CN101852808A - 应用生物条码与基因芯片检测蛋白浓度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了应用生物条码与基因芯片检测蛋白浓度的方法，步骤：(1)分别设计合成基因芯片用探针和扫描用生物条码；(2)用待测蛋白抗原的单克隆抗体修饰磁性微球；(3)用待测蛋白抗原的多克隆抗体与扫描用生物条码标记纳米金；(4)基因芯片制备；(5)将步骤(2)的产物与待测蛋白抗原混合并结合；(6)将步骤(5)的产物与步骤(3)的产物混合并结合；磁性分离，除去未与步骤(5)的产物结合的步骤(3)的产物部分；(7)将三(2-羧乙基)膦盐酸盐的水溶液加入步骤(6)的产物中，磁性分离，分离出上清液；(8)将上清液与基因芯片进行杂交并检测。实验证实其本发明方法的可行性、特异性及高通量。其灵敏度可达fM水平。

Description

应用生物条码与基因芯片检测蛋白浓度的方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种蛋白浓度的检测方法。

背景技术

目前肿瘤标志物分为血清/血浆肿瘤标志和组织细胞肿瘤标志。多为蛋白抗原与组织细胞因子。蛋白类肿瘤标志物现在多应用酶联免疫吸附(ELISA，简称酶免)或放射免疫分析(RIA，简称放免)等方法进行检测。但现有检测方法的灵敏度多局限于ng/ml(即nM-pM)水平。相比较而言放免较之酶免的检测方法灵敏度稍高，但因其具有放射性等因素使其应用受到一定的局限。对于组织细胞因子类肿瘤标志物的检测目前多应用分子生物学、免疫学以及遗传学等方法。目前的检测方法尚都难以进行高通量快速检测，同时灵敏度有限，检测费用也较高，多为进行针对性检测或筛查，尚难以广泛普及应用于临床前预防。

生物条码技术目前多应用于科学研究领域。因其具有高灵敏度而得到广泛认同与应用。生物条码技术的本质是将待测靶目标通过纳米技术制备的纳米粒子及核苷酸加以扩增。生物条码技术也不同于分子生物学中的PCR等方法。与PCR相比，具有更高的灵敏度，同时费用与时间花费也较之为少。现围绕PCR生物技术开展的研究日益广泛。也有将生物条码技术与比色、银染等方法相互结合进行针对蛋白、核苷酸等微量水平的检测，其灵敏度在nM-pM之间，但难以进行高通量的检测。

目前的研究多集中于应用生物条码技术或结合银染，或结合比色及应用酶学等方法，对待测蛋白与核酸的微量水平进行检测。但迄今尚无文献或专利应用生物条码并结合基因芯片技术对蛋白进行微量测定时其灵敏度可达10^-15M，即fM水平的报导。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种高通量、高灵敏度的应用生物条码与基因芯片检测蛋白浓度的方法

本发明的技术方案概述如下：

应用生物条码与基因芯片检测蛋白浓度的方法，其特征是由下述步骤组成：

(1)分别设计合成基因芯片用探针和扫描用生物条码：

A.基因芯片用探针的设计合成：

根据引物设计原则，设计由55-65个碱基组成的、5’端修饰有氨基或羧基的基因芯片用探针，并经相关网站检测所述基因芯片用探针的热力学指标及其Tm值较低；

B.扫描用生物条码的合成：

合成可与所述基因芯片用探针序列3’端起始的35-45个碱基完全互补配对、5’端修饰有荧光基团的、3’端修饰有巯基的序列；

(2)用待测蛋白抗原的单克隆抗体修饰磁性微球；

(3)用待测蛋白抗原的多克隆抗体与所述扫描用生物条码标记纳米金；

(4)基因芯片制备：将所述基因芯片用探针固定在芯片片基上制成；

(5)将所述步骤(2)的产物与待测蛋白抗原混合并结合；

(6)将步骤(5)的产物与所述步骤(3)的产物混合并结合；磁性分离，除去未与步骤(5)的产物结合的步骤(3)的产物部分；

(7)将三(2-羧乙基)膦盐酸盐的水溶液加入步骤(6)的产物中，磁性分离，分离出上清液；

(8)将所述步骤(7)所获得的上清液与所述步骤(4)制备的基因芯片进行杂交并检测。

所述步骤(2)中所述磁性微球为C₁-C₇间隔臂胺基修饰、粒径为2-10μm的。

所述步骤(3)中所述纳米金的粒径为10-20nm。

所述步骤(4)中基因芯片用探针的点样浓度为10-50μM。

所述步骤(7)中所述三(2-羧乙基)膦盐酸盐水溶液的浓度为10-100mM。

所述步骤(1)所述基因芯片用探针的碱基数为60个。

所述步骤(1)所述基因芯片用探针为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的序列。

所述步骤(1)所述扫描用生物条码的碱基数为40个。

所述扫描用生物条码为SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的序列。

本发明的方法已通过实验证实其可行性与灵敏度、特异性及其高通量。其灵敏度可达fM水平。本发明的方法可对蛋白或核酸类靶向标记物进行高灵敏度的测定，同时也可以应用于更加广泛的范围，包括对食品卫生、环境等所需检测的物质或指标进行高灵敏度的检测。

附图说明

图1为用待测蛋白抗原的单克隆抗体修饰磁性微球(C₃-间隔臂胺基磁球)与C₃-间隔臂胺基磁球空白对照的激光共聚焦成像图。其中1-1为C₃-间隔臂胺基磁性微球与待测蛋白抗原的单克隆抗体复合物；1-2为C₃-间隔臂胺基磁性微球作为空白对照。

图2为EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨丙胺)碳化二亚胺盐酸盐)做交联剂对待测蛋白抗原的单抗与C₃-间隔臂胺基磁性微球偶联效果的初步评价。

图3为待测蛋白抗原的单克隆抗体修饰的磁性微球稳定性考察(n＝3)。

图4为纳米金颗粒透射电镜图像。

图5为用待测蛋白抗原的多克隆抗体与扫描用生物条码标记纳米金的透射电镜图像。

图6为通过将荧光剂异硫氰酸荧光素(FITC)标记于待测蛋白抗原的多克隆抗体，推算待测蛋白抗原多克隆抗体标记于纳米金的平均数量。

图7为扫描用生物条码经三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)作用从纳米金表面解离率与扫描用生物条码浓度的关系。

图8为不同浓度扫描用生物条码与未经待测蛋白抗原的多克隆抗体修饰的纳米金的偶联率。

图9为不同浓度扫描用生物条码与经待测蛋白抗原的多克隆抗体修饰的纳米金的偶联率。

图10为不同浓度扫描用生物条码与未经待测蛋白抗原的多克隆抗体修饰的纳米金的解离率。

图11为不同浓度扫描用生物条码与经待测蛋白抗原的多克隆抗体修饰的纳米金的解离率。

图12扫描用生物条码标记于纳米金的紫外扫描曲线。

图13为扫描用生物条码与基因芯片杂交前、后图像。其中13-1为杂交前制备好的基因芯片的矩阵；13-2为基因芯片用探针1(IP1)制备的的基因芯片与其相对应的扫描用生物条码1(SP1)杂交后的图像；13-3为基因芯片用探针2(IP2)制备的的基因芯片与其相对应的扫描用生物条码2(SP2)杂交后的图像；13-4为基因芯片用探针3(IP3)制备的的基因芯片与其相对应的扫描用生物条码3(SP3)杂交后的图像。

图14为测定不同浓度待测蛋白抗原与相应芯片杂交后荧光强度值的关系。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

分别设计合成基因芯片用探针和扫描用生物条码：

A.基因芯片用探针的设计合成：

根据引物设计原则，设计由55-65个碱基组成的、5’端修饰有氨基或羧基的基因芯片用探针(制备基因芯片的探针5’端标记氨基或羧基，可通过与芯片片基活性酯涂层中的羧基或氨基有效结合，形成酰胺键，可有效并牢固的结合于片基表面，制成基因芯片)，是要保证其具有良好的特异性，同时减少因自身形成二级结构或局部结构改变而降低杂交反应的效率。并经相关网站http://dinamelt.bioinfo.rpi.edu检测所述基因芯片用探针的热力学指标及其Tm值较低；我们选用了5’端修饰有氨基的基因芯片用探针的碱基数是60个，SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示序列；(还可用5’端修饰有氨基或羧基的基因芯片用探针的碱基数是60个，或碱基数是55-65个中任意数目的序列。)

SEQ ID NO.1gtt gta tga ttg tga tgg ctt gct act tca ttg acg act gag tgg aca tga gag agt taa

SEQ ID NO.2act cta cct gat aat cta cgt aca aac tca cca tca aga aag cgc tca tca cta tct ccc

SEQ ID NO.3gtt cgt cag aga ctg ctt gtt cta tcg cta acc aga cct cat gat tgc tac gaa tcg cta

SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的序列为固定探针，分别用IP1、IP2、IP3表示；探针经HPLC纯化；

热力学指标及其Tm值：

IP 1：ΔG＝0.5kcal/mol，ΔH＝-30.0kcal/mol，ΔS＝-98.2e.u.，T_m＝32.2℃

IP 2：ΔG＝0.9kcal/mol，ΔH＝-20.3kcal/mol，ΔS＝-68.3e.u.，T_m＝24.0℃

IP 3：ΔG＝-0.1kcal/mol，ΔH＝-52.4kcal/mol，ΔS＝-168.5e.u.，T_m＝37.8℃

B.扫描用生物条码的合成：

合成可与所述基因芯片用探针序列3’端起始的35-45个碱基完全互补配对、5’端修饰有荧光基团Cy3的、3’端修饰有巯基的序列；5’端修饰有荧光基团用于杂交后荧光强度的测定，3’端标记巯基(-SH)用于与纳米金表面的共价结合。扫描用生物条码的所有碱基与固定于基因芯片的探针3’端起始的40个碱基完全互补，这是芯片杂交检测的基础。我们选用的碱基数为40个，SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的序列；(荧光基团还可以选Cy5等)，分别用SP1、SP2、SP3表示；扫描用生物条码经HPLC纯化；

热力学指标及其Tm值：

SP1：ΔG＝0.8kcal/mol，ΔH＝-23.7kcal/mol，ΔS＝-79.0e.u.，T_m＝26.8℃

SP2：ΔG＝-0.8kcal/mol，ΔH＝-34.2kcal/mol，ΔS＝-107.8e.u.，T_m＝44.0℃

SP3：ΔG＝-0.1kcal/mol，ΔH＝-24.5kcal/mol，ΔS＝-78.8e.u.，T_m＝37.7℃

SEQ ID NO.4tta act ctc tca tgt cca ctc agt cgt caa tga agt agc a

SEQ ID NO.5ggg aga tag tga tga gcg ctt tct tga tgg tga gtt tgt a

SEQ ID NO.6tag cga ttc gta gca atc atg agg tct ggt tag cga tag a

SEQ ID NO.4的5’端与SEQ ID NO.1的3’端互补配对；SEQ ID NO.5的5’端与SEQ IDNO.2的3’端互补配对；SEQ ID NO.6的5’端与SEQ ID NO.3的3’端互补配对见表1；

表1

实施例2

用待测蛋白抗原的单克隆抗体修饰磁性微球

胺基1-乙基-3-(3-二甲氨丙胺)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)路线较短，操作简便，效率稳定。故采用EDC做交联剂进行抗体定量偶联。磁性微球可采用各种材质，本发明采用的是天津倍思乐的二氧化硅磁性微球；优选C₁-C₇间隔臂胺基修饰、粒径为2-10μm的磁性微球；我们采用的是C₃间隔臂胺基磁性微球；

取100μl平均粒径为2-3μmC₃间隔臂胺基磁性微球加入pH为7.4，0.05M的磷酸缓冲液1000μl。磁性分离，去除上清。再加入0.2μg/μl待测蛋白抗原的单克隆抗体1000μl、0.2μg/μl EDC与0.1μg/μl氮羟基琥珀酰亚胺100μl，混悬3h；磁性分离，再应用pH为7.4，0.05M的磷酸缓冲液100μl洗涤；重复3次，得到用待测蛋白抗原的单克隆抗体修饰磁性微球，置于质量浓度为0.001％的叠氮钠水溶液中，pH为7.4的磷酸盐缓冲液中4℃保存备用。

实施例3

纳米金的制备、用待测蛋白抗原的多克隆抗体与扫描用生物条码标记纳米金，纳米金的粒径为10-20nm，我们使用的是12-13nm；

(1)通过柠檬酸钠还原法制备纳米金颗粒：取浓度为0.1mg/ml的氯金酸溶液30ml加热回流，然后迅速加入质量浓度为1％的柠檬酸钠水溶液600μl，继续加热回流10min，再搅拌30min，静置15min后停止加热，室温下自然冷却，4℃，15000rpm，离心30分钟以进一步纯化，即得到纳米金胶体溶液，TEM显示纳米金粒径约为13nm(见图4)

(2)采用物理吸附法应用待测蛋白抗原的多克隆抗体与扫描用生物条码标记纳米金：标记前需对纳米金进行过滤处理；在5ml纳米金胶体溶液中加入浓度为1mg/ml的待测蛋白抗原的多克隆抗体250μl，振荡5分钟，再加入250μl聚乙二醇，室温下放置2小时，加入1ml浓度为25μM的实施例1制备的扫描用生物条码，加入0.3M氯化钠和pH为8.2，浓度为10mM Tris-醋酸500μl，室温下放置12个小时；在4℃，14000rpm，离心30分钟，两次；离心后的红色沉淀物经过清洗、离心并溶解于pH为8.0的磷酸缓冲液，4℃保存备用。

实施例4

基因芯片制备：

(1)、芯片点样

①用TE溶解的基因芯片用探针(实施例1制备)加入96孔板并置于点样仪中，点样浓度为25μM，设置相应的参数，启动点样程序将基因芯片用探针点样于芯片片基上(实验证明点样浓度还可以选10-50μM中的任意浓度)；

②静置12h使其干燥；

③置于扫描仪中扫描，检查点样质量，见图13-1。

(2)、芯片的点样后处理(封闭)

①用质量浓度为0.2％的十二烷基磺酸钠水溶液清洗芯片2min；

②再用双蒸水清洗芯片2次，每次2min；

③用0.3M的氢氧化钠水溶液清洗芯片5min；

④再用双蒸水清洗芯片2次，每次2min；

⑤将芯片在沸腾双蒸水中煮沸2min；

⑥在冷乙醇(无水乙醇4℃)中浸泡3分钟。用离心法(2000rpm，5min)除去芯片上的乙醇，干燥，即制得基因芯片。

实施例5

将用待测蛋白抗原的单克隆抗体修饰磁性微球与待测蛋白抗原混合并结合；

单克隆抗体修饰的磁性微球捕获待测蛋白抗原

(1)取浓度为0pg/ml、1pg/ml、10pg/ml、100pg/ml、1000pg/ml待测蛋白抗原人IgG各200μl分别加入上述修饰的磁性微球

(2)25℃，600rpm，振荡60min

(3)磁性分离，弃上清

(4)应用pH为7.4，浓度为0.05M磷酸缓冲液500μl洗脱三次，弃上清，沉淀用pH为7.4磷酸盐缓冲液200μl悬浮4℃保存备用。

实施例6

实施例5的产物与实施例3的扫描用生物条码和待测蛋白抗原的多克隆抗体双标记的纳米金通过捕获的待测蛋白抗原结合：

(1)取200μl扫描用生物条码和待测蛋白抗原的多克隆抗体双标记的纳米金加入实施例5获得的产物；

(2)25℃，600rpm，振荡60min；

(3)磁性分离后弃上清；

(4)沉淀用pH为7.4磷酸盐缓冲液悬浮4℃保存备用。

实施例7

应用三(2-羧乙基)膦盐酸盐取代置换标记于纳米金表面上的扫描用生物条码(因三(2-羧乙基)膦盐酸盐本身具有巯基集团，故可通过取代置换作用将3’端标记巯基的单链DNA从纳米金表面解离出来)；

(1)取浓度为50mM三(乙-羧乙基)膦盐酸盐200μl加入实施例6的产物中(实验证明，三(2-羧乙基)膦盐酸盐水溶液的浓度还可以选10-100mM中任一的浓度)；

(2)室温下放置1h；

(3)磁性分离，弃沉淀，取内含游离的扫描用生物条码的上清液，-20℃保存备用。

因三(2-羧乙基)膦盐酸盐本身具有巯基集团，故可通过取代置换作用将3’端标记巯基的单链DNA(扫描用生物条码)从纳米金表面解离出来。

通过待测蛋白抗原将待测蛋白抗原的单克隆抗体修饰的磁性微球与待测蛋白抗原的多克隆抗体和扫描用生物条码共同标记的纳米金相连接，形成巨大的复合物。通过置换作用，扫描用生物条码可以从纳米金表面解离下来，解离下的扫描用生物条码的数量在与标记时所用的扫描用生物条码的浓度相关的基础上也与待测蛋白抗原的浓度相关。不同浓度的扫描用生物条码标记后，解离率在12.4％-22.3％之间。本实验过程中选择的25μM的扫描用生物条码的解离率在15.2％-21.6％之间。

实施例8

将实施例7所获得的上清液与实施例4制备的基因芯片进行杂交并检测：

步骤如下：

1.杂交

(1)将杂交器和基因芯片置于42℃预热；

(2)杂交缓冲液预热65℃，3min；

(3)按体积比为2∶1的比例，将实施例7得到的含游离的扫描用生物条码的上清液与杂交缓冲液混合；

(4)取步骤(3)的混合液10μl滴加于基因芯片的微阵列区，加盖玻片；

(5)在杂交器中加入200μl的2×SSC用于保持湿度；(SSC为柠檬酸钠缓冲液)

(6)盖紧杂交器，置于42℃温箱中杂交12-16h；

注：实验中用的杂交缓冲液是Ambion公司的3×杂交缓冲液。

2.杂交后洗脱及检测

(1)分别配制三种洗脱液：(在50ml离心管中配制)

①洗脱液成分为0.5×SSC，0.01％SDS。取双蒸水40ml加入20×SSC 1ml，10％SDS40μl，配置两组

②)洗脱液成分为0.06×SSC，0.01％SDS。取双蒸水40ml加入20×SSC 120μl，10％SDS40μl，配置一组

③洗脱液成分为0.06×SSC。取双蒸水40ml加入20×SSC 120μl，配置两组

(2)打开杂交器，迅速将基因芯片置于0.5×SSC，0.01％SDS溶液[(1)-1]中，轻轻直立基因芯片，使盖玻片滑落下来

(3)将基因芯片移入0.5×SSC，0.01％SDS溶液[(1)-2]中，60rpm摇动5min；

(4)将基因芯片移入0.06×SSC，0.01％SDS溶液[(2)]中，60rpm摇动5min；

(5)将基因芯片移入0.06×SSC溶液[(3)-1]中，60rpm摇动5min；

(6)将基因芯片移入0.06×SSC溶液[(3)-2]中，60rpm摇动1min；

(7)将基因芯片置于干燥的离心管中，2000rpm离心5min；

(8)在扫描仪上进行Cy3的荧光扫描。

3.基因芯片数据处理

将扫描结果用ScanArray Express数据分析软件输出各个点的强度数值，软件自动对数值进行标准化处理。将标准化后的数值作为各点的信号强度值，该数值与和探针杂交的DNA含量成正比，从而反映出样品中DNA的含量丰度差异。见图(13-2、13-3、13-4)

为保证探针制备的基因芯片与扫描用生物条码杂交的特异性，本发明选用相互之间有40个碱基互补配对，所以，扫描用生物条码设计为40个碱基，基因芯片用探针设计为60个碱基，上述实施例仅用于说明本发明，并不用于限制本发明，在基因芯片杂交中，为保证杂交的特异性，其相互杂交碱基数至少在30-50个之间，故基因芯片用探针也可以设计为55-65个碱基，与其杂交的扫描用生物条码的碱基数可为35-45个。

本发明对早期肿瘤标志物进行检测，其灵敏度高，并可逐步发展成多项指标谱的检测和筛查，从而对肿瘤等疾病的早期诊断更加有效、实用。

序列表

<110>中国医学科学院生物医学工程研究所

<120>应用生物条码与基因芯片检测蛋白浓度的方法

<160>6

<210>1

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<222>(1)..(60)

<400>1

gttgtatgat tgtgatggct tgctacttca ttgacgactg agtggacatg agagagttaa  60

<210>2

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<222>(1)..(60)

<400>2

actctacctg ataatctacg tacaaactca ccatcaagaa agcgctcatc actatctccc  60

<210>3

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<222>(1)..(60)

<400>3

gttcgtcaga gactgcttgt tctatcgcta accagacctc atgattgcta cgaatcgcta  60

<210>4

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<222>(1)..(40)

<400>4

ttaactctct catgtccact cagtcgtcaa tgaagtagca                        40

<210>5

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<222>(1)..(40)

<400>5

gggagatagt gatgagcgct ttcttgatgg tgagtttgta  40

<210>6

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<222>(1)..(40)

<400>6

tagcgattcg tagcaatcat gaggtctggt tagcgataga  40

Claims (9)

1.应用生物条码与基因芯片检测蛋白浓度的方法，其特征是由下述步骤组成：

(1)分别设计合成基因芯片用探针和扫描用生物条码：

A.基因芯片用探针的设计合成：

根据引物设计原则，设计由55-65个碱基组成的、5’端修饰有氨基或羧基的基因芯片用探针，并经相关网站检测所述基因芯片用探针的热力学指标及其Tm值较低；

B.扫描用生物条码的合成：

合成可与所述基因芯片用探针序列3’端起始的35-45个碱基完全互补配对、5’端修饰有荧光基团的、3’端修饰有巯基的序列；

(2)用待测蛋白抗原的单克隆抗体修饰磁性微球；

(3)用待测蛋白抗原的多克隆抗体与所述扫描用生物条码标记纳米金；

(4)基因芯片制备：将所述基因芯片用探针固定在芯片片基上制成；

(5)将所述步骤(2)的产物与待测蛋白抗原混合并结合；

(6)将步骤(5)的产物与所述步骤(3)的产物混合并结合；磁性分离，除去未与步骤(5)的产物结合的步骤(3)的产物部分；

(7)将三(2-羧乙基)膦盐酸盐的水溶液加入步骤(6)的产物中，磁性分离，分离出上清液；

(8)将所述步骤(7)所获得的上清液与所述步骤(4)制备的基因芯片进行杂交并检测。

2.根据权利要求1所述的应用生物条码与基因芯片检测蛋白浓度的方法，其特征是所述步骤(2)中所述磁性微球为C₁-C₇间隔臂胺基修饰、粒径为2-10μm的。

3.根据权利要求1所述的应用生物条码与基因芯片检测蛋白浓度的方法，其特征是所述步骤(3)中所述纳米金的粒径为10-20nm。

4.根据权利要求1所述的应用生物条码与基因芯片检测蛋白浓度的方法，其特征是所述步骤(4)中基因芯片用探针的点样浓度为10-50μM。

5.根据权利要求1所述的应用生物条码与基因芯片检测蛋白浓度的方法，其特征是所述步骤(7)中所述三(2-羧乙基)膦盐酸盐水溶液的浓度为10-100mM。

6.根据权利要求1所述的应用生物条码与基因芯片检测蛋白浓度的方法，其特征是所述步骤(1)所述基因芯片用探针的碱基数为60个。

7.根据权利要求6所述的应用生物条码与基因芯片检测蛋白浓度的方法，其特征是所述步骤(1)所述基因芯片用探针为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的序列。

8.根据权利要求1所述的应用生物条码与基因芯片检测蛋白浓度的方法，其特征是所述步骤(1)所述扫描用生物条码的碱基数为40个。

9.根据权利要求8所述的应用生物条码与基因芯片检测蛋白浓度的方法，其特征是所述扫描用生物条码为SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的序列。

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