JP2022514574A - pMHC占有率のストレプトアビジン-オリゴコンジュゲート組成物 - Google Patents
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Abstract
本開示は、異なる核酸分子でバーコード化されたpMHC多量体種、および生体試料中の抗原応答性およびTCR結合力の両方を決定し、かつ対応するT細胞トランスクリプトーム、T細胞プロテオーム、T細胞エピゲノム、またはTCR遺伝子座を配列決定するためのその使用について記載する。
Description
関連出願
本出願は、内容が参照により本明細書に組み込まれる、2018年12月18日に出願された米国仮特許出願第62/781,377号の利益およびそれに対する優先権を主張する。
本出願は、内容が参照により本明細書に組み込まれる、2018年12月18日に出願された米国仮特許出願第62/781,377号の利益およびそれに対する優先権を主張する。
同族細胞および結合タンパク質/ペプチドのハイスループット配列決定を可能にするバーコード化抗体およびバーコード化pMHC多量体が最近開発されている1~4。バーコード化MHC多量体は、TCR-pMHC結合事象のハイスループット多重化NGSベースのスクリーニングを可能にし、この情報をトランスクリプトームデータ、プロテオームデータ、およびTCR配列データと潜在的に単一細胞レベルで組み合わせる能力を有する。最近の実例は、バーコード化pMHC多量体の実現可能性および有用性を実証している1、4、5。しかしながら、1つの制限は、現在の技術が、1ストレプトアビジンあたりのpMHC単量体負荷を微調整してTCR-pMHC活性を測定することができないことである。TCR-pMHC活性を評価することができるバーコード化pMHC多量体が必要性とされている。化学的コンジュゲーションを回避し、かつMHC単量体試薬を節約するバーコード化pMHC多量体を産生するための費用効率の高い方法も必要とされている。
Bentzen,A.K.,et al.,Large-scale detection of antigen-specific T cells using peptide-MHC-I multimers labeled with DNA barcodes.Nat Biotechnol,2016.34(10):p.1037-1045.
Stoeckius,M.,et al.,Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells.Nat Methods,2017.14(9):p.865-868.
Peterson,V.M.,et al.,Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells.Nat Biotechnol,2017.35(10):p.936-939.
Zhang,S.Q.,et al.,High-throughput determination of the antigen specificities of T cell receptors in single cells.Nat Biotechnol,2018.
Dahotre,S.N.,et al.,DNA-Barcoded pMHC Tetramers for Detection of Single Antigen-Specific T Cells by Digital PCR.Anal Chem,2019.91(4):p.2695-2700.
TCR-pMHC結合力評価と並行してT細胞オミクス分析を組み合わせるためのプラットフォームとして使用され得る共有結合的にコンジュゲートされたバーコード化ストレプトアビジン-オリゴコンジュゲートおよび非共有結合的にコンジュゲートされたバーコード化ストレプトアビジン-オリゴコンジュゲート(図1)の両方を産生する組成物および方法が本明細書に提供される。
一態様では、本開示は、ストレプトアビジン分子に非共有結合した少なくとも1つのビオチン化pMHC分子と、同じ骨格分子に共有結合または非共有結合した少なくとも1つの核酸分子であって、核酸が中央バーコード領域を有し得る、少なくとも1つの核酸分子とからなる、骨格(例えば、ストレプトアビジン)占有率の異なるバーコード化pMHC多量体種を提供する。
一態様では、本開示は、ストレプトアビジン分子に非共有結合した少なくとも1つのビオチン化pMHC分子と、同じ骨格分子に共有結合または非共有結合した少なくとも1つの核酸分子であって、核酸が中央バーコード領域を有し得る、少なくとも1つの核酸分子とからなる、骨格(例えば、ストレプトアビジン)占有率の異なるバーコード化pMHC多量体種を提供する。
別の態様では、本開示は、所望のストレプトアビジン占有率を得るためにHPLC精製を使用してストレプトアビジンをビオチン化オリゴでバーコード化することを提供する。
別の態様では、本開示は、共有結合的連結(例えば、チオエーテル結合またはビス-アリールヒドラゾンコンジュゲート結合)を使用してストレプトアビジンを1ストレプトアビジンあたり少なくとも1つのオリゴでバーコード化することを提供する。
一態様では、本開示は、中央バーコード領域およびポリ-Aテールを含む少なくとも1つの核酸分子でバーコード化されたpMHC多量体を提供する。
別の態様では、本開示は、中央バーコード領域およびTCR定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの核酸分子でバーコード化されたpMHC多量体を提供する。
別の態様では、本開示は、中央バーコード領域および鋳型スイッチオリゴ配列を含む少なくとも1つの核酸分子でバーコード化されたpMHC多量体を提供する。
別の態様では、本開示は、本明細書に開示されるバーコード化pMHC多量体を作製または使用するための方法を提供する。
一態様では、本開示は、ペプチド-主要組織適合性複合体(pMHC)バーコード化多量体であって、
少なくとも1つの調節可能なpMHC実体を含み、前述のpMHC実体が、
骨格分子によって連結された少なくとも1つのpMHC分子と、
1骨格分子あたり少なくとも1つの核酸分子と、を含み、
前述の核酸分子が共有結合的または非共有結合的に連結されたコンジュゲートを含む、ペプチド-主要組織適合性複合体(pMHC)バーコード化多量体を提供する。
少なくとも1つの調節可能なpMHC実体を含み、前述のpMHC実体が、
骨格分子によって連結された少なくとも1つのpMHC分子と、
1骨格分子あたり少なくとも1つの核酸分子と、を含み、
前述の核酸分子が共有結合的または非共有結合的に連結されたコンジュゲートを含む、ペプチド-主要組織適合性複合体(pMHC)バーコード化多量体を提供する。
本pMHC多量体のいくつかの実施形態では、核酸分子は、
pMHCバーコード化ヌクレオチドの中央ストレッチと、
標的オリゴに対する相補性を有するヌクレオチドの第2のストレッチと、を含む。
pMHCバーコード化ヌクレオチドの中央ストレッチと、
標的オリゴに対する相補性を有するヌクレオチドの第2のストレッチと、を含む。
いくつかの実施形態では、pMHC多量体は、NGSに使用される。
本pMHC多量体のいくつかの実施形態では、骨格分子は、ストレプトアビジンである。
本pMHC多量体のいくつかの実施形態では、多量体は、1骨格分子あたり少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つのpMHC実体を含む。
いくつかの実施形態では、pMHC多量体は、T細胞受容体(TCR)-pMHC結合力を監視するために使用される。
本pMHC多量体のいくつかの実施形態では、ストレプトアビジンは、少なくとも1つの核酸分子に共有結合的にコンジュゲートされ、それにより、1ストレプトアビジンあたり少なくとも4つのMHC単量体を提供する。
本pMHC多量体のいくつかの実施形態では、ストレプトアビジンは、少なくとも1つの核酸分子に非共有結合的にコンジュゲートされており、この核酸分子はビオチン化されており、少なくとも1つのビオチン化核酸分子とストレプトアビジンはある比率で複合体形成されており、この比率は、1ストレプトアビジン:1オリゴ、1ストレプトアビジン:2オリゴ、および1ストレプトアビジン:3オリゴからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、pMHC多量体は、HPLC精製プロセスによって産生される。
本pMHC多量体のいくつかの実施形態では、ストレプトアビジンは、少なくとも1つの核酸分子に共有結合的にコンジュゲートされており、この核酸分子はバーコードおよび少なくとも1つのビオチン結合部位を含み、この結合部位は、
ビオチン化ペプチド、ビオチン化タンパク質、ビオチン化ポリマー、ビオチン化フルオロフォア、切断可能なビオチン化オリゴ、またはビオチン化薬剤を含む。
ビオチン化ペプチド、ビオチン化タンパク質、ビオチン化ポリマー、ビオチン化フルオロフォア、切断可能なビオチン化オリゴ、またはビオチン化薬剤を含む。
本pMHC多量体のいくつかの実施形態では、少なくとも1つの核酸分子は、5’PCRハンドル領域、中央バーコード領域、任意にUMI、または任意に少なくとも10個の連続したアデニンの3’ポリ-Aテール領域を含む。
本pMHC多量体のいくつかの実施形態では、核酸の3’末端テールのうちの少なくとも1つは、標的オリゴ配列に対して相補的な任意の配列で構成されている。
本pMHC多量体のいくつかの実施形態では、少なくとも1つの核酸分子は、約10~200ヌクレオチド長、またはそれ以上である。
別の態様では、本開示は、前述のpMHC多量体のうちのいずれかの複数のサブセットを含む組成物であって、pMHC多量体の各サブセットが異なるペプチドに結合し、対応するバーコード領域配列を有する、組成物を提供する。
別の態様では、本開示は、特異的MHC分子を対応するT細胞トランスクリプトームに連結する方法であって、
a)複数の前述のpMHC多量体分子のうちのいずれかと、T細胞と、5’PCRハンドル、中央細胞バーコード、UMI、およびベイト配列を含む結合標的オリゴに連結された粒子とを含む試験試料を形成することと、
b)各液滴が1つより多くの粒子を含まず、かつ1つ以上のpMHC多量体分子に結合した1つのT細胞を含むように、液滴を試験試料から形成することと、
c)各液滴中にT細胞cDNAライブラリおよびpMHCバーコードライブラリを生成することと、
d)T細胞mRNAライブラリおよびMCHバーコードライブラリの両方を配列決定し、それにより、特異的MHC分子を対応するT細胞トランスクリプトームに連結することと、を含む、方法を提供する。
a)複数の前述のpMHC多量体分子のうちのいずれかと、T細胞と、5’PCRハンドル、中央細胞バーコード、UMI、およびベイト配列を含む結合標的オリゴに連結された粒子とを含む試験試料を形成することと、
b)各液滴が1つより多くの粒子を含まず、かつ1つ以上のpMHC多量体分子に結合した1つのT細胞を含むように、液滴を試験試料から形成することと、
c)各液滴中にT細胞cDNAライブラリおよびpMHCバーコードライブラリを生成することと、
d)T細胞mRNAライブラリおよびMCHバーコードライブラリの両方を配列決定し、それにより、特異的MHC分子を対応するT細胞トランスクリプトームに連結することと、を含む、方法を提供する。
本方法のいくつかの実施形態では、ベイト配列は、3’ポリ-(dT)である。
別の態様では、本開示は、多量体pMHCであって、
骨格分子によって連結された1つ以上のpMHC分子と、
骨格に連結された少なくとも1つの核酸分子と、を含み、核酸分子が、増幅されるように設計された核酸の中央ストレッチ(バーコード領域)と、TCR定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含む、多量体pMHCを提供する。
骨格分子によって連結された1つ以上のpMHC分子と、
骨格に連結された少なくとも1つの核酸分子と、を含み、核酸分子が、増幅されるように設計された核酸の中央ストレッチ(バーコード領域)と、TCR定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含む、多量体pMHCを提供する。
いくつかの実施形態では、多量体pMHCは、骨格に連結された第1のタイプの核酸分子を含み、第1のタイプの核酸分子が、中央バーコード領域と、TCRαまたはTCRβ定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含む。
いくつかの実施形態では、多量体pMHCは、骨格に連結された第1および第2のタイプの核酸分子を含み、
第1のタイプの核酸分子が、中央バーコード領域と、TCRα定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含み、
第2のタイプの核酸分子が、中央バーコード領域と、TCRβ定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含み、
2つのタイプの核酸分子のバーコード領域が同じ配列を有し、
任意に、2つのタイプの核酸分子の各々のUMI配列がランダムであり、それ故に、互いに異なる可能性があるが、それらがそれぞれの核酸の同じ領域に位置する可能性がある。
第1のタイプの核酸分子が、中央バーコード領域と、TCRα定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含み、
第2のタイプの核酸分子が、中央バーコード領域と、TCRβ定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含み、
2つのタイプの核酸分子のバーコード領域が同じ配列を有し、
任意に、2つのタイプの核酸分子の各々のUMI配列がランダムであり、それ故に、互いに異なる可能性があるが、それらがそれぞれの核酸の同じ領域に位置する可能性がある。
本多量体pMHCのいくつかの実施形態では、核酸分子は、5’PCRハンドル、中央バーコード領域、UMI、およびTCR定常遺伝子に対して相補的な3’ヌクレオチド配列を含む。
本多量体pMHCのいくつかの実施形態では、核酸分子は、TCR定常遺伝子の5’末端に対して相補的なヌクレオチド配列を含む。
本多量体pMHCのいくつかの実施形態では、TCR定常遺伝子は、TCRα定常遺伝子、TCRβ定常1遺伝子、またはTCRβ定常2遺伝子である。
本多量体pMHCのいくつかの実施形態では、核酸分子の5’末端および/または3’末端は、骨格分子に連結されている。
本多量体pMHCのいくつかの実施形態では、核酸分子は、バーコード領域に隣接した一意の分子識別子(UMI)をさらに含む。
本多量体pMHCのいくつかの実施形態では、少なくとも1つの核酸分子は、約10~200ヌクレオチド長、またはそれ以上である。
別の態様では、本開示は、前述のpMHC多量体のうちのいずれかの複数のサブセットを含む組成物であって、多量体MHCの各サブセットが異なるペプチドに結合し、対応するバーコード領域配列を有する、組成物を提供する。
別の態様では、本開示は、特異的MHC分子を対応するTCRαおよび/またはTCRβ配列に連結する方法であって、
a)前述の多量体pMHCのうちのいずれかのうちの1つ以上を提供することと、
b)前述の多量体pMHC分子をT細胞と接触させることと、
c)多量体MHC分子に結合したT細胞を多量体MHC分子に結合していないT細胞から分離することと、
d)分離されたT細胞を溶解することと、
e)DNAライブラリを生成することであって、各DNA分子が、TCRαおよび/またはTCRβ遺伝子配列、ならびにpMHCバーコードを含む、生成することと、
f)DNAライブラリを配列決定し、それにより、特異的pMHC分子を対応するTCRαおよび/またはTCRβ配列に連結することと、を含む、方法を提供する。
a)前述の多量体pMHCのうちのいずれかのうちの1つ以上を提供することと、
b)前述の多量体pMHC分子をT細胞と接触させることと、
c)多量体MHC分子に結合したT細胞を多量体MHC分子に結合していないT細胞から分離することと、
d)分離されたT細胞を溶解することと、
e)DNAライブラリを生成することであって、各DNA分子が、TCRαおよび/またはTCRβ遺伝子配列、ならびにpMHCバーコードを含む、生成することと、
f)DNAライブラリを配列決定し、それにより、特異的pMHC分子を対応するTCRαおよび/またはTCRβ配列に連結することと、を含む、方法を提供する。
前述の方法のいくつかの実施形態では、ステップc)は、FACS選別または磁気ビーズベースの分離によって達成される。
前述の方法のいくつかの実施形態では、多量体pMHC分子は、直接または間接的に蛍光標識される。
前述の方法のいくつかの実施形態では、バーコード化pMHC分子に結合したT細胞は、単一の収集管内でバルク選別される。
前述の方法のいくつかの実施形態では、バーコード化pMHC分子に結合した同族T細胞は、単一細胞として個々のプレートウェルに選別される。
別の態様では、本開示は、多量体pMHCであって、
骨格分子によって連結された1つ以上のpMHC分子と、
前述の骨格に連結された少なくとも1つの核酸分子と、を含み、前述の核酸分子が、増幅されるように設計された核酸の中央ストレッチ(バーコード領域)と、鋳型スイッチオリゴ配列と、を含む、多量体pMHCを提供する。
骨格分子によって連結された1つ以上のpMHC分子と、
前述の骨格に連結された少なくとも1つの核酸分子と、を含み、前述の核酸分子が、増幅されるように設計された核酸の中央ストレッチ(バーコード領域)と、鋳型スイッチオリゴ配列と、を含む、多量体pMHCを提供する。
本多量体pMHCのいくつかの実施形態では、核酸分子は、5’PCRハンドル、中央バーコード領域、UMI、および3’鋳型スイッチオリゴ配列を含む。
本多量体pMHCのいくつかの実施形態では、鋳型スイッチオリゴ配列は、3つのリボグアノシンの3’ストレッチを含む。
本多量体pMHCのいくつかの実施形態では、少なくとも1つの核酸分子は、約10~200ヌクレオチド長、またはそれ以上である。
別の態様では、本開示は、前述の多量体pMHCのうちのいずれかの複数のサブセットを含む組成物であって、多量体pMHCの各サブセットが異なるペプチドに結合し、対応するバーコード領域配列を有する、組成物を提供する。
別の態様では、本開示は、特異的pMHC分子を対応するTCRαおよび/またはTCRβ相補的配列に連結する方法であって、
a)複数の前述の多量体pMHC分子のうちのいずれかと、T細胞と、5’PCRハンドル、中央細胞バーコード、UMI、およびTCR定常遺伝子に対して相補的な3’ヌクレオチド配列を含むオリゴにコンジュゲートされたビーズとを含む試験試料を形成することと、
b)各液滴が1つより多くのビーズを含まず、かつ1つ以上の多量体MHC分子に結合した1つのT細胞を含むように、液滴を試験試料から形成することと、
c)DNAライブラリを生成することであって、各DNA分子が、TCRαおよび/またはTCRβ遺伝子配列、ならびにpMHCバーコードを含む、生成することと、
d)DNAライブラリを配列決定し、それにより、特異的pMHC分子を対応するTCRαおよび/またはTCRβ配列に連結することと、を含む、方法を提供する。
a)複数の前述の多量体pMHC分子のうちのいずれかと、T細胞と、5’PCRハンドル、中央細胞バーコード、UMI、およびTCR定常遺伝子に対して相補的な3’ヌクレオチド配列を含むオリゴにコンジュゲートされたビーズとを含む試験試料を形成することと、
b)各液滴が1つより多くのビーズを含まず、かつ1つ以上の多量体MHC分子に結合した1つのT細胞を含むように、液滴を試験試料から形成することと、
c)DNAライブラリを生成することであって、各DNA分子が、TCRαおよび/またはTCRβ遺伝子配列、ならびにpMHCバーコードを含む、生成することと、
d)DNAライブラリを配列決定し、それにより、特異的pMHC分子を対応するTCRαおよび/またはTCRβ配列に連結することと、を含む、方法を提供する。
本方法のいくつかの実施形態では、ビーズは、ヒドロゲルビーズ、硬質ビーズ、および溶解性ビーズから選択される。
本方法のいくつかの実施形態では、ビーズは、2つのオリゴにコンジュゲートされており、第1のオリゴが、5’PCRハンドル、中央細胞バーコード、UMI、およびTCRα定常遺伝子に対して相補的な3’ヌクレオチド配列を含み、第2のオリゴが、5’PCRハンドル、中央細胞バーコード、UMI、およびTCRβ定常遺伝子に対して相補的な3’ヌクレオチド配列を含み、2つのオリゴの中央細胞バーコードが同じ配列を有する。
本方法のいくつかの実施形態では、DNAライブラリ生成ステップc)は、MMLV逆転写酵素を使用したTCR mRNAの逆転写を含む。
前述の多量体pMHCおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、PCRハンドルは、バーコード配列のライブラリ調製を可能にする。
前述の多量体pMHCおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、PCRハンドルは、i7アダプター配列を有し得る。
前述の多量体pMHCおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、バーコード領域は、少なくとも4つのヌクレオチドを含む。
前述の多量体pMHCおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、pMHC分子は、ストレプトアビジン-ビオチン結合を介して、MHC重鎖を介して、またはMHC軽鎖(β2M)を介して骨格に連結されている。
前述の多量体pMHCおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、MHC分子は、ストレプトアビジン-ビオチン結合を介して骨格に連結されている。
前述の多量体pMHCおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、多量体pMHCは、少なくとも1つのMHC分子を含む。
前述の多量体pMHCおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、少なくとも1つの核酸分子は、化学修飾をさらに含む。
前述の多量体pMHCおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、少なくとも1つの核酸分子の5’末端または3’末端は、スペーサーを介してアミノ基に結合している。
前述の多量体pMHCおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、スペーサーは、6炭素スペーサーまたは12炭素スペーサーであり得る。
前述の多量体pMHCおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、少なくとも1つの核酸分子は、5’末端および/または3’末端にホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む。
前述の多量体pMHCおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、少なくとも1つの核酸分子と骨格分子との間の連結は、核酸分子の誘導性解離を可能にする。
前述の多量体pMHCおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、少なくとも1つの核酸分子は、共有結合または非共有結合を介して骨格分子に連結されている。
前述の多量体pMHCおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、共有結合は、チオエーテルである。
前述の多量体pMHCおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、
少なくとも1つの核酸分子は、誘導的に切断可能な結合を介して骨格分子に連結されている。
少なくとも1つの核酸分子は、誘導的に切断可能な結合を介して骨格分子に連結されている。
前述の多量体pMHCおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、誘導的に切断可能な結合は、光切断可能であるか、またはジスルフィド結合を含む。
前述の多量体pMHCおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、MHC分子は、MHCクラスIおよび/またはMHCクラスII単量体である。
前述の多量体pMHCおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、MHC分子は、ペプチドと複合体形成されている。
前述の多量体pMHCおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、MHC分子は、ビオチン化されている。
前述の多量体pMHCおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、骨格は、蛍光標識、Hisタグ、および金属イオンタグからなる群から選択される1つ以上の標識をさらに含む。
前述の多量体pMHCおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、骨格は、蛍光標識に直接コンジュゲートされている。
前述の多量体pMHCおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、蛍光標識は、フルオロフォアタグ付けオリゴである。
前述の多量体pMHCおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、フルオロフォアタグ付けオリゴは、骨格に連結された核酸分子に対して相補的である。
前述の多量体pMHCおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、骨格は、フルオロフォア標識抗ストレプトアビジン抗体で標識される。
前述の多量体pMHCおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、フルオロフォアは、蛍光タンパク質、蛍光色素、または量子ドットである。
前述の多量体pMHCおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、少なくとも1つの核酸分子は、DNA、RNA、人工ヌクレオチド、PNA、およびLNAからなる群から選択される核酸分子を含む。
前述の多量体pMHCおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、多量体pMHCは、同族T細胞に結合する。
前述の多量体pMHCおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、多量体pMHCは、フローサイトメトリー用途と適合性がある。
前述の多量体pMHCおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、フローサイトメトリー用途は、単一細胞またはバルク細胞蛍光活性化細胞選別(FACS)である。
前述の多量体pMHCおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、多量体pMHCは、NGSベースの用途と適合性がある。
前述の多量体pMHCおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、NGSベースの用途は、液滴ベースの単一細胞配列決定である。
別の態様では、本開示は、試料中の抗原応答性細胞を検出するための方法であって、
a)前述の多量体pMHCのうちのいずれかのうちの1つ以上を提供することと、
b)前述の多量体pMHC分子を前述の試料と接触させることと、
c)多量体pMHC分子の前述の抗原応答性細胞への結合を検出し、それにより、MHC分子中に存在する抗原に応答して細胞を検出することと、を含み、前述の結合が、骨格分子を介して1つ以上のMHC分子に連結された前記核酸分子のバーコード領域を増幅することによって検出される、方法を提供する。
a)前述の多量体pMHCのうちのいずれかのうちの1つ以上を提供することと、
b)前述の多量体pMHC分子を前述の試料と接触させることと、
c)多量体pMHC分子の前述の抗原応答性細胞への結合を検出し、それにより、MHC分子中に存在する抗原に応答して細胞を検出することと、を含み、前述の結合が、骨格分子を介して1つ以上のMHC分子に連結された前記核酸分子のバーコード領域を増幅することによって検出される、方法を提供する。
本方法のいくつかの実施形態では、試料は、血液試料、末梢血試料、血液由来試料、組織試料、体液、髄液、および唾液からなる群から選択される。
本方法のいくつかの実施形態では、試料は、哺乳動物から得られる。
本方法のいくつかの実施形態では、本方法は、フローサイトメトリー、FACS、磁気ビーズベースの選択、サイズ排除、勾配遠心分離、カラム付着、およびゲル濾過からなる群から選択される方法による細胞選択をさらに含む。
本方法のいくつかの実施形態では、増幅は、PCRである。
本方法のいくつかの実施形態では、核酸分子のバーコード領域の検出は、バーコード領域の配列決定またはqPCRによるバーコード領域の検出を含む。
本方法のいくつかの実施形態では、核酸分子のバーコード領域の検出は、バーコード領域の配列決定またはqPCRによるバーコード領域の検出を含む。
単一ビーズおよび単一細胞を有する単一液滴(この場合、バーコード化四量体陽性T細胞を表示する)は、ゲルビーズオリゴ、T細胞mRNA、ならびに四量体陽性T細胞結合バーコード化オリゴの両方を放出する溶解試薬を含有する。pMHC四量体結合オリゴを切断可能な結合によって解離するように作製することもできる。逆転写により、ビーズオリゴの3’末端に三重デオキシシチジンストレッチとともにTCR mRNA転写物由来のTCR V(D)J配列が付加される(単純化のために、単一の逆転写遺伝子のみを液滴の下に描写している)。このデオキシシチジンストレッチは、鋳型スイッチのためにスイッチオリゴに結合する。その後の第2鎖合成およびPCR増幅により、ライブラリ調製が完了する。
本開示は、単一細胞またはバルク細胞蛍光活性化細胞選別(FACS)を含むが、これに限定されない、フローサイトメトリー用途、およびNGSベースの用途、ならびに多重分析物分析および単一細胞分析を含む他のプラットフォームと適合性のあるバーコード化pMHC多量体の生成について記載する。本開示は、共有結合的オリゴ結合および非共有結合的オリゴ結合の両方によるバーコード化pMHC多量体の生成、ならびにpMHC-TCR結合力評価におけるこれらの多量体の組み合わせについても記載する。本開示は、TCR配列およびpMHC多量体バーコードの同時処理による配列決定ライブラリ調製を単純化するTCRα/β定常遺伝子を標的とする新たなpMHC多量体バーコード化アプローチについても記載する。様々な塩基修飾の使用を含むバーコード化オリゴ長および/または配列は不変ではなく、変化し得る。
本開示は、pMHC多量体、いくつかの実施形態では、pMHC四量体のための少なくとも2つのオリゴバーコード化戦略について記載する。第1は、特異的pMHCを、TCR配列を含む対応するT細胞トランスクリプトームに連結するバーコード化ポリ-Aテールオリゴを使用する。第2のバーコード化アプローチは、TCRαおよび/またはTCRβ遺伝子座を標的とするストレプトアビジンにコンジュゲートされたオリゴを使用し、それにより、両方のオリゴが四量体バーコードを有する。重要なことに、TCRαオリゴおよびTCRβオリゴの両方が同時に使用される場合、それらは所与の四量体について同じ四量体バーコード化情報を含むであろう。このアプローチにより、全ての逆転写TCR配列が四量体バーコード配列を含むようになり、別個のライブラリ調製の必要性を打ち消す。
MHCタンパク質
本開示の組成物および方法で提供され、かつ使用されるMHCタンパク質は、MHCタンパク質が元来含んでいるペプチドを別のペプチドと交換することが望ましい、当該技術分野で既知の任意の好適なMHC分子であり得る。一般に、それらは、(α-β-P)nを有し、式中、nは、少なくとも2、例えば、2~10、例えば、4である。αは、クラスIまたはクラスII MHCタンパク質のα鎖である。βは、クラスII MHCタンパク質のβ鎖としてまたはMHCクラスIタンパク質のβ2マイクログロブリンとして本明細書で定義されるβ鎖である。Pは、ペプチド抗原である。
本開示の組成物および方法で提供され、かつ使用されるMHCタンパク質は、MHCタンパク質が元来含んでいるペプチドを別のペプチドと交換することが望ましい、当該技術分野で既知の任意の好適なMHC分子であり得る。一般に、それらは、(α-β-P)nを有し、式中、nは、少なくとも2、例えば、2~10、例えば、4である。αは、クラスIまたはクラスII MHCタンパク質のα鎖である。βは、クラスII MHCタンパク質のβ鎖としてまたはMHCクラスIタンパク質のβ2マイクログロブリンとして本明細書で定義されるβ鎖である。Pは、ペプチド抗原である。
MHCタンパク質は、任意の哺乳動物または鳥類種、例えば、霊長類種、特に、ヒト、げっ歯類(マウス、ラット、およびハムスターを含む)、ウサギ、ウマ、ウシ、イヌ、ネコなどに由来し得る。例えば、MHCタンパク質は、ヒトHLAタンパク質またはマウスH-2タンパク質に由来し得る。HLAタンパク質には、クラスIIサブユニットHLA-DPα、HLA-DPβ、HLA-DQα、HLA-DQβ、HLA-DRα、およびHLA-DRβ、ならびにクラスIタンパク質HLA-A、HLA-B、HLA-C、およびβ2-マイクログロブリンが含まれる。H-2タンパク質には、クラスIサブユニットH-2K、H-2D、H-2L、ならびにクラスIIサブユニットI-Aα、I-Aβ、I-Eα、およびI-Eβ、ならびにβ2-マイクログロブリンが含まれる。いくつかの代表的なMHCタンパク質の配列は、Kabat et al.Sequences of Proteins of Immunological Interest,NIH Publication No.91-3242,pp724-815で見つけることができる。本発明での使用に好適なMHCタンパク質サブユニットは、例えば、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの欠失によって当該技術分野で知られているように調製される、通常は膜結合型のタンパク質の可溶性形態である。
クラスIタンパク質の場合、可溶性形態には、α1ドメイン、α2ドメイン、およびα3ドメインが含まれる。可溶性クラスIIサブユニットには、αサブユニットの場合にα1ドメインおよびα2ドメイン、ならびにβサブユニットの場合にβ1ドメインおよびβ2ドメインが含まれる。
αサブユニットとβサブユニットが別個に産生され、インビトロで会合させて、安定したヘテロ二本鎖複合体を形成することができ、またはこれらの両方のサブユニットを単一細胞で発現させてもよい。MHCサブユニットを産生するための方法は、当該技術分野で既知である。
MHC-ペプチド複合体を調製するために、サブユニットを抗原ペプチドと組み合わせ、インビトロで折り畳んで、鎖内ジスルフィド結合ドメインを有する安定したヘテロ二量体複合体を形成することができる。ペプチドは、最初の折り畳み反応に含まれてもよく、または後のステップで空のヘテロ二量体に添加されてもよい。本発明の方法では、これは、退出ペプチドとなる。サブユニットとペプチドとの折り畳みおよび会合を可能にする条件は、当該技術分野で既知である。一例として、ほぼ等モル量の可溶性化αサブユニットとβサブユニットが尿素溶液中で混合され得る。再折り畳みが、尿素を含まない緩衝溶液中に希釈または透析することによって開始される。ペプチドが約pH5~5.5で約1~3日間にわたって空のクラスIIヘテロ二量体に装填され、その後、中和、濃縮、および緩衝液交換が行われ得る。しかしながら、特定の折り畳み条件は、本発明の実施に重要ではない。
単量体複合体(α-β-P)(本明細書では単量体)は、多量体化され得る。結果として生じる多量体は、長期間にわたって安定しているであろう。好ましくは、多量体は、当該技術分野で知られているように(例えば、米国特許第5,635,363号に記載されているように)、αまたはβサブユニット上の特定の結合部位を介して単量体を多価実体に結合することによって形成され得る。MHCタンパク質は、それらの単量体形態または多量体形態のいずれかで、ビーズまたは任意の他の支持体にコンジュゲートされる場合もある。
多くの場合、多量体複合体は、免疫染色または当該技術分野で既知の他の方法で使用される場合、直接検出可能になるように標識されるか、または当該技術分野で既知であり、かつ本明細書に記載されるように、複合体に特異的に結合する二次標識免疫薬剤と併用される。例えば、標識は、フルオロフォア、例えば、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、Texas Red、フィコエリトリン(PE)、アロフィコシアニン(APC)、Brilliant Violet(商標)421、Brilliant UV(商標)395、Brilliant Violet(商標)480、Brilliant Violet(商標)421(BV421)、Brilliant Blue(商標)515、APC-R700、またはAPC-Fire750であり得る。いくつかの実施形態では、多量体複合体は、別の部分に特異的に結合することができる部分によって標識される。例えば、標識は、ビオチン、ストレプトアビジン、オリゴヌクレオチド、またはリガンドであり得る。目的とする他の標識には、染料、酵素、化学発光剤、粒子、放射性同位体、または他の直接もしくは間接的に検出可能な薬剤が含まれ得る。
本明細書に開示される組成物は、任意の好適なMHCタンパク質を含み得る。例示的なMHCタンパク質および本明細書に開示されるペプチドには、H-2 Kb単量体、HLA-A*02:01単量体、HLA-A*24:02単量体、HLA-A*02:01四量体、HLA-A*24:02四量体、およびH-2 Kb四量体が含まれる。しかしながら、例えば、MHC対立遺伝子に対するペプチドの親和性を予測するための既知の技法に従って適切な退出ペプチドを選択する際に、任意のMHC対立遺伝子が本明細書の組成物および方法に使用され得る。
定義:
冠詞「a」および「an」は、1つまたは1つより多く(すなわち、少なくとも1つ)の冠詞の文法上の目的語を指すために本明細書で使用される。一例として、「要素(an element)」は、1つの要素または1つより多くの要素を意味する。
冠詞「a」および「an」は、1つまたは1つより多く(すなわち、少なくとも1つ)の冠詞の文法上の目的語を指すために本明細書で使用される。一例として、「要素(an element)」は、1つの要素または1つより多くの要素を意味する。
「アミノ酸」という用語は、天然であるか合成であるかにかかわらず、アミノ官能基および酸官能基の両方を含み、かつ天然に存在するアミノ酸のポリマーに含まれることができる全ての分子を包含するよう意図されている。例示的なアミノ酸には、天然に存在するアミノ酸、その類似体、誘導体、および同族体、バリアント側鎖を有するアミノ酸類似体、ならびに前述のうちのいずれかのうちのいずれかの全ての立体異性体が含まれる。
「に由来する」という語句は、非再配置可変領域および/または非再配列可変領域遺伝子セグメント「に由来する」再配置可変領域遺伝子に関して使用される場合、再配置可変領域遺伝子の配列を、可変ドメインを発現する遺伝子を形成するように再配置された一組の非再配置可変領域遺伝子セグメントまで遡る能力を指す(該当する場合、スプライスの相違および体細胞変異を説明する)。例えば、体細胞変異を受けた再配置可変領域遺伝子は、依然として非再配置可変領域遺伝子セグメントに由来する。いくつかの実施形態では、内因性遺伝子座が普遍的軽鎖または重鎖遺伝子座で置き換えられる場合、「に由来する」という用語は、配列が体細胞変異を受けた可能性があるにもかかわらず、配列の起源を前述の再配置遺伝子座まで遡る能力を示す。
「PCRハンドル」とは、本明細書に記載のバーコード領域のPCR増幅を可能にする、全てのプライマーと同一の定常配列を指す。
「バーコード化領域」という用語は、一意のヌクレオチド配列を含む領域を指す。このヌクレオチド配列の最小長は、一意に標識されなければならない総MHC多量体総数に依存する。例えば、4ヌクレオチド長のヌクレオチド配列は、最大256個のMHC多量体を一意に標識することができる256個の異なる配列を有し得る。6ヌクレオチド長のヌクレオチド配列は、最大4096個のMHC多量体を一意に標識することができる4096個の異なる配列を有し得る。より長い四量体配列を使用して、スループットを増加させることができる。
「相補的」という用語は、2つの核酸鎖の領域間または同じ核酸鎖の2つの領域間の配列相補性の広範な概念を指す。第1の核酸領域のアデニン残基が、第1の領域に対して逆平行の第2の核酸領域の残基(残基がチミンまたはウラシルである場合)と特異的水素結合(「塩基対合」)を形成することができることが知られている。同様に、第1の核酸鎖のシトシン残基が、第1の鎖に対して逆平行の第2の核酸鎖の残基(残基がグアニンである場合)と塩基対合することができることが知られている。2つの領域が逆平行様式で配置されたときに、第1の領域の少なくとも1つのヌクレオチド残基が第2の領域の残基と塩基対合することができる場合、核酸の第1の領域は、同じまたは異なる核酸の第2の領域に対して相補的である。好ましくは、第1の領域は第1の部分を含み、第2の領域は第2の部分を含み、それにより、第1の部分と第2の部分が逆平行様式で配置されたときに、第1の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約75%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%が、第2の部分のヌクレオチド残基と塩基対合することができる。より好ましくは、第1の部分の全てのヌクレオチド残基が、第2の部分のヌクレオチド残基と塩基対合することができる。
実施形態1.多量体主要組織適合性複合体(MHC)であって、
骨格分子によって連結された1つ以上のMHC分子と、
前記骨格分子に連結された少なくとも1つの核酸分子と、を含み、前記核酸分子が、核酸の中央ストレッチ(バーコード領域)と、標的オリゴに対する相補性を示す配列を有する核酸の第2のストレッチと、を含む、多量体主要組織適合性複合体(MHC)。
骨格分子によって連結された1つ以上のMHC分子と、
前記骨格分子に連結された少なくとも1つの核酸分子と、を含み、前記核酸分子が、核酸の中央ストレッチ(バーコード領域)と、標的オリゴに対する相補性を示す配列を有する核酸の第2のストレッチと、を含む、多量体主要組織適合性複合体(MHC)。
実施形態2.前記少なくとも1つの核酸分子が、5’PCRハンドル領域、中央バーコード領域、および3’ポリ-Aテール領域を含み、任意に、前記少なくとも1つの核酸分子が、5’PCRハンドル領域、中央バーコード領域、一意の分子識別子(UMI)、および3’ポリ-Aテール領域を含む、実施形態1に記載の多量体MHC。
実施形態3.前記ポリ-Aテールが少なくとも10個の連続するアデニンを含む、実施形態1または2に記載の多量体MHC。
実施形態4.前記標的オリゴの一致ヌクレオチドがC、G、またはAである場合、前記ポリ-Aテールの5’末端の前記ヌクレオチドが、G、C、またはTである、実施形態1~3のいずれか1つに記載の多量体MHC。
実施形態5.前記少なくとも1つの核酸分子が少なくとも10ヌクレオチド長であり、任意に、前記少なくとも1つの核酸分子が10~200ヌクレオチド長である、実施形態1~4のいずれか1つに記載の多量体MHC。
実施形態6.実施形態1~5のいずれか1つに記載の多量体MHCの複数のサブセットを含む組成物であって、多量体MHCの各サブセットが異なるペプチドに結合し、対応するバーコード領域配列を有する、組成物。
実施形態7.特異的MHC分子を対応するT細胞トランスクリプトームに連結する方法であって、
a)実施形態1~5のいずれか1つに記載の複数のMHC多量体分子と、T細胞と、5’PCRハンドル、中央細胞バーコード、UMI、および3’ポリ-(dT)を含む相補的標的オリゴに連結された粒子とを含む試験試料を形成することと、
b)各液滴が1つより多くの粒子を含まず、かつ1つ以上の多量体MHC分子に結合した1つのT細胞を含むように、液滴を前記試験試料から形成することと、
c)各液滴中にT細胞cDNAライブラリおよびMHCバーコードライブラリを生成することと、
d)前記T細胞mRNAライブラリおよび前記MCHバーコードライブラリの両方を配列決定し、それにより、特異的MHC分子を前記対応するT細胞トランスクリプトームに連結することと、を含む、方法。
a)実施形態1~5のいずれか1つに記載の複数のMHC多量体分子と、T細胞と、5’PCRハンドル、中央細胞バーコード、UMI、および3’ポリ-(dT)を含む相補的標的オリゴに連結された粒子とを含む試験試料を形成することと、
b)各液滴が1つより多くの粒子を含まず、かつ1つ以上の多量体MHC分子に結合した1つのT細胞を含むように、液滴を前記試験試料から形成することと、
c)各液滴中にT細胞cDNAライブラリおよびMHCバーコードライブラリを生成することと、
d)前記T細胞mRNAライブラリおよび前記MCHバーコードライブラリの両方を配列決定し、それにより、特異的MHC分子を前記対応するT細胞トランスクリプトームに連結することと、を含む、方法。
実施形態8.多量体MHCであって、
骨格分子によって連結された1つ以上のMHC分子と、
前記骨格に連結された少なくとも1つの核酸分子と、を含み、前記核酸分子が、核酸の中央ストレッチ(バーコード領域)と、TCR定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含む、多量体MHC。
骨格分子によって連結された1つ以上のMHC分子と、
前記骨格に連結された少なくとも1つの核酸分子と、を含み、前記核酸分子が、核酸の中央ストレッチ(バーコード領域)と、TCR定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含む、多量体MHC。
実施形態9.前記骨格に連結された第1のタイプの核酸分子を含み、前記第1のタイプの核酸分子が、中央バーコード領域と、TCRαまたはTCRβ定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含む、実施形態8に記載の多量体MHC。
実施形態10.前記骨格に連結された第1および第2のタイプの核酸分子を含み、
前記第1のタイプの核酸分子が、中央バーコード領域と、TCRα定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含み、
前記第2のタイプの核酸分子が、中央バーコード領域と、TCRβ定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含み、
前記2つのタイプの前記核酸分子の前記バーコード領域が同じ配列を有し、
任意に、各タイプの前記核酸分子がUMIをさらに含み、前記第1のタイプの核酸分子のUMI配列が前記第2のタイプの核酸分子のUMI配列とは異なる、実施形態8に記載の多量体MHC。
前記第1のタイプの核酸分子が、中央バーコード領域と、TCRα定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含み、
前記第2のタイプの核酸分子が、中央バーコード領域と、TCRβ定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含み、
前記2つのタイプの前記核酸分子の前記バーコード領域が同じ配列を有し、
任意に、各タイプの前記核酸分子がUMIをさらに含み、前記第1のタイプの核酸分子のUMI配列が前記第2のタイプの核酸分子のUMI配列とは異なる、実施形態8に記載の多量体MHC。
実施形態11.前記核酸分子が、5’PCRハンドル、中央バーコード領域、およびTCR定常遺伝子に対して相補的な3’ヌクレオチド配列を含む、実施形態8~10のいずれか1つに記載の多量体MHC。
実施形態12.前記核酸分子が、前記TCR定常遺伝子の5’末端に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、実施形態8~11のいずれか1つに記載の多量体MHC。
実施形態13.前記TCR定常遺伝子が、TCRα定常遺伝子、TCRβ定常1遺伝子、またはTCRβ定常2遺伝子である、実施形態8~12のいずれか1つに記載の多量体MHC。
実施形態14.前記核酸分子の5’末端および/または3’末端が前記骨格分子に連結されている、実施形態8~13のいずれか1つに記載の多量体MHC。
実施形態15.前記核酸分子が、前記バーコード領域に隣接した一意の分子識別子(UMI)をさらに含む、実施形態8~14のいずれか1つに記載の多量体MHC。
実施形態16.前記少なくとも1つの核酸分子が少なくとも10ヌクレオチド長であり、任意に、前記少なくとも1つの核酸分子が10~200ヌクレオチド長である、実施形態8~15のいずれか1つに記載の多量体MHC。
実施形態17.実施形態8~16のいずれか1つに記載の多量体MHCの複数のサブセットを含む組成物であって、多量体MHCの各サブセットが異なるペプチドに結合し、対応するバーコード領域配列を有する、組成物。
実施形態18.特異的MHC分子を対応するTCRαおよび/またはTCRβ配列に連結する方法であって、
a)実施形態8~16のいずれか1つに記載の1つ以上の多量体主要組織適合性複合体を提供することと、
b)前記多量体MHC分子をT細胞と接触させることと、
c)前記多量体MHC分子に結合したT細胞を前記多量体MHC分子に結合しないT細胞から分離することと、
d)前記分離されたT細胞を溶解することと、
e)DNAライブラリを生成することであって、各DNA分子が、TCRαおよび/またはTCRβ遺伝子配列、ならびに前記MHCバーコードを含む、生成することと、
f)前記DNAライブラリを配列決定し、それにより、前記特異的MHC分子を前記対応するTCRαおよび/またはTCRβ配列に連結することと、を含む、方法。
a)実施形態8~16のいずれか1つに記載の1つ以上の多量体主要組織適合性複合体を提供することと、
b)前記多量体MHC分子をT細胞と接触させることと、
c)前記多量体MHC分子に結合したT細胞を前記多量体MHC分子に結合しないT細胞から分離することと、
d)前記分離されたT細胞を溶解することと、
e)DNAライブラリを生成することであって、各DNA分子が、TCRαおよび/またはTCRβ遺伝子配列、ならびに前記MHCバーコードを含む、生成することと、
f)前記DNAライブラリを配列決定し、それにより、前記特異的MHC分子を前記対応するTCRαおよび/またはTCRβ配列に連結することと、を含む、方法。
実施形態19.前記ステップc)がFACS選別または磁気ビーズベースの分離によって達成される、実施形態18に記載の方法。
実施形態20.前記多量体MHC分子が直接または間接的に蛍光標識される、実施形態18または19に記載の方法。
実施形態21.バーコード化MHC分子に結合した前記T細胞が単一の収集管内でバルク選別される、実施形態18~20のいずれか1つに記載の方法。
実施形態22.バーコード化MHC分子に結合した同族T細胞が単一細胞として個々のプレートウェルに選別される、実施形態18~21のいずれか1つに記載の方法。
実施形態23.多量体MHCであって、
骨格分子によって連結された2つ以上のMHC分子と、
前記骨格に連結された少なくとも1つの核酸分子と、を含み、前記核酸分子が、核酸の中央ストレッチ(バーコード領域)と、鋳型スイッチオリゴ配列と、を含む、多量体MHC。
骨格分子によって連結された2つ以上のMHC分子と、
前記骨格に連結された少なくとも1つの核酸分子と、を含み、前記核酸分子が、核酸の中央ストレッチ(バーコード領域)と、鋳型スイッチオリゴ配列と、を含む、多量体MHC。
実施形態24.前記核酸分子が、5’PCRハンドル、中央バーコード領域、UMI、および3’鋳型スイッチオリゴ配列を含む、実施形態23に記載の多量体MHC。
実施形態25.前記鋳型スイッチオリゴ配列が3つのリボグアノシンの3’ストレッチを含む、実施形態23または24に記載の多量体MHC。
実施形態26.前記少なくとも1つの核酸分子が少なくとも10ヌクレオチド長であり、任意に、前記少なくとも1つの核酸分子が10~200ヌクレオチド長である、実施形態23~25のいずれか1つに記載の多量体MHC。
実施形態27.実施形態23~26のいずれか1つに記載の多量体MHCの複数のサブセットを含む組成物であって、多量体MHCの各サブセットが異なるペプチドに結合し、対応するバーコード領域配列を有する、組成物。
実施形態28.特異的MHC分子を対応するTCRαおよび/またはTCRβ配列に連結する方法であって、
a)実施形態23~26のいずれか1つに記載の複数の多量体MHC分子と、T細胞と、5’PCRハンドル、中央細胞バーコード、UMI、およびTCR定常遺伝子に対して相補的な3’ヌクレオチド配列を含むオリゴにコンジュゲートされたビーズとを含む試験試料を形成することと、
b)各液滴が1つより多くのビーズを含まず、かつ1つ以上の多量体MHC分子に結合した1つのT細胞を含むように、液滴を前記試験試料から形成することと、
c)DNAライブラリを生成することであって、各DNA分子が、TCRαおよび/またはTCRβ遺伝子配列、ならびに前記MHCバーコードを含む、生成することと、
d)前記DNAライブラリを配列決定し、それにより、特異的MHC分子を対応するTCRαおよび/またはTCRβ配列に連結することと、を含む、方法。
a)実施形態23~26のいずれか1つに記載の複数の多量体MHC分子と、T細胞と、5’PCRハンドル、中央細胞バーコード、UMI、およびTCR定常遺伝子に対して相補的な3’ヌクレオチド配列を含むオリゴにコンジュゲートされたビーズとを含む試験試料を形成することと、
b)各液滴が1つより多くのビーズを含まず、かつ1つ以上の多量体MHC分子に結合した1つのT細胞を含むように、液滴を前記試験試料から形成することと、
c)DNAライブラリを生成することであって、各DNA分子が、TCRαおよび/またはTCRβ遺伝子配列、ならびに前記MHCバーコードを含む、生成することと、
d)前記DNAライブラリを配列決定し、それにより、特異的MHC分子を対応するTCRαおよび/またはTCRβ配列に連結することと、を含む、方法。
実施形態29.前記ビーズが、ヒドロゲルビーズ、硬質ビーズ、および溶解性ビーズから選択される、実施形態28に記載の方法。
実施形態30.前記ビーズが2つのオリゴにコンジュゲートされており、第1のオリゴが、5’PCRハンドル、中央細胞バーコード、UMI、およびTCRα定常遺伝子に対して相補的な3’ヌクレオチド配列を含み、第2のオリゴが、5’PCRハンドル、中央細胞バーコード、UMI、およびTCRβ定常遺伝子に対して相補的な3’ヌクレオチド配列を含み、前記2つのオリゴの前記中央細胞バーコードが同じ配列を有する、実施形態28または29に記載の方法。
実施形態31.前記DNAライブラリ生成ステップc)が、MMLV逆転写酵素を使用したTCR mRNAの逆転写を含む、実施形態28~30のいずれか1つに記載の方法。
実施形態32.前記PCRハンドルが前記バーコード配列のライブラリ調製を可能にする、先行実施形態のいずれか1つに記載の多量体MHCまたは方法。
実施形態33.前記PCRハンドルがi7アダプター配列を有する、先行実施形態のいずれか1つに記載の多量体MHCまたは方法。
実施形態34.前記バーコード領域が少なくとも4つのヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか1つに記載の多量体MHCまたは方法。
実施形態35.前記バーコード領域が6つのヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか1つに記載の多量体MHCまたは方法。
実施形態36.前記骨格分子が、多糖、グルカン、デキストラン、ストレプトアビジン、およびストレプトマー多量体からなる群から選択される、先行実施形態のいずれか1つに記載の多量体MHCまたは方法。
実施形態37.前記MHC分子が、ストレプトアビジン-ビオチン結合を介して、MHC重鎖を介して、またはMHC軽鎖(β2M)を介して前記骨格に連結されている、先行実施形態のいずれか1つに記載の多量体MHCまたは方法。
実施形態38.前記MHC分子がストレプトアビジン-ビオチン結合を介して前記骨格に連結されている、先行実施形態のいずれか1つに記載の多量体MHCまたは方法。
実施形態39.前記多量体MHCが少なくとも4つのMHC分子を含む、先行実施形態のいずれか1つに記載の多量体MHCまたは方法。
実施形態40.前記少なくとも1つの核酸分子が化学修飾をさらに含む、先行実施形態のいずれか1つに記載の多量体MHCまたは方法。
実施形態41.前記少なくとも1つの核酸分子の5’末端または3’末端がスペーサーを介してアミノ基に結合している、先行実施形態のいずれか1つに記載の多量体MHCまたは方法。
実施形態42.前記スペーサーが6炭素スペーサーまたは12炭素スペーサーである、先行実施形態のいずれか1つに記載の多量体MHCまたは方法。
実施形態43.前記少なくとも1つの核酸分子が5’末端および/または3’末端にホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか1つに記載の多量体MHCまたは方法。
実施形態44.前記少なくとも1つの核酸分子と前記骨格分子との間の連結が前記核酸分子の誘導性解離を可能にする、先行実施形態のいずれか1つに記載の多量体MHCまたは方法。
実施形態45.前記少なくとも1つの核酸分子がジスルフィド架橋を介して前記骨格分子に連結されている、先行実施形態のいずれか1つに記載の多量体MHCまたは方法。
実施形態46.前記ジスルフィド架橋が、スクシンイミジル-6-ヒドラジノ-ニコチンアミド(S-HyNic)修飾骨格分子を、5’-アミノ修飾されたスクシンイミジル-4-ホルミルベンズアミド類似体(S-SS-4FB)修飾核酸分子と組み合わせることによって形成される、先行実施形態のいずれか1つに記載の多量体MHCまたは方法。
実施形態47.前記少なくとも1つの核酸分子が光切断可能な連結を介して前記骨格分子に連結されている、先行実施形態のいずれか1つに記載の多量体MHCまたは方法。
実施形態48.前記MHC分子がMHCクラスIおよび/またはMHCクラスII単量体である、先行実施形態のいずれか1つに記載の多量体MHCまたは方法。
実施形態49.前記MHC分子がペプチドと複合体形成されている、先行実施形態のいずれか1つに記載の多量体MHCまたは方法。
実施形態50.前記MHC分子がビオチン化されている、先行実施形態のいずれか1つに記載の多量体MHCまたは方法。
実施形態51.前記骨格が、蛍光標識、Hisタグ、および金属イオンタグからなる群から選択される1つ以上の標識をさらに含む、先行実施形態のいずれか1つに記載の多量体MHCまたは方法。
実施形態52.前記骨格が前記蛍光標識に直接コンジュゲートされている、先行実施形態のうちのいずれか1つに記載の多量体MHCまたは方法。
実施形態53.前記蛍光標識が4FBで修飾され、S-HyNic修飾骨格にコンジュゲートされている、先行実施形態のいずれか1つに記載の多量体MHCまたは方法。
実施形態54.前記蛍光標識がフルオロフォアタグ付けオリゴである、先行実施形態のいずれか1つに記載の多量体MHCまたは方法。
実施形態55.前記フルオロフォア標識オリゴが5’アミノ修飾または3’アミノ修飾を有し、4FBでさらに修飾され、S-HyNic修飾骨格にコンジュゲートされている、先行実施形態のいずれか1つに記載の多量体MHCまたは方法。
実施形態56.前記フルオロフォアタグ付けオリゴが前記骨格に連結された前記核酸分子に対して相補的である、先行実施形態のいずれか1つに記載の多量体MHCまたは方法。
実施形態57.前記フルオロフォアタグ付けオリゴが10ヌクレオチド長である、先行実施形態のうちのいずれか1つに記載の多量体MHCまたは方法。
実施形態58.前記骨格がフルオロフォア標識抗ストレプトアビジン抗体で標識される、先行実施形態のうちのいずれか1つに記載の多量体MHCまたは方法。
実施形態59.前記フルオロフォアが、蛍光色素または量子ドットである、先行実施形態のうちのいずれか1つに記載の多量体MHCまたは方法。
実施形態60.前記少なくとも1つの核酸分子が、DNA、RNA、人工ヌクレオチド、PNA、およびLNAからなる群から選択される核酸分子を含む、先行実施形態のいずれか1つに記載の多量体MHCまたは方法。
実施形態61.前記多量体MHCが同族T細胞に結合する、先行実施形態のいずれか1つに記載の多量体MHCまたは方法。
実施形態62.前記多量体MHCがフローサイトメトリー用途と適合性がある、先行実施形態のいずれか1つに記載の多量体MHCまたは方法。
実施形態63.前記フローサイトメトリー用途が単一細胞またはバルク細胞蛍光活性化細胞選別(FACS)である、先行実施形態のいずれか1つに記載の多量体MHCまたは方法。
実施形態64.多量体MHCがNGSベースの用途と適合性がある、先行実施形態のいずれか1つに記載の多量体MHCまたは方法。
実施形態65.前記NGSベースの用途が液滴ベースの単一細胞配列決定である、先行実施形態のいずれか1つに記載の多量体MHCまたは方法。
実施形態66.試料中の抗原応答性細胞を検出するための方法であって、
a)実施形態1~5、8~16、23~26、および32~65のいずれか1つに記載の1つ以上の多量体主要組織適合性複合体を提供することと、
b)前記多量体MHC分子を前記試料と接触させることと、
c)前記多量体MHC分子の前記抗原応答性細胞への結合を検出し、それにより、前記MHC分子中に存在する抗原に応答して細胞を検出することと、を含み、前記結合が、前記骨格分子を介して前記1つ以上のMHC分子に連結された前記核酸分子の前記バーコード領域を増幅することによって検出される、方法。
a)実施形態1~5、8~16、23~26、および32~65のいずれか1つに記載の1つ以上の多量体主要組織適合性複合体を提供することと、
b)前記多量体MHC分子を前記試料と接触させることと、
c)前記多量体MHC分子の前記抗原応答性細胞への結合を検出し、それにより、前記MHC分子中に存在する抗原に応答して細胞を検出することと、を含み、前記結合が、前記骨格分子を介して前記1つ以上のMHC分子に連結された前記核酸分子の前記バーコード領域を増幅することによって検出される、方法。
実施形態67.前記試料が、血液試料、末梢血試料、血液由来試料、組織試料、体液、髄液、および唾液からなる群から選択される、実施形態66に記載の方法。
実施形態68.前記試料が哺乳動物から得られる、実施形態66または67に記載の方法。
実施形態69.前記方法が、フローサイトメトリー、FACS、磁気ビーズベースの選択、サイズ排除、勾配遠心分離、カラム付着、およびゲル濾過からなる群から選択される方法による細胞選択をさらに含む、実施形態66~68のいずれか1つに記載の方法。
実施形態70.前記増幅がPCRである、実施形態66~69のいずれか1つに記載の方法。
実施形態71.前記核酸分子のバーコード領域の検出が、前記バーコード領域の配列決定またはqPCRによる前記バーコード領域の検出を含む、実施形態66~70のいずれか1つに記載の方法。
本発明がここで一般的に記載されているが、本発明のある特定の態様および実施形態を例証するためのみに含まれており、本発明を限定するようには意図されていない以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されるであろう。
実施例1:バーコード化pMHCの構築および実験的検証
多量体種
以下は、任意の配列からなるオリゴの共有結合的コンジュゲーションおよび非共有結合的コンジュゲーションの両方を説明する。共有結合的コンジュゲーションの場合、オリゴ(例えば、図1中)をチオエーテル結合の形成によりストレプトアビジンにコンジュゲートするが、他の化学反応および結合形成を用いることができる。この特定の事例では、共有結合的連結により、オリゴおよびストレプトアビジンの両方が共通のヘテロ二官能性リンカーに架橋されて、ストレプトアビジン-オリゴコンジュゲートがもたらされる(図5)。ストレプトアビジンに非共有結合的にコンジュゲートされたオリゴを、ビオチン化オリゴをストレプトアビジンと最適比率で混合し、所望のストレプトアビジン-オリゴコンジュゲート種のHPLC精製によって得ることができる(図5および図9)。その後、共有結合および非共有結合由来のストレプトアビジン-オリゴコンジュゲート種をpMHC多量体化に供することができる(図5)。これらのpMHC多量体種を、(図11に記載されるように)pMHC-TCR結合力研究のために異なる組み合わせで使用することができる。加えて、1ストレプトアビジンあたり3単量体と4単量体との間の差異がTCR検出に影響を及ぼさないように標的pMHC-TCR結合力が十分に高いことが知られている場合、単一サブタイプのpMHC多量体(例えば、pMHC三量体のみ)をバルクまたは単一細胞配列決定プラットフォームで単独で使用することができる。非共有結合由来のストレプトアビジン-オリゴコンジュゲートのみを使用する利点は、化学的コンジュゲーションなしで済ませ、かつ1ストレプトアビジンあたりより少ない単量体の使用によるコスト削減である。
多量体種
以下は、任意の配列からなるオリゴの共有結合的コンジュゲーションおよび非共有結合的コンジュゲーションの両方を説明する。共有結合的コンジュゲーションの場合、オリゴ(例えば、図1中)をチオエーテル結合の形成によりストレプトアビジンにコンジュゲートするが、他の化学反応および結合形成を用いることができる。この特定の事例では、共有結合的連結により、オリゴおよびストレプトアビジンの両方が共通のヘテロ二官能性リンカーに架橋されて、ストレプトアビジン-オリゴコンジュゲートがもたらされる(図5)。ストレプトアビジンに非共有結合的にコンジュゲートされたオリゴを、ビオチン化オリゴをストレプトアビジンと最適比率で混合し、所望のストレプトアビジン-オリゴコンジュゲート種のHPLC精製によって得ることができる(図5および図9)。その後、共有結合および非共有結合由来のストレプトアビジン-オリゴコンジュゲート種をpMHC多量体化に供することができる(図5)。これらのpMHC多量体種を、(図11に記載されるように)pMHC-TCR結合力研究のために異なる組み合わせで使用することができる。加えて、1ストレプトアビジンあたり3単量体と4単量体との間の差異がTCR検出に影響を及ぼさないように標的pMHC-TCR結合力が十分に高いことが知られている場合、単一サブタイプのpMHC多量体(例えば、pMHC三量体のみ)をバルクまたは単一細胞配列決定プラットフォームで単独で使用することができる。非共有結合由来のストレプトアビジン-オリゴコンジュゲートのみを使用する利点は、化学的コンジュゲーションなしで済ませ、かつ1ストレプトアビジンあたりより少ない単量体の使用によるコスト削減である。
別の例として、補足的S-SS-4FBを補足したSolulinkタンパク質-オリゴヌクレオチドコンジュゲーションキットを使用することができる。ストレプトアビジンを最初にS-HyNicで修飾した。5’アミノ修飾オリゴをS-SS-4FBで修飾した。その後、修飾オリゴと修飾ストレプトアビジンを組み合わせて、直接バーコード化ストレプトアビジンを生成した(図2)。バーコード化オリゴをタンパク質にコンジュゲートし、かつ光切断可能な連結を含むが、これに限定されない誘導性バーコード化オリゴ解離を可能にする代替のコンジュゲーション化学アプローチおよび材料供給業者を使用することができる。オリゴをストレプトアビジンから、この場合は還元条件下で、一時的に解離する能力(図3)、ならびにビオチンに結合するバーコード化ストレプトアビジンの能力(図4)を実験で検証した。
実施例2:バーコード化四量体のフルオロフォアベースの追跡
単一細胞およびバルク細胞選別用途で使用するために、バーコード化四量体を様々なフルオロフォアタグ付け戦略(図図6A~図図6C)と組み合わせることができる。
単一細胞およびバルク細胞選別用途で使用するために、バーコード化四量体を様々なフルオロフォアタグ付け戦略(図図6A~図図6C)と組み合わせることができる。
実施例3:TCR標的バーコード化四量体
記載のコンジュゲーション化学と同じコンジュゲーション化学を使用して、TCRαおよび/またはTCRβ定常遺伝子を標的とするバーコード化pMHC多量体を作製することができる(図17)。本開示は、TCR配列を取得し、かつpMHC情報を一致させることのみに関心を示す科学者の利益になる。この方法の主な利点は、逆転写TCRαおよび/またはTCRβ配列の両方がpMHC多量体バーコードを含むため、1回のライブラリ調製しか必要とされないことである。したがって、単数の配列決定リードは、TCR配列およびpMHC同一性情報の両方を含む。これは、ポリ-Aテールまたは他の捕捉配列ベースのライブラリ調製法と対照的であり、それにより、より小さいpMHCバーコード/抗体バーコードライブラリが別個に処理され、後に配列決定の時点でmRNA由来のライブラリと組み合わせられる1~4。単一またはバルク細胞選別で使用するために、本開示に記載のTCR標的四量体をフルオロフォア検出と組み合わせることができる(図6A~図6C)。単一細胞選別により、TCRクローン性研究(図18~図20)、ならびにTCRαおよびTCRβ対形成配列の選別した起始細胞への潜在的な連結(図18、図21、図22)が可能になる。
記載のコンジュゲーション化学と同じコンジュゲーション化学を使用して、TCRαおよび/またはTCRβ定常遺伝子を標的とするバーコード化pMHC多量体を作製することができる(図17)。本開示は、TCR配列を取得し、かつpMHC情報を一致させることのみに関心を示す科学者の利益になる。この方法の主な利点は、逆転写TCRαおよび/またはTCRβ配列の両方がpMHC多量体バーコードを含むため、1回のライブラリ調製しか必要とされないことである。したがって、単数の配列決定リードは、TCR配列およびpMHC同一性情報の両方を含む。これは、ポリ-Aテールまたは他の捕捉配列ベースのライブラリ調製法と対照的であり、それにより、より小さいpMHCバーコード/抗体バーコードライブラリが別個に処理され、後に配列決定の時点でmRNA由来のライブラリと組み合わせられる1~4。単一またはバルク細胞選別で使用するために、本開示に記載のTCR標的四量体をフルオロフォア検出と組み合わせることができる(図6A~図6C)。単一細胞選別により、TCRクローン性研究(図18~図20)、ならびにTCRαおよびTCRβ対形成配列の選別した起始細胞への潜在的な連結(図18、図21、図22)が可能になる。
実施例4:カスタムTCR液滴ベースの配列決定
別の実施形態では、pMHC多量体コンジュゲートオリゴが、pMHC多量体バーコード配列およびPCRハンドル配列に加えて、鋳型スイッチオリゴ配列を含むように、バーコード化pMHC多量体を作製することができる(図23)。これを行うための鍵は、スイッチオリゴ配列がMMLV逆転写酵素によって付加されたデオキシシチジンに結合するために3つのリボグアノシンの3’ストレッチを含むことである。このシナリオでは、液滴ベースのビーズ(ヒドロゲルビーズ、硬質ビーズ、または溶解性ビーズを含むが、これらに限定されない)を、典型的な細胞バーコードおよびPCRハンドル配列を有するTCRαおよび/またはTCRβ定常遺伝子相補性オリゴにカスタムコンジュゲートするであろう。PCR重複除去のためにUMIをオリゴ配列のうちのいずれかに含めることができる。TCRαおよびTCRβの両方を標的とするオリゴを有するビーズは、所与のビーズについて同じバーコードを含むであろう。ビーズおよびpMHC多量体陽性T細胞の両方を含む単一の液滴内で、MMLV逆転写酵素による逆転写は、TCR mRNA由来のV(D)J配列を有するビーズベースのオリゴを伸長し、pMHC多量体バーコードおよびPCRハンドルを有する鋳型スイッチオリゴ配列も含むであろう。その後の第2鎖合成およびPCR増幅により、配列決定のためのライブラリ調製が完了するであろう。ビーズオリゴおよびpMHCマリンターバーコード化/鋳型スイッチオリゴの両方のオリゴ配列、長さ、および修飾(ロック核酸塩基の使用を含むが、これに限定されない)を変化させることができる。この実施形態は、他の逆転写酵素誘導体と適合性があり得る。
別の実施形態では、pMHC多量体コンジュゲートオリゴが、pMHC多量体バーコード配列およびPCRハンドル配列に加えて、鋳型スイッチオリゴ配列を含むように、バーコード化pMHC多量体を作製することができる(図23)。これを行うための鍵は、スイッチオリゴ配列がMMLV逆転写酵素によって付加されたデオキシシチジンに結合するために3つのリボグアノシンの3’ストレッチを含むことである。このシナリオでは、液滴ベースのビーズ(ヒドロゲルビーズ、硬質ビーズ、または溶解性ビーズを含むが、これらに限定されない)を、典型的な細胞バーコードおよびPCRハンドル配列を有するTCRαおよび/またはTCRβ定常遺伝子相補性オリゴにカスタムコンジュゲートするであろう。PCR重複除去のためにUMIをオリゴ配列のうちのいずれかに含めることができる。TCRαおよびTCRβの両方を標的とするオリゴを有するビーズは、所与のビーズについて同じバーコードを含むであろう。ビーズおよびpMHC多量体陽性T細胞の両方を含む単一の液滴内で、MMLV逆転写酵素による逆転写は、TCR mRNA由来のV(D)J配列を有するビーズベースのオリゴを伸長し、pMHC多量体バーコードおよびPCRハンドルを有する鋳型スイッチオリゴ配列も含むであろう。その後の第2鎖合成およびPCR増幅により、配列決定のためのライブラリ調製が完了するであろう。ビーズオリゴおよびpMHCマリンターバーコード化/鋳型スイッチオリゴの両方のオリゴ配列、長さ、および修飾(ロック核酸塩基の使用を含むが、これに限定されない)を変化させることができる。この実施形態は、他の逆転写酵素誘導体と適合性があり得る。
このシステムは、いくつかの主要な利点を有する。1つは、TCR配列およびpMHCバーコード配列のみを取得し、全トランスクリプトームの配列決定の必要性を打ち消すことである。別の利点は、四量体バーコード配列およびTCR配列の両方が同じ転写物上にあるため、1回のライブラリ調製しか必要とされないことである。別の利点は、TCRαビーズオリゴおよびTCRβビーズオリゴの両方を使用する場合、これらの両方が各液滴内の一意の細胞バーコード配列により自動的に対形成されることである。最後に、pMHC多量体陽性T細胞のみが、2つのPCRハンドルのうちの1つを含む鋳型スイッチ/pMHC多量体バーコード化オリゴを有するため、pMHC多量体陽性T細胞のみが配列決定ライブラリに寄与する。
参照による組み込み
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が各々参照により組み込まれるよう具体的かつ個別に示されるかのように、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、本明細書におけるいずれの定義も含む本出願が優先される。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が各々参照により組み込まれるよう具体的かつ個別に示されるかのように、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、本明細書におけるいずれの定義も含む本出願が優先される。
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等価物
当業者であれば、本明細書に記載の本発明に包含される特定の実施形態の多くの等価物を認識するか、または通例の実験のみを使用して確認することができるであろう。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されるよう意図されている。
当業者であれば、本明細書に記載の本発明に包含される特定の実施形態の多くの等価物を認識するか、または通例の実験のみを使用して確認することができるであろう。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されるよう意図されている。
Claims (76)
- ペプチド-主要組織適合性複合体(pMHC)バーコード化多量体であって、
少なくとも1つの調節可能なpMHC実体を含み、前記pMHC実体が、
骨格分子によって連結された少なくとも1つのpMHC分子と、
1骨格分子あたり少なくとも1つの核酸分子と、を含み、
前記核酸分子が共有結合的または非共有結合的に連結されたコンジュゲートを含む、ペプチド-主要組織適合性複合体(pMHC)バーコード化多量体。 - 前記核酸分子が、
pMHCバーコード化ヌクレオチドの中央ストレッチと、
標的オリゴに対する相補性を有するヌクレオチドの第2のストレッチと、を含む、請求項1に記載のpMHC多量体。 - NGSに使用するための、請求項2に記載のpMHC多量体。
- 前記骨格分子がストレプトアビジンである、請求項1~3のいずれか1項に記載のpMHC多量体。
- 前記多量体が、1骨格分子あたり少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つのpMHC実体を含む、請求項1~4のいずれか1項に記載のpMHC多量体。
- T細胞受容体(TCR)-pMHC結合力の監視に使用するための、請求項1~5のいずれか1項に記載のpMHC多量体。
- 前記ストレプトアビジンが前記少なくとも1つの核酸分子に共有結合的にコンジュゲートされ、それにより、1ストレプトアビジンあたり少なくとも4つのMHC単量体を提供する、請求項1~6のいずれか1項に記載のpMHC多量体。
- 前記ストレプトアビジンが前記少なくとも1つの核酸分子に非共有結合的にコンジュゲートされており、前記核酸分子がビオチン化されており、前記少なくとも1つのビオチン化核酸分子と前記ストレプトアビジンがある比率で複合体形成されており、前記比率が、
1ストレプトアビジン:1オリゴ、
1ストレプトアビジン:2オリゴ、および
1ストレプトアビジン:3オリゴからなる群から選択される、請求項1~6のいずれか1項に記載のpMHC多量体。 - HPLC精製プロセスによって産生される、請求項1に記載のpMHC多量体。
- 前記ストレプトアビジンが前記少なくとも1つの核酸分子に共有結合的にコンジュゲートされており、前記核酸分子がバーコードおよび少なくとも1つのビオチン結合部位を含み、前記結合部位が、
ビオチン化ペプチド、ビオチン化タンパク質、ビオチン化ポリマー、ビオチン化フルオロフォア、切断可能なビオチン化オリゴ、またはビオチン化薬剤を含む、請求項1~9のいずれか1項に記載のpMHC多量体。 - 前記少なくとも1つの核酸分子が、5’PCRハンドル領域、中央バーコード領域、任意にUMI、または任意に少なくとも10個の連続したアデニンの3’ポリ-Aテール領域を含む、請求項1~10のいずれか1項に記載のpMHC多量体。
- 前記核酸の3’末端テールのうちの前記少なくとも1つが標的オリゴ配列に対して相補的な任意の配列で構成されている、請求項1~11のいずれか1項に記載のpMHC多量体。
- 前記少なくとも1つの核酸分子が、約10~200ヌクレオチド長、またはそれ以上である、請求項1~12のいずれか1項に記載のpMHC多量体。
- 請求項1~13のいずれか1項に記載のpMHC多量体の複数のサブセットを含む組成物であって、pMHC多量体の各サブセットが異なるペプチドに結合し、対応するバーコード領域配列を有する、組成物。
- 特異的MHC分子を対応するT細胞トランスクリプトームに連結する方法であって、
a)請求項1~13のいずれか1項に記載の複数のpMHC多量体分子と、T細胞と、5’PCRハンドル、中央細胞バーコード、UMI、およびベイト配列を含む結合標的オリゴに連結された粒子とを含む試験試料を形成することと、
b)各液滴が1つより多くの粒子を含まず、かつ1つ以上のpMHC多量体分子に結合した1つのT細胞を含むように、液滴を前記試験試料から形成することと、
c)各液滴中にT細胞cDNAライブラリおよびpMHCバーコードライブラリを生成することと、
d)前記T細胞mRNAライブラリおよび前記MCHバーコードライブラリの両方を配列決定し、それにより、特異的MHC分子を前記対応するT細胞トランスクリプトームに連結することと、を含む、方法。 - 前記ベイト配列が3’ポリ-(dT)である、請求項15に記載の方法。
- 多量体pMHCであって、
骨格分子によって連結された1つ以上のpMHC分子と、
前記骨格に連結された少なくとも1つの核酸分子と、を含み、前記核酸分子が、増幅されるように設計された核酸の中央ストレッチ(バーコード領域)と、TCR定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含む、多量体pMHC。 - 前記骨格に連結された第1のタイプの核酸分子を含み、前記第1のタイプの核酸分子が、中央バーコード領域と、TCRαまたはTCRβ定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含む、請求項17に記載の多量体pMHC。
- 前記骨格に連結された第1および第2のタイプの核酸分子を含み、
前記第1のタイプの核酸分子が、中央バーコード領域と、TCRα定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含み、
前記第2のタイプの核酸分子が、中央バーコード領域と、TCRβ定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含み、
前記2つのタイプの前記核酸分子の前記バーコード領域が同じ配列を有し、
任意に、前記2つのタイプの前記核酸分子の各々のUMI配列がランダムであり、それ故に、互いに異なる可能性があるが、それらがそれぞれの核酸の同じ領域に位置する可能性がある、請求項17に記載の多量体pMHC。 - 前記核酸分子が、5’PCRハンドル、中央バーコード領域、UMI、およびTCR定常遺伝子に対して相補的な3’ヌクレオチド配列を含む、請求項17~19のいずれか1項に記載の多量体pMHC。
- 前記核酸分子が、前記TCR定常遺伝子の5’末端に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項17~20のいずれか1項に記載の多量体pMHC。
- 前記TCR定常遺伝子が、TCRα定常遺伝子、TCRβ定常1遺伝子、またはTCRβ定常2遺伝子である、請求項17~21のいずれか1項に記載の多量体MHC。
- 前記核酸分子の5’末端および/または3’末端が前記骨格分子に連結されている、請求項17~22のいずれか1項に記載の多量体MHC。
- 前記核酸分子が、前記バーコード領域に隣接した一意の分子識別子(UMI)をさらに含む、請求項17~23のいずれか1項に記載の多量体MHC。
- 少なくとも1つの核酸分子が、約10~200ヌクレオチド長、またはそれ以上である、請求項17~24のいずれか1項に記載の多量体MHC。
- 請求項17~25のいずれか1項に記載の多量体pMHCの複数のサブセットを含む組成物であって、多量体MHCの各サブセットが異なるペプチドに結合し、対応するバーコード領域配列を有する、組成物。
- 特異的MHC分子を対応するTCRαおよび/またはTCRβ配列に連結する方法であって、
a)請求項17~25のいずれか1項に記載の1つ以上の多量体pMHCを提供することと、
b)前記多量体pMHC分子をT細胞と接触させることと、
c)前記多量体MHC分子に結合したT細胞を前記多量体MHC分子に結合していないT細胞から分離することと、
d)前記分離されたT細胞を溶解することと、
e)DNAライブラリを生成することであって、各DNA分子が、TCRαおよび/またはTCRβ遺伝子配列、ならびに前記pMHCバーコードを含む、生成することと、
f)前記DNAライブラリを配列決定し、それにより、前記特異的pMHC分子を前記対応するTCRαおよび/またはTCRβ配列に連結することと、を含む、方法。 - 前記ステップc)がFACS選別または磁気ビーズベースの分離によって達成される、請求項27に記載の方法。
- 前記多量体pMHC分子が直接または間接的に蛍光標識される、請求項27または28に記載の方法。
- バーコード化pMHC分子に結合した前記T細胞が単一の収集管内でバルク選別される、請求項27~29のいずれか1項に記載の方法。
- バーコード化pMHC分子に結合した同族T細胞が単一細胞として個々のプレートウェルに選別される、請求項27~30のいずれか1項に記載の方法。
- 多量体pMHCであって、
骨格分子によって連結された1つ以上のpMHC分子と、
前記骨格に連結された少なくとも1つの核酸分子と、を含み、前記核酸分子が、増幅されるように設計された核酸の中央ストレッチ(バーコード領域)と、鋳型スイッチオリゴ配列と、を含む、多量体pMHC。 - 前記核酸分子が、5’PCRハンドル、中央バーコード領域、UMI、および3’鋳型スイッチオリゴ配列を含む、請求項32に記載の多量体pMHC。
- 前記鋳型スイッチオリゴ配列が3つのリボグアノシンの3’ストレッチを含む、請求項32または33に記載の多量体pMHC。
- 前記少なくとも1つの核酸分子が、約10~200ヌクレオチド長、またはそれ以上である、請求項32~34のいずれか1項に記載の多量体pMHC。
- 請求項32~35のいずれか1項に記載の多量体pMHCの複数のサブセットを含む組成物であって、多量体pMHCの各サブセットが異なるペプチドに結合し、対応するバーコード領域配列を有する、組成物。
- 特異的pMHC分子を対応するTCRαおよび/またはTCRβ相補的配列に連結する方法であって、
a)請求項32~35のいずれか1項に記載の複数の多量体pMHC分子と、T細胞と、5’PCRハンドル、中央細胞バーコード、UMI、およびTCR定常遺伝子に対して相補的な3’ヌクレオチド配列を含むオリゴにコンジュゲートされたビーズとを含む試験試料を形成することと、
b)各液滴が1つより多くのビーズを含まず、かつ1つ以上の多量体MHC分子に結合した1つのT細胞を含むように、液滴を前記試験試料から形成することと、
c)DNAライブラリを生成することであって、各DNA分子が、TCRαおよび/またはTCRβ遺伝子配列、ならびに前記pMHCバーコードを含む、生成することと、
d)前記DNAライブラリを配列決定し、それにより、特異的pMHC分子を対応するTCRαおよび/またはTCRβ配列に連結することと、を含む、方法。 - 前記ビーズが、ヒドロゲルビーズ、硬質ビーズ、および溶解性ビーズから選択される、請求項37に記載の方法。
- 前記ビーズが2つのオリゴにコンジュゲートされており、第1のオリゴが、5’PCRハンドル、中央細胞バーコード、UMI、およびTCRα定常遺伝子に対して相補的な3’ヌクレオチド配列を含み、第2のオリゴが、5’PCRハンドル、中央細胞バーコード、UMI、およびTCRβ定常遺伝子に対して相補的な3’ヌクレオチド配列を含み、前記2つのオリゴの前記中央細胞バーコードが同じ配列を有する、請求項37または38に記載の方法。
- 前記DNAライブラリ生成ステップc)が、MMLV逆転写酵素を使用したTCR mRNAの逆転写を含む、請求項37~39のいずれか1項に記載の方法。
- 前記PCRハンドルが前記バーコード配列のライブラリ調製を可能にする、先行請求項のいずれか1項に記載の多量体pMHCまたは方法。
- 前記PCRハンドルがi7アダプター配列を有し得る、先行請求項のいずれか1項に記載の多量体pMHCまたは方法。
- 前記バーコード領域が少なくとも4つのヌクレオチドを含む、先行請求項のいずれか1項に記載の多量体pMHCまたは方法。
- 前記pMHC分子が、ストレプトアビジン-ビオチン結合を介して、MHC重鎖を介して、またはMHC軽鎖(β2M)を介して前記骨格に連結されている、先行請求項のいずれか1項に記載の多量体pMHCまたは方法。
- 前記MHC分子がストレプトアビジン-ビオチン結合を介して前記骨格に連結されている、先行請求項のいずれか1項に記載の多量体pMHCまたは方法。
- 前記多量体pMHCが少なくとも1つのMHC分子を含む、先行請求項のいずれか1項に記載の多量体pMHCまたは方法。
- 前記少なくとも1つの核酸分子が化学修飾をさらに含む、先行請求項のいずれか1項に記載の多量体pMHCまたは方法。
- 前記少なくとも1つの核酸分子の5’末端または3’末端がスペーサーを介してアミノ基に結合している、先行請求項のいずれか1項に記載の多量体pMHCまたは方法。
- 前記スペーサーが6炭素スペーサーまたは12炭素スペーサーであり得る、先行請求項のいずれか1項に記載の多量体pMHCまたは方法。
- 前記少なくとも1つの核酸分子が5’末端および/または3’末端にホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む、先行請求項のいずれか1項に記載の多量体pMHCまたは方法。
- 前記少なくとも1つの核酸分子と前記骨格分子との間の連結が前記核酸分子の誘導性解離を可能にする、先行請求項のいずれか1項に記載の多量体pMHCまたは方法。
- 前記少なくとも1つの核酸分子が共有結合または非共有結合を介して前記骨格分子に連結されている、先行請求項のいずれか1項に記載の多量体pMHCまたは方法。
- 前記共有結合がチオエーテルである、先行請求項のいずれか1項に記載の多量体pMHCまたは方法。
- 前記少なくとも1つの核酸分子が誘導的に切断可能な結合を介して前記骨格分子に連結されている、先行請求項のいずれか1項に記載の多量体pMHCまたは方法。
- 前記誘導的に切断可能な結合が光切断可能であるか、またはジスルフィド結合を含む、先行請求項のいずれか1項に記載の多量体pMHCまたは方法。
- 前記MHC分子がMHCクラスIおよび/またはMHCクラスII単量体である、先行請求項のいずれか1項に記載の多量体pMHCまたは方法。
- 前記MHC分子がペプチドと複合体形成されている、先行請求項のいずれか1項に記載の多量体pMHCまたは方法。
- 前記MHC分子がビオチン化されている、先行請求項のいずれか1項に記載の多量体pMHCまたは方法。
- 前記骨格が、蛍光標識、Hisタグ、および金属イオンタグからなる群から選択される1つ以上の標識をさらに含む、先行請求項のいずれか1項に記載の多量体pMHCまたは方法。
- 前記骨格が前記蛍光標識に直接コンジュゲートされている、先行請求項のいずれか1項に記載の多量体pMHCまたは方法。
- 前記蛍光標識がフルオロフォアタグ付けオリゴである、先行請求項のいずれか1項に記載の多量体pMHCまたは方法。
- 前記フルオロフォアタグ付けオリゴが前記骨格に連結された前記核酸分子に対して相補的である、先行請求項のいずれか1項に記載の多量体pMHCまたは方法。
- 前記骨格がフルオロフォア標識抗ストレプトアビジン抗体で標識される、先行請求項のいずれか1項に記載の多量体pMHCまたは方法。
- 前記フルオロフォアが、蛍光タンパク質、蛍光色素、または量子ドットである、先行請求項のいずれか1項に記載の多量体pMHCまたは方法。
- 前記少なくとも1つの核酸分子が、DNA、RNA、人工ヌクレオチド、PNA、およびLNAからなる群から選択される核酸分子を含む、先行請求項のいずれか1項に記載の多量体pMHCまたは方法。
- 前記多量体pMHCが同族T細胞に結合する、先行請求項のいずれか1項に記載の多量体pMHCまたは方法。
- 前記多量体pMHCがフローサイトメトリー用途と適合性がある、先行請求項のいずれか1項に記載の多量体pMHCまたは方法。
- 前記フローサイトメトリー用途が単一細胞またはバルク細胞蛍光活性化細胞選別(FACS)である、先行請求項のいずれか1項に記載の多量体pMHCまたは方法。
- 前記多量体pMHCがNGSベースの用途と適合性がある、先行請求項のいずれか1項に記載の多量体pMHCまたは方法。
- 前記NGSベースの用途が液滴ベースの単一細胞配列決定である、先行請求項のいずれか1項に記載の多量体pMHCまたは方法。
- 試料中の抗原応答性細胞を検出するための方法であって、
a)請求項1~13、17~25、32~35、および41~70のいずれか1項に記載の1つ以上の多量体pMHCを提供することと、
b)前記多量体pMHC分子を前記試料と接触させることと、
c)前記多量体pMHC分子の前記抗原応答性細胞への結合を検出し、それにより、前記MHC分子中に存在する抗原に応答して細胞を検出することと、を含み、前記結合が、前記骨格分子を介して前記1つ以上のMHC分子に連結された前記核酸分子の前記バーコード領域を増幅することによって検出される、方法。 - 前記試料が、血液試料、末梢血試料、血液由来試料、組織試料、体液、髄液、および唾液からなる群から選択される、請求項71に記載の方法。
- 前記試料が哺乳動物から得られる、請求項71または72に記載の方法。
- 前記方法が、フローサイトメトリー、FACS、磁気ビーズベースの選択、サイズ排除、勾配遠心分離、カラム付着、およびゲル濾過からなる群から選択される方法による細胞選択をさらに含む、請求項1~73のいずれか1項に記載の方法。
- 前記増幅がPCRである、請求項1~74のいずれか1項に記載の方法。
- 前記核酸分子のバーコード領域の検出が、前記バーコード領域の配列決定またはqPCRによる前記バーコード領域の検出を含む、請求項1~75のいずれか1項に記載の方法。
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