CN103266170A - 一种基于pcr组装磁性纳米粒子进行dna检测的方法 - Google Patents

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Abstract

一种基于PCR组装磁性纳米粒子进行DNA检测的方法，属于纳米生物技术检测领域。本发明包括：磁性纳米粒子分别与上游引物和下游引物偶联，磁性纳米粒子应用PCR进行组装，磁性纳米粒子组装体应用磁共振信号进行检测。本发明提供了一种基于磁性纳米粒子组装体检测DNA的方法，使用引物偶联的磁性纳米粒子，在存在目标DNA的条件下应用PCR对磁性纳米粒子进行不同程度的组装，通过磁性纳米粒子组装体聚集程度的差异，通过磁共振信号对目标DNA进行检测。本发明方法能实现对DNA超灵敏检测，检测限低、检测灵敏度高、特异性好，同时能实现高通量检测的需求。

Description

一种基于PCR组装磁性纳米粒子进行DNA检测的方法
技术领域
一种基于PCR组装磁性纳米粒子进行DNA检测的方法，属于纳米生物技术检测领域。
背景技术
　  DNA是遗传信息的承担者，是生物遗传的主要物质基础, 每一种生物体都具有独一无二的核酸序列，因此可以通过对目标物的DNA检测以达到检测目标物的目的。DNA检测在许多领域都有广泛的应用，在临床诊断方面，可以通过检测细菌病毒病原体的DNA进行致病菌疾病的检测，目前，很多疾病的序列信息已被人们掌握，可以通过及早和准确地探测 DNA 序列来有效抗击这些疾病。在食品安全和环境保护领域，可以通过对DNA的检测来实现对有害微生物、转基因产品等物质的检测。因此，不断开发新型的简单、快速、超灵敏的DNA检测技术以满足各领域的检测需求显得尤为重要。
PCR是对DNA进行检测与定量的一种传统的有效方法，然而通过普通PCR得到的产物，需要用凝胶电泳进行分析这一过程，并且所使用的DNA染色染料如EB具有强毒性，对人体和周围环境具有重大的危害。然而基于SYBR Green的实时荧光定量PCR，由于SYBR Green染料能够和任何双链非特异的DNA结合，因此影响最终的检测定量。近年来，基于DNA功能化的纳米粒子在DNA检测方面进行了大量的研究和应用。纳米粒子具有特殊的性质，如：光学特性、电化学特性、荧光特性、顺磁性等，可以利用这些性质所特有的信号进行放大来达到检测目标物的目的。借助PCR超强的指数扩增能力，将PCR与纳米粒子结合是对纳米粒子信号进行放大的一种有效手段，可以借此大大提高目标物检测的灵敏度。
磁共振成像（NMI）可以用来对生物内脏器官和软组织进行无损的快速检测，是诊断软组织病变尤其是检测肿瘤的最为有效的临床诊断方法之一。超顺磁性纳米粒子根据聚集程度的差异，横向弛豫时间（T2）发生相应的变化，因此可以利用超顺磁性纳米粒子的磁共振信号进行体外目标物的检测。
利用引物修饰的磁性纳米粒子进行PCR，在PCR的作用下对不同目标DNA含量的磁性纳米粒子进行不同程度的组装，用磁共振信号对磁性纳米粒子聚集体进行检测，从而达到检测目标DNA含量的目的。本发明是首次应用磁性纳米粒子的PCR对DNA进行检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种应用磁共振信号对DNA进行检测的方法，借助PCR扩增对引物修饰的磁性纳米粒子进行组装，产生不同程度的磁性纳米粒子聚集体，最后通过磁共振信号对聚集体进行检测，从而间接检测目标DNA含量。
本发明的技术方案：一种基于PCR组装磁性纳米粒子进行DNA检测的方法，包括：磁性纳米粒子分别与上游引物及下游引物偶联，磁性纳米粒子应用PCR进行组装，磁性纳米粒子组装体应用磁共振信号进行检测；具体步骤为：
（1）磁性纳米粒子分别与上游引物、下游引物偶联
1.3 mg mL-1的磁性纳米粒子用含137 mM NaCl的0.01M PBS稀释20倍，0.2 mg 碳二亚胺(EDC)和0.2 mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)加入上述1mL稀释好的磁性纳米粒子中，反应活化15min；活化后的磁性纳米粒子分别加入上游引物、下游引物进行偶联，引物的终浓度均为4μM，室温振荡反应6h；反应物用截留分子量为3000的超滤管进行超滤，除去未偶联的引物，此步骤超滤三次，以保证引物被完全除去；最后截留物用超纯水进行重悬，以得到偶联好的引物修饰的磁性纳米粒子;
上游引物：5’-GAAGGACGAAGGACTCTAACG- NH2-3’，
下游引物：5’-CAATGGCAAAGGATGTTAAACG- NH2-3’；
（2）磁性纳米粒子应用PCR进行组装
整个PCR反应在50μL的反应体系中进行，其中包含：1×PCR buffer，400μM dNTP，2.5U Taq DNA聚合酶，上、下游引物分别修饰的磁性纳米粒子各2.5μL，目标DNA 1μL，所用的目标DNA的浓度为10倍梯度稀释，分别为10000 fM、1000 fM、100 fM、10 fM、1 fM、0.1 fM、0.01 fM；PCR反应参数为：首先94℃预变性2min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，总共为30个循环；目标DNA：5’-GAAGGACGAAGGACTCTAACGTTTAACATCCTTTGCCATTG-3’；
（3）磁性纳米粒子组装体应用磁共振信号进行检测
将步骤（2）目标DNA不同浓度下得到的磁纳米粒子聚集体加入到微孔板中，应用磁共振信号进行检测，首先测定样品的横向弛豫时间T2，得到横向弛豫时间与目标DNA浓度之间的关系，绘制标准曲线；所用的仪器为上海纽迈电子科技公司核磁共振成像设备Niumag-NMI20-Analyst，扫描时间参数为：场强为0.5T，中心频率为21.960MHZ，脉冲重复间隔时间TR为3000ms，回波时间TE为200μs，共8个回波；
再将上述样品测定其核磁共振成像T2加权像，所用的仪器为上海纽迈电子科技公司核磁共振成像设备MiniMR-60，成像参数为：场强为0.55T，中心频率为23.212MHZ，脉冲重复间隔时间TR为1000ms，回波时间TE为100ms，共8个回波；通过磁共振信号对磁性纳米粒子组装体进行检测，从而间接检测目标DNA含量。
所述的磁性纳米粒子是Fe3O4纳米粒子，表面含有羧基基团，所用的引物3’端包含NH2基团，磁性纳米粒子和DNA引物通过EDC法进行偶联。
所述的磁性纳米粒子组装体的形成：在存在目标DNA的条件下，通过PCR 的作用，磁性纳米粒子上修饰的引物通过碱基互不配对作用与目标DNA结合，引物在聚合酶的作用下进行扩增，形成双链DNA，从而使得引物两端的磁性纳米粒子在双链DNA的作用下靠近，循环数越高聚集程度越大，同时，相同循环数下，目标DNA浓度越高，聚集程度越大。
所述的磁共振信号检测是利用PCR形成的磁性纳米粒子组装体，有效的改变水中质子横向弛豫时间T2而产生的信号。在一定的循环数条件下，目标DNA浓度越高，磁性纳米粒子的组装程度越高，则测得的T2数值越大。
本发明的有益效果：本发明提供了一种应用磁共振信号对DNA进行检测的方法，借助PCR扩增对引物修饰的磁性纳米粒子进行组装，产生不同程度的磁性纳米粒子组装体，最后通过磁共振信号对组装体进行检测，从而间接检测目标DNA含量。
附图说明
　图1  DNA检测的标准曲线。
图2  DNA检测的磁共振成像。
具体实施方式
实施例1
一种基于PCR组装磁性纳米粒子进行DNA检测的方法，包括：磁性纳米粒子分别与上游引物、下游引物偶联，磁性纳米粒子应用PCR进行组装，磁性纳米粒子组装体应用磁共振信号进行检测；具体步骤为：
（1）磁性纳米粒子分别与上游引物和下游引物偶联
1.3 mg mL-1的磁性纳米粒子用含137 mM NaCl的0.01M PBS稀释20倍，0.2 mg 碳二亚胺(EDC)和0.2 mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)加入上述1mL稀释好的磁性纳米粒子中，反应活化15min；活化后的磁性纳米粒子分别加入上游引物、下游引物进行偶联，引物的终浓度均为4μM，室温振荡反应6h；反应物用截留分子量为3000的超滤管进行超滤，除去未偶联的引物，此步骤超滤三次，以保证引物被完全除去；最后截留物用超纯水进行重悬，以得到偶联好的引物修饰的磁性纳米粒子；
上游引物： 5’-GAAGGACGAAGGACTCTAACG- NH2-3’，
下游引物： 5’-CAATGGCAAAGGATGTTAAACG- NH2-3’；
（2）磁性纳米粒子应用PCR进行组装
整个PCR反应在50μL的反应体系中进行，其中包含：1×PCR buffer，400μM dNTP，2.5U Taq DNA聚合酶，上、下游引物分别修饰的磁性纳米粒子各2.5μL，目标DNA 1μL，所用的目标DNA的浓度为10倍梯度稀释，分别为10000 fM、1000 fM、100 fM、10 fM、1 fM、0.1 fM、0.01 fM；PCR反应参数为：首先94℃预变性2min；95℃变性30s,60℃退火30s，72℃延伸1min，总共为30个循环；目标DNA： 5’-GAAGGACGAAGGACTCTAACGTTTAACATCCTTTGCCATTG-3’；
（3）磁性纳米粒子组装体应用磁共振信号进行检测
将上述不同目标DNA 浓度下得到的磁纳米粒子聚集体加入到微孔板中，应用磁共振信号进行检测，首先测定样品的横向弛豫时间T2，得到横向弛豫时间与目标DNA浓度之间的关系，绘制标准曲线；所用的仪器为上海纽迈电子科技公司核磁共振成像设备Niumag-NMI20-Analyst，扫描时间参数为：场强为0.5T，中心频率为21.960MHZ，脉冲重复间隔时间TR为3000ms，回波时间TE为200μs，共8个回波。
再将上述样品测定其核磁共振成像T2加权像，所用的仪器为上海纽迈电子科技公司核磁共振成像设备MiniMR-60，成像参数为：场强为0.55T，中心频率为23.212MHZ，脉冲重复间隔时间TR为1000ms，回波时间TE为100ms，共8个回波。
（4）检测灵敏度研究
根据每个目标DNA浓度下对应的T2值，以DNA浓度为横坐标，T2值为纵坐标做出一条标准曲线，根据标准曲线计算出DNA的检测限为4.26aM。
（5）特异性研究
以非目标DNA为检测对象，进行特异性研究，非目标DNA的加入浓度同上述目标DNA的加入浓度相同，操作方法同目标DNA的操作方法一致，将最终的PCR产物进行横向弛豫时间T2测定和T2加权像的测定；所得的T2值与阴性空白即未加入DNA模板的值相同，同时T2加权像的成像颜色与未加入DNA模板的成像颜色相同，由此得出非目标DNA经PCR后没有发生组装，此方法的特异性良好。
（6）基质干扰研究
    在上述DNA检测体系中加入10pM的λDNA，目标DNA的浓度保持不变，目标DNA 在存在λDNA的条件下进行扩增，由于λDNA是由大量的核苷酸组成的DNA序列，用此方法可以分析在基质干扰情况下测定DNA的回收率，分析基质干扰对DNA检测的影响。最终得到的回收率范围在96.8%–106%，因此基质干扰对DNA检测的影响可以忽略。
上游引物： 5’-GAAGGACGAAGGACTCTAACG- NH2-3’；
 
下游引物： 5’-CAATGGCAAAGGATGTTAAACG- NH2-3’；
 
目标DNA：5’-GAAGGACGAAGGACTCTAACGTTTAACATCCTTTGCCATTG-3’。
 

Claims (1)

1.一种基于PCR组装磁性纳米粒子进行DNA检测的方法，其特征在于包括：磁性纳米粒子分别与上游引物及下游引物偶联，磁性纳米粒子应用PCR进行组装，磁性纳米粒子组装体应用磁共振信号进行检测；具体步骤为：
（1）磁性纳米粒子分别与上游引物、下游引物偶联
1.3 mg mL-1的磁性纳米粒子用含137 mM NaCl的0.01M PBS稀释20倍，在1mL稀释好的磁性纳米粒子中，加入0.2 mg 碳二亚胺EDC和0.2 mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺NHS，活化反应15min；活化后的磁性纳米粒子分别加入上游引物、下游引物进行偶联，引物的终浓度均为4μM，室温振荡反应6h；反应物用截留分子量为3000的超滤管进行超滤，除去未偶联的引物，此步骤超滤三次，以保证引物被完全除去；最后截留物用超纯水进行重悬，以得到偶联好的引物修饰的磁性纳米粒子；
上游引物：5’-GAAGGACGAAGGACTCTAACG- NH2-3’，
下游引物：5’-CAATGGCAAAGGATGTTAAACG- NH2-3’；
（2）磁性纳米粒子应用PCR进行组装
整个PCR反应在50μL的反应体系中进行，其中包含：1×PCR buffer，400μM dNTP，2.5U Taq DNA聚合酶，上、下游引物分别修饰的磁性纳米粒子各2.5μL，目标DNA 1μL，所用的目标DNA的浓度为10倍梯度稀释，分别为10000 fM、1000 fM、100 fM、10 fM、1 fM、0.1 fM、0.01 fM；PCR反应参数为：首先94℃预变性2min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，总共为30个循环；目标DNA：
5’-GAAGGACGAAGGACTCTAACGTTTAACATCCTTTGCCATTG-3’；
（3）磁性纳米粒子组装体应用磁共振信号进行检测
将步骤（2）目标DNA不同浓度下得到的磁纳米粒子聚集体加入到微孔板中，应用磁共振信号进行检测，首先测定样品的横向弛豫时间T2，得到横向弛豫时间与目标DNA浓度之间的关系，绘制标准曲线；所用的仪器为上海纽迈电子科技公司核磁共振成像设备Niumag-NMI20-Analyst，扫描时间参数为：场强为0.5T，中心频率为21.960MHZ，脉冲重复间隔时间TR为3000ms，回波时间TE为200μs，共8个回波；
再测定样品的核磁共振成像T2加权像，所用的仪器为上海纽迈电子科技公司核磁共振成像设备MiniMR-60，成像参数为：场强为0.55T，中心频率为23.212MHZ，脉冲重复间隔时间TR为1000ms，回波时间TE为100ms，共8个回波；
通过磁共振信号对磁性纳米粒子组装体进行检测，从而间接检测目标DNA含量。
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