경쇄 폴리펩티드를 발생시키는 숙련자는 동족 인간 중쇄 폴리펩티드 서열을 식별하기 위해 유도된 선택 기술을 이용할 수 있고 그렇게 함으로써 공여자 항체와 비교하여 인간에서 더 적은 면역성인 조작된 항체를 발생시킨다. 유도된 선택 기술은 가령, 미국 특허 제 5,565,332 (Hoogenboom et al.에 의해 발행), Guo-Qiang and Xian-Li (2009) Methods Mol Biol 562:133-142, Klimka et al. (2000) Br J Cancer 83(2):252-260, 및 Beiboer et al. (2000) J Mol Biol 296(3):833-849에서 상세하게 설명된다. 간단히, 유도된 선택은 인간 상보적 (경쇄 또는 중쇄) 가변 영역의 레퍼토리(repertoire)와 관심의 항체 경쇄 폴리펩티드 또는 항체 중쇄 폴리펩티드 쌍을 짓는 것을 수반한다. 혼성체 쌍이 가령, 파지 디스플레이 기법(phage display technique)을 이용하여 검사된다. 관심의 항원에 대한 친화성을 보유한 특이적 혼성체 쌍이 선택될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 명세서에서 설명된 인간화 방법은 가령: 미국 특허 제 7,087,409; Rader et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:8910-8915; 및 Steinberger et al. (2000) J Biol Chem 275(46):36073-36078에서 설명된 바와 같은 다양한 인간 가변 영역 또는 일부 인간 가변 영역의 라이브러리를 검사하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 숙련자는 에쿨리주맙 경쇄 가변 영역의 FR3 및 FR4를 포함하는 중간 조작된 경쇄 폴리펩티드 카세트(cassette) 및 공여자 항체의 CDR3을 발생시킬 수 있다. (개시 카세트는 인접한 프레임워크 영역 및 CDR 서열의 임의의 조합, 가령: FR1-CDR1, FR1-CDR1-FR2, FR1-CDR1-FR2-CDR2, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3, CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, CDR2-FR3-CDR3-FR4, FR3-CDR3-FR4, CDR3-FR4, FR2-CDR2-FR3, CDR1-FR2-CDR2, 등일 수 있다는 것이 이해된다.) 이후 숙련자는 전술한 FR3-CDR3-FR4 카세트가 인간 FR1-CDR1-FR2-CDR2 카세트의 라이브러리와 연결되는 중간 조작된 경쇄 폴리펩티드의 다양한 라이브러리를 발생시킬 수 있다. 혼성체 쌍은 공여자 항체에 결합하는 항원과 동일한 항원에 결합하는 능력을 보유한 하나 이상의 각각의 혼성체 쌍을 식별하기 위해 및 공여자 항체와 비교하여 인간에서 감소된 면역원성을 증명하기 위해 (가령, 파지 디스플레이 기법을 이용하여) 검사될 수 있다. 본 명세서에서 설명된 방법에 따라서 항체를 인간화하기 위해 교환 카세트를 이용하기 위한 추가적인 방법이 가령, 미국 특허 출원 공개 공보 제 20060134098 및 20050255552에서 제시된다.
몇몇 실시양태에서, PRC-지향 돌연변이유발(PCR-directed mutagenesis)은 임의의 돌연변이를 조작된 항체의 프레임워크 영역 내로 도입하는데 이용될 수 있고 그렇게 함으로써 변이 조작된 항체의 라이브러리(library)를 발생시킨다. 몇몇 실시양태에서, 변이 조작된 항체의 라이브러리는 PCR을 이용하여 생성될 수 있으며, 여기서 표적된 돌연변이는 조작된 항체의 하나 이상의 프레임워크 영역 내로 도입된다.
변이 조작된 항체 라이브러리의 최소 일부는 공여자 항체와 비교하여 인간에서 항원에 대해 향상된 친화성 및/또는 감소된 또는 추가로 감소된 면역원성과 같은 하나 이상의 원하는 특성을 갖는 변이 조작된 항체를 식별하기 위해 선별(screen)될 수 있다. 항체 라이브러리를 선별하기 위한 방법은 항체 조작의 당업계에서 잘 알려져 있고 가령, 파지-디스플레이, 박테리아 디스플레이, 효모 표면 디스플레이, 진핵 바이러스 디스플레이, 포유류 세포 디스플레이, 및 무세포 (가령, 리보솜 디스플레이) 항체 선별 기술을 포함한다(가령, Etz et al. (2001) J Bacteriol 183:6924-6935; Cornelis (2000) Curr Opin Biotechnol 11:450-454; Klemm et al. (2000) Microbiology 146:3025-3032; Kieke et al. (1997) Protein Eng 10:1303-1310; Yeung et al. (2002) Biotechnol . Prog. 18:212-220; Boder et al. (2000) Methods Enzymology 328:430-444; Grabherr et al. (2001) Comb Chem High Throughput Screen 4:185-192; Michael et al. (1995) Gene Ther 2:660-668; Pereboev et al. (2001) J Virol 75:7107-7113; Schaffitzel et al. (1999) J Immunol Methods 231:119-135; 및 Hanes et al. (2000) Nat Biotechnol 18:1287-129를 참고). 파지-디스플레이 항체 선별은 파지 (가령, M13 사상 파지 또는, T4, 또는 T7 파지) 표면상에 나타난 항체 단백질이 발현하는 것을 수반한다. 가령, Sidhu (2001) Biomol Eng 18:57-63; Maruyama et al. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:8273-8277; Ren and Black (1998) Gene 215:439-444; Rosenberg et al. (1996) InNovations 6:1-6; 및 Castagnoli et al. (2001) Comb Chem High Throughput Screen 4:121-133을 참고. 간단히, 박테리오파지 외피 단백질 (가령, M13 파지의 pIII 또는 pVIII) 및 상이한 조작된 항체의 융합 단백질을 각각 암호화하는 다수의 파지미드 벡터(phagemid vector)는 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 생성되고 이후, 박테리아 (가령, 대장균(E. coli))의 모집단 내로 도입된다. 박테리아에서 박테리오파지의 발현은, 몇몇 실시양태에서, 보조 파지(helper phage)의 이용을 요구할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 보조 파지가 요구되지 않는다 (가령, Chasteen et al. (2006) Nucleic Acids Res 34(21):e145를 참고). 박테리아로부터 생성된 파지는 회수되고 이후, 가령, 고형 지지체에 결합된 표적 항원과 접촉된다. 결합되지 않은 파지는 고형 지지체를 세척함으로써 제거된다. 세척 단계 다음, 결합된 파지는 가령, 유리형 표적 항원 경쟁자를 이용하여 이후, 고형 지지체로부터 용출된다. 일반적으로, 임의의 용출된 파지는 표적 항원에 결합하는 항체 (또는 이의 단편)를 포함하는 것으로 간주될 수 있다. 각각의 파지 모집단은 가령, 웰 당 하나의 파지의 다수의 감염이 있는 다중-웰(well) 분석 플레이트(plate)의 웰에서 성장한 박테리아를 감염시킴으로써 단리될 수 있다.
표적 항원에 대해 더 높은 친화성을 갖는 (반면에 비-구체적으로 항원에 결합할 수 있는 파지 부분을 감소시키는) 항체를 포함한 파지 입자에 대해 파지 모집단을 농축시키기 위해, 용출된 파지 (상기 설명된)는 박테리아성 숙주 세포의 모집단을 재-감염시키는데 이용될 수 있다. 이후, 발현된 파지는 박테리아로부터 얻어지고 그리고 다시 고형 지지체 (가령, 비드(bead) 또는 칼럼(column)의 표면)에 결합된 표적 항원과 접촉된다. 결합되지 않은 파지는 고체 지지체를 세척함으로써 제거된다. 세척 단계 다음, 결합된 파지는 가령, 유리형 표적 항원 경쟁자를 이용하여, 이후, 고형 지지체로부터 용출된다. 파지 입자가 대상이 되는 감염-결합-용출 주기 횟수는 표적 항원에 대해 더 높은 친화성을 갖는 항체를 포함하는 파지에 대한 농축 수준과 일반적으로 관련이 있다.
항체 파지 디스플레이를 위한 방법은 가령, O' Brien and Aitken (2002) "Antibody Phage Display: Methods and Protocols", Humana Press (ISBN 0896037118); Barbas et al. (2004) "Phage Display: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press (ISBN: 0879697407); 및 Figini et al. (1998) Cancer Res 58:991-996에서 또한 설명되고, 이들 각각의 개시는 이의 전체에서 참조로서 본 명세서에 편입된다. 고-처리량 선별 캠페인(high-throughput screening campaign)에 이용을 위한 항체 파지 디스플레이의 여러 가지 단계를 자동화하기 위한 방법은 가령, Konthur and Walter (2002) TARGETS 1(1):30-36에서 설명된다.
추가적인 선별 방법은 공여자 항체에 결합하는 항원과 동일한 항원에 결합하는 조작된 항체를 식별하는데 이용가능하다. 예를 들어, 상기 방법의 숙련자는 임의의 여러 가지 필터(filter) 선별 방법을 이용할 수 있으며, 가령, 여기서 분비된 항체 단편은 막에 끼어 용해성 표적 항원과 접촉된다. 가령, Skerra et al. (1991) Anal Biochem 196:151-5를 참고. 이 경우에, 박테리아의 주변 세포질 내로 Fab 단편의 분비를 지시하는 박테리아 함유 플라스미드 벡터는 막 또는 필터에서 성장된다. 분비된 단편은 항체 단편 (가령, 항-면역글로불린 항혈청)에 결합할 수 있는 항체로 코팅된 두번째 "포획(capture)" 막으로 분산되도록 허용되고 포획 필터는 특이적 항원으로 탐색(probe)된다. 항체-효소 접합체(conjugate)는 유색 점(colored spot)으로서 포획 막에서 항원-결합 항체 단편을 검출하는데 이용될 수 있다. 콜로니(colony)는 첫번째 막에서 재-성장하고 원하는 항체 단편을 발현하는 클론(clone)이 회수된다.
상기 방법의 숙련자는 공여자 항체에 결합하는 항원과 동일한 항원에 결합하는 조작된 항체를 선별하기 위해 ELISA 기술을 또한 이용할 수 있다. 단일 클론으로부터 발현된 각각의 조작된 항체, 또는 다수의 클론에 의해 생성된 다수의 조작된 항체의 풀(pool)은 가령, Watkins et al. (1997) Anal . Biochem. 253:37-45에서 설명된 바와 같이 분석될 수 있다. 숙련자는 콜로니 리프트 결합 분석(colony lift binding assay)을 또한 이용하며, 여기서 항체는 항원-코팅된 막으로 직접적으로 분산되도록 허용된다. 이러한 방법은 가령, Giovannoni et al. (2001) Nucleic Acids Research 29(5):e27에서 설명된다.
조작된 항체가 인간에서 면역성인지 아닌지 확인하기 위한 방법이 당업계에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, 조작된 항체는 위상 0(Phase 0) 임상 연구의 일부로서 인간 피험자에게 투여될 수 있다. 가령, Kinders et al. (2007) Molecular Interventions 7:325-334를 참고. 조작된 항체는 경구로 또는 경피로 투여될 수 있고, 또는 정맥 내로, 피하로, 근육 내로, 복막 내로, 직장 내로, 질 내로, 비강 내로, 위 내로, 기관 내로, 또는 폐 내로 주사 (또는 주입)될 수 있다. 항체는 적절한 림프 조직 (가령 비장, 림프절, 또는 점막-연관 림프 조직 (MALT))에 직접적으로 전달될 수 있다. 원한다면, 부스터 면역(booster immunization)은 여러 시간(가령, 일주일 간격을 두고)에 한번 또는 여러 번 (예를 들어, 2, 3, 4, 8 또는 12번) 제공될 수 있다. 이후, 조작된 항체 대해 특이적인 항체(가령, IgG, IgM, 또는 IgA) 반응은 당업계에서 숙련자에게 정통한 시험관내(in vitro) 분석, 가령, ELISA를 이용하여 전신으로 (가령, 혈청에서) 또는, 예를 들어, 다양한 점막 부위 (가령, 타액 또는 위 및 기관지폐포 세척액에서)에서 이러한 항체의 존재에 대해 검사함으로써 측정될 수 있다. 상업적 ELISA-기반 키트는 이용가능하고 가령, HAHA ELISA ELPCO™ Immunoassay (ALPCO Diagnostics, Salem, NH)를 포함한다. 치료용 항체와 결합하고 치료용 항체의 활성도를 저해하는 중화 항체의 피험자 (가령, 인간 피험자)에 의한 생성을 검출하기 위한 적합한 방법 (가령, ELISA 또는 SPR 방법)이 당업계에서 알려져 있고 작업 실시예에서 예시화된다. 적합한 방법은 가령, Welt et al. (2003) Clin Cancer Res 9(4):1338-46; Aarden et al. (2008), supra; Szolar et al. (2006) J Pharm Biomed Anal 41(4):1347-1353; Lofgren et al. (2007) J Immunol 178(11):7467-7472; Ritter et al. (2001) Cancer Res 61:6851-6859; 및 Buist et al. (1995) Cancer Immunology , Immunotherapy 40(1):24-30에서 또한 설명된다. 대안적으로, 또는 게다가, CD4+ T 세포 반응이 항체 반응을 위해 일반적으로 요구되기 때문에, 시험관내(in vitro)에서 조작된 항체에 대한 CD4+ T 세포 반응이 당업계에서 알려져 있는 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 이러한 방법은 CD4+ T 세포 증식 또는 림포카인 (가령, 인터루킨-2, 인터루킨-4, 또는 인터페론-γ) 생성 분석을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 본 명세서에서 설명된 방법은 공여자 항체 (가령, 인간화 공여자 항체)가 인간에서 면역성일 가능성이 있는지, 없는지 또는 면역성으로 예상되는지 안 되는지 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 명세서에서 설명된 방법은 인간에서 조작된 항체의 잠재적 면역원성을 인실리코 (in silico)로 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 제공된 항체 또는 항체 가변 영역의 잠재적 면역원성을 예상하기 위한 적합한 컴퓨터-기반 방법/알고리즘은 당업계에서 알려져 있고 SYFPEITHI, TEPITOPE, BEPITOPE, RANKPEP (Harvard University), MMPred, PREDICT, MHCBench, 및 ABCpred를 제한됨 없이, 포함한다. Rammensee et al. (1999) Immunogenetics 50:213; Saha and Raghava (2007) Methods Mol Biol 409:387-394; El-Manzalawy et al. (2008) J Mol Recognit 21(4):243-255; Sturniolo et al. (1999) Nat Biotechnol 17:555; Bhasin and Raghava (2004) Bioinformatics 20(3):421-423; 및 van de Weert and Moller (2008), "Immunogenicity of Biopharmaceuticals", Volume 8 of Biotechnology: Pharmaceutical Aspects, Springer Press ("Epitope prediction tools, databases and data sets" 라는 제목의 표 4.2를 참고)를 참고. 인실리코 (in silico) 확인법은 조작된 항체 (가령, 하나 이상의 공여자 항체의 평가)의 발생에 앞서 및/또는 조작된 항체 (가령, 인간에게 조작된 항체를 투여하기 전)의 발생 후에 일어날 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 인실리코 (in silico) 확인법은 조작된 항체 (가령, 하나 이상의 복귀-돌연변이를 조작된 항체 내로 도입)를 재형성 후 일어날 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 인실리코 (in silico) 방법은 숙련자에게 조작된 항체에 어떤 재형성 기술이 이용될지를 결정하는데 대해 지침을 주는 것을 돕는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 숙련자가 두가지의 비교가능한 재형성 기술 (가령, 프레임워크 영역내 두개의 상이한 아미노산 위치 중 하나에서의 복귀-돌연변이) 사이에서 선택할 수 있다면, 두가지 기술 중 어떠한 것이 인간에서 면역원성에 대해 최소의 잠재성을 갖는 조작된 항체를 야기할 수 있는지 결정하기 위해 숙련자는 전술한 인실리코 (in silico) 방법에 의존할 수 있다.
조작된 항체를 발현시키기 위한 방법
조작된 항체를 암호화하는 핵산(들)은 전사 및 번역 조절 서열을 포함한 발현 벡터 내로 삽입될 수 있고, 이는 가령, 프로모터 서열, 리보솜 결합 부위, 전사 개시 및 정시 서열, 번역 개시 및 정지 서열, 전사 종결 신호, 폴리아데닐화 신호, 및 증폭자 또는 활성자 서열을 포함한다. 조절 서열은 프로모터 및 전사 개시 및 정지 서열을 포함한다. 게다가, 발현 벡터는 하나 이상의 복제 시스템을 포함하여 두개의 상이한 유기체, 예를 들어 발현을 위해 포유류 또는 곤충 세포에서 및 클로닝 및 증폭을 위해 원핵 숙주에서 유지될 수 있도록 할 수 있다.
여러 가지 가능한 벡터 시스템은 포유류 세포에서 핵산으로부터 클로닝된 조작된 항체 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩티드의 발현에 이용가능하다. 벡터의 첫번째 종류는 숙주 세포 유전체 내로 원하는 유전자 서열의 통합에 의존한다. 안정되게 통합된 DNA를 갖는 세포는 대장균(E. coli) gpt (Mulligan and Berg (1981) Proc Natl Acad Sci USA 78:2072) 또는 Tn5 neo (Southern and Berg (1982) Mol Appl Genet 1:327)와 같은 약물 저항 유전자를 동시에 도입함으로써 선택될 수 있다. 선택 마커 유전자는 발현되기 위해 DNA유전자 서열에 연결되거나, 또는 공동-형질감염에 의해 동일한 세포 내로 도입될 수 있다 (Wigler et al. (1979) Cell 16:77). 벡터의 두번째 종류는 자체적으로 복제하는 능력을 염색체외 플라스미드에 부여하는DNA 요소를 활용한다. 이들 벡터는 소 유두종바이러스(Sarver et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA, 79:7147), 폴리오마 바이러스 (Deans et al. (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:1292), 또는 SV40 바이러스 (Lusky and Botchan (1981) Nature 293:79)와 같은 동물 바이러스로부터 파생될 수 있다.
발현 벡터는 핵산의 차후 발현에 적합한 방식으로 세포 내로 도입될 수 있다. 도입의 방법은 하기 설명된, 표적된 세포 유형에 의해 대체로 좌우된다. 예시적인 방법은 CaPO4 침전, 리포솜 융합, 리포펙틴(lipofectin), 전기천공법, 바이러스 감염, 덱스트란(dextran)-매개 형질감염, 폴리브렌(polybrene)-매개 형질감염, 및 직접 미세주입법을 포함한다.
조작된 항체의 발현을 위한 적절한 숙주 세포는 가령, 효모, 박테리아, 곤충, 및 포유류 세포를 포함한다. 특정 관심이 있는 것은 대장균(E. coli)과 같은 박테리아, 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)와 같은 곰팡이, SF9와 같은 곤충 세포, 포유류 세포주 (가령, 인간 세포주), 그리고 1차 세포주이다. 항체의 발현을 위해 선택된 숙주 세포의 유형은 발현되고자 하는 항체의 특정 유형에 그리고 발현된 항체의 의도된 이용에 부분적으로 의존할 것이다. 예를 들어, 숙련자는 단일 쇄 항체 또는 항체의 Fab 단편을 발현시키기 위해 박테리아 숙주를 선택할 것이고, 반면에 숙련자는 전체 항체 발현을 위해 포유류 세포 숙주를 선택할 것이다.
조작된 항체는 항체의 발현을 허용하는데 충분한 조건 하에, 및 충분한 시간 동안, 항체를 암호화하는 핵산을 포함한 발현 벡터를 이용하여 형질전환된 숙주 세포를 배양함으로써 세포로부터 생성된다. 단백질 발현을 위한 이러한 조건은 발현 벡터 및 숙주 세포의 선택으로 달라질 것이고 통상적인 실험을 통해 당업계에서 숙련자에 의해 쉽게 확인될 수 있다. 예를 들어, 대장균(E. coli)에서 발현된 조작된 항체는 봉입체로부터 다시 접힐 수 있다 (가령, Hou et al. (1998) Cytokine 10:319-30을 참고). 이들의 이용을 위한 박테리아 발현 시스템 및 방법은 당업계에서 잘 알려져 있다. 코돈, 적합한 발현 벡터 및 적합한 숙주세포의 선택은 많은 요인에 따라 달라질 것이고, 필요에 따라 쉽게 최적화될 수 있다. 조작된 항체는 포유류 세포에서 또는 효모, 바큘로바이러스, 및 시험관내(in vitro) 발현 시스템을 포함하지만 이에 제한되지 않은 다른 발현 시스템에서 발현될 수 있다 (가령, Kaszubska et. al. (2000) Protein Expression and Purification 18:213-220을 참고).
몇몇 실시양태에서, 조작된 항체는 형질전환 동물 (가령, 형질전환 포유류)에서 발현 및 정제될 수 있다. 예를 들어, 조작된 항체는 가령, Houdebine (2002) Curr Opin Biotechnol 13(6):625-629; van Kuik-Romeijn et al. (2000) Transgenic Res 9(2):155-159; 및 Pollock et al. (1999) J Immunol Methods 231(1-2):147-157에서 설명된 바와 같이 형질전환 비-인간 포유류 (가령, 설치류)에서 생성될 수 있고 그리고 원유(milk)로부터 단리될 수 있다. 적합한 항체 발현 방법은 또한 Thomas et al. (1996), supra에서 제시된다.
발현 후, 조작된 항체는 단리될 수 있다. 본 명세서에서 설명된 임의의 폴리펩티드(가령, 조작된 항체)에 적용된 바와 같은 용어 "단리된" 또는 "정제된"은 가령, 단백질을 발현하는 원핵생물에서 다른 단백질, 지질, 및 핵산을 자연적으로 동반하는 성분 (가령, 단백질 또는 다른 자연적으로-발생한 생물 또는 유기 분자)으로부터 분리되거나 정제된 폴리펩티드를 나타낸다. 전형적으로, 폴리펩티드는 샘플에서 전체 단백질의 최소 60 (가령, 최소 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 또는 99)중량%를 구성할 때, 정제된다.
조작된 항체는 샘플 내에 어떠한 다른 성분이 존재하는지에 따라서 당업계에서 숙련자에게 알려져 있는 여러 가지 방법으로 단리되거나 또는 정제될 수 있다. 표준 정제 방법은 전기영동 기술, 분자 기술, 면역 기술, 및 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 및 역-상 HPLC 크로마토그래피를 포함한 크로마토그래피 기술을 포함한다. 예를 들어, 조작된 항체는 표준 항-항체 칼럼 (가령, 단백질-A 또는 단백질-G 칼럼)을 이용하여 정제될 수 있다. 단백질 농도와 함께, 한외여과(ultrafiltration) 및 정용여과(diafiltration) 기술이 또한 유용하다. 가령, Scopes (1994) "Protein Purification, 3rd edition", Springer-Verlag, New York City, New York을 참고. 필요한 정제의 정도는 원하는 용도에 따라서 달라질 것이다. 일부 예시에서, 발현된 조작된 항체의 정제는 필요하지 않을 것이다.
단리된 조작된 항체의 수득률 또는 순도를 결정하기 위한 방법은 당업계에서 알려져 있고 가령, 브래드포드(Bradford) 분석, UV 분광법, 뷰렛(Biuret) 단백질 분석, 로우리(Lowry) 단백질 분석, 아미도 블랙 단백질(amido black protein) 분석, 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC), 질량 분섭법 (MS), 및 겔 전기영동 방법 (가령, 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 또는 콜로이드 은 염색과 같은 단백질 염색을 이용하여)을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 내독소는 발현된 조작된 항체로부터 제거될 수 있다. 단백질 샘플로부터 내독소를 제거하기 위한 방법은 당업계에서 알려져 있다. 예를 들어, 내독소는 ProteoSpin™ Endotoxin Removal Kits (Norgen Biotek Corporation), Detoxi-Gel Endotoxin Removal Gel (Thermo Scientific; Pierce Protein Research Products), MiraCLEAN® Endotoxin Removal Kit (Mirus), 또는 Acrodisc™-Mustang® E 막 (Pall Corporation)을, 제한됨 없이, 포함한 여러 가지의 상업적으로 이용가능한 시약을 이용하여 단백질 샘플로부터 제거될 수 있다.
샘플 내에 존재하는 내독소의 양을 검출 및/또는 측정하기 위한 방법 (정제 전후 모두)은 당업계에서 알려져 있고 상업적 키트가 이용가능하다. 예를 들어, 단백질 샘플 내에 내독소의 농도는 QCL-1000 발색 키트(Chromogenic kit) (BioWhittaker), Pyrotell®, Pyrotell®-T, Pyrochrome®, Chromo-LAL과 같은 리물루스 아메바모양 용해물(limulus amebocyte lysate) (LAL)-기반 키트 및 Associates of Cape Cod Incorporated에서 이용가능한 CSE 키트를 이용하여 측정될 수 있다.
제약학적 조성물
본 명세서에서 설명된 조작된 항체를 포함한 조성물은 제약학적 조성물로서 조제될 수 있다. 제약학적 조성물은 제약학적으로 허용되는 담체를 일반적으로 포함할 것이다. 본 명세서에서 이용된 바와 같은, "제약학적으로 허용되는 담체"는 생리학적으로 상용성인 임의의 및 모든 용매, 분산 배지, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장성(isotonic) 및 흡수 지연제 등을 나타내고, 포함한다. 조성물은 제약학적으로 허용되는 염, 가령, 산 부가염 또는 염기 부가염을 포함할 수 있다 (가령, Berge et al. (1977) J Pharm Sci 66:1-19를 참고).
조성물은 표준 방법에 따라서 조제될 수 있다. 제약학적 조제는 잘 확립된 기술이고, 가령, Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20th Edition, Lippincott, Williams & Wilkins (ISBN: 0683306472); Ansel et al. (1999) "Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems", 7th Edition, Lippincott Williams & Wilkins Publishers (ISBN: 0683305727); 및 Kibbe (2000) "Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association", 3rd Edition (ISBN: 091733096X)에서 추가로 설명된다. 몇몇 실시양태에서, 조성물은 예를 들어, 적합한 농도에서 및 저장하는데 적합한 2-8℃ (가령, 4℃)에서 완충 용액으로서 조제될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 조성물은 0℃ (가령, -20℃ 또는 -80℃) 아래의 온도에서 저장을 위해 조제될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 조성물은 2-8℃ (가령, 4℃)에서 최대 2년 (가령, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 1½년, 또는 2년) 동안 저장을 위해 조제될 수 있다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 본 명세서에서 설명된 조성물은 2-8℃ (가령, 4℃)에서 최소 1년 동안 저장하는데 안정적이다.
제약학적 조성물은 여러 가지의 형태일 수 있다. 이들 형태는 가령, 액상 용액 (가령, 주사가능한 및 주입가능한 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 알약, 분말, 리포좀 및 좌제와 같은 액상, 반-고형 및 고형 제형을 포함한다. 바람직한 형태는 투여 및 치료적 적용의 의도된 방식에, 부분적으로, 의존한다. 예를 들어, 전신 또는 국소 전달을 위해 의도된 항체 또는 단편을 포함한 조성물은 주사가능한 또는 주입가능한 용액의 형태일 수 있다. 따라서, 조성물은 비경구 방식 (가령, 정맥내, 피하, 복강내, 또는 근육내 주사)에 의한 투여를 위해 조제될 수 있다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, "비경구 투여", "비경구적으로 투여된", 및 다른 문법적으로 동일한 구절은 장관 및 국소 투여 외에 주로 주사에 의한 투여의 방식을 나타내고 정맥내, 비강내, 안구내, 폐, 근육내, 동맥내, 척추강내, 캡슐내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외, 대뇌내, 두개내, 경동맥내 및 흉골내 주사 및 주입을, 제한됨 없이, 포함한다 (하기 참고).
몇몇 실시양태에서, 본 명세서에서 설명된 조작된 항체는 인간에게 폐내 투여 (가령, 분무기 또는 흡입기를 통한 투여를 위한)하는 것에 적합한 조성물로서 조제될 수 있다. 이러한 조성물을 제조하기 위한 방법은 당업계에서 잘 알려져 있고 가령, 미국 특허 출원 공개 공보 제 20080202513; 미국 특허 제 7,112,341 및 6,019,968; 및 PCT 출원 공개 공보 제 WO 00/061178 및 WO 06/122257에서 설명되고, 이들 각각의 개시는 이들 전체에서 참조로서 본 명세서에 편입된다. 건조 분말 흡입기 제제 및 제제를 투여하는데 적합한 시스템은 가령, 미국 특허 출원 공개 공보 제 20070235029, PCT 공개 공보 제 WO 00/69887; 및 미국 특허 제 5,997,848에서 설명된다.
조성물은 고농도에서 안정한 저장에 적합한 용액, 마이크로에멀젼(microemulsion), 분산액, 리포좀, 또는 다른 질서 구조로서 조제될 수 있다. 멸균된 주사가능한 용액은 요구된 바와 같이, 상기 열거된 성분의 하나 또는 조합으로 적합한 용매내 요구되는 양에 본 명세서에서 설명된 항체 (또는 항체의 단편)를 편입시킴으로써, 그 다음 여과된 멸균법으로 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 본 명세서에서 설명된 항체 또는 단편을 기본적인 분산 배지 및 상기 열거된 것들 중에서 요구되는 다른 성분을 포함하는 멸균 비히클(vehicle) 내로 편입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조를 위한 방법은 본 명세서에서 설명된 조작된 항체의 분말과 이의 이전 살균-필터 용액으로부터 임의의 추가적인 원하는 성분 (하기 참고)을 수득하는 진공 건조 및 동결-건조 단계를 포함한다. 용액의 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 주사가능한 조성물의 지연된 흡수는 흡수를 지연시키는 시약, 예를 들어, 모노스테아레이트 염, 및 젤라틴을 조성물 내에 포함시킴으로써 야기될 수 있다.
특정 실시양태에서, 조작된 항체는 이식물(implant) 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함한, 서방성 제제와 같은, 빠른 방출에 대항하여 화합물을 보호하는 담체를 이용하여 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오쏘에스터, 및 폴리유산과 같은 생분해성, 생체적합성 폴리머(polymer)가 이용될 수 있다. 이러한 제제의 제조를 위한 많은 방법이 당업계에서 알려져 있다. 가령, J.R. Robinson (1978) "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems" Marcel Dekker, Inc., New York을 참고.
조작된 항체를 암호화하는 핵산은 세포 내에서 작용제를 발현시키는데 및 생성하는데 이용할 수 있는 핵산을 전달하기 위한 유전자 요법 프로토콜의 일부로서 이용되기 위해 유전자 구조체 내로 편입될 수 있다 (하기 참고). 이러한 성분의 발현 구조체는 임의의 치료적으로 유효한 담체, 가령, 생체내(in vivo) 세포에 성분 유전자를 효과적으로 전달할 수 있는 임의의 제제 또는 조성물에 담겨 투여될 수 있다. 접근법은 재조합 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 렌티바이러스(lentivirus), 및 단순 헤르페스 바이러스-1 (HSV-1), 또는 재조합 바이러스 또는 진핵 플라스미드를 포함한 바이러스 벡터내 대상 유전자의 삽입을 포함한다. 바이러스 벡터는 세포를 직접적으로 형질감염할 수 있다; 플라스미드 DNA는 예를 들어, 양이온성 리포좀(리포펙틴) 또는 유도된 (가령, 항체가 접합된) 폴리라이신 접합체, 그라미시딘 S(gramicidin S), 인공 바이러스 외막 또는 다른 이러한 세포간 담체, 그리고 유전자 구조체의 직접 주사 또는 생체내(in vivo)에서 수행된 CaPO4 침전 (가령, WO04/060407를 참고)의 도움으로 전달될 수 있다. (또한 하기 "생체외 접근(Ex vivo Approaches)" 참고.) 적합한 레트로바이러스의 예시는 당업계에서 숙련자에게 알려져 있는 pLJ, pZIP, pWE 및 pEM을 포함한다 (가령, Eglitis et al. (1985) Science 230:1395-1398; Danos and Mulligan (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:6460-6464; Wilson et al. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:3014-3018; Armentano et al. (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87:6141-6145; Huber et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:8039-8043; Ferry et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:8377-8381; Chowdhury et al. (1991) Science 254:1802-1805; van Beusechem et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:7640-7644; Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:10892-10895; Hwu et al. (1993) J Immunol 150:4104-4115; 미국 특허 제 4,868,116 및 4,980,286; PCT 공개 공보 제 WO89/07136, WO89/02468, WO89/05345, 및 WO92/07573을 참고). 또 다른 바이러스 유전자 전달 시스템은 아데노바이러스-유도된 벡터를 활용한다 (가령, Berkner et al. (1988) BioTechniques 6:616; Rosenfeld et al. (1991) Science 252:431-434; 및 Rosenfeld et al. (1992) Cell 68:143-155를 참고). 아데노바이러스주 Ad 유형 5 dl324 또는 다른 아데노바이러스주 (가령, Ad2, Ad3, Ad7, 등.)로부터 파생된 적합한 아데노바이러스 벡터는 당업계에서 숙련자에게 알려져 있다. 대상 유전자의 전달에 유용한 또 다른 바이러스 벡터 시스템은 아데노-연관 바이러스 (AAV)이다. 가령, Flotte et al. (1992) Am J Respir Cell Mol Biol 7:349-356; Samulski et al. (1989) J Virol. 63:3822-3828; 및 McLaughlin et al. (1989) J Virol 62:1963-1973을 참고.
적용
상기 설명된 바와 같이, 본 명세서에서 설명된 조작된 항체는, 그 중에서도(inter alia), 이를 파생시켰던 공여자 항체의 면역원성과 비교하여 인간에서 감소된 면역성을 갖는 것으로 특징지어진다. 따라서, 조작된 항체는 매우 다양한 진단적 및/또는 치료적 적용에, 가령, 조작된 항체가 인간에게 만성적으로 투여되도록 할 때 이용될 수 있다. 어떠한 방식으로도 제한될 의도없이, 조작된 항체가 발생 및/또는 이용될 수 있는 여러 가지 예시적인 적용이 하기 상술된다.
치료용 항- TNF α 항체
인간 환자에게 만성적으로 투여되는 치료용, 인간화 항-TNFα 항체는 모든 치료된 환자의 상당 비율에서 인간 항-인간 항체 (HAHA) 반응을 유도하기 위해 의료 숙련자에 의해 찾아진다. 더욱이, 이들 환자에서 발생된 항체는 항-TNFα 항체의 치료적 활성도를 실질적으로 중화시킨다. 따라서, 이들 환자에게 항-TNFα 항체의 지속적인 투여는 치료적 혜택을 거의 제공하지 않을 것이라는 것이 밝혀진다. 환자는 류마티스 관절염, 크론병, 궤양성 장염, 및 강직성 척추염을 포함한 여러 가지 중증 자가면역 질환을 앓고, 그리고 그들은 그들의 질병을 효과적으로 치료하기 위해 항-TNFα 항체에 의존한다.
공여자 항-TNFα 항체의 CDR은 본 명세서에서 설명된 감소된 면역원성 수용자 항체 스캐폴드 내로 이식된다. 새로 조작된 항-TNFα 항체는 TNFα에 결합하는 이의 능력에 대해 검사되고, TNFα에 대해 공여자 항-TNFα 항체의 친화성과 대략적으로 동일한 친화성을 갖는다는 것으로 밝혀진다. 위상 0 연구에서, 조작된 항체는 6개월 동안 매달 한번씩 인간 환자 집단에게 투여된다. 혈액 샘플은 매달 투여 바로 직전에 각각의 환자로부터 얻어지고 샘플은 환자가 조작된 항체에 대한 항체를 발생시키는지 확인하는데 이용된다. 조작된 항체로 치료된 환자의 훨씬 더 낮은 비율은 본래 인간화 항-TNFα 항체로 치료된 환자의 비율과 비교하여 HAHA 반응을 발달시킬 것이다. 따라서, 또한 조작된 항체는 본래 인간화 항-TNFα 항체와 비교하여 다수의 환자에서 중증 자가면역 질환의 만성 치료에 효과적일 것이다.
치료용 항- VEGF 항체
인간 환자에게 한번 이상 투여되는 치료용, 인간화 항-혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 항체는 치료된 환자의 상당 비율에서 중화 HAHA 반응을 유도하기 위해 의료 숙련자에 의해 찾아진다. 환자는 대장암을 앓고 그리고 각각의 사례에서, 그들은 그들의 암을 치료하기 위해 항-VEGF 요법에 의존한다.
공여자 항-VEGF 항체의 CDR은 본 명세서에서 설명된 감소된 면역원성 수용자 항체 스캐폴드 내로 이식된다. 새로 조작된 항-VEGF 항체는 VEGF에 결합하는 이의 능력에 대해 검사되고, VEGF에 대해 공여자 항-VEGF 항체의 친화성과 대략적으로 동일한 친화성을 갖는다는 것으로 밝혀진다. 위상 0 연구에서, 조작된 항체는 2개월 동안 2주에 한번씩 인간 환자 집단에게 투여된다. 혈액 샘플은 매 투여 바로 직전에 각각의 환자로부터 얻어지고 샘플은 환자가 조작된 항체에 대한 항체를 발생시키는지 확인하는데 이용된다. 조작된 항체로 치료된 환자의 훨씬 더 낮은 비율은 본래 인간화 항-VEGF 항체로 치료된 환자의 비율과 비교하여 HAHA 반응을 발달시킬 것이다. 또한 조작된 항체는 본래 인간화 항-VEGF 항체와 비교하여 다수의 환자에서 대장암 치료에 효과적일 것이다.
치료용 항- CD20 항체
인간 환자에게 한번 이상 정맥 내로 투여되는 치료용, 인간화 항-CD20 항체는 치료된 환자의 상당 비율에서 중화 HAHA 반응을 유도하기 위해 많은 의료 숙련자에 의해 찾아진다. 환자는 비-호지킨 림프종을 앓고 그리고 각각의 사례에서, 환자는 그들의 질환을 치료하는 것을 보조하기 위해 항-CD20 요법에 의존한다.
공여자 항-CD20 항체의 CDR은 본 명세서에서 설명된 감소된 면역원성 수용자 항체 스캐폴드 내로 이식된다. 새로 조작된 항-CD20 항체는 CD20에 결합하는 이의 능력에 대해 검사되고, CD20 단백질에 대해 공여자 항-CD20 항체의 친화성과 비교하여 CD20 단백질에 대해 감소된 친화성을 갖는다는 것으로 밝혀진다. 항체는 CD20에 대해 향상된 친화성을 갖는 변이 조작된 항-CD20 항체를 식별하기 위해 재형성 기술의 대상이 된다. 치환 돌연변이는 2개의 중쇄 가변 영역 프레임워크 아미노산 잔기 27 및 30 내로 도입된다 (Kabat et al.에 의해 정의된 바와 같이; Riechmann et al. (1988), supra 참고). 변이 조작된 항-CD20 항체는 CD20에 대한 이의 친화성에 대해 다시 검사되고 CD20 단백질에 대해 공여자 항-CD20 항체의 친화성과 적어도 동일한 CD20에 대해 향상된 친화성을 갖는다는 것으로 밝혀진다.
위상 0 연구에서, 변이 조작된 항체는 2개월 동안, 매주에 한번씩 인간 환자 집단에게 투여된다. 혈액 샘플은 매 투여 바로 직전에 각각의 환자로부터 얻어지고 샘플은 환자가 변이 조작된 항체에 대한 항체를 발생시키는지 확인하는데 이용된다. 변이 조작된 항체로 치료된 환자의 훨씬 더 낮은 비율은 본래 인간화 항-CD20 항체로 치료된 환자의 비율과 비교하여 HAHA 반응을 발달시킬 것이다. 또한 변이 조작된 항체는 본래 인간화 항-CD20 항체와 비교하여 다수의 환자에서 비-호지킨 림프종 치료에 효과적일 것이다.
치료용 항- IgE 항체
폐내 투여를 거쳐 인간 환자에 한번 이상 전달된 치료용, 인간화 항-IgE 항체는치료된 환자의 상당 비율에서 중화 HAHA 반응을 유도하기 위해 의료 숙련자에 의해 찾아진다. 환자는 천식 (중등 내지 고중증)을 앓는다.
공여자 항-IgE 항체의 CDR은 본 명세서에서 설명된 감소된 면역원성 수용자 항체 스캐폴드 내로 이식된다. 새로 조작된 항-IgE 항체는 IgE 중쇄 불변 영역에 결합하는 이의 능력에 대해 검사되고, IgE에 대해 공여자 항-IgE 항체의 친화성과 대략적으로 동일한 친화성을 갖는다는 것으로 밝혀진다. 위상 0 연구에서, 조작된 항체는 2개월 동안, 매 2주에 한번씩 인간 환자 집단에게 분무기에 의해 투여된다. 혈액 및 객담 샘플은 매 투여 바로 직전에 각각의 환자로부터 얻어진다. 샘플은 환자가 조작된 항체에 대한 항체를 발생시키는지 확인하는데 이용된다. 조작된 항체로 치료된 환자의 훨씬 더 낮은 비율은 본래 인간화 항-IgE 항체로 치료된 환자의 비율과 비교하여 HAHA 반응을 발달시킬 것이다. 또한 조작된 항체는 본래 인간화 항-IgE 항체와 비교하여 다수의 환자에서 천식 치료에 효과적일 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 에쿨리주맙 ("Ecu") (서열번호:2)의 경쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열및 I.23 면역글로불린 경쇄 가변 영역 ("I.23") (서열번호:8)에 대한 아미노산 서열의 정렬을 도시한다. 카밧(Kabat) 및 초티아(Chothia) 정의에 따라서 정의된 바와 같은 세개의 상보성 결정 영역(CDR) - LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 - 은 브라켓팅(bracketing)에 의해 식별된다. 경쇄 가변 영역 프레임워크 영역은 또한 명시된다. 에쿨리주맙 서열과 관련하여 아미노산 위치(카밧(Kabat) 넘버링(numbering)에 의해 정의된 바와 같은)는 상기 정렬된 서열을 명시한다.
도 2는 에쿨리주맙 ("Ecu") (서열번호:5)의 중쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열및 H20C3 면역글로불린 중쇄 가변 영역 ("H20C3") (서열번호:7)에 대한 아미노산 서열의 정렬을 도시한다. 카밧(Kabat) 및 초티아(Chothia) 정의에 따라서 정의된 바와 같은 세개의 상보성 결정 영역(CDR) - HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 - 은 브라켓팅(bracketing)에 의해 식별된다. 중쇄 가변 영역 프레임워크 영역은 또한 명시된다. 에쿨리주맙 서열과 관련하여 아미노산 위치(카밧(Kabat) 넘버링(numbering)에 의해 정의된 바와 같은)는 상기 정렬된 서열을 명시한다. 위치 52a, 82a, 82b, 82c, 100a, 100b, 100c, 100d, 및 100e가 또한 특이적으로 식별된다.
다음의 실시예는 본 발명을, 제한하지 않고, 설명하는 것으로 의도된다.
실시예
실시예 1. 낮은 면역원성을 갖는 인간화 수용자 항체의 발생
인간 보체 성분 C5에 특이적으로 결합하는 쥐과 단일클론 항체 ("mαC5 항체")를 에쿨리주맙으로서 알려진 항체를 생성하기 위해 다음과 같이 인간화시켰다. mαC5 항체의 CDR을 mαC5 항체의 프레임워크와 높은 정도의 서열 상동성을 갖는 인간 프레임워크 영역 상에 이식하였다. mαC5 항체의 CDR에 대한 수용자서열로서 선택된 인간 가변 영역을 의문 서열(query sequence)로서 생쥐 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL) 서열을 활용하여 프로그램 TFASTA (NCBI)으로 Genbank 서브디렉토리(subdirectory) GB-PR을 스캔함으로써 선택하였다. 본 연구로부터 식별된 인간 VH 영역은 클론 H20C3H (Genbank 위치 번호 HUMIGHRL; 기탁번호 L02325)였다. 가령, Weng et al. (1992) J Immunol 149(7):2518-2529를 참고. 이 인간 VH 영역은 인간 유전체 VH 유전자 HG3 및 인간 유전체 JH5 유전자로부터 파생되었고, 그리고 이들 유전체 유전자로부터 프레임워크 영역에서 변화가 없음을 포함한다. 본 연구에서 식별된 인간 VL 영역은 클론 I.23 (Genbank 기탁번호 X72477)이었다. 가령, Klein et al. (1993) Eur J Immunol 23:3248-3271을 참고. 012　유전체 유전자내 암호화된 글루타민　(Q)　잔기와 비교하여 성숙 가변 영역의 위치　38에서 프레임워크 영역　2 (FR2)내 아르기닌　(R)의 도입과 함께,　이 인간　VL　영역은 인간 유전체　Vκ　유전자　012　및 유전체　Jκ1　유전자로부터 파생되었다. H20C3 VH 및 I.23 VL 서열에 대한 아미노산 서열은 본 명세서에서 각각, 서열번호: 7 및 8로서 제시한다. CDR-프레임워크 이식 (카밧(Kabat)-정의된 CDR에 기초한)을 중복-신장 PCR 기술을 이용하여 수행하였다. 아미노산 치환을 위치 28 및 30에서의 H20C3 VH 서열 내로 도입하였다. 구체적으로, 위치 28에서의 트레오닌 및 위치 30에서의 트레오닌을 각각, 이소류신 및 세린으로 치환하였다. 위치 28에서의 이소류신 및 위치 30에서의 세린은 에쿨리주맙의 CDR을 제공한 쥐과 항-C5 항체 서열에 존재하였다. 에쿨리주맙의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 및 I.23의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 도 1에서 도시된다. 에쿨리주맙의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 및 H20C3의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 도 2에서 도시된다. 에쿨리주맙의 완전한 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호:1에서 도시된다. 에쿨리주맙의 완전한 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호:4에서 도시된다. 위치 28 및 30은 초티아(Chothia) CDR 내에 포함된다는 점 및 결합된 카밧(Kabat)-초티아(Chothia) CDR을 이식하였다면, 동일한 최종 결과를 위치 28 및 30에서 치환할 필요없이 얻었을 것이라는 점을 주목한다.
실시예 2. 인간 항- 에쿨리주맙 항체를 검출하기 위한 분석
다음의 분석을 에쿨리주맙으로 치료한 환자로부터의 생물학적 샘플에서 인간 항-에쿨리주맙의 존재를 검출하는데 이용하였다. 분석은 두 단계를 포함한다: 선별 단계 및 확정 단계. 선별 단계 분석은 음성 대조군 (정상 인간 혈청; 대조군 샘플) 및 양성 대조 기준 표준물의 맥락에서 환자 혈액 샘플 (검사 샘플)의 평가를 포함하였다. 환자 혈청 또는 검사 샘플을 25μL의 에쿨리주맙으로 치료한 환자로부터의 혈청(v/v) 2% 용액을 96 웰 둥근 바닥 프로필렌 분석 플레이트(96 well round bottom propylene assay plate)의 웰에 첨가함으로써 평가하였다. 음성 대조군 샘플에 대해, 이러한 경우, 25μL의 2% (v/v) 정상 인간 혈청 (NHS) 풀(pool)을 플레이트의 웰에 첨가하였다. 일련의 양성 대조군 표준 샘플을 또한 제조하였고 상기 표준 샘플은 에쿨리주맙에 대항하여 발생한 항체의 상이한 사전결정량 (400, 100, 50, 25, 10, 5, 2, 및 0 ng/mL)을 포함한다. 25μL의 표준 샘플을 플레이트의 웰 세트에 첨가하였다. 검사, 대조군, 및 표준 샘플 각각을 삼중(triplicate)으로 평가하였다.
다음, 각각 2μg/mL의 (i) 비오틴(biotin)에 접합한 에쿨리주맙 및 (ii) 루테늄(ruthenium) (TAG)에 접합한 에쿨리주맙을 포함한 25μL의 용액을 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 첨가 후, 플레이트를 밀봉하고, 빛으로부터 보호하였고, 그리고 18시간 동안 상온에서 진탕(shaking)하여 배양하였다. 배양 후, 25μL 분취량(aliquot)의 스트렙타비딘(streptavidin)-코팅된 DynaBeads (Invitrogen; Carlsbad, California) 0.5 mg/ml 용액을 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 다시 밀봉하고, 빛으로부터 보호하였고, 그리고 3시간 동안 상온에서 진탕하여 배양하였다. 배양 후, 인산 완충 식염수에서 1% 소 혈청 알부민(BSA) 및 0.5% 트윈(Tween)-20을 포함한 150mL의 완충액을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트의 각 웰에서부터 생성된 빛(빛 방출)의 양을 BioVeris M-384 Detection System (Roche)을 이용하여 측정하였다.
샘플이 양성인지 아닌지 및 확정 단계에서 추가로 검사를 진행해야하는지 안해도 되는지 확인하기 위해, 다음의 선별 분석을 수행하였다. 검사 샘플을 포함한 웰에서부터 생성된 평균 빛 방출을 상응하는 대조군 샘플을 포함한 웰에서부터 생성된 평균 빛 방출로 나누었다. 결과로 얻은 수가 1.2보다 작거나 동일하면, 검사 샘플은 음성인 것으로 간주하였다. 결과로 얻은 수가 1.2보다 크면, 검사 샘플은 선별검사가 양성인 것으로 간주하고 확정 분석 단계를 진행하였다.
확정 분석은 약물-후 검사 샘플 (에쿨리주맙으로 치료한 환자로부터 얻은 혈액) 및 에쿨리주맙의 투여에 앞서 환자로부터 얻은 상응하는 혈액 샘플 (이하 "약물-전 샘플")의 직접적인 비교를 포함하였다. 약물-후 검사 샘플에서 존재하는 에쿨리주맙의 양을 측정하였다. 이후 "약물전+ec 샘플"을 생성하기 위해 측정된 농도의 에쿨리주맙을 약물전 샘플에 첨가하였다. 약물전 샘플에 에쿨리주맙의 첨가는 비표시(unlabeled) 약물 간섭에 기인한 혈청 매트릭스(matrix) 효과의 정도를 정규화하였다. 게다가, 확정 분석은 분석 신호 저해제로서 에쿨리주맙의 초과량이 존재에서 약물-후 검사 샘플 및 약물전+ec 샘플의 평가를 또한 포함하였고, 이는 "검사+저해제(INHIBITOR)" 및 "약물전+ec+저해제(INHIBITOR)" 샘플로서 본 명세서에서 언급된다. 초과 에쿨리주맙의 첨가는 분석 신호가 약물 특이적일 경우 평가하기 위함이다.
25μL의 검사 샘플 (2% v/v)을 96 웰 분석 플레이트의 6개의 웰에 첨가하였다. 유사하게, 25μL의 약물전+ec 샘플 (2% v/v)을 상기 분석 플레이트의 또 다른 6개의 웰에 첨가하였다. 검사+저해제(INHIBITOR) 조건을 발생시키기 위해, 25μL의 에쿨리주맙 50μg/mL 용액을 검사 샘플을 포함한 6개의 웰 중 3개에 첨가하였다. 이처럼, 약물전+ec+저해제(INHIBITOR) 조건을 발생시키기 위해, 25μL의 에쿨리주맙 50μg/mL 용액을 약물전+ec 샘플을 포함한 6개의 웰 중 3개에 첨가하였다. 상기 설명한 바와 같이, 각각 2μg/mL의 (i) 비오틴에 접합한 에쿨리주맙 및 (ii) 에쿨리주맙- TAG를 포함한 25μL의 용액을 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 첨가 후, 플레이트를 밀봉하고, 빛으로부터 보호하였고, 그리고 18시간 동안 상온에서 진탕하여 배양하였다. 배양 후, 25μL 분취량(aliquot)의 스트렙타비딘-코팅된 DynaBeads (Invitrogen; Carlsbad, California) 0.5 mg/ml 용액을 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 다시 밀봉하고, 빛으로부터 보호하였고, 그리고 3시간 동안 상온에서 진탕하여 배양하였다. 배양 후, 인산 완충 식염수에서 1% 소 혈청 알부민(BSA) 및 0.5% 트윈(Tween)-20을 포함한 150mL의 완충액을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트의 각 웰에서부터의 빛 방출을 BioVeris M-384 Detection System (Roche)을 이용하여 측정하였다.
샘플이 양성인지 (즉, 샘플이 인간 항-에쿨리주맙 항체를 포함한다) 확인하기 위해, 웰의 각 그룹으로부터 평균 빛 방출을 다음과 같이 평가하였다. 첫째, 비율 A는 약물전+ec 샘플을 포함한 웰에서부터 생성된 평균 빛 방출을 약물전+ec+저해제(INHIBITOR) 샘플을 포함한 웰에서부터 생성된 평균 빛 방출로 나눔으로써 측정하였다. 비율 A는 저해제의 존재에서 감소된 백그라운드(background) 혈청에서의 비특이적 신호 변화를 명시한다.
다음, 비율 B를 검사+저해제(INHIBITOR) 샘플을 포함한 웰에서부터 생성된 평균 빛 방출로 나눈 검사 샘플을 포함한 웰에서부터 생성된 평균 빛 방출로서 계산하였다. 비율 B는 저해제의 존재에서 감소된 검사 샘플에서의 임의의 빛 방출 변화을 나타낸다.
세번째 비율인, 비율 C는 비율 A로 나눈 비율 B로서 측정하였다. 따라서 비율 C는 검사 샘플을 제공한 환자에서 인간 항-에쿨리주맙 항체 반응의 발생으로 인한 빛 방출에 있어서 증가 (존재하면)를 나타낸다. 비율 C가 1.3보다 작으면, 검사 샘플은 확정 분석에서 음성인 것으로 간주하였다. 비율 C가 1.3보다 크면, 검사 샘플은 인간 항-에쿨리주맙 항체의 잠재적인 존재에 대해 양성인 것으로 간주하였다.
실시예 3. 중화 인간 항- 에쿨리주맙 항체를 검출하기 위한 분석
선별 및 확정 분석 (HAHA 양성 검사 샘플)둘 모두에서 양성으로 간주된 검사 샘플을 이후, 검사 샘플에서 존재하는 인간 항-에쿨리주맙 항체가 에쿨리주맙을 중화시킬 수 있는지 확인하기 위해 분석하였다.
분석을 위한 샘플을 제조하기 위해, 약물전 샘플 및 HAHA 양성 검사 샘플에서 보체 성분 C5의 양을 또한 측정하였다. 결과를 약물전 또는 HAHA 양성 검사 샘플에 첨가하기 위해 C5의 양을 측정하는데 이용하여 이들 C5 농도가 동일하도록 하였다. HAHA 양성 검사 샘플에서 에쿨리주맙의 양을 측정하였다. 에쿨리주맙의 측정한 양을 약물전+ec 샘플을 생성하기 위해 상응하는, 정규화된 약물전 샘플에 첨가하였다.
분석 플레이트를 제조하기 위해, 150μL의 차단 완충액 [인산 완충 식염수에서 3% BSA]을 스트렙타비딘-코팅된 96 웰 분석 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 1시간 동안 상온에서 진탕하여 배양하였다. 배양 후, 각 웰의 내용물을 제거하였고 상기 웰을 150μL의 세척 완충액[인산 완충 식염수에서 0.05% 트윈(Tween)-20]으로 3번 세척하였다. 최종 세척 후, 완충액을 제거하였고 비오틴에 접합된 에쿨리주맙을 포함한 25μL의 1μg/mL 용액을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 3시간 동안 37℃의 어두운 곳에서 진탕하여 배양하였다. 배양 후, 웰의 내용물을 제거하였고 상기 웰을 세척 완충액으로 3번 세척하였다.
웰을 세척 후, 25μL의 검사 샘플 (2% v/v)을 플레이트의 3개 웰에 첨가하였다. 유사하게, 25μL의 약물전+ec 샘플 (2% v/v)을 분석 플레이트의 3개 웰에 첨가하였다. 게다가, 일련의 양성 대조군 표준 용액을 또한 제조하였고 25μL의 상기 표준 용액을 플레이트의 웰 세트에 첨가하였고, 상기 표준 용액은 에쿨리주맙에 결합하고 및 중화시키는 것으로 알려진 항체의 상이한 사전결정량 (50, 25, 10, 5, 2, 및 0 ng/mL)을 포함한다. 플레이트를 다시 밀봉하였고 1시간 동안 37℃의 어두운 곳에서 진탕하여 배양하였다. 배양 후, 웰의 내용물을 제거하였고, 세척 없이, 류테늄에 접합한 25μL의 C5 250 ng/mL 용액을 각 웰에 첨가하였다. 이후, 플레이트를 덮었고 1시간 동안 상온에서 진탕하여 배양하였다. 배양 후, 플레이트를 150μL의 세척 완충액으로 3번 세척하였다. 다음, 150μL의 2X Read Buffer T (계면활성제를 포함한; MSD® 카탈로그 번호 R92TC-1)를 각 웰에 첨가하였다. 분석 플레이트의 각 웰에서부터 생성된 빛 방출은 MSD® Workbench Software를 이용한 MSD®Sector Imager 2400을 이용하여 측정하였다.
데이터를 분석하기 위해, 다음의 계산을 수행하였다. 약물전+ec 샘플을 포함한 웰에서부터 생성된 평균 빛 방출을 HAHA 양성 검사 샘플을 포함한 웰에서부터 생성된 평균 빛 방출로 나누었다. 결과로 얻은 수치는, 1.3보다 작다면, 검사 샘플에서 HAHA 반응이 비-중화성이라는 것을 명시하는 것으로 간주하였다. 1.3보다 큰 수치는 HAHA 양성 검사 샘플이 중화 항-에쿨리주맙 항체를 포함할 수 있다는 것을 명시하였다. 환자 샘플에서 존재하는 항-에쿨리주맙 항체로, 중화도, 또는 에쿨리주맙 결합 활성도의 "% 억제"를 측정하기 위해 HAHA 양성 검사 샘플에 대한 데이터를 추가로 분석하였다. % 억제를 100% - [(항-에쿨리주맙 항체가 존재하지 않는 샘플을 이용하여 Nab 분석에서 얻은 신호)/(하나 이상의 항-에쿨리주맙 항체를 포함한 확정 분석 양성 샘플을 이용하여 Nab 분석에서 얻은 신호)] x100으로서 계산하였다. 본 분석에서 의미있는 % 신호 억제를 나타내는 값과 동일한 또는 그 이상의 컷-오프(cut-off) 값은 23%이다.
실시예 4. 인간 환자에서 에쿨리주맙의 낮은 수준의 면역원성
임상 연구에서, 에쿨리주맙을 4주 동안 매주 600 mg의 용량, 1주일 후 900m의 용량, 그 후에 매 2주마다 900mg의 유지 용량으로 인간에게 정맥 내로 투여하였다. 각 환자는 2년 6개월 이상 최소 68회 치료 분량의 에쿨리주맙을 받았다. 많은 환자가 최소 5년 이상 (130회 분량 이상) 치료적 농도의 에쿨리주맙을 받았다. 161명의 환자로부터의 전체 793개 혈청 샘플을 인간 항-인간 항체 (HAHA) 반응이 환자에서 일어나는지 안 일어나는지 확인하기 위해 검사하였다. 49개의 혈청 샘플이 상기-설명된 선별 분석에서 양성인 것으로 확인하였다. 이들 49개의 샘플 중, 20개는 에쿨리주맙을 투여하기에 앞서 (약물-전 샘플) 얻은 환자 샘플이었고, 29개 샘플은 에쿨리주맙을 투여한 후 (약물-후 샘플) 환자로부터 얻은 것이었다. 확정 분석을 단지 약물-후 샘플에서 수행하였다. 29개 약물-후 샘플 중 일곱 (7)개가 상기-설명된 확정 분석(확정 분석 양성 샘플)을 이용하여 양성임을 검사하였으며, 이는 항-에쿨리주맙 항체가 7개 샘플에서 존재할 수도 있다는 것을 제시하였다.
확정 분석 양성 샘플을 확정 분석 양성 샘플과 상응하는 약물-전 샘플과 함께 상기-설명된 중화 항체 분석(Neutralizing Antibody Assay, Nab　분석)으로 처리하였다. 상기 설명된 바와 같이, 약물-전 샘플에 약물-후 상대 샘플에서 측정된 농도로 에쿨리주맙 및 보체 성분 C5를 보충하였다.
컷-오프 값보다 약간 더 높은 "% 억제 수준" 값을 갖기 위해 단지 3개의 확정 분석 양성 샘플을 Nab 분석에서 측정하였다. (3개의 샘플 중 하나는 첫번째 환자로부터 얻었고, 다른 2개의 샘플은 두번째 환자로부터 얻었다.) 3개의 샘플에 대한 "% 억제" 값을 각각 25.7%, 27.5%, 및 36.2%가 되도록 측정하였다. 특히, 항체의 약동학적 (PK) 및 약역학적 (PD) 성질은 샘플에서 존재하는 낮은 수준의 항-에쿨리주맙 항체의 영향을 받지 않았다.
이들 데이터는, 치료적 용량으로 인간 환자에게 만성적으로 투여될 때, 에쿨리주맙 항체는 일반적으로 불량한 면역성이고, 항-에쿨리주맙 항체 반응이 면역원성 검사에서 검출가능하였던 극소수의 환자 (161명의 환자 중 2명)에서, 반응이 항체의 치료적 효능을 중화시키지 않았다는 것을 명시한다.
실시예 5. 새로운 인간화 치료적 항체를 발생시키기 위해 본 명세서에서 설명된 스캐폴드( scaffold )의 용도
쥐과 항-인간 C5a 항체의 가변 영역을 인간화 처리하였다. 쥐과 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 표 6에서 보여준다.
쥐과 ( murine ) 항- C5a 항체의 아미노산 서열
SIN : 설명 아미노산 서열*
33 VL 아미노산 서열 DIVMTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCQQSNEDPYTFGGGTKLEIKR
34 경쇄 CDR1 RASESVDSYGNSFMH
35 경쇄 CDR2 RASNLES
36 경쇄 CDR3 QQSNEDPYT
37 VH 아미노산 서열 EVQLQQSGPELVKPGSSVKISCKASGYTFTDYSMDWVKQSHGKSLEWIGAINPNSGGTNYSQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCASSGSYDGYYAMDYWGQGTSVTVSS
38 중쇄 CDR1 GYTFTDYSMD
39 중쇄 CDR2 AINPNSGGTNYSQKFKD
40 중쇄 CDR3 SGSYDGYYAMDY
상기 표에서 "SIN"은 "서열번호"를 의미한다.
* 결합된 카밧(Kabat)-초티아(Chothia) 정의 (상기)에 따라서 정의된 CDR 아미노산 서열.
쥐과 항체 CDR를 인간 생식세포 프레임워크 스캐폴드 상에 이식하기 위해 통상적인 분자 생물학적 방법을 이용하였다. 추가적인 인간화를 중쇄의 CDR2에서의 세린 잔기를 아스파라긴으로 교체함으로써 수행하였고, 그렇게 함으로써 잠재적인 글리코실화 부위를 제거하였다. 인간화 항-인간 C5a 항체의 아미노산 서열을 표 7에서 제시한다.
인간화 항- C5a 항체의 서열
SIN : 설명 아미노산 서열*
41 VL 아미노산 서열 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGKAPKLLIYRASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNEDPYTFGGGTKVEIK
9 경쇄 FR1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
34 경쇄 CDR1 RASESVDSYGNSFMH
10 경쇄 FR2 WYQQKPGKAPKLLIY
35 경쇄 CDR2 RASNLES
11 경쇄 FR3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC
36 경쇄 CDR3 QQSNEDPYT
42 경쇄 FR4 FGGGTKVEIK
43 VH 아미노산 서열 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSMDWVRQAPGQGLEWMGAINPNSGGTNYNQKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSGSYDGYYAMDYWGQGTTVTVSS
17 중쇄 FR1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS
38 중쇄 CDR1 GYTFTDYSMD
14 중쇄 FR2 WVRQAPGQGLEWMG
44 중쇄 CDR2 AINPNSGGTNYNQKFKD
15 중쇄 FR3 RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
40 중쇄 CDR3 SGSYDGYYAMDY
45 중쇄 FR4 WGQGTTVTVSS
상기 표에서 "SIN"은 "서열번호"를 의미한다.
* 결합된 카밧(Kabat)-초티아(Chothia) 정의 (상기)에 따라서 정의된 CDR 아미노산 서열.
굵은 활자체(bold)는 에쿨리주맙의 상응하는 FR4 영역과 상이한 경쇄 및 중쇄 프레임워크 영역 4 아미노산이다.
표 7에서 보이는 바와 같이, 인간화 항-C5a 항체는 에쿨리주맙 항체의 경쇄 프레임워크 영역 1 (서열번호:9), 2 (서열번호:10) 및 3 (서열번호:11) 및 에쿨리주맙 항체의 중쇄 프레임워크 영역 1 (서열번호:17), 2 (서열번호:14), 및 3 (서열번호:15)을 포함하고, 이들 모두는 카밧(Kabat)-초티아(Chothia) 정의 하에 정의된다. 상기 표 1 및 2를 참고. 경쇄 프레임워크 4 (LFR4)는 하나의 아미노산 (상기 표 7에서 굵은 활자체로 된)에 의해 에쿨리주맙의 LFR4로부터 벗어난다. 유사하게, 중쇄 프레임워크 4 (HFR4)는 하나의 아미노산 (또한 상기 표 7에서 굵은 활자체로 된)에 의해 에쿨리주맙의 HFR4로부터 벗어난다.
인간 C5a에 대한 이의 친화성을 정량하기 위해, 부분적으로, 인간화가 이의 항원에 대한 항체의 결합 친화성에 영향을 주었는지 확인하기 위해 인간화 항체를 BIAcore 분석하였다. 가령, Karlsson and Larsson (2004) Methods Mol Biol 248:389-415를 참고. 간단히, 인간화 항체를 포획 기술을 이용하여 3-4 농도의 인간 C5a (항원)로 선별하였다. 센서 칩(sensor chip) 표면을 지나가는 0.6 nM 내지 5.9 nM의 범위의 인간 C5a를 여러 가지 농도로 CM5 센서 칩상에 직접적으로 고정화 시킨 항-Fc (인간) 항체로 항체를 포획하였다. 결합된 항체 및 항원을 제거하기 위해 각 주기 이후에 표면을 20mM HCl, 0.02% P20로 재생시켰다. 데이터를 1:1 Langmuir Model Fit (Rmax:Global Fit; RI:Local Fit)를 이용한 Biacore BIAevaluation 소프트웨어(software)를 이용하여 평가하였다. ka (연관 속도 상수), kd (해리 속도 상수), 및 KD (평형 해리 상수)와 같은 동력학 정보를 상기 피트(fit)로부터 얻었다. 분석 결과는 다음과 같다: ka
Figure pct00005
1.93 x 106 M-1s-1; kd
Figure pct00006
5.76 x 10-4 s-1; 및 KD
Figure pct00007
2.98 x 10-10 M. 유사한 조건하에, 대응 쥐과 항-C5a 항체를 다음의 매개변수: ka
Figure pct00008
2.76 x 106 M-1s-1; kd
Figure pct00009
1.41 x 10-4 s-1; 및 KD
Figure pct00010
5.12 x 10-10 M로 인간 C5a에 결합시켰다. 이들 데이터는 쥐과 항체의 인간화가 인간 C5a에 대한 항체의 결합 친화성을 향상시켰다는 것을 명시하였다 (5.12 x 10-10 M 내지 2.98 x 10-10 M의 KD). 공여자 항체와 비교하여, 인간에서 감소된 면역원성에 대한 인간화 항체를 검사하기 위한 방법이 당업계에서 알려져 있고 및 본 명세서에서 설명된다.
최소한, 이들 결과는 본 명세서에서 설명된 에쿨리주맙 프레임워크 영역을 이들 동족 항원에 대한 항체의 친화성에 역으로 영향을 주지 않고 다른 비-인간 항체를 인간화하는데 이용할 수 있다는 것을 명시한다.
본 개시가 이의 특정 실시양태를 참조하여 설명되었지만, 여러 가지 변화가 생길 수 있고 등가물이 본 개시의 진정한 사상 및 범위에서 벗어남이 없이 치환될 수 있다는 점이 당업계에서 숙련자에 의해 이해되어야 한다. 게다가, 본 개시의 목적, 사상 및 범위에 특정한 상황, 물질, 물질의 조성물, 과정, 과정 단계 또는 단계들을 적응시키는데 많은 변경이 일어날 수 있다. 모든 이러한 변경은 본 개시의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> ROTHER, Russell P. <120> Antibodies Having Reduced Immunogenicity in a Human <130> ALXN-155-WO1 <140> <141> 2011-04-29 <150> 60/330,261 <151> 2010-04-30 <160> 45 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 214 <212> PRT <213> Amino acid sequence of the eculizumab light chain polypeptide <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Asn Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Amino acid sequence of the eculizumab light chain polypeptide variable region <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Asn Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 3 <211> 107 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the eculizumab light chain polypeptide constant region <400> 3 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 4 <211> 448 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the eculizumab heavy chain polypeptide <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Glu Tyr Thr Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Pro Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys 210 215 220 Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 5 <211> 122 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the eculizumab heavy chain polypeptide variable region <400> 5 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Glu Tyr Thr Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Pro Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 326 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the eculizumab heavy chain polypeptide constant region <400> 6 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 7 <211> 126 <212> PRT <213> Amino acid sequence of the H20C3 heavy chain variable region <400> 7 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Pro His Gln Arg Thr Arg Ile Ala Ala Arg Pro Gly Glu 100 105 110 Gly Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 8 <211> 111 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the I.23 light chain variable region <400> 8 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 <210> 9 <211> 23 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the eculizumab light chain framework region 1 (Kabat) <400> 9 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the eculizumab light chain framework region 2 (Kabat) <400> 10 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 11 <211> 32 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the eculizumab light chain framework region 3 (Kabat) <400> 11 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the eculizumab light chain framework region 4 (Kabat) <400> 12 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 13 <211> 30 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the eculizumab heavy chain framework region 1 (Kabat) <400> 13 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser 20 25 30 <210> 14 <211> 14 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the eculizumab heavy chain framework region 2 (Kabat) <400> 14 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 15 <211> 32 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the eculizumab heavy chain framework region 3 (Kabat) <400> 15 Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the eculizumab heavy chain framework region 4 (Kabat) <400> 16 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 17 <211> 25 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the eculizumab heavy chain framework region 1 (Kabat-Chothia) and the amino acid sequence for the eculizumab heavy chain framework region 1 (Chothia) and the amino acid sequence for the H20C3 heavy chain framework region 1 (Chothia) <400> 17 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 20 25 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the I.23 light chain framework region 2 (Kabat) <400> 18 Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 19 <211> 30 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the H20C3 heavy chain framework region 1 (Kabat) <400> 19 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 <210> 20 <211> 25 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the eculizumab light chain framework region 1 (Chothia) <400> 20 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala 20 25 <210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the eculizumab light chain framework region 2 (Chothia) <400> 21 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 1 5 10 15 Tyr <210> 22 <211> 38 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the eculizumab light chain framework region 3 (Chothia) <400> 22 Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 10 15 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 20 25 30 Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn 35 <210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the eculizumab light chain framework region 4 (Chothia) and the amino acid sequence for the I.23 light chain framework region 4 (Chothia) <400> 23 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 24 <211> 25 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the I.23 light chain framework region 1 (Chothia) <400> 24 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala 20 25 <210> 25 <211> 17 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the I.23 light chain framework region 2 (Chothia) <400> 25 Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 1 5 10 15 Tyr <210> 26 <211> 38 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the I.23 light chain framework region 3 (Chothia) <400> 26 Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 10 15 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 20 25 30 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 35 <210> 27 <211> 20 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the eculizumab heavy chain framework region 2 (Chothia) <400> 27 Trp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 1 5 10 15 Gly Glu Ile Leu 20 <210> 28 <211> 43 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the eculizumab heavy chain framework region 3 (Chothia) <400> 28 Ser Thr Glu Tyr Thr Glu Asn Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg 1 5 10 15 Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 20 25 30 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr 35 40 <210> 29 <211> 12 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the eculizumab heavy chain framework region 4 (Chothia) <400> 29 Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 30 <211> 20 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the H20C3 heavy chain framework region 2 (Chothia) <400> 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 1 5 10 15 Gly Ile Ile Asn 20 <210> 31 <211> 43 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the H20C3 heavy chain framework region 3 (Chothia) <400> 31 Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg 1 5 10 15 Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 20 25 30 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala 35 40 <210> 32 <211> 12 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the H20C3 heavy chain framework region 4 (Chothia) <400> 32 Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 33 <211> 112 <212> PRT <213> Amino acid sequence of a murine light chain variable region of an anti-human C5a antibody <400> 33 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the light chain CDR1 of a murine anti-C5a antibody (Combined Kabat-Chothia definition) <400> 34 Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His 1 5 10 15 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the light chain CDR2 of a murine anti-C5a antibody (Combined Kabat-Chothia definition) <400> 35 Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the light chain CDR3 of a murine anti-C5a antibody (Combined Kabat-Chothia definition) <400> 36 Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Thr 1 5 <210> 37 <211> 121 <212> PRT <213> Amino acid sequence of a murine heavy chain variable region of an anti-human C5a antibody <400> 37 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Ser Gly Ser Tyr Asp Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the heavy chain CDR1 of a murine anti-C5a antibody (Combined Kabat-Chothia definition) <400> 38 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Met Asp 1 5 10 <210> 39 <211> 17 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the heavy chain CDR2 of a murine anti-C5a antibody (Combined Kabat-Chothia definition) <400> 39 Ala Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ser Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 40 <211> 12 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the heavy chain CDR3 of a murine anti-C5a antibody (Combined Kabat-Chothia definition) <400> 40 Ser Gly Ser Tyr Asp Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 41 <211> 111 <212> PRT <213> Amino acid sequence of a light chain variable region of a humanized anti-human C5a antibody <400> 41 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the light chain framework region 4 of a humanized anti-C5a antibody (Combined Kabat-Chothia definition) <400> 42 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 43 <211> 121 <212> PRT <213> Amino acid sequence of a heavy chain variable region of a humanized anti-human C5a antibody <400> 43 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Ser Tyr Asp Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 44 <211> 17 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the heavy chain CDR2 of a humanized anti-C5a antibody (Combined Kabat-Chothia definition) <400> 44 Ala Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> Amino acid sequence for the heavy chain framework region 4 of a humanized anti-C5a antibody (Combined Kabat-Chothia definition) <400> 45 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 1 5 10

Claims (161)

  1. 다음의 아미노산 서열 조각을 순서대로 포함하는 폴리펩티드: LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4에 있어서, 경쇄 프레임워크(framework) 영역 LFR1, LFR2, 및 LFR3 중 하나 이상은 서열번호:2 또는 서열번호:8에서 도시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역으로부터 얻으며, 그리고 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 중 하나 이상은 공여자 항체로부터 얻는데, 단서 조항으로, 상기 폴리펩티드는 서열번호:2 또는 서열번호:8에서 도시된 완전한 아미노산 서열을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, LFR4는 서열번호:2 또는 서열번호:8에서 도시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역으로부터 얻은 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나의 CDR은 서열번호:2 또는 서열번호:8에서 도시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역으로부터 얻은 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 두개의 CDR은 서열번호:2 또는 서열번호:8에서 도시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역으로부터 얻은 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 최소 두개의 CDR은 동일한 공여자 항체에서 얻은 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 모든 CDR은 동일한 공여자 항체에서 얻은 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 프레임워크 영역 및 CDR은 카밧(Kabat)에 따라서 정의되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 프레임워크 영역 및 CDR은 초티아(Chothia)에 따라서 정의되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 프레임워크 영역 및 CDR은 결합된 카밧(Kabat)-초티아(Chothia) 정의에 따라서 정의되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  10. 제1항 내지 제7항 또는 제9항 중 어느 한 항에 있어서, LFR1은 서열번호:9에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  11. 제1항 내지 제7항, 제9항, 또는 제10항 중 어느 한 항에 있어서, LFR2는 서열번호:10 또는 서열번호:18에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  12. 제1항 내지 제7항 또는 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, LFR3은 서열번호:11에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  13. 제1항 내지 제7항 또는 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, LFR4는 서열번호:12에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  14. 제1항 내지 제7항 또는 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, LFR1은 서열번호:9에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR2는 서열번호:10에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR3은 서열번호:11에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 LFR4는 서열번호:12에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  15. 제1항 내지 제7항 또는 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, LFR1은 서열번호:9에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR2는 서열번호:18에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR3은 서열번호:11에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 LFR4는 서열번호:12에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  16. 제1항 내지 제6항 또는 제8항 중 어느 한 항에 있어서, LFR1은 서열번호:20 또는 서열번호:24에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  17. 제1항 내지 제6항, 제8항, 또는 제16항 중 어느 한 항에 있어서, LFR2는 서열번호:21 또는 서열번호:25에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  18. 제1항 내지 제6항, 제8항, 제16항, 또는 제17항 중 어느 한 항에 있어서, LFR3은 서열번호:22 또는 서열번호:26에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  19. 제1항 내지 제6항, 제8항, 또는 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, LFR4는 서열번호:23을 도시하는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  20. 제1항 내지 제6항, 제8항, 또는 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, LFR1은 서열번호:20에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR2는 서열번호:21에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR3은 서열번호:22에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 LFR4는 서열번호:23에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  21. 제1항 내지 제6항, 제8항, 또는 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, LFR1은 서열번호:24에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR2는 서열번호:25에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR3은 서열번호:26에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 LFR4는 서열번호:23에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드 불변 영역 모두 또는 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  23. 제22항에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호:3에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  24. 다음의 아미노산 서열 조각을 순서대로 포함하는 폴리펩티드: HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4에 있어서, 중쇄 프레임워크 영역 HFR1, HFR2, 및 HFR3 중 하나 이상은 서열번호:5 또는 서열번호:7에서 도시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역으로부터 얻으며, 그리고 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 중 하나 이상은 공여자 항체로부터 얻는데, 단서 조항으로, 상기 폴리펩티드는 서열번호: 5 또는 서열번호:7에서 도시된 완전한 아미노산 서열을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  25. 제24항에 있어서, LFR4는 서열번호:5 또는 서열번호:7에서 도시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역으로부터 얻은 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 하나의 CDR은 서열번호:5 또는 서열번호:7에서 도시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역으로부터 얻은 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  27. 제24항 또는 제25항에 있어서, 두개의 CDR은 서열번호:5 또는 서열번호:7에서 도시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역으로부터 얻은 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  28. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 최소 두개의 CDR은 동일한 공여자 항체로부터 얻은 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  29. 제24항 또는 제25항에 있어서, 모든 CDR은 동일한 공여자 항체로부터 얻은 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  30. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 프레임워크 영역 및 CDR은 카밧(Kabat)에 따라서 정의되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  31. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 프레임워크 영역 및 CDR은 초티아(Chothia)에 따라서 정의되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  32. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 프레임워크 영역 및 CDR은 결합된 카밧(Kabat)-초티아(Chothia) 정의에 따라서 정의되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  33. 제24항 내지 제30항 또는 제32항 중 어느 한 항에 있어서, HFR1은 서열번호:13, 17, 또는 19 중 어느 하나에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  34. 제24항 내지 제30항, 제32항, 또는 제33항 중 어느 한 항에 있어서, HFR2는 서열번호:14에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  35. 제24항 내지 제30항 또는 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, HFR3은 서열번호:15에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  36. 제24항 내지 제30항 또는 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, HFR4는 서열번호:16에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  37. 제24항 내지 제30항 또는 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, HFR1은 서열번호:13에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR2는 서열번호:14에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR3은 서열번호:15에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 HFR4는 서열번호:16에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  38. 제24항 내지 제30항 또는 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, HFR1은 서열번호:17에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR2는 서열번호:14에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR3은 서열번호:15에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 HFR4는 서열번호:16에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  39. 제24항 내지 제30항 또는 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, HFR1은 서열번호:19에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR2는 서열번호:14에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR3은 서열번호:15에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 HFR4는 서열번호:16에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  40. 제24항 내지 제29항 또는 제31항 중 어느 한 항에 있어서, HFR1은 서열번호:17에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  41. 제24항 내지 제29항, 제31항, 또는 제40항 중 어느 한 항에 있어서, HFR2는 서열번호:27 또는 서열번호:30에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  42. 제24항 내지 제29항, 제31항, 제40항, 또는 제41항 중 어느 한 항에 있어서, HFR3은 서열번호:28 또는 서열번호:31에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  43. 제24항 내지 제29항, 제31항, 또는 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, HFR4는 서열번호:29 또는 서열번호:32에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  44. 제24항 내지 제29항, 제31항, 또는 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, HFR1은 서열번호:17에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR2는 서열번호:27에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR3은 서열번호:28에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 HFR4는 서열번호:29에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  45. 제24항 내지 제29항, 제31항, 또는 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, HFR1은 서열번호:17에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR2는 서열번호:30에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR3은 서열번호:31에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 HFR4는 서열번호:32에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  46. 제24항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 불변 영역 모두 또는 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  47. 제46항에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호:6에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  48. 제46항에 있어서, 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 불변 영역은 IgG, IgA, IgE, IgD, 또는 IgM 중쇄 폴리펩티드 불변 영역인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  49. (i) 경쇄 폴리펩티드 및 (ii) 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 조작된 항체에 있어서, 경쇄 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열 조각을 순서대로 포함하고: LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4, 경쇄 프레임워크 영역 LFR1, LFR2, 및 LFR3은 서열번호:2 또는 서열번호:8에서 도시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역으로부터 얻으며, 그리고 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 중 하나 이상은 공여자 항체로부터 얻는데, 단서 조항으로, 상기 경쇄 폴리펩티드는 서열번호:2 또는 서열번호:8에서 도시된 완전한 아미노산 서열을 포함하지 않고; 그리고 중쇄 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열 조각을 순서대로 포함하고: HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4, 중쇄 프레임워크 영역 HFR1, HFR2, 및 HFR3은 서열번호:5 또는 서열번호:7에서 도시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역으로부터 얻으며, 그리고 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 중 하나 이상은 공여자 항체로부터 얻는데, 단서 조항으로, 상기 중쇄 폴리펩티드는 서열번호: 5 또는 서열번호:7에서 도시된 완전한 아미노산 서열을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  50. 제49항에 있어서, 경쇄 프레임워크 영역, 중쇄 프레임워크 영역, 경쇄 CDR, 및 중쇄 CDR은 카밧(Kabat) 정의에 따라서 정의되는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  51. 제49항에 있어서, 경쇄 프레임워크 영역, 중쇄 프레임워크 영역, 경쇄 CDR, 및 중쇄 CDR은 초티아(Chothia) 정의에 따라서 정의되는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  52. 제49항에 있어서, 경쇄 프레임워크 영역, 중쇄 프레임워크 영역, 경쇄 CDR, 및 중쇄 CDR은 결합된 카밧(Kabat)-초티아(Chothia) 정의에 따라서 정의되는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  53. 제49항, 제50항, 또는 제52항 중 어느 한 항에 있어서, LFR1은 서열번호:9에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  54. 제49항, 제50항, 제52항, 또는 제53항 중 어느 한 항에 있어서, LFR2는 서열번호:10 또는 서열번호:18에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  55. 제49항, 제50항, 또는 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, LFR3은 서열번호:11에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  56. 제49항, 제50항, 또는 제52항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, LFR4는 서열번호:12에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  57. 제49항, 제50항, 또는 제52항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, LFR1은 서열번호:9에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR2는 서열번호:10에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR3은 서열번호:11에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 LFR4는 서열번호:12에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  58. 제49항, 제50항, 또는 제52항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, LFR1은 서열번호:9에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR2는 서열번호:18에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR3은 서열번호:11에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 LFR4는 서열번호:12에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  59. 제49항 또는 제51항에 있어서, LFR1은 서열번호:20 또는 서열번호:24에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  60. 제49항, 제51항, 또는 제59항 중 어느 한 항에 있어서, LFR2는 서열번호:21 또는 서열번호:25에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  61. 제49항, 제51항, 제59항, 또는 제60항 중 어느 한 항에 있어서, LFR3은 서열번호:22 또는 서열번호:26에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  62. 제49항, 제51항, 또는 제59항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, LFR4는 서열번호:23에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  63. 제49항, 제51항, 또는 제59항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, LFR1은 서열번호:20에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR2는 서열번호:21에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR3은 서열번호:22에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 LFR4는 서열번호:23에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  64. 제49항, 제51항, 또는 제59항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, LFR1은 서열번호:24에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR2는 서열번호:25에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR3은 서열번호:26에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 LFR4는 서열번호:23에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  65. 제49항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 폴리펩티드는 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드 불변 영역 모두 또는 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  66. 제65항에 있어서, 경쇄 폴리펩티드 불변 영역은 인간 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서, 경쇄 불변 영역은 λ 경쇄 불변 영역 또는 κ 경쇄 불변 영역인 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  68. 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:3에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  69. 제49항, 제50항, 또는 제52항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, HFR1은 서열번호:13, 17, 또는 19 중 어느 하나에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  70. 제49항, 제50항, 또는 제52항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, HFR2는 서열번호:14에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  71. 제49항, 제50항, 또는 제52항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, HFR3은 서열번호:15에서 도시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  72. 제49항, 제50항, 또는 제52항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, HFR4는 서열번호:16에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  73. 제49항, 제50항, 또는 제52항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, HFR1은 서열번호:13에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR2는 서열번호:14에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR3은 서열번호:15에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 HFR4는 서열번호:16에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  74. 제49항, 제50항, 또는 제52항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, HFR1은 서열번호:17에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR2는 서열번호:14에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR3은 서열번호:15에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 HFR4는 서열번호:16에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  75. 제49항, 제50항, 또는 제52항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, HFR1은 서열번호:19에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR2는 서열번호:14에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR3은 서열번호:15에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 HFR4는 서열번호:16에서 도시된 아미노산 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  76. 제49항, 제51항, 또는 제53항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, HFR1은 서열번호:17에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  77. 제49항, 제51항, 제53항 내지 제68항, 또는 제76항 중 어느 한 항에 있어서, HFR2은 서열번호:27 또는 서열번호:30에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  78. 제49항, 제51항, 제53항 내지 제68항, 제76항, 또는 제77항 중 어느 한 항에 있어서, HFR3은 서열번호:28 또는 서열번호:31에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  79. 제49항, 제51항, 제53항 내지 제68항, 또는 제76항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, HFR4는 서열번호:29 또는 서열번호:32에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  80. 제49항, 제51항, 제53항 내지 제68항, 또는 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, HFR1은 서열번호:17에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR2는 서열번호:27에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR3은 서열번호:28에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 HFR4는 서열번호:29에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  81. 제49항, 제51항, 제53항 내지 제68항, 또는 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, HFR1은 서열번호:17에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR2는 서열번호:30에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR3은 서열번호:31에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 HFR4는 서열번호:32에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  82. 제49항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 폴리펩티드는 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 불변 영역 모두 또는 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  83. 제82항에 있어서, 중쇄 폴리펩티드 불변 영역은 인간 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  84. 제82항 또는 제83항에 있어서, 중쇄 폴리펩티드는 면역글로불린 분자의 Fc 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  85. 제84항에 있어서, Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, 또는 IgD 면역글로불린 Fc 영역인 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  86. 제49항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 폴리펩티드는 서열번호:6에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  87. 제49항에 있어서, LFR1은 서열번호:9에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR2은 서열번호:10에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR3은 서열번호:11에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 LFR4는 서열번호:12에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 HFR1은 서열번호:13에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR2은 서열번호:14에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR3은 서열번호:15에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 HFR4는 서열번호:16에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  88. 제49항에 있어서, LFR1은 서열번호:9에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR2은 서열번호:18에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR3은 서열번호:11에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 LFR4는 서열번호:12에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 HFR1은 서열번호:19에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR2은 서열번호:14에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR3은 서열번호:15에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 HFR4는 서열번호:16에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  89. 제49항에 있어서, LFR1은 서열번호:9에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR2은 서열번호:18에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR3은 서열번호:11에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 LFR4는 서열번호:12에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 HFR1은 서열번호:13에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR2은 서열번호:14에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR3은 서열번호:15에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 HFR4는 서열번호:16에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  90. 제49항에 있어서, LFR1은 서열번호:9에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR2은 서열번호:10에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR3은 서열번호:11에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 LFR4는 서열번호:12에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 HFR1은 서열번호:19에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR2은 서열번호:14에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR3은 서열번호:15에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 HFR4는 서열번호:16에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  91. 제49항에 있어서, LFR1은 서열번호:9에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR2은 서열번호:10에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR3은 서열번호:11에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 LFR4는 서열번호:12에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 HFR1은 서열번호:17에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR2은 서열번호:14에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR3은 서열번호:15에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 HFR4는 서열번호:16에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  92. 제49항에 있어서, LFR1은 서열번호:9에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR2은 서열번호:18에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR3은 서열번호:11에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 LFR4는 서열번호:12에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 HFR1은 서열번호:17에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR2은 서열번호:14에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR3은 서열번호:15에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 HFR4는 서열번호:16에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  93. 제49항에 있어서, LFR1은 서열번호:20에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR2은 서열번호:21에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR3은 서열번호:22에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 LFR4는 서열번호:23에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 HFR1은 서열번호:17에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR2은 서열번호:27에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR3은 서열번호:28에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 HFR4는 서열번호:29에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  94. 제49항에 있어서, LFR1은 서열번호:20에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR2은 서열번호:21에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR3은 서열번호:22에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 LFR4는 서열번호:23에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 HFR1은 서열번호:17에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR2은 서열번호:30에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR3은 서열번호:31에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 HFR4는 서열번호:32에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  95. 제49항에 있어서, LFR1은 서열번호:24에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR2은 서열번호:25에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR3은 서열번호:26에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 LFR4는 서열번호:23에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 HFR1은 서열번호:17에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR2은 서열번호:27에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR3은 서열번호:28에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 HFR4는 서열번호:29에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  96. 제49항에 있어서, LFR1은 서열번호:24에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR2은 서열번호:25에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; LFR3은 서열번호:26에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 LFR4는 서열번호:23에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 HFR1은 서열번호:17에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR2은 서열번호:30에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; HFR3은 서열번호:31에서 도시된 아미노산 서열을 포함하고; 및 HFR4는 서열번호:32에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  97. 제49항에 있어서, 조작된 항체는 표 5에서 도시된 중쇄 프레임워크 영역 및 경쇄 프레임워크 영역의 쌍으로된 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  98. 제49항 내지 제64항, 제69항 내지 제82항, 또는 제87항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 항체는 Fd 단편, Fab 단편, Fab' 단편, 및 F(ab ')2 단편으로 구성된 그룹에서 선택된 항체 단편인 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  99. 제49항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 폴리펩티드 및 중쇄 폴리펩티드는 공유결합으로 서로 결합하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  100. 제49항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 항체는 보체 성분 단백질에 결합하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  101. 제100항에 있어서, 보체 성분 단백질은 C1q, C1r, C1s, C4, C4a, C4b, C3, C3a, C3b, C2, C2a, C2b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, 프로퍼딘, 보체 인자 D, 보체 인자 B, MBL, MASP1, MASP2, 및 MASP3으로 구성된 그룹에서 선택된 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  102. 제49항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 항체는 세포 표면 수용체에 결합하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  103. 제102항에 있어서, 세포 표면 수용체는 G 단백질 결합 수용체인 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  104. 제102항 또는 제103항에 있어서, 세포 표면 수용체는 케모카인 수용체 또는 사이토카인 수용체인 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  105. 제102항에 있어서, 세포 표면 수용체는 수용체 타이로신 키나아제인 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  106. 제49항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 항체는 (i) 사멸 수용체 또는 (ii) 사멸 수용체의 리간드에 결합하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  107. 제49항 내지 제99항에 있어서, 조작된 항체는 성장 인자, 케모카인, 또는 사이토카인에 결합하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  108. 제49항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 항체는 면역글로불린 분자에 결합하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  109. 제108항에 있어서, 면역글로불린 분자는 IgE 분자인 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  110. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항의 폴리펩티드; 또는 49 내지 109 중 어느 한 항의 조작된 항체를 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  111. 제110항의 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  112. 제111항에 있어서, 핵산은 발현 조절 서열과 실시가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 벡터.
  113. 제111항 또는 제112항의 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
  114. 폴리펩티드 또는 조작된 항체를 생성하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은 폴리펩티드 또는 조작된 항체의 발현을 허용하는데 적합한 조건하에 제113항의 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  115. 제114항에 있어서, 폴리펩티드 또는 조작된 항체를 배양된 세포로부터 또는 상기 세포가 배양된 배지로부터 단리시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  116. 제114항 또는 제115항의 방법에 의해 생성된 것을 특징으로 하는 단리된 폴리펩티드 또는 단리된 조작된 항체.
  117. 공여자 경쇄 가변 영역의 면역원성과 비교하여 인간에서 더 적은 면역성인 조작된 경쇄 항체 가변 영역을 발생시키기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은
    (i) 서열번호:2 또는 서열번호:8에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 수용자(acceptor) 경쇄 항체 가변 영역 아미노산 서열 또는 (ii) 수용자 경쇄 항체 가변 영역 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 정보를 제공하는 단계;
    (iii) 최소 하나의 공여자 항체 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 또는 (iv) 공여자 항체 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 정보를 제공하는 단계;
    수용자 경쇄 항체 가변 영역의 하나 이상의 CDR을 공여자 항체 경쇄 가변 영역으로부터 얻은 하나 이상의 CDR로 교체하고 그렇게 함으로써 공여자 항체 경쇄 가변 영역의 면역원성과 비교하여 인간에서 더 적은 면역성인 조작된 경쇄 가변 영역을 발생시키는 단계를 포함하는데, 단서 조항으로, 상기 조작된 경쇄 가변 영역은 서열번호:2 또는 서열번호:8에서 도시된 완전한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  118. 제117항에 있어서, 중쇄 항체 가변 영역, 또는 중쇄 항체 가변 영역을 암호화하는 핵산을 얻고, 이는 조작된 경쇄 항체 가변 영역과 상보적이며 그렇게 함으로써 조작된 항체를 발생시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  119. 제118항에 있어서, 유도된 선택(guided selection)은 중쇄 항체 가변 영역을 얻는데 이용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  120. 제118항에 있어서, 중쇄 항체 가변 영역은 조작된 중쇄 항체 가변 영역인 것을 특징으로 하는 방법.
  121. 제120항에 있어서, 조작된 중쇄 항체 가변 영역의 발생은
    (i) 서열번호:5 또는 서열번호:7에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 수용자 중쇄 항체 가변 영역 또는 (ii) 수용자 중쇄 항체 가변 영역 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 제공하는 단계;
    (iii) 최소 하나의 공여자 항체 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 또는 (iv) 공여자 항체 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 정보를 제공하는 단계;
    수용자 중쇄 항체 가변 영역의 하나 이상의 CDR을 공여자 항체 중쇄 가변 영역으로부터 얻은 하나 이상의 CDR로 교체하고 그렇게 함으로써 공여자 항체 중쇄 가변 영역의 면역원성과 비교하여 인간에서 더 적은 면역성인 조작된 중쇄 가변 영역을 발생시키는 단계를 포함하는데, 단서 조항으로, 상기 조작된 중쇄 가변 영역은 서열번호:5 또는 서열번호:7에서 도시된 완전한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드 가변 영역을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  122. 공여자 항체 중쇄 가변 영역의 면역원성과 비교하여 인간에서 더 적은 면역성인 조작된 중쇄 항체 가변 영역을 발생시키기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은
    (i) 서열번호:5 또는 서열번호:7에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 수용자 중쇄 항체 가변 영역 또는 (ii) 수용자 중쇄 항체 가변 영역 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 제공하는 단계;
    (iii) 최소 하나의 공여자 항체 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 또는 (iv) 공여자 항체 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 정보를 제공하는 단계;
    수용자 중쇄 항체 가변 영역의 하나 이상의 CDR을 공여자 항체 중쇄 가변 영역으로부터 얻은 하나 이상의 CDR로 교체하고 그렇게 함으로써 공여자 항체 중쇄 가변 영역의 면역원성과 비교하여 인간에서 더 적은 면역성인 조작된 중쇄 가변 영역을 발생시키는 단계를 포함하는데, 단서 조항으로, 상기 조작된 중쇄 가변 영역은 서열번호:5 또는 서열번호:7에서 도시된 완전한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드 가변 영역을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  123. 제122항에 있어서, 조작된 중쇄 항체 가변 영역과 상보적인 경쇄 항체 가변 영역을 얻고 그렇게 함으로써 조작된 항체를 발생시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  124. 제123항에 있어서, 유도된 선택은 조작된 경쇄 항체 가변 영역을 얻는데 이용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  125. 제123항에 있어서, 경쇄 항체 가변 영역은 조작된 경쇄 항체 가변 영역인 것을 특징으로 하는 방법.
  126. 제125항에 있어서, 조작된 경쇄 항체 가변 영역의 발생은
    (i) 서열번호:2 또는 서열번호:8에서 도시된 아미노산 서열을 포함하는 수용자 경쇄 항체 가변 영역 또는 (ii) 수용자 경쇄 항체 가변 영역 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 제공하는 단계;
    (iii) 최소 하나의 공여자 항체 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 또는 (iv) 공여자 항체 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 정보를 제공하는 단계;
    수용자 경쇄 항체 가변 영역의 하나 이상의 CDR을 공여자 항체 경쇄 가변 영역으로부터 얻은 하나 이상의 CDR로 교체하고 그렇게 함으로써 공여자 항체 경쇄 가변 영역의 면역원성과 비교하여 인간에서 더 적은 면역성인 조작된 경쇄 가변 영역을 발생시키는 단계를 포함하는데, 단서 조항으로, 상기 조작된 경쇄 가변 영역은 서열번호:2 또는 서열번호:8에서 도시된 완전한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  127. 제117항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 프레임워크 영역 및 CDR은 카밧(Kabat) 정의에 따라서 정의되는 것을 특징으로 하는 방법.
  128. 제117항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 프레임워크 영역 및 CDR은 초티아(Chothia) 정의에 따라서 정의되는 것을 특징으로 하는 방법.
  129. 제117항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 프레임워크 영역 및 CDR은 결합된 카밧(Kabat)-초티아(Chothia) 정의에 따라서 정의되는 것을 특징으로 하는 방법.
  130. 제117항에 있어서, 조작된 항체 경쇄 가변 영역을 생성하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  131. 제130항에 있어서, 조작된 항체 경쇄 가변 영역은 세포에서 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  132. 제122항에 있어서, 조작된 항체 중쇄 가변 영역을 생성하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  133. 제132항에 있어서, 조작된 항체 중쇄 가변 영역은 세포에서 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  134. 제130항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 항체 경쇄 가변 영역 또는 조작된 중쇄 가변 영역을 세포 또는 상기 세포가 배양된 배지로부터 단리시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  135. 제118항 또는 제123항에 있어서, 조작된 항체를 생성하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  136. 제135항에 있어서, 조작된 항체는 세포에서 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  137. 제135항 또는 제136항에 있어서, 조작된 항체를 세포 또는 상기 세포가 배양된 배지로부터 단리시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  138. 제135항 내지 제137항에 있어서, 조작된 항체가 공여자 항체에 결합하는 항원과 동일한 항원에 결합하는지 안하는지 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  139. 제135항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 항체는 표적 항원에 대해 공여자 항체의 친화성과 비교하여 상기 표적 항원에 대해 더 큰 친화성을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  140. 제135항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 항체가 인간에게 투여된 후 조작된 항체에 결합하는 항체를 생성하는지 안하는지 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  141. 제135항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 항체를 재형성하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  142. 제141항에 있어서, 재형성은 프레임워크 영역의 최소 하나의 아미노산을 치환하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  143. 제141항 또는 제142항에 있어서, 재형성은 프레임워크 영역의 최소 두개의 아미노산을 치환하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  144. 제141항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 재형성은 최소 두개의 상이한 프레임워크 영역내 최소 하나의 아미노산을 치환하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  145. 제144항에 있어서, 재형성은 프레임워크 영역내 하나 이상의 아미노산을 치환하는 단계를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  146. 제141항 또는 제145항에 있어서, 재형성은 최소 하나의 CDR의 최소 하나의 아미노산을 치환하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  147. 제141항, 제145항, 또는 제146항에 있어서, 재형성은 최소 하나의 CDR의 최소 두개의 아미노산을 치환하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  148. 제146항 또는 제147항에 있어서, 재형성은 CDR의 최소 하나의 아미노산 위치를 치환하는 단계를 포함하며, 여기서 CDR은 카밧(Kabat) 또는 결합된 카밧(Kabat)-초티아(Chothia) 정의에 따라서 정의되는 것을 특징으로 하는 방법.
  149. 제141항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 재형성은 중쇄 가변 영역의 위치 28 및 30 중 하나 또는 둘 모두(카밧(Kabat) 넘버링(numbering)에 따라서)에서 아미노산을 치환하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  150. 제141항 또는 제145항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 재형성은 최소 두개의 상이한 CDR내 최소 하나의 아미노산을 치환하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  151. 제141항 내지 제144항 또는 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 재형성은 중쇄 가변 영역의 위치 27, 28, 30, 71, 또는 78 (카밧(Kabat) 넘버링에 따라서)에서 최소 하나의 아미노산을 치환하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  152. 제141항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 재형성은 조작된 항체의 중쇄 가변 영역의 위치 27, 28, 또는 30 (카밧(Kabat) 넘버링에 따라서)에서 최소 하나의 아미노산을 치환하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  153. 제141항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 재형성은 조작된 항체의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 중 하나 또는 둘 모두 내로 최소 하나의 스페이서(spacer) 아미노산 서열을 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  154. 제141항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 프레임워크 또는 CDR의 하나 이상의 아미노산은 교체에 앞서 치환되는 것을 특징으로 하는 방법.
  155. 제141항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 프레임워크 또는 CDR의 하나 이상의 아미노산은 교체 후 치환되는 것을 특징으로 하는 방법.
  156. 제117항 내지 제122항 또는 제126항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 수용자 항체 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 제1항의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  157. 제121항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 수용자 항체 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 제24항의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  158. 제117항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, 수용자 항체 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 제1항의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하고 수용자 항체 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 제24항의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  159. (i) 경쇄 폴리펩티드 및 (ii) 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 조작된 항체에 있어서, 경쇄 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열 조각을 순서대로 포함하고: LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4,
    여기서, LFR1은 서열번호:9에서 도시된 아미노산 서열을 포함하지만, 0 내지 3개의 아미노산 치환을 갖고; LFR2는 서열번호:10 또는 서열번호:18에서 도시된 아미노산 서열을 포함하지만, 0 내지 3개의 아미노산 치환을 갖고; LFR3은 서열번호:11에서 도시된 아미노산 서열을 포함하지만, 0 내지 3개의 아미노산 치환을 갖고; 및 LFR4는 서열번호:12에서 도시된 아미노산 서열을 포함하지만, 0 내지 3개의 아미노산 치환을 갖고;
    여기서, LCDR1은 공여자 항체로부터 얻은 경쇄 CDR1의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 공여자 항체로부터 얻은 경쇄 CDR2의 아미노산 서열을 포함하고, 및 LCDR3은 공여자 항체로부터 얻은 경쇄 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는데;
    단서 조항으로, 경쇄 폴리펩티드는 서열번호:2 또는 서열번호:8에서 도시된 아미노산 서열을 포함하지 않고; 그리고
    중쇄 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열 조각을 순서대로 포함하고: HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4,
    여기서, HFR1은 서열번호:13, 17, 또는 19에서 도시된 아미노산 서열을 포함하지만, 0 내지 3개의 아미노산 치환을 갖고; HFR2는 서열번호:14에서 도시된 아미노산 서열을 포함하지만, 0 내지 3개의 아미노산 치환을 갖고; HFR3은 서열번호:15에서 도시된 아미노산 서열을 포함하지만, 0 내지 3개의 아미노산 치환을 갖고; 및 HFR4는 서열번호:16에서 도시된 아미노산 서열을 포함하지만, 0 내지 3개의 아미노산 치환을 갖고,
    여기서, HCDR1은 공여자 항체로부터 얻은 중쇄 CDR1의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 공여자 항체로부터 얻은 중쇄 CDR2의 아미노산 서열을 포함하고, 및 HCDR3은 공여자 항체로부터 얻은 중쇄 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는데,
    단서 조항으로, 중쇄 폴리펩티드는 서열번호:5 또는 서열번호:7에서 도시된 아미노산 서열을 포함하지 않고; 그리고
    여기서, 조작된 항체는 공여자 항체 또는 항체들과 비교하여 인간에서 더 적은 면역원성이고 상기 조작된 항체는 공여자 항체 또는 항체들에 결합하는 항원과 동일한 항원에 결합하는 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
  160. 제159항에 있어서, 다음 중 하나 또는 둘 모두를 특징으로 하는 조작된 항체: (a) LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 단일 공여자 항체에서 얻고; 및 (b) HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 단일 공여자 항체에서 얻는다.
  161. 제159항 또는 제160항에 있어서, 모든 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR은 상기 동일한 공여자 항체로부터 얻은 것을 특징으로 하는 조작된 항체.
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