CN107636162B - 用针对特定群体的抗原筛选t细胞的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

用于分离患者来源的抗原特异性T细胞的组合物和方法包括具有与肽负载链霉抗生物素蛋白主要组织相容性复合物(MHC)四聚体复合的多核苷酸条码化纳米颗粒分选剂的抗原复合物，条码化技术允许所述抗原复合物的文库的高保真度筛选，以容易地分离和识别抗原特异性T细胞。

Description

用针对特定群体的抗原筛选T细胞的组合物和方法
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明是在国立卫生研究院授予的基金号CA151819和CA1710689的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
背景技术
来自肿瘤细胞的新抗原是含有突变的突变蛋白的肽片段，并且能够在肿瘤内的细胞的表面上的主要组织相容性复合物(MHC)I类分子的裂隙中提呈，在那里它们可以被CD8阳性T细胞调查。新抗原的肿瘤特异性结合新抗原特异性T细胞特异性杀伤癌细胞的能力已经使得肿瘤新抗原对癌症免疫治疗越来越重要。另外，识别特异性新抗原的T细胞受体(TCR)是用于靶向产生新抗原的感染的基于TCR工程化细胞的疗法的候选者。
此前已经通过肿瘤外显子组分析识别推定的新抗原，并且随后使用计算机模拟(in silico)分析根据其MHC结合强度排列等级。然而，由于多个原因，发现哪些候选新抗原实际上促进T细胞肿瘤浸润是具有挑战性的。首先，具有每一百万个表达的DNA碱基对十的突变密度的患者肿瘤可能被预测为近似地具有50个推定的新抗原，其表现出与给定的人类白细胞抗原(HLA)基因型MHC的结合常数(Kd)为500nM或更低。而且，任何特定的新抗原特异性T细胞群体可能以非常低的丰度存在于患者中，使得新抗原特异性T细胞的分离和/或识别非常困难。与这些问题相关的挑战包括新抗原与其同源(congnate)TCR的配对。尽管如此，这些新抗原-T细胞配对相互作用处于癌症免疫治疗的核心位置，因此已经为应对这些挑战做出巨大努力。已经显示过往用于新抗原-特异性T细胞配对的方法是费力的、非定量的，和/或由于灵敏度有限，它们可能每个HLA基因型仅识别一个或两个T细胞群体。
发明内容
在本发明的一些实施方式中，抗原复合物包含纳米颗粒分选剂，其包含纳米颗粒，具有至少一个编码区的多核苷酸检测标签，多核苷酸检测标签与纳米颗粒缀合，和与多核苷酸检测标签缀合的第一多核苷酸杂交结构域。抗原复合物还包含肽负载链霉抗生物素蛋白主要组织相容性复合物(MHC)四聚体，其包含修饰的链霉抗生物素蛋白，四个生物素修饰的MHC蛋白，其各自独立地与修饰的链霉抗生物素蛋白缀合，与生物素修饰的MHC蛋白结合的抗原肽，和与第一多核苷酸杂交结构域不同且与修饰的链霉抗生物素蛋白缀合的第二多核苷酸杂交结构域，其中纳米颗粒分选剂通过第一多核苷酸杂交结构域与第二多核苷酸杂交结构域的杂交而与肽负载链霉抗生物素蛋白MHC四聚体连接。
在本发明的一些实施方式中，抗原复合物的文库包含多个上文公开的抗原复合物，其中每个抗原复合物具有与多个抗原复合物中的任何其他抗原复合物不同的抗原肽和不同的多核苷酸检测标签。
在本发明的一些实施方式中，用于检测新抗原特异性T细胞的试剂盒包括包含至少一个编码区的多核苷酸检测标签，其中多核苷酸检测标签与纳米颗粒缀合，试剂盒还包括能够与多核苷酸检测标签的至少一个编码区杂交的解码多核苷酸。在一些实施方式中，试剂盒还包括能够与解码多核苷酸杂交的置换多核苷酸。在一些实施方式中，试剂盒包括图4的多核苷酸检测标签序列中的至少一个。在一些实施方式中，试剂盒包括图8A的解码多核苷酸序列中的至少一个。在一些实施方式中，试剂盒包括图8B的置换多核苷酸序列中的至少一个。在一些实施方式中，试剂盒还包括至少一个肽负载链霉抗生物素蛋白主要组织相容性复合物(MHC)四聚体，其包含修饰的链霉抗生物素蛋白，四个生物素修饰的MHC蛋白，其各自独立地与修饰的链霉抗生物素蛋白缀合，和与生物素修饰的MHC蛋白结合的抗原肽。
在本发明的一些实施方式中，用于分离针对受试者中的肿瘤的新抗原特异性T细胞的方法包括使用主要组织相容性复合物(MHC)结合算法识别针对肿瘤的候选T细胞表位，合成对应于候选T细胞表位的抗原肽，使用抗原肽制备抗原复合物的文库，将抗原复合物的文库与来自受试者的TIL或PBMC孵育，和将配对的T细胞与未配对的T细胞分离，配对的T细胞包含已经与抗原复合物的文库中的任何抗原复合物的任何抗原肽配对的那些T细胞。
在本发明的一些实施方式中，如上所述用于分离针对受试者中的肿瘤的新抗原特异性T细胞的方法还包括将配对的T细胞添加至微流体装置以将配对的T细胞分离为单独的配对的T细胞，和检测每个单独的配对的T细胞的抗原复合物的多核苷酸检测标签的至少一个编码区的序列。在一些实施方式中，检测每个单独的配对的T细胞的抗原复合物的多核苷酸检测标签的至少一个编码区的序列包括孵育每个单独的配对的T细胞的多核苷酸检测标签与至少两个标记的解码多核苷酸，和检测杂交的标记的解码多核苷酸的存在，以由此确定多核苷酸检测标签的至少一个编码区的序列。
在本发明的一些实施方式中，用于分离针对受试者中的肿瘤的新抗原特异性T细胞的方法如上所述，其中抗原复合物的多核苷酸检测标签的至少一个编码区包含至少两个编码区，并且检测每个单独的配对的T细胞的抗原复合物的多核苷酸检测标签的至少两个编码区的序列包括孵育每个单独的配对的T细胞的多核苷酸检测标签与至少两个第一标记的解码多核苷酸，检测一个或多个第一杂交的标记的解码多核苷酸的存在，以由此确定多核苷酸检测标签的至少两个编码区中的第一个的序列，孵育一个或多个第一杂交的标记的解码多核苷酸与一个或多个置换多核苷酸以从第一杂交的标记的解码多核苷酸中除去第一标记的解码多核苷酸以产生部分解码的多核苷酸检测标签，孵育部分解码的多核苷酸检测标签与一个或多个第二标记的解码多核苷酸，和检测第二杂交的标记的解码多核苷酸的存在，以由此确定每个单独的配对的T细胞的抗原复合物的多核苷酸检测标签的至少两个编码区中的第二个的序列。
附图说明
本专利或申请文件含有以颜色制作的至少一个附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公布的副本将由办公室在请求且支付必要费用时提供。
图1是描绘在T细胞(以蓝色显示)上的T细胞受体(TCR)与由抗原提呈细胞(APC)(以红色显示)上的主要组织相容性复合物(MHC)提呈的抗原之间的相互作用的示意图，如Coulie等，2014，Nat Rev Cancer 14:135-146所述，其全部内容通过引用并入本文。
图2A-2B显示在MHC分子(绿色)中的肽抗原(黄色)与TCR(紫色)相互作用之间的特异性结合相互作用，以及突变表位残基与天然表位残基相比的预测IC50结合，如Fritsch等，2014，Cancer Immunol Res，2:522-529所述，其全部内容通过引用并入本文。
图3A是根据本发明的实施方式，显示使用由四个生物素-MHC分子结合的DNA标记的(黑色)和半胱氨酸修饰的链霉抗生物素蛋白(棕色)，构建用于装载不同候选抗原肽的条件性抗原MHC分子(绿色和紫色)，以形成DNA标记的抗原-MHC复合物的文库的示意图。
图3B是根据本发明的实施方式，显示组装和连接DNA条码化纳米颗粒(NP)与DNA标记的抗原-MHC复合物以形成条码化NP-抗原-MHC复合物的文库的示意图，其中DNA条码(即，多核苷酸检测标签)包含与纳米颗粒连接的三个不同编码区(红色，绿色或黄色)并具有在条码的3'端处的杂交DNA(黑色)，其与DNA标记的抗原-MHC复合物的杂交DNA复合以形成条码化NP-抗原-MHC复合物文库。
图3C是根据本发明的实施方式，显示3位编码区条码(红色，绿色或黄色)的实例的示意图。
图4是根据本发明的实施方式，列出用于制备用于识别抗原特异性T细胞的条码化NP-抗原-MHC复合物的文库的3位DNA条码(多核苷酸检测标签)(红色，绿色或黄色)序列的实例的表格。
图5A是根据本发明的实施方式，列出用于条码化NP-抗原-MHC复合物文库中的解码序列(红色，黄色或绿色)的27个候选抗原和对应条码序列和荧光染料颜色的抗原条码密匙(key)。
图5B是根据本发明的实施方式，显示具有所识别的对应编码区序列(D1，D2，D3，D5，D6，D7，D9，D10或D11)以及用于解码序列的对应荧光染料(红色，黄色或绿色)的每个抗原的相应读出的抗原条码密钥。
图6是根据本发明的实施方式，描绘与T细胞上的同源T细胞受体(TCR)配对的条码化磁性NP-抗原-MHC复合物，以及用磁体分离磁性NP的示意图。
图7根据本发明的实施方式，显示DNA序列条码读出的示意图(A)和荧光图像(B-G)，其中如图像B所示NP-DNA首先与读取1DNA杂交以产生红色荧光；如图像C所示引入置换1DNA和读取2DNA以除去读取1DNA，并且如图像D所示产生绿色荧光；如图像E所示按照类似的过程除去读取2DNA，并且如图像F所示产生第三黄色荧光信号，比例尺为50μm。
图8A是根据本发明的实施方式，用于解码图4和图5B的的每个编码区的具有以附着染料(红色，黄色或绿色)的颜色所示的序列的荧光染料标记的DNA(多核苷酸解码序列)(M1，M2，M3，M5，M6，M7，M9，M10和M11)的列表。
图8B是根据本发明的实施方式，用于置换图9A中列出的每个解码序列的置换DNA(多核苷酸置换序列)(M1comp，M2comp，M3comp，M5comp，M6comp，M7comp，M9comp，M10comp和M11comp)的列表。
图9根据本发明的实施方式，显示从来自患者(患者#1)的扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的样品收集的条码化和沉淀新抗原特异性T细胞的单细胞分析，其中最左边的图像是配有10个细胞陷阱的微流体室的光学显微照片，其中9个含有单一条码化T细胞；荧光图像(从左到右)显示编码区1(1st)的读出，编码区2(2nd)的读出和编码区3的读出，读出的结果在图像下方显示，R＝红色，Y＝黄色和G＝绿色。
图10A是根据本发明的实施方式，用于从Jurkat和GBM U876细胞(蓝色细胞)的混合物捕获用Mart-1特异性T细胞受体(绿色细胞)转导的Jurkats细胞的条码化NP-Mart-1MHC四聚体的示意图。
图10B显示根据本发明的实施方式，混合的Jurkat细胞(染成绿色)和GBM U87细胞(染成蓝色)的荧光图像。
图10C显示根据本发明的实施方式，在从图10B的Jurkat(绿色细胞)和GBM U876(蓝色细胞)的细胞混合物分离条码化NP-Mart-1MHC四聚体后，细胞上清液的图像。
图10D显示根据本发明的实施方式，与从图10B的Jurkat(绿色细胞)和GBM U876(蓝色细胞)的细胞混合物磁性下拉条码化NP-Mart-1MHC四聚体相关的细胞的图像。
图11显示患者#1的胸壁、胸膜和肺中的黑素瘤的计算机化轴向断层摄影(CAT)扫描。
图12是根据本发明的实施方式，显示使用两个独立的细胞捕获(扩增#1为橙色和扩展#2为蓝色)，患者#1的新抗原特异性CD8+T细胞的捕获百分比的图，条码化NP-抗原-MHC复合物文库为图5列出的27个推定抗原，非选择性捕获为约0.5％，如通过使用相同方法捕获的CD4+阳性T细胞的数量估计的。
图13是根据本发明的实施方式，显示从来自患者#1的肿瘤的扩增TIL检测到的新抗原群体的图，其中对于所示三个运行(运行#1＝绿色，运行#2＝红色和运行#3＝蓝色)的每个运行，在用于附着NP-条码的基于荧光的读出的微流体芯片的细胞捕获室内分析和分离大约10,000个CD8+TIL；其中运行#1和#2使用具有图5的27个新抗原的相同27元件NP条码化抗原-MHC文库，运行#3使用设计为捕获对等级次序为28-50的新抗原具有特异性的CD8+T细胞的NP-条码化抗原-MHC文库。
图14A显示根据本发明的实施方式，患者#1中的病变(lesion)大小的时间线，其中第0天对应于抗PD1疗法的开始，并且在第28天收集基线肿瘤活检(由红色星号表示)用于基因组和转录组分析，如图11所示黑点对应于CT扫描测量日期，彩色箭头(橙色，紫色/粉色，蓝色，绿色和黑色)对应于图14B中的相同彩色数据条。
图14B显示根据本发明的实施方式，从对患者#1在第187天收集的TIL(上图)(紫色/粉色条)和在治疗过程中收集的PBMC检测到的新抗原特异性T细胞群体(具有图14A中所示相应病变大小，橙色、绿色和蓝色条匹配相同彩色箭头)的图，以及来自基线RNA测序的突变蛋白的含有突变的mRNA读取计数(底部图)，其中PBMC分析图中的水平虚线表示信号阈，在其之上的T细胞群体的识别是统计学显著的；垂直灰色虚线表示在不同时间点和患者材料中检测到的T细胞群体，而垂直橙色虚线对应于在第41天检测到的转录物和相应T细胞群体；并且对于TIL分析，MART-1肿瘤抗原被作为文库元件#50包含，而对于PBMC，含有条件性抗原(MHC-J)的文库元件被作为该元件包含。
图15A是根据本发明的实施方式，显示使用为患者#1设计的NP-条码化抗原-MHC文库以从健康供体的PBMC(橙色)和来自相同临床试验中的无关黑素瘤患者的PBMC(蓝色)捕获CD8+T细胞而分离的T细胞的平均数量的对照实验的图。
图15B是根据本发明的实施方式，其中x轴上的数字标签对应于推定的新抗原的等级次序的图，说明在图15A中的两个对照之间不存在相关性，橙色条代表健康PMBC，而蓝色条代表来自不同患者(非患者#1)的黑素瘤PMBC。
图16显示根据本发明的实施方式，使用基于针对患者#2预测的前28个推定的新抗原的NP-条码NACS文库，加上MART-1肿瘤抗原，对患者#2的TIL(具有绿条的上图)的新抗原特异性CD8+T细胞群体的图形分析，其中只有在多于5个细胞/3000个TIL处检测到的T细胞群体被认为是统计学显著的，并且下图(灰色条)显示对从其衍生新抗原的突变蛋白测量的mRNA拷贝。
图17显示来自患者#1的TIL的多重流分析的数据，其中T细胞用荧光-链霉抗生物素蛋白缀合的新抗原多聚体染色，具有如图例所示的双色条码，流数据肯定地确认新抗原#12在>10个细胞中只有两种颜色，并且用这种多重方法，由于流数据不可以解析个体细胞，其他新抗原如#7、Mart-1、#19和#27(虚线框)是模糊不清的。
图18是根据本发明的实施方式，显示使用用在抗PD-1治疗开始后第439天收集的血液抽取筛选的患者#1特异性条码化NP-抗原-MHC文库在患者#1的PBMC中分析的T细胞的数量的图，其中未分离高于记录的平均值的两个标准偏差(2.2±1.4个细胞/文库元件)的T细胞群体。
图19A是根据本发明的实施方式，具有设计成彼此间隔2mm的单细胞陷阱(用黑色箭头在顶部通道中指示)的单细胞陷阱装置的示意图，允许通过1mm细胞冲孔器(puncher)分离特定俘获细胞而不干扰其他俘获细胞，比例尺显示2mm。
图19B是根据本发明的实施方式，单细胞陷阱的显微镜图像，比率尺显示50μm。
图20A描绘根据本发明的实施方式，显示(从左到右)来自患者#1的捕获的条码化T细胞的光学显微照片，接着是3个连续荧光读出步骤(分别为黄色，红色和绿色)以识别针对新抗原#12的特异性，比例尺为20μm；随后对捕获的单一T细胞冲孔(punche out)以进行RT-PCR以获得TCRα和TCRβ基因序列(DNA梯：100bp)，然后将所获得的TCR基因组装并转移到逆转录病毒载体中(示意性示出)并递送到Jurkat T细胞中(示意性显示为绿色)，以通过流式细胞术进行分析。
图20B显示根据本发明的实施方式，未转导的Jurkat细胞(左)，用LNGFR表达报告体转导的Jurkat细胞(中)和用NGFR和对新抗原12具有特异性的TCR二者转导的Jurkat细胞(右)的流式细胞术结果。
具体实施方式
T细胞介导的免疫的特征在于能够诱导细胞中的凋亡的抗原特异性细胞毒性T细胞的激活，所述细胞在其表面上的主要组织相容性复合物(MHC)中展示外来抗原的表位，如图1描绘的。这些展示负载有外来抗原的MHC复合物的细胞包括病毒感染的细胞，具有细胞内细菌的细胞和展示肿瘤抗原的癌细胞。为了利用T细胞介导的免疫过程，例如用于患者特异性癌症免疫治疗，最初步骤之一包括识别患者的肿瘤特异性抗原(即新抗原)。为了识别患者的推定的新抗原(肿瘤或病原体)，使用计算机模拟预测算法程序，其分析肿瘤、病毒或细菌测序数据以识别对应于推定地表达的新抗原的体细胞突变。此外，从患者的肿瘤或血液样品确定人类白细胞抗原(HLA)分型，并且将该HLA信息与所识别的推定的新抗原肽序列一起用于针对MHC结合的预测算法中，如Fritsch等，2014，同上，所证实的和图2A-2B中描绘的。这些计算机模拟分析产生患者的候选新抗原肽的分级列表，其可以被容易地合成，用于筛选同源抗原特异性T细胞。如本文所用，“抗原特异性T细胞”是指通过其T细胞受体(TCR)相互区分的细胞，所述T细胞受体给予它们它们的抗原特异性。
目前已知用于筛选新抗原特异性T细胞的方法是耗时的和/或具有低灵敏度，并且大多数方法每个HLA基因型仅识别少数T细胞。本发明的实施方式包括用于高保真度、快速和非破坏性地分离和识别靶向患者特异性抗原(例如新抗原)的患者特异性T细胞群体的重组抗原负载MHC组合物和容易的解码方法。本发明的实施方式包括具有与独特的重组抗原-MHC复合物连接的独特的多核苷酸条码(NP)的纳米颗粒(NP)。利用条码化纳米颗粒-抗原-MHC复合物，然后通过选择性分离纳米颗粒，分离该抗原-MHC-T细胞复合物中与抗原-MHC复合物配对的T细胞。然后可以将分离的抗原-MHC-T细胞复合物转移至细胞俘获平台以分离单独的抗原-MHC复合物-T细胞。根据本发明的实施方式，用于每个分离的NP的独特条码是通过原位扩增或使用荧光标记的条码有义链“阅读器”识别。使用这种纳米颗粒分离和条码识别方法，识别但不破坏个体抗原-MHC-T细胞复合物。因此，分离的T细胞在被识别为有价值的来源之后可用于进一步表征(例如肿瘤生物标志物分析)或用于进一步繁殖。T细胞的进一步生长导致靶向患者特异性抗原的患者衍生T细胞的富集群体。该靶向患者特异性抗原的患者衍生T细胞的群体可以用于过继性细胞转移至患者中，作为靶向肿瘤或病原体的免疫疗法的手段。
根据本发明的实施方式的组合物包含与条码化纳米颗粒(NP)分选剂复合以形成条码化NP-抗原-MHC复合物的重组抗原-MHC。条码化NP-抗原-MHC复合物在形式上是模块化的，如图3A和3B示意性示出的。条码化NP-抗原-MHC复合物由通过多核苷酸杂交结构域(在图3B中以黑色显示)连接在一起的抗原-MHC复合物和条码化NP复合物构成。条码化NP-抗原-MHC复合物的模块形式允许容易地修饰条码化编码区以增加特异性和增加可以一并分析并随后分离和识别的不同复合物的数量。在条码化编码区形成多核苷酸检测标签的情况下，每个抗原与独特的n位条码多核苷酸序列相关联，允许每个位置n个可能序列。3位条码的实例在图3B和3C中以不同颜色(黄色，红色或绿色)示出。该3位条码产生33或27重抗原文库，27个不同抗原中的每一个具有在分离复合物后可以容易地确定的特定条码。用一个T细胞悬浮体筛选27个不同抗原的能力是相对于目前更加费时的方法的显著优势。条码化NP-抗原-MHC复合物的每个模块组分在下文中更详细地描述。
计算机模拟分析可用于识别新抗原。用于识别推定的新抗原的计算机模拟分析需要患者中的肿瘤、病毒或细菌的基因组(DNA)或外显子(RNA)序列。由于患者中发现的大多数病毒和细菌对于一名患者不是唯一的，因此这些病原体的基因组序列可能是已知的，并且可以使用可获得的序列数据。尽管如此，未知的(新的)和先前识别的病毒和细菌二者可以从患者(例如从血液样品)分离用于DNA或RNA测序。
由于肿瘤癌症包括患者特异性突变，因此来自患者的肿瘤活检或血液样品的肿瘤细胞的DNA或RNA测序作为起始步骤进行。使用肿瘤新抗原的实例，根据本发明的实施方式，对患者具有特异性的肿瘤新抗原的识别包括DNA和/或RNA测序以及来自患者的肿瘤活检或血液样品的肿瘤细胞的HLA-分型。对于体细胞突变识别(即体细胞突变调用)，也对匹配的正常患者肿瘤或血液样品进行DNA或RNA测序。然后将总的肿瘤-正常测序数据输入到至少一个(例如两个或三个)算法程序(例如，MuTect v1.1.7，Varscan2Somatic(V2.3.6)，和/或GATK-HaplotypeCaller(HC，v3.3))以识别推定表达(对应于)新抗原的体细胞突变。在本发明的一些实施方式中，对于具有低突变负荷的肿瘤的患者，可以利用所有的计算机模拟识别的体细胞突变形成用于T细胞筛选的候选肿瘤新抗原组。或者，尽管可以分析所有识别的体细胞突变，但是在具有高突变负荷的肿瘤的患者中可以识别大量体细胞突变，因此筛选所有的识别的突变可能不是高效的或必然有效的。因此，在本发明的一些实施方式中，对计算机模拟识别的体细胞突变进行分级，最高等级的体细胞突变是由至少三个算法程序观察到的，随后是由至少2个算法程序观察到的。为了筛选可管理数量的候选新抗原肽，使用用于HLA分型的软件(例如，ATHLATES)从肿瘤外显子组测序数据确定患者的HLA类型。使用用于患者特异性HLA类型的软件(例如，NetMHC3.4server)，识别来自患者的活检肿瘤或血液样品的推定的新抗原序列。
本发明的实施方式包括能够与同源T细胞配对的重组抗原-MHC复合物。如本文所用，“抗原复合物”，“抗原-MHC”，“抗原-MHC复合物”，“重组抗原-MHC复合物”，“肽MHC”和“p/MHC”可互换使用以指具有在抗原结合沟中的肽的重组主要组织相容性复合物。如本文所用，“抗原”包括任何抗原，包括患者特异性新抗原。
根据本发明的实施方式的重组抗原-MHC复合物包含重组MHC分子。在本发明的一些实施方式中，MHC复合物可以是与CD8-阳性(CD8+)T“杀伤”细胞配对的MHC I类(MHC I)复合物。在本发明的其他实施方式中，MHC复合物可以是与CD4+“辅助”T细胞配对的MHC II类(MHC II)复合物。由MHC I类复合物提呈的抗原是胞质蛋白，而由MHC II类复合物提呈的抗原衍生自细胞外蛋白。由于肿瘤细胞是表达突变的内源衍生细胞，肿瘤抗原通常由MHC I类分子提呈，由此与CD8+T细胞配对。类似地，病毒蛋白是从患者的细胞内源地表达，并且也由MHC I类分子提呈给CD8+T细胞。然而，细菌细胞使用它们自己的细胞机制表达蛋白质，其在患者中感染时，被认为是外源表达的，并且由患者的MHC II类分子提呈给CD4+T辅助细胞。MHC III类分子包括其他免疫组分，如补体组分(例如C2，C4，B因子)和编码细胞因子(例如TNF-α)的一些以及热休克蛋白(hsp)。
根据本发明的实施方式，重组抗原MHC复合物的MHC I或MHC II分子被合成以对应于患者的HLA类型。在MHC I和MHC II分子二者中发现多态性。MHC I类分子是由两条多肽链α和β2-微球蛋白(b2m)组成的异二聚体。α链具有三个结构域，包括α1，α2和α3。α和b2m链通过b2m和α链的α3结构域的相互作用非共价连接。α链是多态的，且由HLA基因复合物编码，而b2m亚基不是多态的，且由b2m基因编码。α和b2m链的组装通过在α1和α2结构域表面的抗原结合沟中负载的9-11个氨基酸的肽抗原的存在而稳定。根据本发明的实施方式，患者特异性MHC I类抗原在对应于患者的HLA类型的重组MHC I类复合物上提呈。例如，MHC Iα链由HLA-A，HLA-B或HLA-C基因编码。HLA-A，HLA-B和HLA-C基因中的每一个表达等位基因特异性亚型，其中的一些在实施例19中的表7中示出。
MHC II类分子是由两条多肽链α和β组成的异二聚体。α和β链各自具有两个结构域：分别为α1和α2以及β1和β2。α和β链二者是多态的，且由HLA基因复合物编码。α和β链的组装在α1和β2结构域二者的表面上形成抗原结合沟，抗原肽长度为11到30个氨基酸。根据本发明的实施方式，患者特异性MHC II类抗原在对应于患者的HLA类型的重组MHC II类复合物上提呈。例如，HLA基因包括HLA-DM，HLA-DO，HLA-DQ和HLA，其中MHC IIα链由HLA-A-DMA，HLA-DOA，HLA-DPA1，HLA-DQA2或HLA-DRA基因编码，并且β链由HLA-DMB，HLA-DOB，HLA-DPB1，HLA-DQB1，HLA-DQB2，HLA-DRB1，HLA-DRB3，HLA-DRB4或HLA-DRB5基因编码。
在本发明的一些实施方式中，重组MHC分子是如Novak等，1999，J.Clin.Invest.104:R63-R67(其全部内容通过引用并入本文)所述表达和用候选抗原肽加载的MCH II类分子。
在本发明的一些实施方式中，重组MHC分子是作为条件性配体表达的MHC I类分子。由于MHC I类分子在不存在肽(即抗原肽)的情况下不稳定，因此表达重组MHC I类分子与具有可切割部分的肽，其在用UV光照射时，从复合物解离并分解。然而，如果可切割肽的UV分解是在“救援肽(rescue peptide)”的存在下进行，则救援肽将容易地替换结合沟中的UV照射的肽，如图3A所描绘的和Toebes等，2006，Nat.Med.12:246-251和Bakker等，PNAS，2008，105:3825-3830中所述的，二者的全部内容通过引用并入本文。使用这种技术，可以用候选新抗原容易地加载多个组装的MHC I类分子以形成用于筛选T细胞的MHC I类新抗原文库。
在本发明的一些实施方式中，重组MHC分子是四个MHC分子的四聚体复合物，各自负载相同的候选抗原肽。由于大多数新抗原对MHC蛋白具有低结合亲和力(Kd)(例如，500nM或更低)，因此四聚体MHC复合物允许增加的结合亲合力，由此增加该抗原-MHC四聚体探针用于与低丰度同族T细胞配对的灵敏度。在本发明的一些实施方式中，使用与四个生物素修饰的MHC分子缀合的修饰的链霉抗生物素蛋白形成MHC四聚体。链霉抗生物素蛋白被修饰以使能够结合多核苷酸(例如DNA或RNA)接头。链霉抗生物素蛋白的修饰包括可与与多核苷酸分子连接的相应同源结合部分配对(例如共价结合)的结合部分。可使用任何合适的结合部分对修饰链霉抗生物素蛋白和多核苷酸以用于连接。结合部分对的非限制性实例包括硫醇基团(例如半胱氨酸)和马来酰亚胺，金刚烷和环糊精，氨基基团和羧基基团，以及叠氮基团和炔基团(即点击化学)。与马来酰亚胺修饰的DNA杂交结构域连接的半胱氨酸修饰的链霉抗生物素蛋白(“DNA标记的四聚体”)的实例显示在图3A中。
筛选多个抗原-MHC-T细胞配对的当前挑战之一是分离和识别对应于配对肽抗原的T细胞受体表位。本发明的实施方式包括连接至多核苷酸检测标签(即，条码)的修饰的纳米颗粒，其中多核苷酸检测标签包含至少一个编码区。该复合物以及使用该复合物的方法也被称为纳米颗粒-条码化核酸细胞分选(NP-条码化NACS)和纳米颗粒分选剂。在一些实施方式中，纳米颗粒是磁性的，用于使用磁体进行分离。在一些实施方式中，纳米颗粒是通过重力分离的1μm至15μm聚苯乙烯颗粒。根据本发明的实施方式，纳米颗粒用结合部分修饰以连接至多核苷酸编码区。纳米颗粒的修饰包括可以与与多核苷酸分子连接的对应同源结合部分配对(例如，共价结合)的结合部分。可以使用任何合适的结合部分对修饰纳米颗粒和多核苷酸检测标签以用于连接。结合部分对的非限制性实例包括硫醇基团(例如半胱氨酸)和马来酰亚胺，金刚烷和环糊精，氨基基团和羧基基团，以及叠氮基团和炔基团。
本发明的实施方式包括条码化纳米颗粒复合物，其中条码是由编码区组成的多核苷酸检测标签，所述编码区提供在T细胞分离后用于识别的独特抗原特异性序列。如本文所用，“编码区”是具有与另外的多核苷酸分开的独特且特异性的序列的核苷酸组。在一些实施方式中，一个多核苷酸编码区由5至25个核苷酸碱基对构成。在一些实施方式中，一个多核苷酸编码区由7至25个核苷酸碱基对，8至25个核苷酸碱基对，9至25个核苷酸碱基对，10至25个核苷酸碱基对，10至20个核苷酸碱基对，10至19个核苷酸碱基对，10至18个核苷酸碱基对，10至17个核苷酸碱基对，或10至16个核苷酸碱基对构成。在一些实施方式中，条码化纳米颗粒复合物具有带有至少一个编码区的多核苷酸检测标签(即1位条码)。如本领域技术人员所理解的，编码区的数量(n)对应于可一起筛选并随后识别的不同抗原的数量。对于原位编码区的分析，不同编码区的数量仅受限于不同着色荧光染料的数量。对于多核苷酸检测标签的解码，将从称为第一编码区或编码区1的附着到纳米颗粒的编码区开始“读取”编码区。在远离纳米颗粒的方向上的之后的任何编码区是第二编码区(编码区2)，接着是第三编码区(编码区3)等等。与具有三个编码区和多核苷酸(例如，ssDNA)杂交结构域(黑色)的多核苷酸检测标签连接的纳米颗粒的实例在图3B中描绘为“NP条码文库”。在条码化NP复合物的文库中，根据本发明的实施方式，每个多核苷酸检测标签序列对于所有其他多核苷酸检测标签序列是独特的。在本发明的一些实施方式中，虽然可以在多于一个检测标签序列中找到编码区序列，但是每个编码区序列可以仅出现在一个编码区位置中。例如，ssDNA的3位编码区文库包括编码区1中的编码区D1，D2和D3，编码区2中的D5，D6和D7以及编码区3中的D9，D10和D11，导致如图4的表格中列出的27个不同检测标签序列。
根据本发明的实施方式，将多核苷酸杂交结构域连接至条码化NP的多核苷酸检测标签的3’端，并将第二多核苷酸杂交结构域连接至抗原-MHC复合物的链霉抗生物素蛋白支架。因此，抗原-MHC复合物通过互补杂交结构域的杂交连接到条码化纳米颗粒。在本发明的一些实施方式中，第一多核苷酸杂交结构域和第二多核苷酸杂交结构域可以是分别具有第一和第二杂交序列的单链DNA(ssDNA)，其中第一和第二杂交序列是互补的，导致杂交的双链DNA(dsDNA)的接头，如图3B，3C中的重叠黑线所示。在一些实施方式中，第一和第二杂交结构域是“通用的”，并且对于文库中的所有条码化NP复合物和抗原-MHC复合物是相同的。使用通用杂交结构域允许合成具有附着的杂交结构域的一个链霉抗生物素蛋白分子。此外，使用编码限制性位点或UV可切割序列的通用杂交结构域允许从NP条码快速切割抗原-MHC复合物。在本发明的其他实施方式中，对于每个条码化NP-抗原-MHC复合物，第一和第二杂交结构域是不同的。
如本领域普通技术人员所理解的，每个独特的抗原-MHC复合物与独特的条码序列连接(即杂交)。在本发明的一些实施方式中，条码化NP-抗原-MHC复合物文库的制备包括候选抗原及其相应条码(即，多核苷酸检测标签序列)的记录(例如，密匙或图例)。该编码密匙有助于有效识别与T细胞配对的特异性抗原。用于图4的候选抗原(患者特异性候选新抗原和MART-1肿瘤抗原)的列表的抗原和条码密匙的实例在图5A-5B中显示。
本发明的实施方式包括用于筛选抗原特异性T细胞的条码化纳米颗粒-抗原-MHC复合物。如本领域技术人员所理解的，可以在T细胞存在下使用复合物分析单一抗原。然而，分析一个候选抗原不像筛选多个候选抗原那样高效。根据本发明的实施方式，使用不同的候选抗原和相应的独特编码区制备不同的条码化NP抗原-MHC复合物，形成条码化NP-抗原-MHC复合物的文库。使用条码化NP-抗原-MHC复合物的文库描述以下方法；然而可以遵循或容易地适用该方法筛选单个候选抗原。
根据本发明的实施方式，使用条码化NP-抗原-MHC复合物的文库分离和识别患者衍生的且抗原特异性的T细胞包括孵育候选抗原复合物与患者衍生T细胞。在一些实施方式中，从患者的外周血单核细胞(PBMC)或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)分离患者衍生T细胞。在本发明的一些实施方式中，使用抗CD4和抗CD8荧光抗体从PBMC或TIL标记和分选CD4+和CD8+T细胞二者，使用荧光激活细胞分选(FACS)分选CD4+和CD8+单阳性细胞的活群体，以仅分离CD4+或CD8+细胞。在本发明的一些实施方式中，可以使用抗CD3荧光抗体，然后是FACS，分离对CD4和CD8二者为阳性的T细胞。本领域技术人员能够确定针对所使用的抗原-MHC复合物的一个或多个类型而分离的T细胞的类型。例如，如果文库由MHC I分子排他地构成，则T细胞群体可能仅为CD8+，而MCH II分子需要CD4+T细胞。在其他实施方式中，具有MHC I和MHCII分子二者的抗原文库可以与作为CD4和CD8二者阳性的T细胞孵育。在又一些实施方式中，具有MHC I或MHC II分子的抗原文库可以用对CD4和CD8二者阳性的T细胞筛选。
本发明的实施方式包括孵育条码化NP-抗原-MHC复合物文库与CD4+，CD8+或CD4+/CD8+T细胞的悬浮液。纳米颗粒文库与T细胞悬浮液的孵育允许纳米颗粒结合的抗原完全和彻底地暴露于各个T细胞受体。该方法可以包括细胞的摇摆或旋转。在孵育抗原复合物与T细胞之后，选择性分离或选择性收集纳米颗粒。例如，如果纳米颗粒是磁性的，则将磁体施加到悬浮液允许分离与抗原配对的T细胞复合的纳米颗粒，并去除未配对的T细胞。具有配对的T细胞的分离的磁性纳米颗粒的实例在图6中示意性地示出。或者，如果纳米颗粒是聚苯乙烯纳米颗粒，则可以通过重力(例如离心)分离未配对的T细胞。在分离未配对的T细胞后，在一些实施方式中，将分离的纳米颗粒洗涤至少一次以除去任何非特异性结合的T细胞。
为了分析用纳米颗粒复合物分离的配对的T细胞，将细胞装载到微流体装置中，其在装置的通道中的个***置(“陷阱”)中分离并安置单一细胞。
如本文关于条码化纳米颗粒抗原-MHC复合物所使用的，“配对的T细胞”和“T细胞配对的抗原MHC复合物”是指具有T细胞受体表位的T细胞的复合物，所述表位结合条码化纳米颗粒抗原-MHC复合物中的抗原肽。因此，在细胞俘获装置中分离的配对的T细胞的情况下，原位识别配对的抗原-MHC复合物的编码区(条码)以确定同源肽抗原的序列。因此，从编码区1开始读取每个编码区。编码区1的所有可能的互补多核苷酸序列与可区分的荧光染料连接，形成染料-多核苷酸解码器序列，其使荧光与纳米颗粒上的互补编码区杂交，由此“读取”编码区1。如本文所用，“可区分的荧光染料”和“可区分的染料”是指具有与另外的染料在视觉上不同的颜色的染料。可以使用能够连接到多核苷酸的任何合适的染料。为了读取第二编码区，添加“置换”多核苷酸以移除编码区1的染料-多核苷酸解码器，随后是与编码区2相对应的所有可能的染料-多核苷酸解码器序列，或者同时添加它们。在多于一个编码区的解码中，在读取编码区1之后，多核苷酸检测标签被部分地解码。也就是说，“部分解码的多核苷酸检测标签”具有至少一个解码的编码区，但不是所有编码区都被解码。使用这种读取-置换/读取-置换/读取的格式读取后续编码区。使用条码化颗粒验证这种逐步读出技术，并在图7中描绘和示出。如本领域技术人员所理解的，对于这种条码化纳米颗粒文库中的编码区的荧光读取，一个可区分的荧光染料可以仅与每个编码区位置的一个解码序列相关联。例如，为了读取编码区2，红色荧光染料可以仅对应于用于解码编码区2的一个特定解码序列。在本发明的一些实施方式中，多核苷酸解码器序列是ssDNA或RNA。例如，如图8A的表中列出的，ssDNA解码序列M1，M2，M3，M5，M6，M7，M9，M10和M11是与D1，D2，D3，D5，D6，D7，D9，D10和D11的各自编码区杂交的荧光染料连接的解码序列(图4)，每个解码序列以相应荧光染料的颜色显示。与图8A中的每个解码序列对应(即，与之杂交)的实例置换ssDNA序列包括如图8B的表中列出的ssDNA序列M1comp，M2comp，M3comp，M5comp，M6comp，M7comp，M9comp，M10comp和M11comp。
在本发明的一些实施方式中，使用与“置换”多核苷酸序列组合的荧光染料-多核苷酸解码“读取器”序列原位识别T细胞配对的抗原MHC复合物的编码区(条码)。该方法使用图5A中的27个抗原的条码化NP-抗原-MHC文库进行，其具有如图4中列出的NP条码(检测标签)序列。在与衍生自患者的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的T细胞孵育后，与分离的磁性纳米颗粒缔合的细胞在如图9左侧配有10个细胞陷阱的微流体室的光学显微照片所示的微流体细胞俘获装置中分离。如所示的，细胞陷阱中只有9个含有单一条码化T细胞。这9个条码化T细胞被读出并分别使用图8A和8B中列出的荧光染料连接的解码ssDNA序列置换。图9中从左向右显示每个编码区读取的荧光图像，编码区1的图像标记为1st，编码区2的图像标记为2nd，和编码区3标记为3rd。图像下方提供了9个俘获细胞的比色读出(R＝红色，G＝绿色，Y＝黄色)。注意位置8处的细胞不提供清楚的读取，并且位置9处的细胞丢失。使用根据本发明的实施方式的方法，仅考虑提供清楚的、毫无疑义的读出的俘获细胞，由此允许控制筛选过程的保真度。使用图5的条码密匙，确定相应的新抗原和肿瘤抗原MART-1。例如，图9中的位置3处的细胞读取对应于图5A中列出的新抗原12的YRG，并且位置4处的细胞读取对应于MART-1肿瘤抗原的RGY。
本发明的实施方式包括用于制备条码化纳米颗粒的文库的试剂盒，所述试剂盒包括条码(多核苷酸检测标签)序列，用于读取条码的相应的荧光染料连接的多核苷酸解码器序列，以及用于除去解码器序列的相应的置换多核苷酸序列。多核苷酸序列包括ssDNA或RNA。在本发明的一些实施方式中，多核苷酸序列是ssDNA。在本发明的一些实施方式中，多核苷酸检测标签序列在其5'端被修饰为结合部分以附着至纳米颗粒。例如，图4中的多核苷酸检测标签(ssDNA条码)序列与生物素分子缀合以结合至链霉抗生物素蛋白-纳米颗粒；然而可以使用任何合适的结合部分。如本文所述并且如本领域技术人员所理解的，合适的结合部分对是本领域已知的。结合部分的非限制性实例包括硫醇，马来酰亚胺，金刚烷，环糊精，胺，羧基，叠氮化物和炔烃。在本发明的一些实施方式中，试剂盒还可以包括用对应于修饰的多核苷酸检测标签上的结合部分的同源结合部分修饰的修饰的纳米颗粒。
在本发明的一些实施方式中，用于制备条码化纳米颗粒的文库的试剂盒还包括能够负载任何MHC抗原肽的重组条件性MHC四聚体复合物。MHC可以是MHC I类或MHC II类，并且包括对应于患者的单倍型的任何特定单倍型。例如，试剂盒可以包括对应于表7中列出的HLA类型的MHC I类分子。例如，试剂盒可以包括对应于HLA-DM，HLA-DO，HLA-DQ和HLA的MHCII类分子，其中MHCIIα链由HLA-A-DMA，HLA-DOA，HLA-DPA1，HLA-DQA2或HLA-DRA基因编码，且β链由HLA-DMB，HLA-DOB，HLA-DPB1，HLA-DQB1，HLA-DQB2，HLA-DRB1，HLA-DRB3，HLA-DRB4或HLA-DRB5基因编码。
在本发明的一些实施方式中，用于制备条码化纳米颗粒的文库的试剂盒包括用于附着至纳米颗粒的修饰的多核苷酸检测标签序列。可以使用用于识别俘获的条码化T细胞的替代方法。例如，可以从微流体装置扩增和测序多核苷酸检测标签序列。
使用用于识别多核苷酸检测标签和与俘获的T细胞配对的相应抗原的原位解码读出方法不破坏或不利地影响T细胞。因此，在已经识别抗原之后，可以从微流体装置移除俘获的T细胞以用于进一步的分析和/或生长。
以下实施例仅出于说明目的而提供，并不限制本申请的范围或内容。
实施例
实施例1.抗原特异性T细胞的捕获效率。
通过采用从细胞混合物中选择性捕获Mart-1抗原特异性T细胞，验证了条码化NP抗原-MHC复合物文库。图10A显示用于捕获用Mart-1特异性T细胞受体转导的Jurkat细胞的NP-Mart-1四聚体的示意。图10B显示混合的Jurkat(染成绿色)和GBM U87细胞(染成蓝色)。NP-Mart-1四聚体与混合细胞群体一起孵育，并用来自图10C所示上清液的和来自图10D所示磁性下拉的细胞磁性地富集。
实施例2.条码化NP-抗原-MHC复合物文库的使用。
使用NP-抗原-MHC复合物文库工具分析从两名转移性黑素瘤癌症患者的治疗中(on-treatment)肿瘤活检收集的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增的CD8+细胞，所述患者在活检时阳性地响应于抗PD-1检查点抑制剂疗法，如图11所示。在I期试验中用抗PD-1抗体pembrolizumab治疗这两名患者，已知对该疗法的响应是由肿瘤浸润CD8+细胞介导的。对于每一名患者，还收集了治疗前活检(图11)，并分析肿瘤外显子组和基因表达二者。进行计算机模拟分析以制备推定的新抗原的列表，根据对HLA A*02.01的预测Kd排列等级(下表1-4)。对于每一名患者是独特的这些列表报告了被构建以提呈前27个推定的新抗原加上MART-1黑素体抗原的NP-条码化NACS文库的构建(新抗原#8被排除，因为其导致NP聚集)。对于患者#1，对应于新抗原编号3、5、11、26、31、34、36、37、46和48的突变蛋白的转录物产生了零突变读取(表3)，并且被包括在所有试验中作为跨越来自微流体装置的新抗原/MHC结合亲和力的取样范围的对照以进行进一步分析和/或生长。
表1.患者#1的推定的新抗原。括号内的字母表示天然肽。
Figure BDA0001488986720000211
Figure BDA0001488986720000221
表2.患者#2的推定的新抗原。括号内的字母表示天然肽。
Figure BDA0001488986720000222
Figure BDA0001488986720000231
表3.患者#1的新抗原和突变基因的全面分析。
Figure BDA0001488986720000232
表4.患者#2的新抗原和突变基因的全面分析。
Figure BDA0001488986720000241
患者#1的最强结合的27个新抗原列于图5A中。对于患者#1，对应的NP-条码化NACS文库捕获4.5-5％的CD8+TIL，0.5％为非选择性捕获，如通过对来自相同患者肿瘤的CD4+T细胞测试所述文库而测量的(图12)。对于患者#1的样品，在对两个分开小瓶的扩增TIL进行的两次分开的运行中，将条码化T细胞加载到微流体芯片中，进行顺序荧光读取以平行地识别相同的8个新抗原特异性T细胞群体(加上MART-1特异性细胞)(图13)。在两个试验中均检测到所有但丰度非常低的群体(1或2次事件/分析)。最丰富的群体是对新抗原#12具有特异性的，占每1000个扩增TIL约12个细胞。对于患者#1，进一步扩增NP-条码化NACS文库以分析TIL对等级为28-50(Kd值为至多500nM)的新抗原的特异性。检测到两个另外的群体(#的38和45)。条码化荧光读出方法的价值在于对于捕获的每个T细胞，存在高保真度读取，或者偶尔地，无义读取(参见，例如，图9中的细胞#8)。因此，这种方法的噪音水平非常低。检测到的新抗原特异性T细胞群体被定义为通过3个或更多个毫无疑义的读取识别的那些，或者在患者#1的TIL的两个分析中都被检测到的那些。患者#1的TIL对于该50个元件的文库的总和分析在图14B中提供，对应病变分析在图14A中显示。
实施例3.在PBMC中筛选条码化NP-抗原-MHC复合物文库。
使用连续方法分析一些生物样本，其中使用每个NP条码化NACS文库元件查询特定T细胞群体。这种方法对于PBMC的分析是最有用的，其中新抗原特异性T细胞群体特别罕见，并且除去所有可能干扰荧光读出的未结合磁性NP可能是具有挑战性的。为了表征该方法的非特异性下拉速率，使用针对患者#1设计的NP条码化NACS文库分析来自在相同临床试验中的另外的不相关的黑素瘤患者的扩增TIL，以及来自健康志愿者的PBMC。新抗原的列表对于每一名患者是独特的，因此针对患者#1设计的文库不应当捕获两个对照患者样品的T细胞群体。对于对照二者的结果是相似的：患者#1的新抗原文库捕获平均2个细胞/文库元件，标准偏差为1.4，如图15所示。因此，噪声水平被设定为5个细胞(比平均值高2个标准偏差)。在两个对照的分析中，没有文库元件捕获多于5个细胞，并且在对照之间没有相关性(图15)，表明患者#1的文库元件都不是固有地低选择性的。使用5-细胞截断(cut-off)患者#2的NP条码化NACS文库，该患者的TIL的系列分析产生与对患者#1的TIL的相应分析发现的数量相似的新抗原特异性T细胞群体，如图16所示。
实施例4.与多重流分析的比较。
患者二者的TIL的分析揭示了比使用类似患者样品的多重流分析已经报道的数量更大的新抗原特异性T细胞群体。使用Andersen等，2012，Nat.Protocols，7:891-902(其全部内容通过引用并入本文)中描述的多重流方法分析扩增的患者#1的TIL。对于该分析，制备了14元件四聚体文库，提呈推定的新抗原1-8、12、14、15、19、27和Mart-1(其中的8个被使用NP条码化NACS检测)。只有对新抗原#12具有特异性的T细胞被检测到为仅有两种颜色且在>10个细胞中(图17)。这是来自通过NP-条码化NACS方法分析的TIL的最丰富的群体。然而，由于流数据不可以解析个体细胞(这使用根据本发明的实施方式的NP-NACS技术现在是可能的)，对于其他新抗原如#7、#19、#27和Mart-1的结果是模糊不清的。
实施例5.采用来自患者#1的PMBC的分析。
NP条码化NACS方法的灵敏度促进分析来自患者#1的外周血的新抗原特异性T细胞群体。这些T细胞没有体外扩增，从而避免可能伴随这样的扩增的任何群体偏差。对于血液分析，使用完整的50个元件的新抗原文库询问在四个时间点收集的PBMC。两个时间点(第187天和第208天，图11)在响应于疗法的过程中收集，同时肿瘤正在缩小，并且准确地对应于从其收集TIL的肿瘤活检的日期(第187天)。对于这2个PBMC样品，新抗原特异性T细胞水平低于在TIL中发现的那些(所有CD8+T细胞的1％相对于7％)，但阳性地检测到水平>0.05％的多个群体。大多数群体与从TIL检测到的那些一致，识别了两个新的群体(对新抗原#15和#33具有特异性)。如图18所示，第439天的PBMC的分析检测到零的新抗原特异性群体。
第41天的PBMC对应于接近从其进行外显子组和转录组测量的活检，但同样在响应之前患者#1的伪进展的时间段期间(图11)的时间。在这个早期时间点观察到T细胞，并且相对于肿瘤正在退化时的后期时间点，这些群体以实质性高的数量(CD8+PBMC的约2％)存在。在第187天和第208天检测到的相同群体也在第41天被检测到，以及另外的群体。
来自PBMC的检测到的新抗原特异性T细胞群体中的多个对应于相对弱(Kd>100nM)的新抗原/MHC结合亲和力。来自与来自治疗前转录组分析的突变蛋白相关的mRNA的含有突变的读取的数量在图14的底部图中提供。在对较弱结合的新抗原具有特异性的T细胞群体的出现与相应突变蛋白的表达水平之间存在突出的对应。例如，根据mRNA表达水平排列的前12个新抗原中的8个被检测到(表3)。进一步地，对于其相应mRNA水平被测量为零的组中的10个新抗原，只有强结合新抗原#5与任何所检测到的群体(TIL和第41天的PBMC)相关。
实施例6.捕获的T细胞不被破坏。
NP-条码化NACS方法的优点在于该方法是非破坏性的，并且现在具有已知的抗原特异性的单一T细胞被通过微流体装置单独地分离且可用于进一步分析，包括TCRα和β基因测序。为此，克隆来自患者#1的单一T细胞的配对TCRα和TCRβ基因，二者均作为条码化新抗原特异性的能力(capability)和验证的证据。在单一微流体俘获装置中捕获CD8+T细胞(图19A、19B)并条码化以识别新抗原的身份(图20A)。对捕获的单一T细胞冲孔以进行RT-PCR以获得TCRα和β基因序列。发现被转导以表达该TCR的Jurkat细胞结合同源新抗原四聚体(图20B)。
从响应于抗-PD1疗法的免疫治疗患者的两个肿瘤收集的T细胞的分析显示，前50个预测的新抗原中的大约20％占肿瘤中的CD8+T细胞的大部分(对于HLA A*02.01为～7％)。此处分析的两名患者各自表达6个HLA基因型。虽然另外的HLA基因型的实际表现仍然需要被测试，但这意味着这些患者肿瘤内的CD8+TIL中的40％或更多是新抗原特异性的。这个数量显著大于已经使用替代分析方法推断的数量，并着重强调新抗原特异性T细胞群体作为抗PD-1癌症免疫治疗中的主要效应物的重要性。第二个观察结果是新抗原特异性T细胞群体的测量谱仅与推测的新抗原的预测等级次序松散地相关。然而，发现了与mRNA表达水平的另外的相关性，特别是对于较弱结合的新抗原。第三个观察结果是在肿瘤中检测到的相同新抗原特异性群体也在血液中检测到，尽管是处于对所有CD8+PBMC的较低相对丰度。在此处报道的针对患者#1的分析中，在实际肿瘤收缩的传统临床措施(通过体内成像)的整整两个月之前，检测到这些群体。
实施例7.患者、治疗和标本收集。
通过作为是HLA-A*02:01阳性，具有适当的基线活检以及治疗中活检，并且在参与pembrolizumab的1期试验时显示客观肿瘤响应，选择转移性黑素瘤患者用于当前分析。患者#1和#2静脉内接受单一试剂pembrolizumab，每3周10mg/kg(10Q3W)。在第12周开始评估肿瘤响应，在第一次响应后4周确认，并此后每12周成像。响应通过实体瘤中的响应评估标准(RECIST)和免疫相关的响应标准(irRC)二者表征。肿瘤活检和外周血细胞收集和分析由UCLA IRBs11-001918和11-003066批准。来自所分析的患者的肿瘤活检在基线处和治疗中获得并处理，一个等分试样立即固定在***中，然后石蜡包埋用于病理学分析，第二个等分试样通过立即浸入液氮中而突然冷冻用于遗传分析，并且第三个等分试样在无菌条件下新鲜切碎，然后是在液氮中冷冻保存之前DNA酶/胶原酶消化以产生单细胞悬浮体(s.c.s)。通过Ficoll-Paque密度梯度离心从新鲜全血制备外周血单核细胞(PBMC)并冷冻保存。
实施例8.TIL分离和扩增。
使用抗-CD3抗体(OKT3，50ng/mL，48小时暴露)和IL-2(300IU/mL)从冷冻保存的s.c.s扩增肿瘤浸润淋巴细胞，并在2-4周后以5x106细胞/mL重新冷冻保存。将TIL解冻并在使用早晨用DNA酶处理45分钟，并用对CD4(BV510，BioLegend，San Diego，CA)和CD8+(BV605，BioLegend，San Diego，CA)的抗体染色。使用FACS Cell Sorter(BD Biosciences，San Jose，CA)分选CD4和CD8+单一阳性细胞的活(7AAD-阴性)群体。
实施例9.全外显子组测序(WES)、突变调用和HLA-分型。
从突然冷冻的肿瘤活检(Qiagen AllPrep Kit)同时提取DNA和RNA二者。在UCLAClinical Microarray Core上对来自肿瘤和匹配的正常血液样品的DNA进行测序。在使用靶向65Mb的基因组的Nimblegen SeqCap EZ Human Exome Library v3.0(Roche)的外显子捕获之后，在HiSeq 2000平台(Illumina，San Diego，CA)上进行配对末端2x100bp测序。测序产生每个样品60-100亿个读取，每个靶向的碱基被平均90-150个读取覆盖。使用BWA-mem算法(v0.7.9)将序列与UCSC hg19人类基因组参比进行比对。预处理遵循GATK BestPractices Workflow v3，包括双重去除(Picard Tools)，***缺失重新比对，和碱基质量分数重新校准。使用MuTect(v1.1.7)2，Varscan2Somatic(v2.3.6)3和GATK-HaplotypeCaller(HC，v3.3)，用从1修改的方法调用体细胞突变。只保留高置信度的突变，定义为由三个程序中的至少两个识别的那些。对于GATK-HC，在肿瘤/正常对之间使用单侧Fisher精确检验(P值截止≤0.01)确定体细胞变体。变体由Oncotator4注释，非同义突变是被分类为Nonsense，Missense，Splice_Site或Nonstop Mutations的那些，以及改变***/缺失的Frame_Shift，In_Frame或Start_Codon。HLA分型通过来自全外显子组测序数据的ATHLATES进行。
实施例10.RNA测序。
使用Illumina HiSeq 2500平台对根据制造商的说明书使用IlluminaTruSeq RNA样品制备试剂盒制备的100-bp配对末端文库进行RNA测序。使用TopHat2v2.0,5将读取映射到hg19，并且使用Cufflinks v2.2.16程序和CuffNorm对其进行量化和归一化，以使用几何归一化方法产生按照文库大小的归一化表达表(片段/千外显子碱基/百万映射片段，FPKM)。通过使用Biopython和pysam包的自定义Python(v2.7.3)脚本识别含有突变的RNA读取，并通过Integrated Genomics Viewer(IGV)中的目视检查进行验证。
实施例11.肽HLA结合预测和新抗原候选者识别。
在围绕每个非同义氨基酸改变突变的滑动窗口中，通过netMHC3.47对9聚体肽和10聚体肽产生对HLA-A02:01的肽结合预测。(肽序列来源于Ensembl GRCh37release 74。)候选肽通过1)由RNA-seq识别的具有含有突变的读取的那些，2)具有RNA表达(FPKM>0)但不具有识别出的突变读取的那些，和3)不具有可检测的RNA-seq表达的所有其他而置入仓中(bin)。在每个仓内按照HLA结合亲和力对肽进行分级和分选。
实施例12.生产ssDNA-SAC缀合物。
按照在Kwong等，2009，J.Am.Chem.Soc.，131:9695-9703(其全部内容通过引用并入本文)中描述的以前公布的方案生产ssDNA-SAC(链霉抗生物素蛋白抗原复合物)缀合物。简言之，如Sano等，1990，PNAS，87:142-146(其全部内容通过引用并入本文)中所述，首先从含有SAC基因的pTSA-C质粒(Addgene)表达SAC。在与DNA缀合之前，使用zeba脱盐柱(Pierce)将SAC(1mg/ml)缓冲液交换为含有三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP，5mM)的PBS。然后将DMF中的MHPH(3-N-马来酰亚胺基-6-肼鎓(hydrazinium)吡啶盐酸盐，100mM，Solulink)以300:1的摩尔过量加入到SAC中。同时，将DMF中的SFB(4-甲酰基苯甲酸琥珀酰亚胺酯，100mM，Solulink)以40:1的摩尔比加入到5'-胺修饰ssDNA(500μM)(5'-NH2-AAA AAA AAA ATAG GCA TCC CGA GGA TTC AG)。在室温下反应4小时后，将MHPH标记的SAC和SFB标记的DNA缓冲液交换为柠檬酸化的(50mM柠檬酸钠，150mM NaCl，pH 6.0)，然后以20:1比率的DNA与SAC混合以在室温下过夜反应。使用Superdex 200凝胶过滤柱(GE health)纯化DNA-SAC缀合物并用10K MWCO超离心过滤器(Millipore)浓缩。
实施例13.人类MHC I类新抗原文库构建。
使用如Rodenko等，2006，Nat.Protoc.1:1120-1132(其全部内容通过引用并入本文)中描述的UV介导肽交换方法产生MHC文库。用标准自动化Fmoc-肽合成方法(J,(S)-3-(Fmoc-氨基)-3-(2-硝基苯基)丙酸，是光不稳定氨基酸残基)合成光不稳定肽KILGFVFJV和其他新抗原肽。编码人类MHC I类重链的质粒和含有人类b2m的细菌菌株是来自Ton N MSchumacher的友善礼物。根据先前公布的方案11从MHC重链包涵体、b2m包涵体和光不稳定肽折叠MHC光不稳定蛋白，然后使用BirA生物素连接酶进行生物素化。将MHC光不稳定蛋白(0.5μM)和新抗原肽(50μM)的混合物暴露于365nm UV光1小时以产生MHC新抗原文库。
实施例14.NP MHC新抗原文库构建。
将链霉抗生物素蛋白磁性NP(1μm，ThermoFisher scientific)与生物素-DNA以1:20的比率混合以获得NP-DNA。通过3次洗涤磁性NP除去过量DNA。平行地，将MHC新抗原文库以4:1的比率加入到ssDNA-SAC中以形成DNA-MHC四聚体。等量(依据DNA比率)的NP-DNA和DNA-MHC四聚体在37℃下杂交30分钟以产生NP MHC新抗原文库。
实施例15.细胞俘获微流体装置制造。
首先，使用SU-8 2025光致抗蚀剂制备具有细胞陷阱(多陷阱或单陷阱)的母模。然后将Sylgard 184(A:B＝10:1)混合物倒入模具中，脱气并在80℃下固化2小时。同时，将PDMS薄层以2000rpm/min旋涂到载玻片上并在80℃下固化1小时。将PDMS装置和PDMS涂布玻璃用O2等离子体处理1分钟并结合在一起以获得最终的细胞俘获微流体装置。
实施例16.TIL下拉和条码。
在室温下将NP MHC新抗原文库加入到CD8+人类T细胞30分钟。将NP结合的T细胞磁性地富集并用PBS洗涤以除去任何非特异性拉动的T细胞。然后将细胞加载到costartranswell聚碳酸酯膜(5μm孔)中以除去游离NP。然后，将细胞加载到细胞俘获微流体装置中，并顺序地条码化。首先，将3个不同DNA-染料(cy3，cy5和Alex 488)加载到装置上以在37℃与NP上的DNA杂交15分钟。短暂洗涤后，获取荧光图像以获得第一轮条码。在37℃下将置换DNA加入到装置中15分钟以除去第一轮DNA染料。采用类似的程序获得第二和第三轮条码化图像。
实施例17.从PBMC下拉CD8+T细胞。
通过FACS分选来自PBMC的CD8+T细胞。然后将CD8+T细胞(10K)用Calcein AM(ThermoFisher)染色，并与每个单独的NP-NACS文库在室温下孵育30分钟。新抗原特异性细胞通过磁体下拉富集。收集上清液中未捕获的T细胞以与其他NP-NACS文库元件进一步孵育。富集的T细胞通过PBS洗涤一次以除去任何非特异性细胞下拉。然后将细胞加载到细胞血球计中。将血球计芯片中的整个区域成像以获得总下拉细胞数量。使用健康供体的PBMC和来自无关男性黑素瘤患者的PBMC作为对照以获得背景。
实施例18.单细胞TCR克隆。
新抗原特异性T细胞被俘获在具有单细胞陷阱的微流体装置中(图19A-19B)。然后通过PDMS冲孔器回收细胞。施加短暂的超声处理以将细胞从被冲孔的PDMS释放到细胞裂解缓冲液(10mM Tris，pH＝8，具有1U/μl RNA酶抑制剂，Promega)。采用结合TRAV和TRBV基因区段(表5-6)的多重正向引物和结合恒定Cα(5'-GCCACAGCACTGTTGCTCTTGAAGTCC-3')和Cβ(5'-CCACCAGCTCAGCTCCACGTG-3')结构域基因的反向引物，使用OneStep RT PCR试剂盒(Qiagen)从单细胞克隆重排的Vα和Vβ结构域基因。cDNA产物在采用通用引物组(α正向引物：5'-TGGCCTGCTTTGTTTGCCGTGGTTACAGGAAGCCTCAGCA-3'，α-反向引物：5'-GCCACAGCACTGTTGCTCTTGAAGTCCATAG-3'；β正向引物：5'-CGGGCTCCTTTGCCTACCGTGCCTGCAGGAGGGCTCGGCA-3'，β反向引物：5'-CGTGCTGACCCCACTGTGCACCTCCTTCCCATTCACCCACCAGCTCAGCTCCACGTGGTC-3')的第二半巢式扩增中用作模板。对Vα和VβcDNA进行测序并使用单一TRAV/TRBV正向引物重新扩增，以纠正通过多重PCR引入的错误引导的人造物。构建逆转录病毒载体以用于通过PCR装配进行功能测试。Vα和Vβ结构域基因用人生长激素(HGH)信号肽，TCRα和TCRβ链的恒定区，和2A核糖体跳跃序列组装，然后用限制性酶消化，并连接到基于MSCV的非复制性逆转录病毒骨架中。
表5.单细胞TCRα克隆引物
Figure BDA0001488986720000331
Figure BDA0001488986720000341
Figure BDA0001488986720000351
表6.单细胞TCRβ克隆引物。
Figure BDA0001488986720000352
Figure BDA0001488986720000361
Figure BDA0001488986720000371
为了产生逆转录病毒，用TCR载体，编码gag-pol的包装载体和编码RD114包膜糖蛋白的假分型(pseudotyping)载体通过磷酸钙沉淀转染HEK-293T/17细胞。转染后24小时更换培养基，且转染后48小时收集病毒上清液。将等体积的病毒上清液加入在基于RPMI的培养基中的Jurkat T细胞中(最终密度：0.5×106细胞/mL)，并加入聚凝胺至终浓度为5μg/mL。细胞在30℃下以1350×g旋染(spinfect)90分钟，然后在37℃、5％CO2下与病毒过夜孵育。在感染后24小时更换一半培养基，并在感染后48小时通过使用同源荧光肽-MHC四聚体的流式细胞法分析细胞的TCR特异性。
实施例19.MHC I HLA亚型。
表7.MHC I HLA等位基因亚型
A*02:01 C*04:01 A*02:01 A*11:01
C*07:01 C*07:01 C*04:01 A*24:02
A*01:01 C*06:02 A*24:02 C*07:02
A*03:01 A*02:01 C*07:02 C*01:02
C*07:02 A*23:01 C*07:01 A*33:03
C*04:01 C*02:02 C*03:04 C*08:01
B*44:02 A*03:01 A*03:01 C*03:04
B*07:02 C*07:02 B*07:02 A*02:01
B*08:01 B*53:01 B*35:01 B*40:01
C*05:01 B*07:02 C*06:02 C*04:01
C*03:04 C*16:01 C*05:01 B*58:01
C*06:02 B*15:03 A*01:01 B*46:01
A*11:01 B*58:01 A*11:01 B*51:01
B*40:01 A*68:02 B*51:01 C*03:02
A*24:02 C*17:01 C*16:01 B*38:02
B*35:01 B*45:01 B*44:03 A*02:07
C*03:03 B*42:01 C*01:02 B*15:01
B*51:01 A*30:01 A*29:02 A*02:06
C*12:03 B*35:01 C*08:02 C*03:03
B*15:01 A*01:01 B*18:01 B*15:02
A*29:02 C*03:04 A*31:01 A*02:03
A*26:01 A*30:02 B*52:01 B*44:03
A*32:01 B*08:01 B*14:02 C*14:02
C*08:02 A*34:02 C*02:02 B*35:01
A*25:01 A*74:01 C*12:03 C*06:02
B*57:01 A*33:03 A*26:01 B*54:01
B*14:02 C*18:01 A*68:01 B*13:01
C*02:02 A*29:02 B*08:01 B*40:02
B*18:01 B*44:03 A*30:02 B*55:02
B*44:03 B*49:01 B*44:02 A*26:01
虽然已经参考某些示例性实施方式说明和描述本发明，但是本领域的普通技术人员将理解，在不脱离如在以下权利要求中限定的本发明的精神和范围的情况下，可以对所描述的实施方式进行各种修改和改变。
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Claims (19)

1.一种抗原复合物，其包含：
纳米颗粒分选剂，其包含：
纳米颗粒；
具有至少一个编码区的多核苷酸检测标签，所述多核苷酸检测标签与所述纳米颗粒缀合；和
与所述多核苷酸检测标签缀合的第一多核苷酸杂交结构域；和
肽负载链霉抗生物素蛋白主要组织相容性复合物（MHC）四聚体，其包含：
修饰的链霉抗生物素蛋白；
四个生物素修饰的MHC蛋白，其各自独立地与所述修饰的链霉抗生物素蛋白缀合；
与所述生物素修饰的MHC蛋白结合的抗原肽；和
与所述第一多核苷酸杂交结构域不同且与所述修饰的链霉抗生物素蛋白缀合的第二多核苷酸杂交结构域，
所述纳米颗粒分选剂通过所述第一多核苷酸杂交结构域与所述第二多核苷酸杂交结构域的杂交而与所述肽负载链霉抗生物素蛋白MHC四聚体连接，
其中所述至少一个编码区提供用于识别条码化纳米颗粒-抗原-MHC复合物的独特抗原特异性序列。
2.权利要求1所述的抗原复合物，其中所述修饰的链霉抗生物素蛋白被用选自半胱氨酸，硫醇基团，马来酰亚胺基团，金刚烷基团，环糊精基团，胺基团，羧基基团，叠氮化物基团和炔基团的结合部分修饰。
3.权利要求1所述的抗原复合物，其中所述修饰的链霉抗生物素蛋白被用半胱氨酸修饰。
4.权利要求1所述的抗原复合物，其中所述第二多核苷酸杂交结构域被用选自半胱氨酸，硫醇基团，马来酰亚胺基团，金刚烷基团，环糊精基团，胺基团，羧基基团，叠氮化物基团和炔基团的结合部分修饰。
5.权利要求1所述的抗原复合物，其中所述第二多核苷酸杂交结构域被用马来酰亚胺修饰。
6.权利要求1所述的抗原复合物，其中所述纳米颗粒是磁性纳米颗粒或聚苯乙烯纳米颗粒。
7.权利要求1所述的抗原复合物，其中所述多核苷酸检测标签的所述至少一个编码区包含至少三个不同的编码区。
8.权利要求1所述的抗原复合物，其中所述纳米颗粒被用选自链霉抗生物素蛋白，生物素，半胱氨酸，硫醇基团，马来酰亚胺基团，金刚烷基团，环糊精基团，胺基团，羧基基团，叠氮化物基团和炔基团的结合部分修饰。
9.权利要求1所述的抗原复合物，其中所述纳米颗粒被用链霉抗生物素蛋白修饰，并且所述多核苷酸检测标签被用生物素修饰。
10.权利要求1所述的抗原复合物，其中所述抗原肽选自肿瘤抗原，肿瘤新抗原，病毒抗原，磷抗原及其组合。
11.一种抗原复合物的文库，其包含：
多个权利要求1所述的抗原复合物，每个所述抗原复合物具有与所述多个抗原复合物中的任何其它所述抗原复合物不同的抗原肽和不同的多核苷酸检测标签。
12.一种用于检测新抗原特异性T细胞的试剂盒，其包括：
纳米颗粒分选剂，其包含：
纳米颗粒；
包含至少一个编码区的多核苷酸检测标签，所述多核苷酸检测标签与所述纳米颗粒缀合；和
与所述多核苷酸检测标签缀合的第一多核苷酸杂交结构域；
肽负载链霉抗生物素蛋白主要组织相容性复合物（MHC）四聚体，其包含：
修饰的链霉抗生物素蛋白；
四个生物素修饰的MHC蛋白，其各自独立地与所述修饰的链霉抗生物素蛋白缀合；
与所述生物素修饰的MHC蛋白结合的抗原肽；和
与所述第一多核苷酸杂交结构域不同且与所述修饰的链霉抗生物素蛋白缀合的第二多核苷酸杂交结构域，
所述纳米颗粒分选剂通过所述第一多核苷酸杂交结构域与所述第二多核苷酸杂交结构域的杂交而与所述肽负载链霉抗生物素蛋白MHC四聚体连接；和
能够与所述多核苷酸检测标签的所述至少一个编码区杂交的解码多核苷酸，
其中所述至少一个编码区提供用于识别条码化纳米颗粒-抗原-MHC复合物的独特抗原特异性序列。
13.权利要求12所述的试剂盒，其中所述解码多核苷酸是标记的解码多核苷酸，所述试剂盒还包括：
能够与所述解码多核苷酸杂交的置换多核苷酸。
14.权利要求13所述的试剂盒，其中所述标记的解码多核苷酸包含与可区分的荧光染料缀合的核苷酸序列。
15.一种用于分离针对受试者中的肿瘤的新抗原特异性T细胞的方法，其包括：
使用主要组织相容性复合物（MHC）结合算法识别针对所述肿瘤的候选T细胞表位；
合成对应于所述候选T细胞表位的抗原肽；
使用所述抗原肽制备权利要求11所述的抗原复合物的文库；
将所述抗原复合物的文库与来自所述受试者的TIL或PBMC孵育；和
将配对的T细胞与未配对的T细胞分离，所述配对的T细胞包含已经与所述抗原复合物的文库中的任何所述抗原复合物的任何所述抗原肽配对的那些T细胞。
16.权利要求15所述的方法，其中识别候选T细胞表位包括获取所述肿瘤的基因组或外显子组序列。
17.权利要求15所述的方法，其还包括：
将所述配对的T细胞添加至微流体装置以将所述配对的T细胞分离为单独的配对的T细胞；和
检测每个单独的配对的T细胞的所述抗原复合物的所述多核苷酸检测标签的所述至少一个编码区的序列。
18.权利要求17所述的方法，其中检测每个单独的配对的T细胞的所述抗原复合物的所述多核苷酸检测标签的所述至少一个编码区的序列包括：
孵育每个单独的配对的T细胞的所述多核苷酸检测标签与至少两个标记的解码多核苷酸；和
检测杂交的标记的解码多核苷酸的存在，以由此确定所述多核苷酸检测标签的所述至少一个编码区的序列。
19.权利要求17所述的方法，其中所述抗原复合物的所述多核苷酸检测标签的所述至少一个编码区包含至少两个编码区，并且检测每个单独的配对的T细胞的所述抗原复合物的所述多核苷酸检测标签的所述至少两个编码区的序列包括：
孵育每个单独的配对的T细胞的所述多核苷酸检测标签与至少两个第一标记的解码多核苷酸；
检测一个或多个第一杂交的标记的解码多核苷酸的存在，以由此确定所述多核苷酸检测标签的所述至少两个编码区中的第一个的序列；
孵育所述一个或多个第一杂交的标记的解码多核苷酸与一个或多个置换多核苷酸以从所述第一杂交的标记的解码多核苷酸中除去所述第一标记的解码多核苷酸以产生部分解码的多核苷酸检测标签；
孵育所述部分解码的多核苷酸检测标签与一个或多个第二标记的解码多核苷酸；和
检测第二杂交的标记的解码多核苷酸的存在，以由此确定每个单独的配对的T细胞的所述抗原复合物的所述多核苷酸检测标签的所述至少两个编码区中的第二个的序列。
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