JP2007537450A - バイオバーコードに基づく標的検体の検出 - Google Patents

バイオバーコードに基づく標的検体の検出 Download PDF

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Abstract

本発明は、試料中の１つまたは複数の標的検体、例えば生体分子の存否を検出するためのスクリーニング方法、組成物およびキットに関する。特に、本発明は、溶液中の多数のタンパク質構造体または他の標的検体を検出するための生化学バーコードとしてレポータオリゴヌクレオチドを利用する方法に関する。

Description

本発明は、１つまたは複数の標的検体、例えばタンパク質、核酸、または試料中の他の化合物の存否を検出するためのスクリーニング方法に関する。詳細には、本発明は、溶液中の１つまたは複数の検体を検出するための生化学バーコードとしてレポータヌクレオチドを利用する方法に関する。
相互参照
本出願は、ともにその全体を本願明細書に援用する、２００４年６月２５日に出願された米国特許出願第１０／８７７，７５０号、および２００４年６月２５日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０４／０２０４９３の一部継続である。本出願は、２００４年５月１２日に出願された仮出願第６０／５７０，７２３号、２００４年７月１日に出願された第６０／５８５，２９４号、および２００５年１月１９日に出願された代理人整理番号第０５−１９２号の利益を主張する。本出願は、また、２００３年９月２５日に出願された仮出願第６０／５０６，７０８号、２００３年６月２７日に出願された第６０／４８２，９７９号、２００３年８月２１日に出願された第６０／４９６，８９３号、２００３年１０月２８日に出願された第６０／５１５，２４３号、および２００３年１２月１８日に出願された第６０／５３０，７９７号の利益を主張するものであり、２００２年３月２７日に出願された米国特許出願第１０／１０８，２１１号の一部継続である。米国特許出願第１０／１０８，２１１号は、その全体を本願明細書に援用する２０００年３月２８日に出願された米国仮出願第６０／１９２，６９９号、および２００１年１１月１３日に出願された第６０／３５０，５６０号の利益を主張するものであり、２００１年３月２８日に出願された米国特許出願番号第０９／８２０，２７９号の一部継続である。本出願に報告されている研究は、一部にＮＳＦ、ＡＲＯ、ＡＦＯＳＲ、ＤＡＲＰＡおよびＮＩＨの助成金を受けている。本明細書における研究は、また、一部に国立衛生研究所奨学金１ＤＰ１−０Ｄ０００２８５−０１、空軍科学技術事務所助成金Ｆ４９６−２０−０１−１−０４０１およびエジソン助成金６１４４６０１−０５−０００１の支援を受けた。よって、米国政府は、本出願に記載されている発明に対して一定の権利を有する。
検体の検出は、分子生物研究用途および医療用途の双方に重要である。現在では、蛍光、質量分析、ゲル電気泳動、レーザ走査および電気化学に基づく診断方法が、様々なタンパク質構造を識別するのに利用可能である１−４。血球の遺伝タンパク質変異体を識別し、疾病を診断し、組織に分子プローブを局在化させ、かつ分子を精製し、または分離ステップを行うのに、抗体に基づく反応が広く用いられている５。医療診断用途（例：マラリアおよびＨＩＶ）では、酵素結合免疫吸着検定、ウェスタンブロッティングおよび間接的蛍光抗体試験の如き抗体試験は、単一の標的タンパク質構造を識別するのに極めて有用である６、７。多数の抗体の存在に対する高速同時試料スクリーニングは、研究および臨床の双方の用途において有益である。しかし、上記の関連プロトコルを用いた検定条件下でいくつかのタンパク質構造を同時に検出することは困難で、高価で、かつ時間がかかる。
ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、および他の形態の標的増幅により、研究、法医学および臨床の用途に向けた対象ＤＮＡ標的を検出、定量するための有力なツールの開発における急速な進歩が可能になった２６−３２。タンパク質に対する同等の標的増幅方法の開発により、医療診断、およびプロテオミクスの開発分野を著しく向上させることが可能になった３３−３６。タンパク質標的を化学的に複製することはまだ不可能であるが、後にＰＣＲで増幅することが可能なオリゴヌクレオチドマーカで当該標的を標識し、次いでＤＮＡ検出を用いて、対象の標的を識別することが可能である３７−４５。しばしば免疫ＰＣ
Ｒと称するこの手法は、様々な異なる形式のＤＮＡ標識でタンパク質を検出することを可能にする（図５）。今日まで、すべての免疫ＰＣＲ手法は、最初に標的検体を表面に固定し、続いてＤＮＡ標識とともに抗体を使用して検出を行うことを含む異種検定を含む（例：米国特許第５，６３５，６０２号および５，６６５，５３９号）。ＤＮＡ標識は、通常、（共有結合相互作用またはストレパビジン−ビオチン結合を介して）抗体に強く結合する。これらの手法は、タンパク質検出における特筆すべき進歩ではあるが、いくつかの欠点がある。すなわち、１）ＤＮＡ識別配列の検出抗体に対する割合が小さいため感度が制限される、２）標的捕獲手順の不均一な性質により標的結合速度が遅く、検定時間が長くなるとともに、検定感度が低下する（図５のステップ３）、３）抗体とＤＮＡマーカを化学的に結合させるのに必要な結合化学現象が複雑である（図５のステップ４）、４）ＰＣＲ増幅ステップが必要である４５。したがって、多重化に適合し、実施が容易な、試料中の標的検体を検出するための高感度かつ迅速な方法が必要である。
ＤＮＡ検出方法については、放射性標識、分子蛍光体、化学発光スキーム、電気化学標識、および最近ではナノ構造に基づく標識６１−７０を用いて多くの検定が開発されてきた。いくつかのナノ構造に基づく方法は、感度の点でＰＣＲに近づいているが、これまでいずれも、ＰＣＲが提供する１〜１０コピーの感度レベルを達成していない。ＰＣＲに伴う複雑さ、費用、および多大な時間および労力の側面を伴わずにＰＣＲと同様のシグナル増幅を可能にする手法は、当該ＰＣＲに基づく方法に比べて大きな利点をもたらすことになる。
発明の開示
本発明は、１つの溶液中の多数の検体を検出するための生化学バーコードとしてオリゴヌクレオチドを利用する方法、プローブ、組成物およびキットに関する。その手法は、ナノ粒子によって直接または間接的に機能化された特異的結合対の認識要素、および金ナノ粒子凝集をもたらすハイブリダイゼーション事象が金ナノ粒子の物理特性（例：光学的、電気的、機械的特性）を変化させうるというこれまでの知見を利用している８−１２。一般的な考え方は、特異的結合対の各認識要素を、個別かつ調節可能なハイブリダイゼーションおよび溶融特性ならびにナノ粒子に関する物理的性質を有する異なるオリゴヌクレオチド配列に対応づけることができるということである。個別的なハイブリダイゼーションおよび溶融特性を用いて、ナノ粒子に伴う物理的性質に変化を生じさせ、またはハイブリダイゼーション／脱ハイブリダイゼーションまたは溶融／アニーリング事象を通じてオリゴヌクレオチド配列を検出することにより、多検体検定における一連の検体をデコードすることが可能である。
本発明は、それぞれが試料中の特異的結合相補体との特異的結合相互作用のための少なくとも２つの結合部位を有する、試料中の１つまたは複数の標的検体の存在を検出するための方法であって、
ａ）特定の標的検体の少なくとも第１の結合部位に結合する特定の標的検体の少なくとも１つの特異的結合相補体が結合した少なくとも１種類の捕獲基体を提供するステップと、
ｂ）（ｉ）特定の標的検体に対する少なくとも１つの特異的結合相補体と、（ｉｉ）場合によってはレポータ標識で標識される複数のＤＮＡバーコードとが結合した微粒子を含む、少なくとも１種類の微粒子検出プローブを提供するステップであって、微粒子検出プローブに結合した特異的結合相補体は、標的検体の少なくとも第２の結合部位に結合するステップと、
ｃ）標的検体を捕獲基体上に固定するように、捕獲基体に結合した特異的結合相補体に対する特定の標的検体の結合を可能にするのに有効な条件下で、標的検体を含有すると思われる試料に捕獲基体を接触させるステップと、
ｄ）標的検体と、検体に対する微粒子検出プローブに結合した特異的結合相補体との結
合を可能にし、捕獲基体上の標的検体の存在下で複合体を形成するのに有効な条件下で、少なくとも１種類の微粒子検出プローブに、固定された標的検体を接触させるステップと、
ｅ）場合によって、捕獲基体を分離し、洗浄して、未結合の微粒子検出プローブを除去するステップと、
ｆ）試料中の特定の標的検体の存在を示すＤＮＡバーコードの存在を検出するステップと、を含む方法を提供する。
加えて、本発明は、それぞれが試料中の特異的結合相補体との特異的結合相互作用のための少なくとも２つの結合部位を有する、試料中の１つまたは複数の標的検体の存在を検出するための方法であって、
ａ）特定の標的検体の少なくとも第１の結合部位に結合する特定の標的検体の少なくとも１つの特異的結合相補体が結合した少なくとも１種類の捕獲基体を提供するステップと、
ｂ）（ｉ）特定の標的検体に対する少なくとも１つの特異的結合相補体と、（ｉｉ）蛍光標識した複数のＤＮＡバーコードとが結合した微粒子を含む、少なくとも１種類の微粒子検出プローブを提供するステップであって、微粒子検出プローブに結合した特異的結合相補体は、標的検体の少なくとも第２の結合部位に結合するステップと、
ｃ）標的検体を捕獲基体上に固定するように、捕獲基体に結合した特異的結合相補体に対する特定の標的検体の結合を可能にするのに有効な条件下で、標的検体を含有すると思われる試料に捕獲基体を接触させるステップと、
ｄ）標的検体と、検体に対する微粒子検出プローブに結合した特異的結合相補体との結合を可能にし、捕獲基体上の標的検体の存在下で複合体を形成するのに有効な条件下で、少なくとも１種類の微粒子検出プローブに、固定された標的検体を接触させるステップと、
ｅ）場合によって、捕獲基体を分離し、洗浄して、未結合の微粒子検出プローブを除去するステップと、
ｆ）試料中の特定の標的検体の存在を示すＤＮＡバーコードからの蛍光シグナルの存在を検出するステップと、を含む方法を提供する。
本発明は、また、それぞれが試料中の特異的結合相補体との特異的結合相互作用のための少なくとも２つの結合部位を有する、試料中の１つまたは複数の標的検体の存在を検出するための方法であって、
ａ）特定の標的検体の少なくとも第１の結合部位に結合する特定の標的検体の少なくとも１つの特異的結合相補体が結合した少なくとも１種類の捕獲基体を提供するステップと、
ｂ）（ｉ）特定の標的検体に対する少なくとも１つの特異的結合相補体と、（ｉｉ）蛍光標識した複数のＤＮＡバーコードとが結合した微粒子を含む、少なくとも１種類の微粒子検出プローブを提供するステップであって、微粒子検出プローブに結合した特異的結合相補体は、標的検体の少なくとも第２の結合部位に結合するステップと、
ｃ）標的検体を捕獲基体上に固定するように、捕獲基体に結合した特異的結合相補体に対する特定の標的検体の結合を可能にするのに有効な条件下で、標的検体を含有すると思われる試料に捕獲基体を接触させるステップと、
ｄ）標的検体と、検体に対する微粒子検出プローブに結合した特異的結合相補体との結合を可能にし、捕獲基体上の標的検体の存在下で複合体を形成するのに有効な条件下で、少なくとも１種類の微粒子検出プローブに、固定された標的検体を接触させるステップと、
ｅ）場合によって、捕獲基体を分離し、洗浄して、未結合の微粒子検出プローブを除去するステップと、
ｆ）分離、洗浄された捕獲基体に、ＤＮＡバーコードを剥離させるのに有効な条件を施
すステップと、
ｇ）試料中の特定の標的検体の存在を示すＤＮＡバーコードの蛍光シグナルの存在を検出するステップと、を含む方法を提供する。
本発明は、また、それぞれが試料中の特異的結合相補体との特異的結合相互作用のための少なくとも２つの結合部位を有する、試料中の１つまたは複数の標的検体の存在を検出するための方法であって、
ａ）特定の標的検体の少なくとも第１の結合部位に結合する特定の標的検体の少なくとも１つの特異的結合相補体が結合した少なくとも１種類の捕獲基体を提供するステップと、
ｂ）（ｉ）特定の標的検体に対する少なくとも１つの特異的結合相補体と、（ｉｉ）レポータ標識を含む複数のＤＮＡバーコードとが結合した微粒子を含む少なくとも１種類の微粒子検出プローブを提供するステップであって、微粒子検出プローブに結合した特異的結合相補体は、標的検体の少なくとも第２の結合部位に結合するステップと、
ｃ）標的検体を捕獲基体上に固定するように、捕獲基体に結合した特異的結合相補体に対する特定の標的検体の結合を可能にするのに有効な条件下で、標的検体を含有すると思われる試料に捕獲基体を接触させるステップと、
ｄ）標的検体と、検体に対する微粒子検出プローブに結合した特異的結合相補体との結合を可能にし、捕獲基体上の標的検体の存在下で複合体を形成するのに有効な条件下で、少なくとも１種類の微粒子検出プローブに、固定された標的検体を接触させるステップと、
ｅ）場合によって、捕獲基体を分離し、洗浄して、未結合の微粒子検出プローブを除去するステップと、
ｆ）分離、洗浄された捕獲基体に、ＤＮＡバーコードを剥離させるのに有効な条件を施すステップと、
ｇ）試料中の特定の標的検体の存在を示すＤＮＡバーコードのレポータ標識の存在を検出するステップと、を含む方法を提供する。
本発明は、また、それぞれが試料中の特異的結合相補体との特異的結合相互作用のための少なくとも２つの結合部位を有する、試料中の１つまたは複数の標的検体の存在を検出するための方法であって、
ａ）特定の標的検体の少なくとも第１の結合部位に結合する特定の標的検体の少なくとも１つの特異的結合相補体が結合した少なくとも１種類の捕獲基体を提供するステップと、
ｂ）（ｉ）特定の標的検体に対する少なくとも１つの特異的結合相補体と、（ｉｉ）場合によってはレポータ標識で標識された複数のＤＮＡバーコードが結合された微粒子またはナノ粒子と、を備えた少なくとも１種類の粒子検出プローブを提供するステップであって、粒子検出プローブに結合した特異的結合相補体は、標的検体の少なくとも第２の結合部位に結合するステップと、
ｃ）標的検体を捕獲基体上に固定するように、捕獲基体に結合した特異的結合相補体に対する特定の標的検体の結合を可能にするのに有効な条件下で、標的検体を含有すると思われる試料に捕獲基体を接触させるステップと、
ｄ）標的検体と、検体に対する粒子検出プローブに結合した特異的結合相補体との結合を可能にし、捕獲基体上の標的検体の存在下で複合体を形成するのに有効な条件下で、少なくとも１種類の粒子検出プローブに、固定された標的検体を接触させるステップと、
ｅ）場合によって、捕獲基体を分離し、洗浄して、未結合の粒子検出プローブを除去するステップと、
ｆ）化学剥離剤によって粒子検出プローブからＤＮＡバーコードを剥離させるステップと、
ｇ）試料中の特定の標的検体の存在を示すＤＮＡバーコードの存在を検出するステップ
と、を含む方法を提供する。
本発明は、また、それぞれが試料中の特異的結合相補体との特異的結合相互作用のための少なくとも２つの結合部位を有する、試料中の１つまたは複数の標的検体の存在を検出するための方法であって、
ａ）特定の標的検体の少なくとも第１の結合部位に結合する特定の標的検体の少なくとも１つの特異的結合相補体が結合した、試料から分離可能な少なくとも１種類捕獲基体を提供するステップと、
ｂ）標的検体を捕獲基体上に固定するように、捕獲基体に結合した特異的結合相補体に対する特定の標的検体の結合を可能にするのに有効な条件下で、標的検体を含有すると思われる試料に捕獲基体を接触させるステップと、
ｃ）場合によっては捕獲基体、およびそれに結合した任意の標的検体を試料から分離するステップと、
ｄ）（ｉ）特定の標的検体に対する少なくとも１つの特異的結合相補体と、（ｉｉ）場合によってはレポータ標識で標識される複数のオリゴヌクレオチドとが結合した粒子を含む、少なくとも１種類の粒子検出プローブを提供するステップであって、粒子検出プローブに結合した特異的結合相補体は、標的検体の少なくとも第２の結合部位に結合するステップと、
ｅ）標的検体と、検体に対する粒子検出プローブに結合した特異的結合相補体との結合を可能にし、捕獲基体上の標的検体の存在下で、標的検体、捕獲基体および粒子検出プローブを備えた複合体を形成するのに有効な条件下で、少なくとも１種類の粒子検出プローブに、固定された標的検体を接触させるステップと、
ｆ）場合によっては未結合の粒子検出プローブから複合体を分離するステップと、
ｇ）試料中の特定の標的検体の存在を示す複合体の存在を検出するステップと、を含む方法を提供する。
本明細書に記載されるように、本発明の検定方法は、感度が極めて高く、酵素増幅または走査検出スキームを必要とせずに、６０分間未満で実施されうる。本発明の方法は、感度を損なわずにＰＣＲおよび走査方法の両方を除くことによって、長い検定時間および検定の複雑さの如き従来の方法の両方の欠点のいくつかを克服する。また、簡潔であるため、看護士、医師および兵士等の非科学者でも簡単なトレーニングの後に本発明の方法の利用法を習得できるはずである。異なる標的タンパク質に対して異なる蛍光体を使用することによって本発明の方法を容易に多重化することが可能であり、プローブ濃度および反応条件を最適化することによって全検定時間をさらに短くすることが可能である。加えて、本発明の方法を用いて、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、小分子および金属イオンを含む、サンドイッチ検定で検出できる任意の標的を検出することが可能である。また、他の種類のレポータ基をバーコードに貼付して、蛍光検出以外の方法でバーコードおよび増幅検出シグナルを識別することが可能である。これらの基としては、酸化還元基、電気特性を有する基、放射性基、触媒基、特徴的な吸収特性を有する基、およびラマン特性を有する基が挙げられるが、それらに限定されない。レポータ基は、特徴的かつ測定可能な化学または物理特性を有するものであれば、いかなるものであってもよい。
本発明の１実施形態において、試料中の少なくとも２つの結合部位を有する１つまたは複数の標的検体の存否を検出するための方法であって、
基体を提供するステップと、
特定の標的検体に対する１つまたは複数の特異的結合相補体と、１つまたは複数のＤＮＡバーコードとが結合した粒子をそれぞれ備えた１つまたは複数の種類の粒子プローブを提供するステップであって、それぞれの種類の粒子プローブの特異的結合相補体は、特定の標的検体に特異的であり、それぞれの種類の粒子プローブに対するＤＮＡバーコードは、特定の標的検体に対するマーカとして機能するステップと、
標的検体を基体上に固定するステップと、
標的検体と検体に対する特異的結合相補体との結合を可能にし、標的検体の存在下で複合体を形成するのに有効な条件下で、１つまたは複数の種類の粒子プローブに、固定された標的検体を接触させるステップと、
基体を洗浄して、未結合の粒子プローブを除去するステップと、
場合によってはＤＮＡバーコードを増幅させるステップと、
ＤＮＡの存否を検出し、マーカの存否は、試料中の特定の標的検体の存否を示すステップと、を含む方法が提供される。
本発明の本実施形態の１態様において、標的検体は、タンパク質またはハプテンであり、その特異的結合相補体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を含む抗体である。
本発明の別の態様において、ＤＮＡバーコードは、ＰＣＲによって増幅される。
本発明の別の態様において、粒子は、少なくとも２つのＤＮＡバーコードで標識される。
本発明の別の態様において、基体は、標的検体に対する１つまたは複数の種類の捕獲プローブと整列される。
本発明の別の実施形態において、それぞれ少なくとも２つの結合部位を有する、試料中の１つまたは複数の標的検体の存否を検出するための方法であって、
特定の標的検体の第１の結合部位に対する特異的結合相補部分をそれぞれ備えた、基体に結合した１つまたは複数の種類の捕獲プローブを提供するステップと、
オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子、特定の標的検体の第２の結合部位に対する１つまたは複数の結合相補体、および特定の標的検体に対するマーカとして機能する１つまたは複数のＤＮＡバーコードをそれぞれ備えた１つまたは複数の種類の検出プローブを提供し、ＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部は、ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかに対してハイブリダイズされるステップと、
標的検体とプローブとの特異的結合作用を可能にし、標的検体の存在下で凝集複合体を形成するのに有効な条件下で、試料と、捕獲プローブと、検出プローブとを接触させるステップと、
基体を洗浄して、未結合検出プローブを除去するステップと、
基体上の任意の凝集複合体におけるＤＮＡバーコードの存否を検出し、ＤＮＡバーコードの存否の検出は、試料中の標的検体の存否を示すステップと、を含む方法が提供される。
本発明の本実施形態の１態様において、検出プローブは、（ｉ）特定の標的検体の第２の結合部位に対する１つまたは複数の特異的結合相補体と、（ｉｉ）ナノ粒子に結合する少なくとも１種類のオリゴヌクレオチド、および少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的な所定の配列を有するＤＮＡバーコードとを備え、それぞれの種類の検出プローブに結合したＤＮＡバーコードは、特定の標的検体に対するマーカとして機能する。
本実施形態の別の態様において、前記検出ステップの前に、該方法は、
凝集複合体に、凝集複合体を脱ハイブリダイズし、ＤＮＡバーコードを剥離させるのに有効な条件を施すステップと、
前記検出の前にＤＮＡバーコードを増幅するステップと、をさらに含む。
本実施形態の別の態様において、ＰＣＲによってＤＮＡバーコードを増幅する。
本実施形態の別の態様において、捕獲プローブは、磁性微粒子の如き磁性基体に結合す
る。
本実施形態の別の態様において、標的検体は、少なくとも２つの部分の配列を有する標的核酸であり、検出プローブは、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子を備え、オリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードに相補的な配列を有し、検出プローブの特異的結合相補体は、標的核酸の第１の部分に相補的な配列を有する第１の標的認識オリゴヌクレオチドを備え、捕獲プローブの特異的結合相補体は、標的核酸の少なくとも第２の部分に相補的な配列を有する第２の標的認識オリゴヌクレオチドを備える。
本実施形態の別の態様において、標的検体は、少なくとも２つの部分の配列を有する標的核酸であり、検出プローブは、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子を備え、ＤＮＡバーコードは、検出プローブに結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的な配列を有し、特異的結合相補体は、少なくとも第１および第２の部分の配列を有する標的認識オリゴヌクレオチドを備え、第１の部分は、標的核酸の第１の部分に相補的であり、第２の部分は、ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的であり、基体の特異的結合相補体は、標的核酸の第２の部分に相補的である少なくとも一部を有する標的認識オリゴヌクレオチドを備える。
本実施形態の別の態様において、検出プローブは、デンドリマーを備える。
本発明のさらに別の実施形態において、それぞれ少なくとも２つの結合部位を有する、試料中の１つまたは複数の標的検体の存否を検出するための方法であって、
（ｉ）磁性微粒子、および（ｉｉ）特定の標的検体の第１の結合部位に結合する、磁性微粒子に結合された第１の特異的結合対の第１の構成要素、をそれぞれ備えた１つまたは複数の種類の捕獲プローブを提供するステップと、
（ｉ）ナノ粒子、（ｉｉ）標的検体の第２の結合部位に結合する、ナノ粒子に結合された第２の特異的結合対の第１の構成要素、（ｉｉｉ）ナノ粒子に結合された少なくとも１種類のオリゴヌクレオチド、および（ｉｖ）それぞれ特定の種類のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的であり、特定の標的検体に対するマーカとして機能する所定の配列を有する少なくとも１種類のＤＮＡバーコード、を備えた、それぞれの標的検体に対する１つまたは複数の種類の検出プローブを提供するステップと、
標的検体とプローブの特異的結合相互作用を可能にし、標的検体の存在下で磁性微粒子に結合した凝集複合体を形成するのに有効な条件下で、捕獲プローブおよび検出プローブに試料を接触させるステップと、
未結合の検出プローブを磁性微粒子から洗浄するステップと、
複合体中のＤＮＡバーコードの存否を検出し、ＤＮＡバーコードの検出は、標的検体の存在を示すステップと、を含む方法が提供される。
本実施形態の１態様において、該方法は、前記検出ステップの前に、
磁界を印加することによって凝集複合体を分離するステップと、
ＤＮＡバーコードを脱ハイブリダイズし、凝集複合体から剥離させるのに有効な条件を凝集複合体に施すステップと、
剥離されたＤＮＡバーコードを分離するステップと、をさらに含む。
本実施形態の別の態様において、該方法は、剥離されたＤＮＡバーコードを増幅させるステップをさらに含む。
本実施形態の別の態様において、該方法は、
ＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部に相補的である配列を有するオリゴヌクレオチドが結合した基体を提供するステップと、
オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子を提供し、ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部が、ＤＮＡバーコードの少なくとも一部に相補的である配列を有す
るステップと、
少なくとも相補的オリゴヌクレオチドが、基体に結合したＤＮＡバーコードの第１の部分と、およびオリゴヌクレオチドのいくつかが、ナノ粒子に結合したＤＮＡバーコードの第２の部分とのハイブリダイゼーションを可能にするのに有効な条件下で、ＤＮＡバーコードと、基体に結合したオリゴヌクレオチドと、ナノ粒子とを接触させるステップと、をさらに含む。
本実施形態の別の態様において、検出の前に、ＰＣＲによってＤＮＡバーコードを増幅する。
本実施形態の別の態様において、該方法は、凝集複合体を分析する前に、凝集複合体を分離するステップをさらに含む。
本実施形態の別の態様において、凝集複合体に磁界を印加することによって凝集複合体を分離する。
本実施形態の別の態様において、ナノ粒子は、金ナノ粒子または半導体ナノ粒子の如き金属ナノ粒子である。
本実施形態の別の態様において、特異的結合対は、抗体および抗原、受容体およびリガンド、酵素および基体、薬物および標的分子、アプタマーおよびアプタマー標的、少なくとも部分的に相補的なオリゴヌクレオチドの２つの鎖である。
本実施形態の別の態様において、ＤＮＡバーコードをビオチニル化、放射性標識または蛍光標識することができる。
本発明の他の実施態様において、試料中の１つまたは複数の標的検体の存否を検出するための方法であって、
結合したオリゴヌクレオチド、特定の標的検体の１つまたは複数の特異的結合相補体、および特定の標的検体に対するマーカとして機能する１つまたは複数のＤＮＡバーコードをそれぞれ備えた少なくとも１つまたは複数の種類の粒子複合体プローブを提供し、ＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部は、ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかに対してハイブリダイズされるステップと、
標的検体と粒子複合体プローブとの特異的結合相互作用を可能にし、標的検体の存在下で凝集複合体を形成するのに有効な条件下で、試料を粒子複合体プローブに接触させるステップと、
凝集複合体形成が生じたかどうかを確認するステップと、を含む方法が提供される。
本発明の別の実施形態は、少なくとも２つの結合部位をそれぞれ有する１つまたは複数の標的検体の存否を検出するための方法を提供する。該方法は、使用されるそれぞれの標的検体に対して、少なくとも１種類の捕獲プローブと、少なくとも１種類の検出プローブとを備える。これらのプローブは、実際の検定が実施される前、または検定が実施されている間に所定位置で生成されうる。捕獲プローブは、第１の特異的結合対の第１の構成要素を備え、第１の特異的結合対の第１の構成要素は、標的検体の第１の結合部位に結合し、第１の特異的結合対の第１の構成要素は、場合によっては基体に結合する。１つの好ましい実施形態において、基体は、磁性微粒子を備える。検出プローブは、（１）ナノ粒子と、（２）標的検体の第２の結合部位に結合する、ナノ粒子に結合された第２の特異的結合対の第１の構成要素と、（３）ナノ粒子に結合した少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドと、（４）特定の種類のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的である所定の配列をそれぞれ有する少なくとも１種類のＤＮＡバーコードとを備える。標的検体を含有する試料に使用されると、捕獲プローブ上の第１の特異的結合対の第１の構成要素は、標的検体の第１の結合部位に結合し、検出プローブ上の第２の特異的結合対の第１の構成要素は、標的検体の第２の結合部位に結合する。標的検体によって捕獲プローブと検出プロ
ーブを一緒にすると、凝集が生じる。凝集体を分離し、さらなる溶融分析を施して、上述のような多数の標的が存在する特定の標的検体を識別することができる。あるいは、凝集体を脱ハイブリダイズして、ＤＮＡバーコードを剥離させることが可能である。
本実施形態の１態様において、それぞれの種類の粒子複合体プローブにおけるＤＮＡバーコードは、異なる配列であり、特定の標的検体に対する識別子として機能する配列を有する。
本実施形態の別の態様において、該方法は、
凝集複合体を分離するステップと、
凝集複合体を分析して、異なる配列を有する１つまたは複数のＤＮＡバーコードの存在を判断するステップと、をさらに含む。
本実施形態の別の態様において、該方法は、
凝集複合体を分離するステップと、
凝集複合体を脱ハイブリダイズさせ、ＤＮＡバーコードを剥離させるのに有効な条件を凝集複合体に施すステップと、
ＤＮＡバーコードを分離するステップと、
異なる配列を有する１つまたは複数のＤＮＡバーコードの存在を検出し、それぞれのＤＮＡバーコードは、試料中の特定の標的検体の存在を示すステップと、をさらに含む。
本実施形態の別の態様において、該方法は、
凝集複合体を分離するステップと、
凝集複合体を脱ハイブリダイズさせ、ＤＮＡバーコードを剥離させるのに有効な条件を凝集複合体に施すステップと、
ＤＮＡバーコードを分離するステップと、
分離されたＤＮＡバーコードを増幅するステップと、
異なる配列を有する１つまたは複数の増幅ＤＮＡバーコードの存在を検出し、それぞれのＤＮＡバーコードは、試料中の特定の標的検体の存在を示すステップと、をさらに含む。
本実施形態の別の態様において、標的は、３つ以上の結合部位を有し、少なくとも２種類の粒子複合体プローブが提供され、第１の種類のプローブは、標的検体上の第１の結合部位に対する特異的結合相補部分を有し、第２の種類のプローブは、プローブ上の第２の結合部位に対する特異的結合相補部分を有する。複数の粒子複合体プローブを提供することができ、それぞれの種類のプローブは、標的検体上の異なる結合部位に対する特異的結合相補部分を有する。
本実施形態の別の態様において、１つまたは複数のＤＮＡバーコードの存在に対する検出ステップは、
ＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが結合した基体を提供するステップと、
オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子を提供し、ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの少なくとも一部に相補的である配列を有するステップと、
少なくとも基体に結合した相補的オリゴヌクレオチドとＤＮＡバーコードの第１の部分、およびナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドのいくつかとＤＮＡバーコードの第２の部分のハイブリダイゼーションを可能にするのに有効な条件下で、ＤＮＡバーコードと、基体に結合したオリゴヌクレオチドと、ナノ粒子とを接触させるステップと、
検出可能な変化を確認するステップと、を含む。
本実施形態の別の態様において、基体には、１つまたは複数の異なる種類のＤＮＡバーコードの検出を可能にする配列で、複数の種類のオリゴヌクレオチドが結合されている。
本実施形態の別の態様において、検出可能な変化は、基体上の暗領域の形成である。
本実施形態の別の態様において、検出可能な変化は、光学スキャナで確認される。
本実施形態の別の態様において、基体を銀染料に接触させて、検出可能な変化を生じさせる。
本実施形態の別の態様において、ＤＮＡバーコードが、基体に結合した相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることを可能にするのに有効な条件下で、ＤＮＡバーコードを基体に接触させ、続いて、ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかが、基体上のＤＮＡバーコードの配列の一部にハイブリダイズすることを可能にするのに有効な条件下で、基体に結合したＤＮＡバーコードをオリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子に接触させる。
本実施形態の別の態様において、ＤＮＡバーコードが、ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかにハイブリダイズすることを可能にするのに有効な条件下で、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子にＤＮＡバーコードを接触させ、続いて、ナノ粒子に結合したＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部が、基体に結合した相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることを可能にするのに有効な条件下で、ナノ粒子に結合したＤＮＡバーコードを基体に接触させる。
本実施形態の別の態様において、接触ステップの前にＤＮＡバーコードを増幅させる。
本実施形態の別の態様において、少なくとも２種類の粒子複合体プローブが提供され、第１の種類のプローブは、標的検体の第１の結合部位に対する特異的結合相補部分を有し、第２の種類のプローブは、標的検体の第２の結合部位に対する特異的結合相補部分を有する。
本発明の別の実施形態において、粒子複合体プローブが提供される。したがって、本実施形態の１態様において、粒子複合体プローブは、オリゴヌクレオチドが結合した粒子、１つまたは複数のＤＮＡバーコード、および特定の標的検体に対する特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドを備え、（ｉ）ＤＮＡバーコードは、少なくとも２つの部分を有する配列を有し、（ｉｉ）粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかは、ＤＮＡバーコードの第１の部分に相補的である配列を有し、（ｉｉｉ）特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分に相補的である配列を有し、（ｉｖ）それぞれの種類の粒子複合体プローブにおけるＤＮＡバーコードは、異なる配列であり、特定の標的検体に対する識別子として機能する配列を有する。
本実施形態の別の態様において、粒子複合体プローブは、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドが結合した粒子、１つまたは複数のＤＮＡバーコード、および標的検体に対する特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドを備え、プローブに結合した第１の種類のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの少なくとも一部に相補的である配列を有し、プローブに結合した第２の種類のオリゴヌクレオチドは、特異的結合相補体を有するオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部に相補的である配列を有する。
本実施形態の別の態様において、粒子複合体プローブは、オリゴヌクレオチドが結合した粒子、１つまたは複数のＤＮＡバーコード、および標的検体に対する特異的結合相補体を備え、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部に相補的である配列を有し、ＤＮＡバーコードは、特定の標的検体に
対する識別子として機能する。
本発明のさらに別の実施形態において、粒子複合体プローブを提供する。したがって、本発明の１実施形態において、オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および特定の標的検体に対する特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドを備え、（ｉ）ＤＮＡバーコードは、少なくとも２つの部分を有する配列を有し、（ｉｉ）粒子に結合されたオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかは、ＤＮＡバーコードの第１の部分に相補的である配列を有し、（ｉｉｉ）特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分に相補的である配列を有し、（ｉｖ）それぞれの種類の粒子複合体プローブにおけるＤＮＡバーコードは、異なる配列であり、特定の標的検体に対する識別子として機能する配列を有する粒子複合体プローブが提供される。
本発明の別の実施形態において、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的検体に対する特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドを備え、プローブに結合した第１の種類のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの少なくとも一部に相補的である配列を有し、プローブに結合した第２の種類のオリゴヌクレオチドは、特異的結合相補体を有するオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部に相補的である配列を有する粒子複合体プローブが提供される。
本発明のさらに別の実施形態において、オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的検体に対する特異的結合相補体を備え、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部に相補的である配列を有し、ＤＮＡバーコードは、特定の標的検体に対する識別子として機能する、粒子複合体プローブが提供される。
本発明のさらに別の実施形態において、ナノ粒子、ナノ粒子に結合した特異的結合対の構成要素、ナノ粒子に結合した少なくとも１種類のオリゴヌクレオチド、およびそれぞれ所定の配列を有する少なくとも１種類のＤＮＡバーコードを備え、それぞれの種類のＤＮＡバーコードは、少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に対してハイブリダイズされる、検出プローブが提供される。
本発明の別の実施形態において、上述の粒子複合体プローブを備えたキットが提供される。
本発明の以上のおよび別の実施形態は、以下の詳細な説明を読めば明らかになるであろう。
本明細書に用いられる場合、オリゴヌクレオチドが結合されたナノ粒子、複合体、粒子、ラテックスおよび微球体等の「種類」とは、同じ種類のオリゴヌクレオチドが結合された複数のそれらの項目を意味する。「オリゴヌクレオチドが結合されたナノ粒子」または「オリゴヌクレオチドが結合されたナノ粒子」とは、「ナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体」を意味することもあり、または本発明の検出方法の場合には、「ナノ粒子−オリゴヌクレオチドプローブ」、「ナノ粒子プローブ」もしくは単に「プローブ」を意味することもある。
本明細書に用いられる場合、「粒子」という用語は、好ましくは金属、シリカ、酸化珪素またはポリエチレンで構成されうる小片を意味する。「粒子」は、球状または棒状の如き任意の形状でありうる。本明細書に用いられる場合、「粒子」という用語は、具体的には、以下に定義かつ記載されるナノ粒子および微粒子の両方を包含する。
本発明の全体を通じて用いられるように、「バーコード」、「生化学バーコード」、「バイオバーコード」、「バーコードＤＮＡ」、「ＤＮＡバーコード」、「レポータバーコード」および「レポータバーコードＤＮＡ」等は、いずれも互いに区別なく、同一の意味を有する。ＤＮＡバーコードは、デオキシ核酸またはリボ核酸の如き核酸であってもよい。好ましくは、ＤＮＡバーコードは、所定の配列のオリゴヌクレオチドである。望まれる場合は、ＤＮＡバーコードを例えばビオチン、放射標識または蛍光標識で標識することができる。
「ナノ粒子複合体」または「ナノ粒子複合体プローブ」という用語は、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体、レポータオリゴヌクレオチド、および標的検体に対する特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドで構成される複合体を意味する。
「検体」または「標的検体」という用語は、薬物、代謝物質、殺虫剤および汚染物質等を含む検出対象化合物または組成物を意味する。検体は、特異的結合対（ｓｂｐ）の構成要素で構成することが可能であり、一価（モノエピトープ）または多価（ポリエプトープ）、好ましくは抗原性またはハプテンであるリガンドであってもよく、単一化合物、または共通のエピトープまたは確定部位を共有する複数の化合物である。検体は、細菌如き細胞の一部、Ａ、ＢおよびＤ等の血液型抗原もしくはＨＬＡ抗原を担持する細胞、または微生物（例：細菌、心筋、原虫もしくはウイルス）でありうる。検体がモノエピトープである場合、検体を例えば化学的にさらに修飾して、１つまたは複数の追加的な結合部位を提供することが可能である。本発明を実行する上で、検体は、少なくとも２つの結合部位を有する。
多価のリガンド検体は、通常は、ポリペプチドおよびタンパク質、多糖類、核酸、およびそれらの組合せの如き、しばしばポリマー特性を有するより大きい有機化合物である。当該組合せとしては、細菌、ウイルス、染色体、遺伝子、ミトコンドリア、核酸および細胞膜等が挙げられる。
たいていの場合は、本発明を適用することが可能であるポリエピトープリガンド検体は、分子量が少なくとも約５，０００以上、より一般的には約１０，０００以上である。ポリマー分子の範疇では、対象のポリマーは、分子量が一般的には約５，０００から５，０００，０００、より一般的には約２０，０００から１０００，０００であり、対象のホルモンの間では、分子量は、通常約５，０００から６０，０００である。
広範なタンパク質が、類似の構造的特徴を有するタンパク質、特定の生物学的機能を有するタンパク質、および特定の微生物、特に病因微生物に関連するタンパク質等の族に属するものと見なすことができる。そのようなタンパク質としては、例えば、免疫グロブリン、サイトカイン、酵素、ホルモン、癌抗原、栄養マーカおよび組織特有抗原等が挙げられる。
タンパク質、血液凝固因子、タンパク質ホルモン、抗原性糖類、微生物および本発明における他の対象病原菌の種類は、その全体を本願明細書に援用する米国特許第４，６５０，７７０号に具体的に開示されている。
モノエピトープリガンド検体は、分子量が一般には約１００から２，０００、より一般的には１２５から１，０００である。
検体は、宿主からの体液の如き試料中に直接見られる分子であってもよい。試料を直接調べることもできるし、検体がより容易に検出できるように前処理することもできる。また、対象の検体が試料中に存在する場合にのみその存在が検出されることになる対象の検体に相補的な特異的結合対構成要素の如き、対象の検体を示す薬剤を検出することによっ
て、対象の検体を決定することができる。したがって、検体を示す薬剤は、検定で検出される検体になる。体液は、例えば、尿、血液、血漿、血清、唾液、***、便、痰、脳脊髄液、涙および粘液でありうる。
「特異的結合対（ｓｂｐ）構成要素」という用語は、他の分子の特定の空間および／または極性構造に結合し、相補的であると規定することができる２つの異なる分子のうちの１つを意味する。特異的結合対の構成要素をリガンドおよび受容体（アンチリガンド）と呼ぶことが可能である。これらは、通常は抗原−抗体の如き免疫対の構成要素であるが、ビオチン−アビチン、酵素−基質、酵素−拮抗剤、酵素−作用薬、薬物−標的分子、ホルモン−ホルモン受容体、核酸二重鎖、ＩｇＧタンパク質Ａ／タンパク質Ｇ、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、タンパク質ＤＮＡ、脂質−ＤＮＡ、脂質−タンパク質、多糖−脂質、タンパク質−多糖、核酸アプタマーおよび関連する標的リガンド（例：小有機化合物、核酸、タンパク質、ペプチド、ウイルスおよび細胞等）等は、免疫対ではないが、本発明、およびｓｂｐ構成要素の定義に含まれる。特異的結合対の構成要素は、分子全体であるか、または構成要素が標的検体上の結合部位に特異的に結合して、特異的結合対を形成するのであれば分子の一部のみでありうる。
「リガンド」という用語は、それに対する受容体が本質的に存在するか、または製造できる、任意の有機化合物を意味する。リガンドという用語は、リガンド類似体を他の分子に接続させる修飾提供手段である受容体について類似リガンドと競合しうる、通常は分子量が１００を上回る修飾リガンド、通常は有機ラジカルまたは検体類似体であるリガンド類似体をも含む。リガンド類似体は、リガンド類似体をハブまたは標識に結合させる結合で水素を置換すること以外の点でもリガンドと通常異なるが、それは必須ではない。リガンド類似体は、リガンドと同様にして受容体に結合することが可能である。リガンド類似体は、例えば、リガンドに対する抗体のイディオタイプに対して誘導される抗体である。
「受容体」または「アンチリガンド」という用語は、分子の特定の空間および極性構造、例えばエピトームまたは確定部位を認識することが可能な任意の化合物または組成物を意味する。例示的な受容体としては、天然受容体、例えばサイロキシン結合グロブリン、抗体、酵素、Ｆａｂフラグメント、レクチン、核酸、核酸アプタマー、アビジン、タンパク質Ａ、バルスターおよび補体成分Ｃｌｑ等が挙げられる。アビジンは、ストレプタビジンの如き他の源からの卵白アビジンおよびビオチン結合タンパク質を含むことになる。
「特異的結合」という用語は、他の分子の認識が実質的により低いことに比較して、２つの異なる分子の他方に対する認識が特異的であることを意味する。一般に、分子は、２つの分子間の特異的認識をもたらす領域をその表面または空隙内に有する。特異的結合の典型例は、抗体−抗原相互作用、酵素−基体相互作用およびポリヌクレオチド相互作用等である。
「非特異的結合」という用語は、特異的表面構造とは相対的に無関係である分子間の結合を意味する。非特異的結合は、分子間の疎水相互作用を含むいくつかの要因に起因しうる。
「抗体」という用語は、他の分子の特定の空間および極性構造に特異的に結合するため該構造に相補的であると定義される免疫グロブリンを意味する。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり、宿主の免疫化および血清（ポリクローナル）の回収の如き当該技術分野でよく知られている技術、または連続的なハイブリッド細胞系統を調製し、***タンパク質（モノクローナル）を回収すること、または天然抗体の特異的結合に必要な少なくともアミノ酸配列に対してコードするヌクレオチド配列またはその変位型を複製および発現することによって調製されうる。抗体としては、完全免疫グロブリンまたはそ
の断片を挙げることができ、免疫グロブリンとしては、様々なＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３、ＩｇＭ等の様々なクラスおよびイソタイプが挙げられる。その断片としては、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ’等を挙げることができる。加えて、特定の分子に対する結合親和性が維持されるのであれば、免疫グロブリンの凝集体、ポリマーおよび複合体、あるいはそれらの断片を適宜使用することが可能である。
特定の実施形態において、本発明は、予め選択された標的化学種を特異的に結合させるいくつかの選択的結合部分と、および予め選択されたレポータ部分の多数の複製物とをその表面に含むように誘導された適切な大きさのレポータ粒子を含有する新規の検出試薬を提供する。レポータ部分は、標準的な化学化学作用を利用してレポータ粒子の表面に共有結合される。
この増幅材料を利用する好ましい検出方法は、サンドイッチ免疫検定に用いられるのと類似している。特に、分析される試料は、対象の種に選択的かつ特異的に結合することが可能な捕獲相に曝され、捕獲相は、不溶材料上に固定される。次いで、標準的な手段を通じて、固定された検体から未結合材料を分離する。次いで、固定された検体を本発明の検出試薬に接触させる。検出試薬は、そこに取り入れた選択的結合部分を通じて、固定された検体に結合する。したがって、そのようにして形成された「サンドイッチ」構造（不溶基体−検体−検出試薬）は、不溶基体上に検出試薬を効果的に固定する。未結合の検出試薬を、標準的な方法によりこの固定された構造から分離することが可能である。固定された不溶基体−検体−検出試薬サンドイッチをレポータ部分とレポータ粒子の結合を破壊する手段に接触させて、レポータ部分を媒体中に放出させることによって、増幅を行うことが可能である。レポータ部分とレポータ粒子に最初に結合した選択的結合部分との数の比は、検出試薬の調製時に１より大きい数値に設定されうるため、粒子からのレポータ部分の放出により、媒体に浸入するレポータ分子の方が、不溶基体に結合した標的検体分子より多くなる。レポータ部分の化学的性質に合った任意の方法を用いて、放出されたレポータ部分の検出、および場合によっては定量を行うことが可能である。個々の標的検体の分子の検出によるレポータ部分の検出シグナルの著しい増幅により、極めて高感度で、信頼性があり、適応性のある化学検出検定が得られる。
特定の実施形態において、本発明の検出試薬は、標的化学物質または標的検体に特異的に結合する選択的結合部分と、予め選択された複数のレポータ部分とをその表面に含むように誘導された適切な大きさのレポータ粒子で構成される。レポータ粒子は、標的検体を含む試料に適合し、選択的結合部分およびレポータ部分の双方を結合することが可能な任意の材料でありうる。好適なレポータ粒子の例としては、金属、シリカ、酸化珪素およびポリスチレンが挙げられるが、それらに限定されない。
選択的結合化合物は、標的検体を選択的に認識し、標的検体と捕獲相の結合に緩衝することなく標的検体に結合することが可能な任意の化合物でありうる。好適な選択的結合化合物の例としては、抗体、酵素、タンパク質、オリゴヌクレオチドおよび無機化合物が挙げられるが、それらに限定されない。
レポータ粒子は、典型的にはナノメートルからマイクロメートル範囲の直径を有する機能的大きさで選択される。レポータ部分と、レポータ粒子に最初に結合する選択的結合部分との数の比は、本発明の検出試薬の調製時に１より大きい値に設定されうるため、粒子からのレポータ部分の放出により、媒体に浸入するレポータ部分の方が、レポータ粒子に結合した検体分子より多くなる。この比は、標的検体分子の検出によるシグナルの増幅率を定める。例えば、固定された検体の１つの分子に結合するレポータ部分の１，０００の複製物を担持する１つのレポータ粒子からレポータ部分を放出させると、１，０００の分
子のレポータ部分が、本来のサンドイッチにおける検体の分子毎に媒体中に現れることになる。これにより、標的検体によって表される化学シグナルが１，０００倍増幅される。レポータ粒子の表面積や、レポータ粒子の表面の選択的結合部分とレポータ部分の充填密度の比のようなパラメータを操作することによって、検出試薬の合成時に、この増幅を調節することが可能である。したがって、レポータ粒子の大きさは、放出されうるレポータ部分の数、および標識された標的分子に関して得られる最終的な増幅因子を規定する。例えば、１３ｎｍの金粒子は、レポータ部分として機能する２００のチオール化された表面オリゴマーを担持することができ、それにより、検出検定で形成されたサンドイッチ内の単一レポータ粒子に対して２００のレポータ部分の増幅因子を達成することが可能である。より大きいサイズ（例：マイクロメートルサイズの）粒子は、より大きい増幅因子になるのは明らかである。
レポータ部分は、好ましくは、検出方法のステップ中はレポータ部分の著しい非特異的放出を防ぐのに十分に強力であるが、同時に検出ステップの直前はレポータ部分の分離および放出を生じやすい手段によって、レポータ粒子の表面に結合される。好ましくは、レポータ部分は、検出ステップの直前に、固体支持体に添加される特定の試薬に接触すると破壊されうる二重結合を通じて、レポータ粒子の表面に結合される。二重結合を用いて、レポータ粒子にレポータ部分を固定する実施形態において、レポータ部分をレポータ粒子から放出させるのに使用される化学物質は、レポータ部分を変位させながらレポータ部分と優先的に結合または反応することによって、レポータ粒子の表面上にレポータ部分を効果的に配置させる分子である。
レポータ部分の例としては、蛍光体、発色団、蛍光体または発色団が、結合するかまたは結合していないオリゴヌクレオチド、酵素およびポルフィリン、脂質、炭水化物、合成ポリマー、および同位体または放射性標識のような標識を挙げることができるが、それらに限定されない。これらの化学物質は、チオール、二硫化物およびホスホリルチオレートの如き硫黄原子間の二重結合を通じてレポータ粒子に結合されうる。この場合、二重結合中の硫黄原子を優先的に結合させることによってレポータ部分を変位させる化学物質にレポータ粒子を接触させることにより、後の検出に向けてレポータ粒子を放出する。レポータ部分を効果的に変位させる化学物質は、他のチオール含有分子または二硫化物含有分子、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）およびメルカプトエタノール等のチオール結合を通じてレポータ粒子に優先的に結合することになる任意の分子を含む。同様に、水酸化ホウ素ナトリウムの如き還元剤は、レポータ部分を放出させる二硫化物結合を開裂させる。
本発明の具体的な実施形態において、レポータ部分および選択的結合化合物は、同じ化学物質である。例えば、好ましい実施形態において、レポータ部分および選択的結合化合物は、標的検体に相補的であり、レポータ粒子から除去された後に（例：オリゴヌクレオチドに存在する蛍光標識を通じて）追加的に検出されうる単一のオリゴヌクレオチドによって記述される。
本発明の検出方法の第１のステップにおいて、標的分子の存在について、分析試料を、抗体、オリゴヌクレオチド、レクチン、または対象の標的種に選択的かつ特異的に結合することが可能である同様の材料の如き捕獲相に接触させる。捕獲相は、化学検定に適合すると共に反応媒体から容易に分離されうる不溶材料に固定される。固定された捕獲相は、対象の検体を特異的に結合、捕獲、固定するが、好ましくは試料中に存在しうるあらゆる他の材料を結合させないように構成される。本発明の方法での使用に好適な不溶材料の例としては、マイクロタイタープレートのウェル、微粒子、繊維またはメンブレンフィルタ、あるいは当該不溶材料を挙げることができるが、それらに限定されない。
捕獲相は、好ましくは、検出試薬の選択的結合部分とは異なる検体上の決定基に結合するように選択される。次いで、例えばデンカンテーション、沈降、洗浄、遠心、またはこれらの方法の組合せを含む任意の好適な手段によって、固定された標的検体から未結合材料を分離する。この方法の正味の結果、対象の検体は、不溶材料の表面に精製および濃縮された状態で存在する。
本発明の方法の次にステップにおいて、固定された標的検体を、レポータ部分に結合するレポータ粒子、および少なくとも１つの選択的結合部分を含有する本発明の検出試薬に接触させる。選択的結合部分は、標的検体に特異的に結合し、検出試薬に結合する標的検体に結合した不溶基体を含む「サンドイッチ」構造を形成する。このサンドイッチ構造は、不溶基体に検出試薬を固定し、デカンテーション、沈降、洗浄、遠心、またはこれらの方法の組合せを含む任意の好適な方法によって、未結合検出試薬をこの固定構造から分離することが可能である。
本方法の他のステップにおいて、固定された不溶基体−標的検体−検出試薬サンドイッチを、レポータ部分をレポータ粒子から放出することが可能である化学物質を含む媒体に接触させることによって、標的検体の結合および検出によるシグナルを増幅する。次いで、放出されたレポータ部分は、上記に詳述したように標的検体に結合した検出試薬を取り囲む媒体に浸入する。
レポータ部分の化学的性質に合った任意の方法を用いて、放出されたレポータ部分の存在について、放出されたレポータ部分を含む媒体を分析することが可能である。例えば、蛍光標識されたレポータ部分を媒体の蛍光強度または蛍光消極の測定によって検出し、さらには定量することができるのに対し、適切なトリガ試薬を添加すると発生する発光を測定することによって、化学発光標識レポータの存在を判断することが可能である。オリゴヌクレオチドをベースとするレポータ部分を、ポリマー鎖反応によってさらに増幅するか、あるいは不溶基体に固定された相補的オリゴヌクレオチドによって捕獲し、核酸をベースとしたマイクロアレイと通常併用される方法を用いて検出、定量することが可能である。電気化学、インピーダンス、酵素および放射性検出を含む多くの他の選択肢も利用可能である。
したがって、特定の実施形態において、本発明は、それぞれが試料中の特異的結合相補体との特異的結合相互作用のための少なくとも２つの結合部位を有する、試料中の１つまたは複数の標的検体の存在を検出するための方法であって、
ａ）特定の標的検体の少なくとも第１の結合部位に結合する特定の標的検体の少なくとも１つの特異的結合相補体が結合した少なくとも１種類の捕獲基体を提供するステップと、
ｂ）（ｉ）特定の標的検体に対する少なくとも１つの特異的結合相補体と、（ｉｉ）場合によってはレポータ標識で標識される複数のＤＮＡバーコードとが結合した微粒子を含む少なくとも１種類の微粒子検出プローブを提供するステップであって、微粒子検出プローブに結合した特異的結合相補体は、標的検体の少なくとも第２の結合部位に結合するステップと、
ｃ）標的検体を捕獲基体上に固定するように、捕獲基体に結合した特異的結合相補体に対する特定の標的検体の結合を可能にするのに有効な条件下で、標的検体を含有すると思われる試料に捕獲基体を接触させるステップと、
ｄ）標的検体と、検体に対する微粒子検出プローブに結合した特異的結合相補体との結合を可能にし、捕獲基体上の標的検体の存在下で複合体を形成するのに有効な条件下で、少なくとも１種類の微粒子検出プローブに、固定された標的検体を接触させるステップと、
ｅ）場合によって、捕獲基体を分離し、洗浄して、未結合の微粒子検出プローブを除去
するステップと、
ｆ）試料中の特定の標的検体の存在を示すＤＮＡバーコードの存在を検出するステップと、を含む方法を提供する。
別の実施形態において、本発明は、それぞれが試料中の特異的結合相補体との特異的結合相互作用のための少なくとも２つの結合部位を有する、試料中の１つまたは複数の標的検体の存在を検出するための方法であって、
ａ）特定の標的検体の少なくとも第１の結合部位に結合する特定の標的検体の少なくとも１つの特異的結合相補体が結合した少なくとも１種類の磁性基体を提供するステップと、
ｂ）（ｉ）特定の標的検体に対する少なくとも１つの特異的結合相補体と、（ｉｉ）蛍光標識した複数のＤＮＡバーコードとが結合した微粒子を含む少なくとも１種類の微粒子検出プローブを提供するステップであって、微粒子検出プローブに結合した特異的結合相補体は、標的検体の少なくとも第２の結合部位に結合するステップと、
ｃ）標的検体を磁性基体上に固定するように、磁性基体に結合した特異的結合相補体に対する特定の標的検体の結合を可能にするのに有効な条件下で、標的検体を含有すると思われる試料に磁性基体を接触させるステップと、
ｄ）標的検体と、検体に対する微粒子検出プローブに結合した特異的結合相補体との結合を可能にし、磁性基体上の標的検体の存在下で複合体を形成するのに有効な条件下で、少なくとも１種類の微粒子検出プローブに、固定された標的検体を接触させるステップと、
ｅ）場合によって、磁性基体を分離し、洗浄して、未結合の微粒子検出プローブを除去するステップと、
ｆ）試料中の特定の標的検体の存在を示すＤＮＡバーコードからの蛍光シグナルの存在を検出するステップと、を含む方法を提供する。
さらなる実施形態において、本発明は、それぞれが試料中の特異的結合相補体との特異的結合相互作用のための少なくとも２つの結合部位を有する、試料中の１つまたは複数の標的検体の存在を検出するための方法であって、
ａ）特定の標的検体の少なくとも第１の結合部位に結合する特定の標的検体の少なくとも１つの特異的結合相補体が結合した少なくとも１種類の磁性基体を提供するステップと、
ｂ）（ｉ）特定の標的検体に対する少なくとも１つの特異的結合相補体と、（ｉｉ）蛍光標識した複数のＤＮＡバーコードとが結合した微粒子を含む少なくとも１種類の微粒子検出プローブを提供するステップであって、微粒子検出プローブに結合した特異的結合相補体は、標的検体の少なくとも第２の結合部位に結合するステップと、
ｃ）標的検体を磁性基体上に固定するように、磁性基体に結合した特異的結合相補体に対する特定の標的検体の結合を可能にするのに有効な条件下で、標的検体を含有すると思われる試料に磁性基体を接触させるステップと、
ｄ）標的検体と、検体に対する微粒子検出プローブに結合した特異的結合相補体との結合を可能にし、磁性基体上の標的検体の存在下で複合体を形成するのに有効な条件下で、少なくとも１種類の微粒子検出プローブに、固定された標的検体を接触させるステップと、
ｅ）場合によって、磁性基体を分離し、洗浄して、未結合の微粒子検出プローブを除去するステップと、
ｆ）分離、洗浄された磁性基体に、ＤＮＡバーコードを剥離させるのに有効な条件を施すステップと、
ｇ）試料中の特定の標的検体の存在を示すＤＮＡバーコードの蛍光シグナルの存在を検出するステップと、を含む方法を提供する。
さらに別の実施形態において、本発明は、それぞれが試料中の特異的結合相補体との特異的結合相互作用のための少なくとも２つの結合部位を有する、試料中の１つまたは複数の標的検体の存在を検出するための方法であって、
ａ）特定の標的検体の少なくとも第１の結合部位に結合する特定の標的検体の少なくとも１つの特異的結合相補体が結合した少なくとも１種類の磁性基体を提供するステップと、
ｂ）（ｉ）特定の標的検体に対する少なくとも１つの特異的結合相補体と、（ｉｉ）レポータ標識を含む複数のＤＮＡバーコードとが結合した微粒子を含む少なくとも１種類の微粒子検出プローブを提供するステップであって、微粒子検出プローブに結合した特異的結合相補体は、標的検体の少なくとも第２の結合部位に結合するステップと、
ｃ）標的検体を磁性基体上に固定するように、磁性基体に結合した特異的結合相補体に対する特定の標的検体の結合を可能にするのに有効な条件下で、標的検体を含有すると思われる試料に磁性基体を接触させるステップと、
ｄ）標的検体と、検体に対する微粒子検出プローブに結合した特異的結合相補体との結合を可能にし、磁性基体上の標的検体の存在下で複合体を形成するのに有効な条件下で、少なくとも１種類の微粒子検出プローブに、固定された標的検体を接触させるステップと、
ｅ）場合によって、磁性基体を分離し、洗浄して、未結合の微粒子検出プローブを除去するステップと、
ｆ）分離、洗浄された磁性基体に、ＤＮＡバーコードを剥離させるのに有効な条件を施すステップと、
ｇ）試料中の特定の標的検体の存在を示すＤＮＡバーコードのレポータ標識の存在を検出するステップと、を含む方法を提供する。
さらなる実施形態において、本発明は、それぞれが試料中の特異的結合相補体との特異的結合相互作用のための少なくとも２つの結合部位を有する、試料中の１つまたは複数の標的検体の存在を検出するための方法であって、
ａ）特定の標的検体の少なくとも第１の結合部位に結合する特定の標的検体の少なくとも１つの特異的結合相補体が結合した少なくとも１種類の捕獲基体を提供するステップと、
ｂ）（ｉ）特定の標的検体に対する少なくとも１つの特異的結合相補体と、（ｉｉ）場合によってはレポータ標識で標識される複数のＤＮＡバーコードとが結合した微粒子またはナノ粒子を含む、少なくとも１種類の粒子検出プローブを提供するステップであって、粒子検出プローブに結合した特異的結合相補体は、標的検体の少なくとも第２の結合部位に結合するステップと、
ｃ）標的検体を捕獲基体上に固定するように、捕獲基体に結合した特異的結合相補体に対する特定の標的検体の結合を可能にするのに有効な条件下で、標的検体を含有すると思われる試料に捕獲基体を接触させるステップと、
ｄ）標的検体と、検体に対する粒子検出プローブに結合した特異的結合相補体との結合を可能にし、捕獲基体上の標的検体の存在下で複合体を形成するのに有効な条件下で、少なくとも１種類の粒子検出プローブに、固定された標的検体を接触させるステップと、
ｅ）場合によって、捕獲基体を分離し、洗浄して、未結合の粒子検出プローブを除去するステップと、
ｆ）化学剥離剤によって、ＤＮＡバーコードを粒子検出プローブから剥離させるステップと、
ｇ）試料中の特定の標的検体の存在を示すＤＮＡバーコードの存在を検出するステップと、を含む方法を提供する。
特定の実施形態において、本発明の方法は、標的検体を固定した後で、捕獲基体を粒子検出プローブに接触させる前に、捕獲基体を洗浄するステップをさらに含むことが可能で
ある。
標的検体は、タンパク質またはハプテンであり、その特異的結合相補体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を含む抗体でありうる。標的検体は、核酸分子でもありうる。
微粒子を複数のＤＮＡバーコードで標識することが可能である。
別の実施形態において、本発明の方法は、前記検出ステップの前で、前記分離および洗浄ステップの後に、微粒子検出プローブからＤＮＡバーコードを剥離させるのに有効な条件を複合体に施すステップと、前記検出の前に、場合によってＤＮＡバーコードを増幅させるステップとを含むことが可能である。
前記検出の前に、放出されたＤＮＡバーコードを基体に固定することが可能である。
ＤＮＡバーコードは、微粒子に直接結合させるか、または任意の結合部分を通じて微粒子に結合させることが可能である。微粒子は、それに結合したオリゴヌクレオチドをさらに備えることが可能であり、ＤＮＡバーコードを、微粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に対してハイブリダイズすることが可能である。
本発明の方法に使用される微粒子は、ポリマー（ポリスチレン等）、ガラス、金属、半導体またはセラミックでありうる。
特異的結合対は、例えば、抗体および抗原、受容体およびリガンド、酵素および競合的阻害剤、薬物および標的分子、または少なくとも部分的に相補的なオリゴヌクレオチドでありうる。
特定の実施形態において、ＤＮＡバーコードは、ビオチン化、放射性標識、または蛍光標識される。
標的検体は、３つ以上の結合部位を有することが可能である。場合によって、その第１の結合部位に加えて、第２の結合部位を含むように標的検体を修飾することが可能である。
いくつかの実施形態において、本発明の方法で少なくとも２種類の微粒子検出プローブを提供し、第１の種類のプローブは、標的検体上の第１の結合部位に対する特異的結合相補部分を有し、第２の種類のプローブは、プローブ上の第２の結合部位に対する特異的結合相補部分を有する。
場合によって、それぞれが標的検体上の異なる結合部位に対する特異的結合相補部分を有する複数の微粒子検出プローブを提供する。
特異的結合相補体および標的検体は、特異的結合対の構成要素でありうる。「特異的結合対の構成要素」は、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、ポリペプチド、抗体、抗原、炭水化物、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬物、ウイルス、多糖類、脂質、リポ多糖、糖タンパク質、リポタンパク質、核タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗体、免疫グロブリン、アルブミン、ヘモグロビン、凝固因子、ペプチドおよびタンパク質ホルモン、非ペプチドホルモン、インターロイキン、インターフェロン、サイトカイン、腫瘍に特異的なエピトープを含むペプチド、細胞、細胞表面分子、微生物、微生物の断片、部分、成分または生成物、小有機分子、核酸およびオリゴヌクレオチド、上記の物質のいずれかの代謝物質または抗体を含むことが可能である。核酸およびオリゴヌクレオチドは、遺伝子、ウイルスＲＮＡおよびＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、真菌ＤＮＡ、哺乳類ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、一本鎖および二本鎖核酸、ならびに天然および合成核酸を含む。
標的検体および特異的結合相補体の非限定的な例を以下に示す。標的検体は、核酸であり、特異的結合相補体は、オリゴヌクレオチドでありうる。標的検体は、タンパク質またはハプテンであり、特異的結合相補体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を含む抗体でありうる。標的検体は、ゲノムＤＮＡ試料からの配列であり、特異的結合相補体は、ゲノム配列の少なくとも一部に相補的である配列を有するオリゴヌクレオチドでありうる。ゲノムＤＮＡは、真核、細菌、真菌またはウイルスＤＮＡでありうる。標的検体は、真核ＤＮＡ試料からの配列であり、特異的結合相補体は、真核ＤＮＡ配列の少なくとも一部に相補的である配列を有するオリゴヌクレオチドでありうる。特異的結合相補体および標的検体は、抗体−リガンド対の構成要素でありうる。
上述のように、かつ本開示を通じて、「捕獲基体」は、検体を固定することが可能である任意の不溶材料でありうる。本発明に用いられる「捕獲基体」は、試料からの標的検体を捕獲し、これらの捕獲された標的検体（検出プローブによる処理前および後のいずれも）を試料から分離しやすくすることが可能である。当該基体は、典型的には検体に比べて物理的に大きく、好ましくは試料に不溶である。特定の場合において、本発明の方法は、磁性基体に磁場を印加することによって分離されうる、本明細書に記載されている磁性基体の使用を含む。
本発明の方法におけるさらなる分離ステップは、当業者に知られている任意の分離方法を含むことが可能である。例えば、分離方法としては、濾過、沈降、浮揚、流動または勾配法が挙げられる。濾過ステップは、例えば、ＤＮＡバーコードを含まない試料成分を除去する膜を含むことが可能である。
上記、かつ本開示の他の個所に記載されているように、表面に対するバーコードの結合を破壊する化学剥離剤によって、ＤＮＡバーコードを、それらが結合された微粒子から剥離させることができる。本明細書に記載されている当該薬剤としては、他のチオールまたは二硫化物含有分子、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスルトール（ＤＴＥ）およびメルカプトエタノール等のチオール結合を通じて微粒子に優先的に結合する任意の分子、および二硫化物結合を開裂させることにより、ＤＮＡバーコードを、それらが結合した微粒子から剥離させる水素化ホウ素ナトリウムの如き還元剤が挙げられるが、それらに限定されない。
バーコードを微粒子に結合させたオリゴヌクレオチドからＤＮＡバーコードを脱ハイブリダイズする条件にバーコードに曝すことによって、ＤＮＡバーコードを微粒子から剥離させることも可能である。
本明細書に記載されているように、バーコードは検出可能なレポータ基で標識することが可能である。当該レポータ基としては、蛍光体、発色団、酸化還元基、電気特性を有する基、放射性基、触媒基またはラマン標識が挙げられるが、それらに限定されない。
ラマン標識は、異なるラマン散乱スペクトルを有するいくつかの分子のいずれか１つでありうる。酵素免疫検定で使用される酵素と異なり、これらの標識種は、必要に応じて化学修飾することができる安定で、単純で安価な分子である。以下の属性は、この用途における標識の効果を高める。（ａ）レーザ励起波長付近で強い吸収帯（吸光度は１０４付近）。（ｂ）特異的結合構成要素に対する共有結合を可能にする官能基。（ｃ）光安定性。（ｄ）ナノグラム以下の範囲における検体の検出を可能にする十分な表面および共鳴強化。（ｅ）標識特異的結合構成要素と非標識特異的結合構成要素との間の結合相互作用における干渉が最小限にとどめられる。（ｆ）用いられる励起波長における強い蛍光発光の露出が最小限にとどめられる。（ｇ）いくつかの強度ピークを伴う比較的単純な散乱パター
ン、および／または（ｈ）互いに干渉しないため、いくつかの指標分子を同時に分析することができる散乱パターンを有する標識。
これらのラマン活性標識のすべてではないが、いくつかの潜在的な候補としては、４−（４−アミノフェニルアゾ）フェニルアルソン酸一ナトリウム塩、アルセナゾＩ、塩基性フクシン、シカゴスカイブルー、ダイレクトレッド８１、ディスパースオレンジ３、ＨＡＢＡ（２−（４−ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸）、エリスロシンＢ、トリパンブルー、ポンソーＳ、ポンソーＳＳ、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、クレシルバイオレットおよびｐ−ジメチルアミノアゾベンゼンが挙げられる。選択した標識を対象の特異的結合構成要素に共有結合させるか、または結合もしくは会合させることができる。
本発明の重要な態様は、多重ラマン標識を粒子に結合させて、異なる粒子に索引を付けるための多重コード化ラマン標識を提供することができる。したがって、本発明は、多重ラマン色素、ならびにＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体、抗原、および粒子に結合した小分子等の特異的結合基体を有する試薬を含む。粒子をベースとした検出プローブについては、ラマン標識または色素を直接または間接的に粒子に結合させることが可能である。ラマン標識を官能基、例えば金属ナノ粒子の如き粒子の表面に結合できるチオール、アミンまたはホスフィンで修飾することが可能である。望まれる場合は、ナノ粒子安定性を高めるためのオリゴヌクレオチド（例：ポリアデノシンおよびポリチミジン）の如き分子、または特異的結合対構成要素（核酸標的、または特定のリガンドのための受容体の少なくとも一部に相補的である配列を有するオリゴヌクレオチド等）でラマン色素をさらに機能化することが可能である。あるいは、ラマン標識を、粒子に結合させるための官能基を担持する分子または任意のリンカー、例えばポリＡまたはポリＴオリゴヌクレオチドと共役させることが可能である。例えば、本願明細書に援用する２００３年５月７日出願の米国特許出願番号第１０／４３１，３４１号に記載されているように、ラマン標識を検出することが可能である。
本明細書で提示している実施例１−１０は、臨床標本、環境試料、工業工程の流れ試料、または標的検体を潜在的に含有する他の当該媒体における非常に低濃度の多数の異なる標的検体を同時に検出し、場合によっては定量する能力を実証する。実施例１１および１２では、より高い濃度と同様に濃度のより少ない異なる標的検体をより迅速に検出する能力を実証する。具体的には、実施例１１および１２では、該方法の有利な感度を維持しながらより簡単な様式で該方法を用いることを可能にする、実施例１−１０に提示され、記載された方法の改造型を提示する。当該改造型方法は、代替的な検出技術の利用を容易にする。
より簡単な様式の１例は、実施例１−１０に記載されている方法の範囲内にある数十から数百ではなく、ごく少量、典型的には１−１０の標的検体の同時検出を必要とする。この場合、実施例１１および１２は、実施例１−１０に記載されているように検出の前にオリゴヌクレオチドを回収／分離することによるのではなく、検出プローブのオリゴヌクレオチドに結合された蛍光標識の放射波長に基づいて、標的検体の差別化および識別を便利に行う。また、本明細書に記載されている方法は、本発明の特定の末端使用に応じて、基体と標的抗原と検出プローブの間に形成された三成分サンドイッチ上で検出ステップを直接実施することを可能にする。実施例１−１０で実施されるオリゴヌクレオチドの回収および分離をより高速かつ簡単な様式でエミュレートするように、これらの方法をさらに拡張することが可能である。
本発明の方法は、標的が、互いに異なり、標的検体を含有する媒体中に存在するすべての他の材料から標的検体を区別することを可能にする少なくとも第１および第２の特徴を
有することを必要とする。例示を目的として、標的検体はタンパク質であり、異なる特徴は、それぞれが対応する抗体によって選択的に結合されうる異なるエピトームであると想定される。しかし、以降において本明細書に記載されている特異的結合相補体および結合対構成要素とも称するそれらの種類の特徴および相補的化学結合部分のいずれもこれらの改良型の実施において同様に利用できる。媒体に存在しうる多数の標的検体を検出することが望まれる場合は、１つの好ましい構成は、同じ媒体に存在しうる他の標的検体のすべてを特徴づける特異的特徴の対とは異なるように存在しうる標的検体のいずれか１つを特徴づける特異的特徴の対を対象とする。あるいは、１つの特異的特徴は、存在しうる標的検体の全てに対して同じでありうるのに対して、第２の特異的特徴は、それぞれの標的検体に特有のものである。いずれの場合も、媒体に存在しうる他の材料は、標的検体に伴ういずれの特異的特徴も有さないことが望ましい。
加えて、本発明の方法は、それぞれの標的検体上の第１の特徴に対応する相補的化学結合部分が結合される基体を利用する。本明細書に記載されている特定の方法において、標的検体の第１の特徴を結合する相補的化学結合部分を担持する個別の基体を標的検体毎に設ける。本発明は、追加的な基体構成の使用をさらに可能にする方法をも提供する。１つの当該構成において、標的検体のそれぞれに対応する相補的な化学結合部分を同じ基体に結合させる。他の当該構成において、標的検体のそれぞれの第１の特徴に対応する相補的な化学結合部分を、１つの標的検体に対応する相補的化学結合部分が、他の標的検体に対応する相補的化学結合部分である基体の異なる空間領域に局在化されるように、同じ基体に結合させるこれらの代替の構成はいくつかの使用および本発明の実施に有益である。
本発明の方法に使用される基体は、主な３つの目的を果たす。１つの目的は、標的検体を選択的に固定することができるが、標的検体ではない媒体中の材料は固定されない表面を提供することである。これは、標的検体の第１の特徴に対応する相補的化学結合部分を基体の表面に結合させ、標的検体が、相補的化学結合部分に結合し、基体の表面に固定することを可能にすることによって達成される。第２の目的は、基体の表面に固定された標的検体の媒体からの分離を容易にすることである。本発明の特定の実施形態において、基体は、磁界の印加によって、その表面に結合した任意の材料とともに媒体から分離されうる磁性材料で構成されうる。基体を媒体から分離する多くの他の手段は、知られており、同様に採用されうる。多くの可能な実例の２つは、媒体より多少高密度であるため、それぞれ沈降または浮揚により媒体から分離させることが可能である材料で構成される基体、および濾過によって媒体から分離できるほど十分に大きい基体である。基体は、本明細書に記載されている媒体に懸濁可能でありうる。あるいは、本発明の方法は、異なる相補的化学結合部分を含む空間的に分離された領域が形成されうる顕微鏡スライドを含むが、それに限定されない巨視的な基体の使用の恩恵を受けることができる。本発明の第３の目的は、標的検体を結合する能力により、基体の表面における標的検体の局所的濃度を、媒体中の標的検体の濃度より高くすることである。まとめると、これらの３つの目的は、検体の感度および特異性を著しく向上させ、あらゆる特定の用途または目的に対する本発明の最適な実施態様を選択することができる広範な選択肢を提供する。
本明細書に記載されている方法は、標的検体の第２の特徴および複数のオリゴヌクレオチドついに選択的に結合する相補的化学結合部分が結合される直径が約１０から５０ｎＭの金微粒子を備える検出プローブを利用することが可能である。特定の検出プローブが応答する標的検体の識別情報を、金ナノ粒子に結合されたオリゴヌクレオチドの塩基配列でコードすることが可能である。特定の標的検体の識別情報をコードするオリゴヌクレオチドは、不定的に標的検体に対する「バーコード」または「バイオバーコード」と呼ばれてきた。
特定の実施形態において、本発明の方法は、本明細書に記載されている金ナノ粒子を利
用する方法の感度を維持しながら、代替的に、以下に記載されるような検出プローブを利用することができる。特に、球状粒子の表面積は、その直径の平方として測定される。直径１マイクロメートルの球体の表面積は、例えば、直径３０ｎＭの粒子の表面積の約１１００倍である。このことは、直径１マイクロメートルの粒子は、３０ｎＭの粒子に比べて約１１００倍のオリゴヌクレオチドを収容することが可能であり、これらの発明における測定可能なシグナルは、このオリゴヌクレオチドの数の関数であるため、１マイクロメートルの粒子を使用して構成された検出プローブは、３０ｎＭの粒子から入手可能な測定可能シグナルに比べて結合事象当たり約１１００倍の測定可能シグナルをもたらすことが期待できる。より大きい粒子を使用することによるこの「利得」または「増幅」の増加により、感度を犠牲にすることなく、分析手順を著しく単純化させることが可能になる。しかし、粒子の拡散率、ならびにそれらが検出対象の標的検体に接触する頻度、および存在する標的検体の特定の部分との結合を達成するのに必要とされる時間は、その直径に反比例する。したがって、これらの結合事象に利用可能な時間は、採用できる最大の粒径に実用的な制限を課すが、本発明の特定の用途または実施態様によって課される時間的制限を満たす。したがって、特定の用途または実施態様に対する最適な粒径は、先述の要因間のバランスによって決定づけられ、典型的には０．５から５．０マイクロメートルの範囲にある。
１マイクロメートル（１０００ｎＭ）のポリスチレン微粒子を採用することを除いて、１種類の検出プローブを、３０ｎＭの金粒子に基づいて先述のプローブと同様に構成することが可能である。第２の種類の検出プローブは、ごく少数の標的検体の存在を同時に判断しようとするときに特定の有用性を有する。第２の種類のこれらの検出プローブは、オリゴヌクレオチドに結合した「検出可能物体」の特性において標的検体の識別情報をコードし、次にそれが、オリゴヌクレオチドを備えた塩基の配列ではなくプローブ粒子に結合する。この文脈において、「検出可能な物体」とは、例えば、蛍光体の放射波長でコード化される標的検体の識別情報を有する蛍光体であってもよい。他の好適な検出可能な物体としては、放射性同位体、電気化学活性種、ラマン活性種および化学発光種等を挙げることができるが、それらに限定されない。この種類の検出プローブは、流動血球測定法の検出、および標的検体の原位置検出に特に好適である。第３の種類の検出プローブは、検出可能な物体を担持するオリゴヌクレオチドを、微粒子から化学的に開裂して、溶液中での検出を容易にすることをさらに可能にする。これらの改良検出プローブは、特定の用途または目的に対して本発明の実施態様を最適化するためのさらなる選択肢を提供する。
本発明は、試料中の多数の検体を検出するための生化学バーコードとしてオリゴヌクレオチドを利用する方法に関する。その手法は、ナノ粒子で直接または間接的に機能化された認識要素（例：タンパク質または核酸）、および金ナノ粒子の凝集をもたらすハイブリダイゼーション事象は、それらの物理特性（例：光学、電気、機械特性）を著しく変化させうるという従来の知見を利用している８−１２。全体的な考え方は、個別的かつ調節可能なハイブリダイゼーションおよび溶融特性、ならびに溶解すると変化して、多検体検定における一連の検体をデコードするナノ粒子に伴う物理特性により、それぞれの認識要素を異なるオリゴヌクレオチド配列（ＤＮＡバーコード）に対応づけることができることである。したがって、多検体検定において、ＤＮＡ結合凝集体の溶融温度、および溶融すると変化して、多検体検定における一連の検体をデコードするナノ粒子に伴う物理特性を利用することが可能である。本明細書におけるバーコードは、ナノロッド２３、蛍光体標識ビーズ２４および量子ロッド２５との如き物理的診断マーカに基づくものとは、デコード情報が、予め設計されたオリゴヌクレオチド配列に格納された化学情報の形をとる点において異なっている。
本発明は、一試料中の様々な生体分子、例えば単一または多数の多価タンパク質を検出するように、オリゴヌクレオチドで強力に機能化されたナノ粒子プローブ（好ましくは金
ナノ粒子プローブ）に対するいくつかの広く適用可能な手法を提供する。特に、一試料中の多数のタンパク質を検出するための知られている方法は、複雑で、しばしば時間がかかり、高価な検定プロトコルである。この点において、他の方法では、一溶液中の多数のタンパク質標的を認識するために、蛍光体標識ペプチド核酸およびＤＮＡマイクロアレイが使用されてきた１５−１７。しかし、この方法は、オリゴヌクレオチドで標識されたタンパク質のマイクロアレイ表面への結合に依存する。本明細書に記載されている方法の最後のステップは、通常のＤＮＡの表面化学作用に専ら基づくものである。したがって、そのステップは、最新技術のナノ粒子ＤＮＡ検出方法の高感度な側面の多くを取り入れることが可能であるが９、１１、検出事象中に存在するタンパク質を有することなく、ＤＮＡではなくタンパク質の如き様々な生体分子を検出することを可能にする。表面検定については、タンパク質は、典型的には、固体の支持体に対するより強い非特異的結合を示す傾向があるため、短いオリゴヌクレオチドに対して作用することがより困難であり、しばしばより高いバックグラウンドシグナルをもたらす。最後に、均質検定については、これらのナノ粒子構造に伴う異常にシャープな溶融プロフィルは、通常の広いＤＮＡ溶融挙動を示すプローブによって可能なものより多くのバイオバーコードを設計することを可能にする。
本発明は、検出検定での使用に好適なオリゴヌクレオチドが結合した任意の好適な粒子の使用を想定している。しかし、本発明を実施する上で、微粒子およびナノ粒子が好ましい。粒子の径、形状および化学組成は、ＤＮＡバーコードを含む得られるプローブの特性に寄与することになる。これらの特性としては、光学特性、光電子特性、電気化学特性、電子特性、様々な溶液における安定性、孔およびチャネルサイズのばらつき、およびフィルタとして作用しながら生体活性分子を分離する能力等が挙げられる。異なる粒径、形状および／または化学組成を有する粒子の混合物の使用、ならびに均一の粒径、形状および化学組成を有するナノ粒子の使用が想定される。好適な粒子の例としては、ナノおよびマイクロサイズのコア粒子、凝集粒子、等方性粒子（球状粒子）および異方性粒子（非球状ロッド、四面体および角柱）、ならびに全体を本願明細書に援用する、２００２年１２月２８日に出願された米国特許出願第１０／０３４，４５１、および２００２年１２月２８日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／５０８２５号に記載されている粒子の如きコアシェル粒子が挙げられるが、それらに限定されない。本発明を実施する上で、検出プローブは、好ましくは、実際の検定を実施する前に生成される。あるいは、検定を実施しながら、検出プローブを原位置で生成することもできる。
したがって、本発明の１実施形態において、ナノ粒子複合体プローブが提供される。本発明の実施に有用なナノ粒子としては、金属（例：金、銀、銅および白金）、半導体（例：ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、およびＺｎＳが塗布されたＣｄｓまたはＣｄＳｅ）および磁性（例：強磁性）コロイド材料が挙げられる。本発明の実施に有用な他のナノ粒子としては、ＺｎＳ、ＺｎＯ、ＴｉＯ２、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓおよびＧａＡｓが挙げられる。ナノ粒子の粒径は、好ましくは約５ｎｍから約１５０ｎｍ（平均直径）、より好ましくは約３０から約１００ｎｍ、最も好ましくは約４０から約８０ｎｍである。本発明の微粒子の粒径は、好ましくは約１μｍから約１５０μｍ（平均直径）、好ましくは約１μｍから約５０μｍ、最も好ましくは約１μｍである。本発明の方法で使用される微粒子またはナノ粒子の粒径をそれらの特定の用途または応用により必要に応じて変更することが可能である。粒径の変更を有利に利用して、ナノ粒子の特定の物理特性、例えば誘導可能な光学特性または量および表面積を最適化することが可能であるナノ粒子はまたロッド、プリズムあるいは四面体でありうる。
金属、半導体および磁性ナノ粒子の製造方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、Ｓｃｈｍｉｄ，Ｇ（編）、Ｃｌｕｓｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｏｌｌｏｉｄｓ（ＶＣＨ
、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、１９９４）；Ｈａｙａｔ，Ｍ．Ａ．（編）Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｇｏｌｄ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９１）；Ｍａｓｓａｒｔ，Ｒ．の論文、ＩＥＥＥ Ｔａｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ Ｏｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、１７、１２４７（１９８１）；Ａｈｍａｄｉ，Ｔ．Ｓ．らの論文、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７２、１９２４（１９９６）；Ｈｅｎｇｌｅｉｎ，Ａ．らの論文、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、９９、１４１２９（１９９５）；およびＣｕｒｔｉｓ，Ａ．Ｃ．らの論文、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、２７、１５３０（１９８８）を参照されたい。
ＺｎＳ、ＺｎＯ、ＴｉＯ２、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓおよびＧａＡｓがナノ粒子の製造方法も当該技術分野でよく知られている。例えば、Ｗｅｌｌｅｒの論文、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３２、４１（１９９３）；Ｈｅｎｇｌｅｉｎの論文、Ｔｏｐ．Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．、１４３、１１３（１９８８）；Ｈｅｎｇｌｅｉｎの論文、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、８９、１８６１（１９８９）；Ｂｒｕｓの論文、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ａ．、５３、４６５（１９９１）；Ｂａｈｎｃｍａｎｎの論文、「光化学変換および太陽エネルギーの保存」（Ｐｅｌｉｚｅｔｔｉ ａｎｄ Ｓｃｈｉａｖｅｌｌｏ編、１９９１）、２５１頁；Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｈｅｒｒｏｎ、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、９５、５２５（１９９１）；Ｏｌｓｈａｖｓｋｙらの論文、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１２、９４３８（１９９０）；およびＵｓｈｉｄａらの論文、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、９５、５３８２（１９９２）を参照されたい。
好適なナノ粒子は、例えば、Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ，Ｉｎｃ．（金）、Ａｍｅｒｓｈａｍ
ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（金）およびＮａｎｏｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（金）からも市販されている。
現在では、核酸の検出に使用するには金ナノ粒子が好ましい。金コロイド粒子は、美しい色を発する帯域に対して高い吸光度を有する。これらの強い色は、粒径、濃度、粒子間距離、ならびに凝集体の凝集規模および形状（幾何学構造）に応じて変化するため、これらの材料は、比色検定にとって特に魅力的になっている。例えば、金ナノ粒子に結合されたオリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドおよび核酸とハイブリダイズすると、裸眼に見える即座の色変化が生じる（例：実施例を参照）。
ナノ粒子、オリゴヌクレオチドまたは双方は、ナノ粒子にオリゴヌクレオチドを結合させるために機能化される。当該方法は、当該技術分野で知られている。例えば、その３’−末端または５’−末端がアルカンチオールで機能化されたオリゴヌクレオチドは、金ナノ粒子に容易に結合する。Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓの論文、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ
ｔｈｅ Ｒｏｂｅｒｔ Ａ．Ｗｅｌｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ３９ｔｈ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎａｎｏｐｈａｓｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（テキサス州Ｈｏｕｓｔｏｎ）、１０９〜１２１頁（１９９５）を参照されたい。また、Ｍｕｃｉｃらの論文、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．５５５−５５７（１９９６）（平坦な金の表面に３’チオールＤＮＡを結合させる方法が記載されている。この方法を用いて、オリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合させることが可能である）。アルカンチオール法を用いて、オリゴヌクレオチドを他の金属、半導体および金属コロイド、および上記の他のナノ粒子に結合させることも可能である。オリゴヌクレオチドを固体表面に結合させるための他の官能基としては、ホスホロチオエート基（例：オリゴヌクレオチド−ホスホロチオエートの金表面への結合についての米国特許第５，４７２，８８１号を参照）、および置換アルキルシロキサン（例：オリゴヌクレオチドのシリカおよびガラス表面への結合についてのＢｕｒｗｅｌｌの論文、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４、３７０〜３７７（１９７４）およびＭａｔｔｅｕｃｃｉおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ
の論文、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０３、３１８５−３１９１（１９８１）、ならびにアミノアルキルシロキサンの結合およびメルカプトアルキルシロキサンの同様の結合についてのＧｒａｂａｒらの論文、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、６７、７３５−７４３を参照）が挙げられる。オリゴヌクレオチドを固体表面に結合させるために、５’チオヌクレオシドまたは３’チオヌクレオシドを末端とするオリゴヌクレオチドを使用することもできる。以下の参考文献には、オリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合させるのに採用できる他の方法が記載されている。Ｎｕｚｚｏらの論文、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０９、２３５８（１９８７）（金上のジスルフィド）；ＡｌｌａｒａおよびＮｕｚｚｏ、Ｌａｎｇｍｕｉｒの論文、１、４５（１９８５）（アルミニウム上のカルボン酸）；ＡｌｌａｒａおよびＴｏｍｐｋｉｎｓの論文、Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ．、４９、４１０−４２１（１９７４）（銅上のカルボン酸）；Ｉｌｅｒの論文、「シリカの化学」、第６章（Ｗｉｌｅｙ １９７９）（シリカ上のカルボン酸）；ＴｉｍｍｏｎｓおよびＺｉｓｍａｎの論文、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ、６９、９８４−９９０（１９６５）（白金上のカルボン酸）；ＳｏｒｉａｇａおよびＨｕｂｂａｒｄの論文、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０４、３９３７（１９８２）（白金上芳香族環化合物）；Ｈｕｂｂａｒｄの論文、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．、１３、１７７（１９８０）（白金上のスルホラン、スルホキシドおよび他の機能化溶媒）；Ｈｉｓｃｋｍａｎらの論文、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１１、７２７１（１９８９）（白金上イソニトリル）；ＭａｏｚおよびＳａｇｉｖの論文、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、３、１０４５（１９８７）（シリカ上のシラン）；ＭａｏｚおよびＳａｇｉｖの論文、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、３、１０３４（１９８７）（シリカ上のシラン）；Ｗａｓｓｅｒｍａｎらの論文、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、５、１０７４（１９８９）（シリカ上のシラン）；ＥｌｔｅｋｏｖａおよびＥｌｔｅｋｏｖの論文、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、３、９５１（１９８７）（二酸化チタンおよびシリカ上の芳香族カルボン酸、アルデヒド、アルコールおよびメトキシ基）；およびＬｅｃらの論文、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、９２、２５９７（１９８８）（金属上の硬質リン酸塩）。
本発明の本実施形態の１態様において、少なくとも二種類のオリゴヌクレオチドで標識されたデンドリマーと結合したナノ粒子が提供される。樹状分子は、多数の分枝単位モノマーで構成された構造体であり、様々な用途に使用される。例えば、Ｂａｒｔｈらの論文、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５：５８−６６（１９９４）；Ｇｉｔｓｏｖ ＆ Ｆｒｅｃｈｅｔの論文、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２６：６５３６−６５４６（１９９３）；Ｈａｗｋｅｒ ＆ Ｆｒｅｃｈｅｔの論文、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：７６３８−７６４７（１９９０ａ）；Ｈａｗｋｅｒ ＆ Ｆｒｅｃｈｅｔの論文、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２３：４７２６−４７２９（１９９０ｂ）；Ｈａｗｋｅｒらの論文、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１：１２８７−１２９７（１９９３）；Ｌｏｃｈｍａｎｎらの論文、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５−７０４３−７０４４（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒらの論文、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１０１８−１０２５（１９９２）；Ｍｏｕｓｙらの論文、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２５：２４０１−２４０６（１９９２）；Ｎａｙｌｏｒらの論文、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３３９−２３４１（１９８９）；Ｓｐｉｎｄｌｅｒ ＆ Ｆｒｅｃｈｅｔの論文、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ
２６：４８０９−４８１３（１９９３）；Ｔｕｒｎｅｒらの論文、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２６：４６１７−４６２３（１９９３）；Ｗｉｅｎｅｒらの論文、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｍｅｄ．３１（１）：１−８（１９９４）；Ｓｅｒｖｉｃｅ、２６７：４５８−４５９（１９９５）；Ｔｏｍａｌｉａ、Ｓｃｉ．Ａｍｅｒ．６２−６６（１９９５）；ならびにいずれも全体を本願明細書に援用する米国特許第４，５５８，１２０号；４，５０７，４６６号；４，５６８，７３７号；４，５８７，３２９号；４，８５７，５９９号；５，５２７，５２４号；５，３３８，５３２号（Ｔｏｍａｌｉａ）および米国特許第６，２７４，７２３号（Ｎｉｌｓｅｎ）を参照されたい。樹状分子は、最小限の構造単位で最大限の体積に接触すること、サイズ、重量および成長特性をより
容易に制御する能力、ならびに多数の末端が、標識間の規定の間隔で高度に標識された分子を生成するように誘導され、または他の分子もしくはその混合物に対する結合の部位を与えることが可能であることなど、他の種類の超分子構造に比べて重要な利点を提供する。全体的に、米国特許第６，２７４，７２３号、および合成方法についての上記引用文献を参照されたい。
本発明の方法に有用である核酸デンドリマーは、核酸で機能化できる、または核酸／オリゴヌクレオチドから生成できる当該技術分野で知られているデンドリマーのいずれかである。当該デンドリマーは、Ｈｕｄｓｏｎらの論文「核酸デンドリマー：バイオポリマー構造」、Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：２１１９−２１２４（１９９３）；米国特許第６，２７４，７２３号および米国特許第５，５６１，０４３号（Ｃａｎｔｏｒ）等の開示内容に従って合成されうる。
本発明の本実施形態の別の態様において、汎用ナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体が提供される。その汎用プローブを、少なくとも２つの部分を含む任意の標的核酸に対する検定に使用することができる。この「汎用プローブ」は、（ｉ）レポータオリゴヌクレオチド（例：バーコードＤＮＡ）の少なくとも一部、および標的認識オリゴヌクレオチドの一部に相補的である、プローブに結合した単一の「捕獲」配列のオリゴヌクレオチドを備える（汎用プローブの１実施形態は図１６Ａおよび１６Ｂに記載されている）。標的認識オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの部分を有する配列を備え、第１の部分は、ナノ粒子に結合された捕獲配列に対する相補的配列を備え、第２の部分は、特定の標的核酸配列の第１の部分に対する相補的配列を備える。特定の試験溶液中の特定の標的核酸配列を選択するために、標的認識オリゴヌクレオチドのライブラリを切り換えまたは交換することができるように、様々な種類の標的認識オリゴヌクレオチドを汎用プローブとともに極めて有利に使用することが可能である。標的核酸の第２の部分に相補的な配列を備えた第２の種類のオリゴヌクレオチドを磁性微粒子またはガラススライドの如き支持体表面に結合させる。
ハイブリダイゼーションを可能にする条件下でレポータオリゴヌクレオチド（バーコードＤＮＡ）および標的認識オリゴヌクレオチドを含む溶液に汎用プローブを接触させると、標的核酸を含有しうる溶液との接触に向けて「活性化される」汎用プローブが作製される（図１６Ａ、上部反応スキーム）。順次、または支持体に結合される「活性化」汎用プローブまたは第２の種類のオリゴヌクレオチドのいずれかまたは双方と組み合わせて、試験用液を、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触させることが可能である。複合体形成のための十分な時間が確保されると、複合化されていない試験溶液成分が複合体から除去され、レポータオリゴヌクレオチドが検出される。この検定の１実施形態は図１６Ｂに描かれている。
実施される特定の検定に応じた有益性を高めるために汎用プローブを操作することが可能である。第２の部分が、対象の標的核酸に対する相補的配列を備えるように、標的認識オリゴヌクレオチドを単に置換または交換することによって、プローブを様々な単一標的核酸配列に合わせて「調整」することが可能である。同様に、多数の標的核酸配列を単一試験溶液中で検定する場合には、レポータオリゴヌクレオチドは、それぞれの標的核酸に特有の配列を備えることが可能である。したがって、知られている特異的配列のレポータオリゴヌクレオチドの検出は、試験溶液中の特定の標的核酸の存在を示すことになる。
本発明の本実施形態の別の態様において、硫黄系官能基を使用して、オリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合させる。米国特許出願第０９／７６０，５００号および０９／８２０，２７９号ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０１１９０号およびＰＣＴ／ＵＳ０１／１００７１号には、本発明を実施する上で有用である環式ジスルフィドで機能化された
オリゴヌクレオチドが記載されている。環式ジスルフィドは、好ましくは、２つの硫黄原子を含めて、環内に５または６の原子を有する。好適な環式ジスルフィドは、商業的に入手可能であるか、または知られている手順によって合成されうる。環式ジスルフィドの還元形態を使用することも可能である。
好ましくは、リンカーは、環式ジスルフィドに結合された炭化水素成分をさらに備える。好適な炭化水素は、商業的に入手可能であり、環式ジスルフィドに結合される。好ましくは、炭化水素成分は、ステロイド残基である。環式ジスルフィドに結合されたステロイド残基を備えたリンカーを使用して調製されたオリゴヌクレオチド−ナノ粒子複合体は、意外にも、リンカーとしてアルカンチオールまたは非環式ジスルフィドを使用して調製された複合体と比較して、チオール（例：ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）溶液）に対して顕著に安定性を有することが認められた。実際、本発明のオリゴヌクレオチド−ナノ粒子複合体は、３００倍もの安定性を有することが確認された。この予想外の安定性は、おそらくそれぞれのオリゴヌクレオチドが、単一の硫黄原子ではなく、２つの硫黄原子を通じてナノ粒子に固定されるためである。特に、環式ジスルフィドの２つの隣接硫黄原子は、オリゴヌクレオチド−ナノ粒子複合体を安定化させる上で有利であるキレート化効果を有するものと考えられる。リンカーの大きな疎水性ステロイド残基も、ナノ粒子の表面への水溶性分子の接近によりナノ粒子をスクリーニングすることによって、複合体の安定性に寄与するものと思われる。
先述の内容に鑑み、環式ジスルフィドの２つの硫黄原子は、好ましくは、双方の硫黄原子がナノ粒子に同時に結合できるように、十分に接近している必要がある。最も好ましくは、２つの硫黄原子が互いに隣接する。また、炭化水素成分は、ナノ粒子の表面をスクリーニングする大きい疎水性表面を示す程大きいものである必要がある。
環式ジスルフィドリンカーを採用するオリゴヌクレオチド−環式ナノ粒子を、米国特許出願第０９／７６０，５００号および０９／８２０，２７９号ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０１１９０号およびＰＣＴ／ＵＳ０１／１００７１号に記載されているように試料中の標的検体を検出するための診断検定のプローブとして使用できる。これらの複合体は、それらを使用する診断検定の感度を向上させることが認められた。特に、環式ジスルフィドに結合されたステロイド残基を備えたリンカーを使用して調製されたオリゴヌクレオチド−ナノ粒子複合体を採用する検定は、アルカンチオールまたは非環式ジスルフィドをリンカーとして使用して調製された複合体を採用する検定に比べて感度が約１０倍であることが認められた。
それぞれのナノ粒子には、複数のオリゴヌクレオチドが結合されることになる。結果として、それぞれのナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体は、相補的配列を有する複数のオリゴヌクレオチドまたは核酸に結合することが可能である。
規定の配列のオリゴヌクレオチドは、本発明の実施における様々な目的に使用される。所定の配列のオリゴヌクレオチドを製造する方法はよく知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの論文、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）およびＦ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（編）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ、第１版（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１）を参照されたい。オリゴヌクレオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドの双方に対して固相合成方法が好ましい（よく知られているＤＮＡ合成方法は、ＲＮＡの合成にも有用である）。オリゴヌクレオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドを酵素的に調製することも可能である。標的検体に対する特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドについては、オリゴヌクレオチドに対するタンパク質の如き特異的結合相補体を結合させるための任意の好適な方法を
用いることができる。
粒子、ナノ粒子またはナノ球体表面にオリゴヌクレオチドを結合させるための任意の好適な方法を用いることができる。オリゴヌクレオチドを表面に結合させるための特に好ましい方法は、その開示内容を全体を本願明細書に援用する、１９９９年６月２５日に出願された米国出願第０９／３４４，６６７号；２０００年６月２６日に出願された０９／６０３，８３０号、２００１年１月１２日に出願された０９／７６０，５００号；２００１年３月２８日に出願された０９／８２０，２７９号、および２００１年８月１０日に出願された０９／９２７，７７７号、ならびに１９９７年７月２１日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／１２７８３号、２０００年６月２６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ００／１７５０７号、２００１年１月１２日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ０１／０１１９０号、および２００１年３月２８日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ０１／１００７１号に記載されている熟成ステップに基づく。熟成ステップは、予想外の高い安定性および選択性を有するナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体を提供する。
該方法は、好ましくはナノ粒子に結合することが可能である官能基を備えた部分が共有結合したオリゴヌクレオチドを提供するステップを含む。それらの部分および官能基は、オリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合（すなわち化学吸着または共有結合によって結合）させることを可能にする部分である。例えば、アルカンチオール、アルカンジスルフィドまたは環式ジスルフィドが５’または３’末端に共有結合したオリゴヌクレオチドを使用して、金ナノ粒子を含む様々なナノ粒子にオリゴヌクレオチドを結合させることが可能である。
官能基により、オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかをナノ粒子に結合させることを可能にするのに十分な時間にわたって、オリゴヌクレオチドを水中のナノ粒子に接触させる。当該時間は経験的に決定されうる。例えば、約１２から２４時間の時間が良好な結果をもたらすことが確認された。オリゴヌクレオチドを結合させるための他の好適な条件も経験的に決定することが可能である。例えば、ナノ粒子の濃度を１０から２０ｎＭとすること、および室温で温置することにより良好な結果が与えられる。
次に、少なくとも１つの塩を水に添加して、塩溶液を形成する。その塩は、任意の好適な水溶性塩でありうる。例えば、その塩は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、これらの塩の２つ以上の組合せ、またはこれらの塩のうちの１つをリン酸緩衝液に含めたものであってもよい。その塩を濃縮液に添加することが好ましいが、固体に添加することも可能である。その塩を一時に水に添加することも可能であり、または時間をかけて徐々に添加する。「時間をかけて徐々に」とは、塩を一定時間の間隔をおいて少なくとも二回に分けて添加することを意味する。好適な時間間隔は経験的に決定されうる。
塩溶液のイオン強度は、オリゴヌクレオチド同士の静電反発力、および正電荷を帯びたナノ粒子に対する負電荷を帯びたオリゴヌクレオチドの静電引力、または負電荷を帯びたナノ粒子に対する負電荷を帯びたオリゴヌクレオチドの静電反発力を少なくとも部分的に克服するのに十分なものでなければならない。時間をかけて徐々に塩を添加することにより静電引力および反発力を徐々に低減することは、ナノ粒子状のオリゴヌクレオチドの最大の表面密度を与えることが確認された。好適なイオン強度は、それぞれの塩または塩の組合せに対して経験的に決定されうる。好ましくは塩化ナトリウムの濃度を経時的に徐々に増加させて、リン酸緩衝液における約０．１Ｍから約１．０Ｍの塩化ナトリウムの最終濃度とすることは、良好な結果を与えることが確認された。
塩を添加した後に、十分な追加的なオリゴヌクレオチドがナノ粒子に結合して、安定し
たナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体を生成することを可能にするのに十分な追加的時間にわたって、オリゴヌクレオチドおよびナノ粒子を塩溶液中で温置する。以下に詳細に記載するように、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの表面密度が高くなると、複合体が安定することが確認された。この温置の時間は、経験的に決定されうる。約２４から４８時間、好ましくは４０時間の合計温置時間は、良好な結果を与えることが確認された（これは、温置の合計時間である。上記のように、この合計時間にわたって塩濃度を徐々に高くすることが可能である）。塩溶液におけるこの第２の温置時間は、本明細書では、「熟成」ステップと称する。この「熟成」ステップに対する他の好適な条件は経験的に決定されうる。例えば、室温でｐＨ７．０の温置は良好な結果を与える。
「熟成」ステップを用いることによって製造された複合体は、「熟成」ステップを用いずに製造された複合体よりはるかに安定していることが確認された。上記のように、この安定性の向上は、「熟成ステップ」によって達成される、ナノ粒子の表面上のオリゴヌクレオチドの密度の増加によるものである。「熟成」ステップによって達成される表面密度は、ナノ粒子の粒径および種類、ならびにオリゴヌクレオチドの長さ、配列および濃度に依存することになる。ナノ粒子とオリゴヌクレオチドの所望の組合せに対して、ナノ粒子を安定させるのに十分な表面密度、およびそれを得るのに必要な条件は、経験的に決定されうる。一般に、少なくとも１０ピコモル／ｃｍ２の表面密度は、安定なナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体を提供するのに十分である。好ましくは、表面密度は少なくとも１５ピコモル／ｃｍ２である。表面密度が大きすぎる場合は、核酸およびオリゴヌクレオチド標的にハイブリダイズする複合体のオリゴヌクレオチドの能力が低下しうるため、表面密度は、約３５から４０ピコモル／ｃｍ２を上回らないことが好ましい。
本明細書に用いられる場合、「安定」とは、複合体が製造された後少なくとも６ヶ月の期間にわたって、オリゴヌクレオチドの大半がナノ粒子に結合されたままであり、オリゴヌクレオチドは、核酸検出方法およびナノ製造方法で用いられる標準的な条件下で核酸およびオリゴヌクレオチド標的にハイブリダイズすることができることを意味する。
ナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体のハイブリダイゼーションの効率を、認識部およびスペーサ部を備える認識オリゴヌクレオチドの使用によって、飛躍的に高めることが可能であることが確認されている。「認識オリゴヌクレオチド」は、核酸またはオリゴヌクレオチド標的の配列の少なくとも一部に相補的な配列を備えるオリゴヌクレオチドである。本実施形態において、認識オリゴヌクレオチドは、認識部およびスペーサ部を備え、認識部が核酸またはオリゴヌクレオチド標的に対してハイブリダイズする。認識オリゴヌクレオチドのスペーサ部は、ナノ粒子に結合できるように設計される。例えば、スペーサ部には、ナノ粒子に結合できる官能基を含む成分が共有結合することが可能である。これらは、上述したものと同じ成分および官能基である。認識オリゴヌクレオチドのスペーサ部がナノ粒子に結合することにより、認識部は、ナノ粒子の表面から離れ、標的とのハイブリダイゼーションがより容易になる。認識部のナノ粒子からの間隔を良好にするスペーサ部の長さおよび配列は、経験的に決定されうる。少なくとも１０のヌクレオチド、好ましくは１０から３０のヌクレオチドを備えたスペーサ部が良好な結果を与えることが確認されている。スペーサ部は、ナノ粒子または核酸もしくはオリゴヌクレオチド標的に結合する認識オリゴヌクレオチドの能力を損なわない任意の配列を有することができる。例えば、スペーサ部は、互いに相補的な配列、認識オリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列、または認識オリゴヌクレオチドの核酸もしくはオリゴヌクレオチド標的の配列に相補的な配列を有することはない。好ましくは、これにより上述した問題が全く生じなければ、スペーサ部のヌクレオチドの塩基はすべてアデニン、すべてチミン、すべてシチジニンまたはすべてグアニンである。より好ましくは、塩基はすべてアデニンまたはすべてチミジンである。最も好ましくは、塩基は、すべてチミンである。
認識オリゴヌクレオチドに加えて、希釈ヌクレオチドを使用すると、所望のレベルのハイブリダイゼーションを与える複合体を調製する手段が提供される。希釈および認識オリゴヌクレオチドは、複合体を調製するためにナノ粒子と接触させる溶液における割合とほぼ同じ割合でナノ粒子に結合することが確認された。したがって、ナノ粒子に結合した認識オリゴヌクレオチドに対する希釈オリゴヌクレオチドの割合を、複合体が所望の数のハイブリダイゼーション事象に関与するように制御することが可能である。希釈オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子に結合する、または核酸もしくはオリゴヌクレオチド標的に結合する認識オリゴヌクレオチドの能力を損なわない任意の配列を有することができる。例えば、希釈オリゴヌクレオチドは、認識オリゴヌクレオチドの配列、または認識オリゴヌクレオチドの核酸もしくはオリゴヌクレオチド標的の配列に相補的な配列を有することはない。希釈オリゴヌクレオチドは、また、認識オリゴヌクレオチドがそれらの核酸またはオリゴヌクレオチド標的に結合できるように、認識オリゴヌクレオチドよりも短いことが好ましい。認識オリゴヌクレオチドがスペーサ部を備える場合は、希釈オリゴヌクレオチドは、最も好ましくは、スペーサ部と長さがほぼ同じである。このように、希釈オリゴヌクレオチドは、核酸またはオリゴヌクレオチド標的にハイブリダイズする認識オリゴヌクレオチドの認識部の能力を損なわない。さらにより好ましくは、希釈オリゴヌクレオチドは、認識オリゴヌクレオチドのスペーサ部の配列と同じ配列を有する。
本発明の別の実施形態において、粒子複合体プローブが提供される。それぞれの種類の粒子複合体プローブは、特定の標的検体に対する所定のレポータオリゴヌクレオチドまたはバーコードを含む。標的検体の存在下では、粒子複合体と標的検体との結合相互作用の結果として凝集体が生成される。これらの凝集体を任意の好適な手段、例えば熱変性によって分離、分析して、１つまたは複数の異なる種類のレポータオリゴヌクレオチドの存在を検出することが可能である。本発明を実施する上で、ナノ粒子複合体プローブが好ましい。
したがって、本発明の１態様において、粒子複合体プローブは、オリゴヌクレオチドが結合した粒子、１つまたは複数のＤＮＡバーコード、および特定の標的検体に対する特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドを備え、（ｉ）ＤＮＡバーコードは、少なくとも２つの部分を有する配列を有し、（ｉｉ）粒子に結合されたオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかは、ＤＮＡバーコードの第１の部分に相補的である配列を有し、（ｉｉｉ）特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分に相補的である配列を有し、（ｉｖ）それぞれの種類の粒子結合体プローブにおけるＤＮＡバーコードは、異なる配列であり、特定の標的検体に対する識別子として機能する配列を有する。
本実施形態の別の態様において、粒子複合体プローブは、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドが結合した粒子、１つまたは複数のＤＮＡバーコード、および標的検体に対する特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドを備え、プローブに結合した第１の種類のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの少なくとも一部に相補的な配列を有し、プローブに結合した第２の種類のオリゴヌクレオチドは、特異的結合相補体を有するオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部に相補的である配列を有する。
本実施形態の別の態様において、粒子複合体プローブは、オリゴヌクレオチドが結合した粒子、１つまたは複数のＤＮＡバーコード、および標的検体に対する特異的結合相補体を備え、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部に相補的である配列を有し、ＤＮＡバーコードは、特定の標的検体に対する識別子として機能する。
本発明のさらに別の実施形態において、粒子複合体プローブが提供される。したがって
、本発明の１実施形態において、オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡプローブ、および特定の標的検体に対する特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドを備え、（ｉ）ＤＮＡバーコードは、少なくとも２つの部分を有する配列を有し、（ｉｉ）粒子に結合されたオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかは、ＤＮＡバーコードの第１の部分に相補的である配列を有し、（ｉｉｉ）特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分に相補的である配列を有し、（ｉｖ）それぞれの種類の粒子複合体プローブにおけるＤＮＡバーコードは、異なる配列であり、特定の標的検体に対する識別子として機能する配列を有する粒子複合体プローブが提供される。
本発明の別の実施形態において、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的検体に対する特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドを備え、プローブに結合した第１の種類のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの少なくとも一部に相補的である配列を有し、プローブに結合した第２の種類のオリゴヌクレオチドは、特異的結合相補体を有するオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部に相補的である配列を有する粒子複合体プローブが提供される。
本発明のさらに別の実施形態において、オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的検体に対する特異的結合相補体を備え、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部に相補的である配列を有し、ＤＮＡバーコードは、特定の標的検体に対する識別子として機能する粒子複合体プローブが提供される。
本発明のさらに別の実施形態において、ナノ粒子、ナノ粒子に結合した特異的結合対の構成要素、ナノ粒子に結合した少なくとも１種類のオリゴヌクレオチド、およびそれぞれ所定の配列を有する少なくとも１種類のＤＮＡバーコードを備え、それぞれの種類のＤＮＡバーコードは、少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に対してハイブリダイズされる検出プローブが提供される。
好ましくは、粒子は、金属、半導体、絶縁体または磁性ナノ粒子の如き上述のナノ粒子を含む。好ましくは、粒子は、金属ナノ粒子である。特異的結合相補体または結合対構成要素および標的検体は、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、ポリペプチド、抗体、抗原、炭水化物、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬物、ウイルス、多糖類、脂質、リポ多糖、糖タンパク質、リポタンパク質、核タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗体、免疫グロブリン、アルブミン、ヘモグロビン、凝固因子、ペプチドおよびタンパク質ホルモン、非ペプチドホルモン、インターロイキン、インターフェロン、サイトカイン、腫瘍に特異的なエピトープを含むペプチド、細胞、細胞表面分子、微生物、微生物の断片、部分、成分または生成物、小有機分子、核酸およびオリゴヌクレオチド、上記の物質のいずれかの代謝物質または抗体を含む特異的結合対の構成要素である。
本発明の別の実施形態において、試料中の少なくとも２つの結合部位を有する１つまたは複数の標的検体の存否を検出するための方法が提供される。本発明の本実施形態の１態様において、
基体を提供するステップと、
特定の標的検体に対する１つまたは複数の特異的結合相補体、および１つまたは複数のＤＮＡバーコードが結合された粒子をそれぞれ備えた１つまたは複数の種類の粒子プローブを提供し、それぞれの種類の粒子プローブの特異的結合相補体は、特定の標的検体に特異的であり、それぞれの種類の粒子プローブに対するＤＮＡバーコードは、特定の標的検体に対するマーカとして機能するステップと、
標的検体を基体上に固定するステップと、
標的検体と検体に対する特異的結合相補体との結合を可能にし、標的検体の存在下で複合体を形成するのに有効な条件下で、固定された標的検体を１つまたは複数の粒子プローブに接触させるステップと、
基体を洗浄して、未結合の粒子プローブを除去するステップと、
場合によってはＤＮＡバーコードを増幅するステップと、
増幅されたＤＮＡバーコードの存否を検出し、マーカの存否は、試料中の特定の標的検体の存否を示すステップと、を含む方法が提供される。
本発明の本実施形態の１態様において、標的検体は、タンパク質またはハプテンであり、特異的結合相補体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を含む抗体である。
本発明の別の態様において、任意の好適な基体を使用することができる。基体を標的検体に対する１つまたは複数の種類の捕獲プローブと整列させることができる。
本発明の本態様において、バーコードを分離することができる。検体検出は、ＤＮＡチップの如き任意の好適な手段によってレポータオリゴヌクレオチドまたはバイオバーコードの存在を確認することにより間接的に行われる。
ＤＮＡバーコードは、場合によって、ＰＣＲ増幅を含む任意の好適な手段によって増幅され、次いで任意の好適な検出プローブを使用する任意の好適なＤＮＡ検出システムによって検出されうる。粒子は、好ましくは、十分なシグナル増幅を提供し、ＤＮＡバーコード増幅の必要性を排除するのに十分な量のＤＮＡバーコードで標識される。本発明を実施する上で、ＰＣＲ法による増幅が好ましい。ＤＮＡバーコードのＰＣＲ増幅（本明細書ではＢＰＣＲとも称する）は、アトモルレベルでタンパク質標的を検出することを可能にする。図６に例示されている検定は、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチド（バイオバーコード）３６およびポリクローナル検出抗体で強く機能化された新しい種類のナノ粒子を利用して、標的検体、すなわち前立腺特有抗原（ＰＳＡ）を認識する（実施例５）。加えて、磁性酸化鉄芯を有するポリアミン微粒子（１μｍ直径）をＰＳＡモノクローナル抗体で機能化する（図６および実施例５）。金粒子とポリアミン微粒子は、ＰＳＡ標的を挟み、タンパク質標的に対するバーコードＤＮＡの割合が大きい複合体を生成する（それぞれの粒子が２００鎖までのＤＮＡを支持することが可能な１３ｎｍの粒子について。これは、この粒径の粒子に対する上限である）。磁界の印加により、数秒間で磁性微粒子が反応容器の壁に引きつけられ、反応混合物から反応済および未反応の両微粒子、そして反応済ナノ粒子を分離することが可能になる。凝集構造体をナノ純水（１８メガオーム）で洗浄することにより、バーコードＤＮＡをナノ粒子−固定相補体から脱ハイブリダイズする。磁性分離器を使用して、凝集体を検定溶液から容易に除去し、バーコードＤＮＡを残し、ＰＣＲを使用してそれを増幅し、続いて即座に標準的なＤＮＡ検出法（走査法１１、ゲル電気泳動または蛍光体標識手法）によって識別することが可能である。ＰＳＡは、米国の男性の中で最も多い癌の１つで二番目の死因である前立腺癌の早期検出において重要であるため、これらの試験のための最初の標的として選択された４７、４８。重要なことは、ＰＳＡを低量（数十部）で存在するマーカとして使用して前立腺癌の外科治療に続く疾病再発を確認することは、極めて有益であり、治療補助剤の配達を可能にする４６、４９。
実施例５〜６では、ＢＰＣＲは、ゲル電気泳動または走査マイクロアレイ検出を用いて背景タンパク質の存在下で低アトモル濃度でタンパク質検体、すなわちＰＳＡを検出するための極めて有力な方法であることを実証する。この方法は、現行のタンパク質検定方法に比べていくつかの利点がある。第１に、検定の標的結合タンパク質は均質である。したがって、大量の磁性微粒子を反応容器に添加して、検出抗体と標的検体との結合運動を促進させることが可能である。これは、捕獲ステップがより効率的であるため、不均一系より高速であるとともに感度を高めることができる検定をもたらすものである。第２に、ナ
ノ粒子バイオバーコードを使用すると、ＰＣＲ増幅可能ＤＮＡの標識抗体に対する割合が高くなり、検定感度を実質的に高めるように機能する。例えば、本明細書に報告されているＢＰＣＲ検定は、３ａＭ濃度でＰＳＡを検出することが可能であるが、ＰＣＲをベースとした免疫検定は、同じ標的検体に対して３ｆＭの検出限界を有することが報告されている４３。第３に、この検定は、ＤＮＡを標識抗体に結合するための複雑な共役化学作用を不要とする。バーコードＤＮＡは、標識反応の開始時にハイブリダイゼーションを通じてナノ粒子プローブに結合され、単純な洗浄ステップを用いたＰＣＲ増幅に向けて放出される。標識抗体およびＤＮＡが同じ粒子上に存在するため、バーコードＤＮＡのＰＣＲ増幅の前にさらなる抗体またはＤＮＡ−タンパク質複合体を添加する必要はない。加えて、バーコードＤＮＡは、検出検定から除去され、ＰＣＲは、ＰＳＡのないバーコードＤＮＡの試料、たいていの生体試料、微粒子およびナノ粒子上で実施される。これにより、実質的には、バックグラウンドシグナルが低下する。最後に、このタンパク質検出スキームは、１つの溶液中の多くの検体の大量多重および同時検出の潜在性を有する。ＰＳＡシステムは、概念の証明に用いられるが、知られている結合相手によるほぼあらゆる標的に対して汎用的であり、ナノ粒子をベースとしたバイオバーコード手法３６を用いることによって、実質的にあらゆる対象標的に対する特異的な識別可能バーコードを調製することが可能である。
実施例９は、本発明のプローブは試料中の標的検体の量の直接的な検出および測定を行うことが可能であることを実証する。したがって、バーコードＤＮＡを増幅させるためのＢＰＣＲを含むステップを必要とせずに、優れた感度および検出限界（図６Ｂ（ステップ４）、図９（挿入図）および図１２）が達成される。
複合体形成後に基体の表面から未結合のプローブを除去する任意の好適な洗浄液を使用することができる。代表的な例としては、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）が挙げられるが、それに限定されない。
標的検体の存在下で、ナノ粒子複合体プローブと標的検体との結合相互作用の結果として、ナノ粒子凝集複合体が生成される。これらの凝集体は、分離され、凝集体を脱ハイブリダイズし、レポータオリゴヌクレオチドを放出するのに有効な条件が施される。次いで、レポータオリゴヌクレオチドが分離される。望まれる場合は、ＰＣＲ増幅を含む任意の好適な手段によってレポータオリゴヌクレオチドを増幅させることができる。検体検出は、ＤＮＡチップの如き任意の好適な手段によってレポータオリゴヌクレオチドまたはバイオバーコードの存在を確認することにより間接的に行われる。
次いで、任意の好適な手段によってＤＮＡバーコードまたはレポータオリゴヌクレオチドを検出することができる。一般には、ＤＮＡバーコードは、検出前に、脱ハイブリダイゼーションを介して複合体から剥離される。ＤＮＡバーコードを脱ハイブリダイズさせ、複合体から剥離させる任意の好適な溶液または媒体を使用することができる。代表的な媒体は水である。
捕獲オリゴヌクレオチドが結合した基体を使用して、凝集体の脱ハイブリダイゼーションにより剥離されたＤＮＡバーコードを直接検出することが可能である。オリゴヌクレオチドは、レポータオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的な配列を有する。ＤＮＡバーコードを検出する方法のいくつかの実施形態は、相補的オリゴヌクレオチドが結合した基体を利用して、レポータオリゴヌクレオチドを捕獲する。次いで、任意の好適な手段によってこれらの捕獲レポータオリゴヌクレオチドを検出する。基体を採用することによって、検出可能な変化（シグナル）を増幅させ、検定の感度を高めることが可能である。
オリゴヌクレオチドを基体に結合させるための任意の好適な方法を用いることができる。例えば、Ｃｈｒｉｓｅｙらの論文、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４、３０３１−３０３９（１９９６）；Ｃｈｒｉｓｅｙらの論文、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２４、３０４０−３０４７（１９９６）；Ｍｕｃｉｃらの論文、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、５５５（１９９６）；ＺｉｍｍｅｒｍａｎｎおよびＣｏｘ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２２、４９２（１９９４）；Ｂｏｔｔｏｍｌｅｙらの論文、Ｊ．Ｖａｃ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ａ、１０、５９１（１９９２）；およびＨｅｇｎｅｒらの論文、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、３３６、４５２（１９９３）に記載されているように、オリゴヌクレオチドを基体に結合させることが可能である。
基体に結合されたオリゴヌクレオチドは、検出すべきレポータオリゴヌクレオチドの配列の第１の部分に相補的な配列を有する。基体上のオリゴヌクレオチドのレポータオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを可能にするのに有効な条件下で、レポータオリゴヌクレオチドを基体に接触させる。このように、レポータオリゴヌクレオチドが基体に結合される。好ましくは、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体の如き検出プローブを添加する前に、未結合レポータオリゴヌクレオチドを基体から洗浄する。
本発明の１態様において、基体上のオリゴヌクレオチドに結合したレポータオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドが結合された第１の種類のナノ粒子に接触させる。オリゴヌクレオチドは、レポータオリゴヌクレオチドの配列の第２の部分に相補的な配列を有し、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドのレポータオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを可能にするのに有効な条件下で接触が行われる。このようにして、第１の種類のナノ粒子が基体に結合される。ナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体が基体に結合された後に、基体を洗浄して、未結合のナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体を除去する。
第１の種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、すべて同じ配列を有していてもよいし、検出すべきレポータオリゴヌクレオチドの異なる部分にハイブリダイズする異なる配列を有していてもよい。異なる配列を有するオリゴヌクレオチドが使用される場合は、それぞれのナノ粒子は、すべての異なるオリゴヌクレオチドが結合されていてもよく、あるいは、好ましくは、異なるオリゴヌクレオチドが異なるナノ粒子に結合される。あるいは、第１の種類のナノ粒子のそれぞれにおけるオリゴヌクレオチドは、複数の異なる配列を有することができ、その少なくとも１つが、検出すべきレポータオリゴヌクレオチドの一部にハイブリダイズされなければならない。
場合によって、基体に結合した第１の種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体を、オリゴヌクレオチドが結合された第２の種類のナノ粒子に接触させる。これらのオリゴヌクレオチドは、第１の種類のナノ粒子に結合されたオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部に相補的な配列を有し、第１の種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの第２の種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを可能にするのに有効な条件下で接触が行われる。ナノ粒子が結合した後に、基体を洗浄して、未結合のナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体を除去するのが好ましい。
ハイブリダイゼーションの組合せは、検出可能な変化をもたらす。検出可能な変化は、多重ハイブリダイゼーションが検出可能な変化をもたらすことを除いて、上述の変化と同じである。特に、第１の種類のナノ粒子のそれぞれには多数のオリゴヌクレオチド（同一または異なる配列を有する）が結合されているため、第１の種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体のそれぞれは、複数の第２の種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体に対してハイブリダイズすることが可能である。また、第１の種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体を、検出すべきレポータオリゴヌクレオチドの２つ以上の部分に対してハイブリダイズすることができる。多重ハイブリダイゼーションによってもたらされる増
幅は、変化を初めて検出可能にすることができ、あるいは検出可能な変化の規模を増大させることができる。この増幅は、検定の感度を高め、少量のレポータオリゴヌクレオチドの検出を可能にする。
望まれる場合は、第１および第２の種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体を連続的に添加することによって、追加的なナノ粒子の層を提供することができる。このように、標的核酸の分子毎に固定されたナノ粒子の数をさらに増加させ、それに対応してシグナルの強度を高めることが可能である。
また、互いに直接ハイブリダイズするように設計された第１および第２の種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体を使用する代わりに、結合オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの結果としてナノ粒子同士を結合するように機能するオリゴヌクレオチドを担持するナノ粒子を使用することも可能である。
基体を採用する場合は、標的レポータオリゴヌクレオチドの多数の部分を検出するために、多数の異なるレポータオリゴヌクレオチドを検出するために、またはその双方のために、複数の最初の種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体またはオリゴヌクレオチドを基体にアレイ状に結合させることが可能である。例えば、標的レポータオリゴヌクレオチドの一部に結合するように設計された異なる種類のオリゴヌクレオチドをそれぞれ含むスポットの列を基体に設けることができる。１つまたは複数のレポータオリゴヌクレオチドを含む試料を各スポットに塗布し、適切なオリゴヌクレオチド−ナノ粒子複合体を使用して、上述の方法の１つで検定の残りを実施する。
さらに別の態様において、ＢＰＣＲによる検体検出の方法、ならびに直接的検出を、基体、例えばガラス、金、シリコン、ニッケルおよびプラスチック上の検体検出を含む方法で使用されるように構成することが可能である。これらの方法を、ＤＮＡ−タンパク質結合事象、生理的タンパク質−タンパク質結合または二量化、および先述した他の生体分子相互作用の如き他の生物および化学的認識事象を検出するように構成することも可能である。
本態様の一実施形態において、該方法は、それぞれの標的検体に対する１つまたは複数の種類の捕獲プローブを基体に結合させるステップと、基体を試験溶液に接触させるステップと、場合によっては試験溶液を基体から洗浄するステップと、続いて基体をそれぞれの標的検体に対する１つまたは複数の検出プローブに接触させるステップと、未結合の検出プローブを除去するステップと、観察可能なシグナルを検出するステップとを含み、観察可能なシグナルの検出は、試験溶液中の標的検体の存在を示す。
本発明の本態様において、本明細書に記載されている任意の方法を用いて、観察可能なシグナルを検出することが可能である。例えば、バーコードＤＮＡの直接的検出、ＢＰＣＲ増幅バーコードＤＮＡの検出、１つまたは複数の種類の検出プローブの凝集の検出（例：目視検査、蛍光、比色、電気化学、電子、濃度測定および放射活性等による）、あるいはバーコードＤＮＡの少なくとも一部に相補的である配列、および検出可能なシグナル部分（例：蛍光標識）を備えたレポータヌクレオチドを使用することによる。
基体が採用される場合は、検出可能な変化を生成するか、または銀もしくは金染色の如き染色によってさらに増強させることが可能である。銀染色は、銀の還元を触媒する任意の種類のナノ粒子に採用されうる。貴金属（例：金および銀）製のナノ粒子が好ましい。Ｂａｓｓｅｌｌらの論文、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１２６、８６３−８７６（１９９４）；およびＢｒａｕｎ−Ｈｏｗｌａｎｄらの論文、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１３、９２８−９３１（１９９２）を参照されたい。核酸の検出に対して採用されるナノ粒子
が銀の還元を触媒しない場合は、銀イオンを核酸に複合させて、還元を触媒することが可能である。Ｂｒａｕｎらの論文、Ｎａｔｕｒｅ、３９１、７７５（１９９８）を参照されたい。また、核酸上のリン酸塩基と反応することができる銀染料が知られている。
銀染色を用いて、上述の変化を含めて、基体上で実施される任意の検定における検出可能な変化を生成または増強することが可能である。特に、銀染色は、ナノ粒子の層の使用をしばしば除外できるように、単一の種類のナノ粒子を採用する検定の感度を著しく高めることが確認された。
基体上で実施されるレポータオリゴヌクレオチドの検出のための検定において、検出可能な変化を光学スキャナで観察することが可能である。好適なスキャナとしては、反射モードで動作することが可能である、コンピュータに文書を走査するのに使用されるスキャナ（例：平床式スキャナ）、この機能を果たすことが可能である、または同じ種類の光学素子を利用する他のデバイス、任意の種類のグレースケール感応測定デバイス、および本発明による基体を走査するように改造された標準的なスキャナ（例：基体用ホルダを含むように改造された平床式スキャナ）（今日まで、透過モードで動作するスキャナを使用することが可能であると見なされていなかった）がある。スキャナの解像度は、基体上の反応面積がスキャナの単一の画素より大きくなる程度のものでなければならない。検定によって生成された検出可能な変化を基体に対して観察することが可能であれば、スキャナを任意の基体に使用できる（例：銀染色によって生成されたグレースポットの如きグレースポットは、白色の背景に対して観察することができるが、グレーの背景に対しては観察することができない）。スキャナは白黒スキャナ、または好ましくはカラースキャナでありうる。最も好ましくは、スキャナは、文書をコンピュータに走査するのに使用される種類の標準的なカラースキャナである。当該スキャナは安価で、商業的に容易に入手可能である。例えば、Ｅｐｓｏｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ６３６（６００×６００ｄｐｉ）、ＵＭＡＸ Ａｓｔｒａ １２００（３００×３００ｄｐｉ）またはＭｉｃｒｏｔｅｃ １６００（１６００×１６００ｄｐｉ）を使用することが可能である。スキャナは、基体を操作することによって得られる画像を処理するためのソフトウェアがロードされたコンピュータに接続される。ソフトウェアは、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ５．２およびＣｏｒｅｌ Ｐｈｏｔｏｐａｉｎｔ ８．０の如き商業的に容易に入手可能である標準的なソフトウェアでありうる。そのソフトウェアを用いてグレースケール測定値を計算することは、検定の結果を定量する手段となる。そのソフトウェアは、着色スポットに対する色数を与え、核酸の存在の定性測定、核酸の定量または双方を行うために精査することができるスキャンの画像（例：印刷出力）を生成することも可能である。コンピュータは、商業的に容易に入手可能である標準的なパーソナルコンピュータでありうる。したがって、標準的なソフトウェアがロードされた標準的なコンピュータに接続された標準的なスキャナを使用することは、検定を基体上で実施する場合に核酸の検出および定量を行う便利、容易かつ安価な手段となりうる。さらなる参照または使用のためにスキャンをコンピュータに格納して、その結果の記録を維持することも可能である。勿論、望まれる場合は、より精密な計器およびソフトウェアを使用することが可能である。
本発明の別の実施形態において、それぞれが少なくとも２つの結合部位を有する、試料中の１つまたは複数の標的検体の存否を検出するための方法であって、
それぞれが特定の標的検体の第１の結合部位に対する特異的結合相補部分を備えた、基体に結合した１つまたは複数の種類の捕獲プローブを提供するステップと、
オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子、特定の標的検体の第２の結合部位に対する１つまたは複数の特異的結合相補体、特定の標的検体に対するマーカとして機能する１つまたは複数のＤＮＡバーコードをそれぞれ備えた１つまたは複数の種類の検出プローブを提供し、ＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部が、ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかに対してハイブリダイズされるステップと、
標的検体とプローブの特異的結合相互作用を可能にし、標的検体の存在下で凝集複合体を形成するのに有効な条件下で、試料と捕獲プローブと検出プローブとを接触させるステップと、
基体を洗浄して、未結合検出プローブを除去するステップと、
基体上の任意の凝集複合体におけるＤＮＡバーコードの存否を検出し、ＤＮＡバーコードの存否の検出は、試料中の標的検体の存否を示すステップと、を含む方法が提供される。
本発明の本実施形態の１態様において、検出プローブは、（ｉ）特定の標的検体の第２の結合部位に対する１つまたは複数の特異的結合相補体、（ｉｉ）ナノ粒子に結合した少なくとも１種類のオリゴヌクレオチド、および少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的である所定の配列を有するＤＮＡバーコードを備え、それぞれの種類の検出プローブに結合したＤＮＡバーコードは、特定の標的検体に対するマーカとして機能する。
本実施形態の別の態様において、該方法は、前記検出ステップの前に、
複合体を脱ハイブリダイズさせ、ＤＮＡバーコードを剥離させるのに有効な条件を凝集複合体に施すステップと、
前記検出前に、場合によってはＤＮＡバーコードを増幅させるステップと、を含む。
本発明の別の態様において、捕獲プローブは、磁性微粒子、例えば磁性酸化鉄を有するポリスチレンＭＭＰの如き磁性基体に結合される。これにより、複合体が溶液から容易に除去される。次いで、上述の基体をベースとした検出技術を用いて直接的に、または増幅、そしてその後の検出技術によって間接的にＤＮＡバーコードを検出することが可能である。以下の実施例において、オリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子（ＮＰ）、磁性微粒子（ＭＭＰ）、およびそれに続く１つまたは複数の核酸配列の増幅器として機能するバーコードＤＮＡの検出に基づく方法が記載されている。好ましくは、オリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子は、金ナノ粒子を備える。標的ＤＮＡシグナルの存否の（バーコードＤＮＡの検出による）検出は、好ましくは、上述の基体をベースとした検出を用いて実施される。
１態様において、本発明は、ＰＣＲ法に依存せず、オリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子（ＮＰ）、磁性微粒子（ＭＭＰ）、およびバーコードＤＮＡの形の増幅標的核酸の検出に基づく標的核酸増幅法を提供する。本態様の１実施形態において、オリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子（ＮＰ）は、金ナノ粒子である。本態様の別の実施形態において、チップをベースとした検出方法を用いて、増幅ＤＮＡシグナル（標的配列に特異的なバーコードＤＮＡ）の検出を行う。本態様の別の実施形態において、バーコードＤＮＡは、対象となるそれぞれの標的核酸分子に特異的な配列を備え、試験溶液中の多数の標的核酸配列の特異的検出を可能にする。
本発明の別の態様において、バーコードＤＮＡは、試験試料中の対象となるそれぞれの特定の標的検体に特異的な配列を備え、単一の検定／試験溶液中の多数の特定の標的の検出を可能にする。実施例に示されるように、約５００ゼプトモル（ｚＭ）程度の検出限界を達成することが可能である（「ゼプト」の桁は１０−２１である。例えば、全量２０μＬの試料に１０部）。当該検出限界は、標的核酸分子のＰＣＲなしの検出の感度の著しい向上を表す。
本態様において、標的ＤＮＡ検出（ＤＮＡ−ＢＣＡ）のための二種類のプローブが提供される。特定の実施形態において、第１の種類のプローブは、標的配列の少なくとも一部に相補的であるオリゴヌクレオチドで機能化された磁性酸化鉄芯を有するポリスチレンＭＭＰである。ＭＭＰのオリゴヌクレオチドの相補的部分は、特定の検出条件（例：緩衝シ
ステム、標的核酸配列および温度等）に応じて様々な長さを有することが可能である。
別の実施形態において、第２のプローブは、二種類のオリゴヌクレオチドで修飾されたナノ粒子を備え、一方の種類は、ＭＭＰによって認識される標的上の領域と異なる標的配列の少なくとも一部に相補的である配列を備え、他方の種類は、バーコードＤＮＡ配列の少なくとも一部に相補的である配列を備え、そのＤＮＡバーコードは、特定の標的配列に対する独自の識別標識を提供する。特定の実施形態において、ナノ粒子は金ナノ粒子である。さらなる実施形態において、金ナノ粒子は、１３、２０または３０ｎｍの金ナノ粒子を含む。
ナノ粒子表面上の標的結合配列に対するバーコードＤＮＡの比をそれぞれの検定に応じて変更することが可能である。バーコードＤＮＡのＰＣＲなしの検出に対応させるために、バーコードＤＮＡの標的結合ＤＮＡの比は、１：１より大きく、好ましくは約２５：１であり、より好ましくは約５０：１であり、最も好ましくは約１００：１である。標的配列ではなく、バーコードＤＮＡは、ＤＮＡ−ＢＣＡ法で識別され、検出されるため、より高い比がＰＣＲなしの標的増幅に対応する。例えば、１３ｎｍの金ナノ粒子は、粒子毎に少なくとも１００のチオール化ＤＮＡ鎖を収容することが可能である７３。２０および３０ｎｍのナノ粒子については、オリゴヌクレオチド量が同等で、それぞれの粒子が球状であると仮定すると、それらの粒子は、それぞれ約２４０および５３０の固定オリゴヌクレオチドを収容することが可能である。
本実施形態の別の態様において、ナノ粒子に結合した特異的結合相補体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体である。
本実施形態の別の態様において、捕獲プローブに結合した特異的結合相補体は、モノクローナル抗体である。
本実施形態の別の態様において、抗体は抗ＰＳＡ抗体である。
本実施形態の別の態様において、該方法は、前記洗浄ステップの前に、
磁性微粒子に結合した凝集複合体に磁界を印加することによって、洗浄前に凝集複合体を分離するステップをさらに含む。
本実施形態の別の態様において、該方法は、凝集複合体を脱ハイブリダイズさせ、ＤＮＡバーコードを剥離させるのに有効な条件を、分離された凝集複合体に施すステップをさらに含む。
本実施形態の別の態様において、剥離されたＤＮＡバーコードをＰＣＲの如き任意の好適な技術で増幅させる。
本実施形態の別の態様において、標的検体は、少なくとも２つの部分を有する核酸である。
本実施形態の別の態様において、標的検体は、少なくとも２つの部分の配列を有する標的核酸であり、検出プローブは、ＤＮＡバーコードに相補的である配列を有するオリゴヌクレオチドを有し、検出プローブの特異的結合相補体は、標的核酸の第１の部分に相補的である配列を有する第１の標的認識オリゴヌクレオチドを備え、捕獲プローブの特異的結合相補体は、標的核酸の少なくとも第２の部分に相補的である配列を有する第２の標的認識オリゴヌクレオチドを備える。
本実施形態の別の態様において、標的検体は、少なくとも２つの部分の配列を有する標的核酸であり、検出プローブは、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子を備え、ＤＮＡバーコードは、検出プローブに結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的で
ある配列を有し、特異的結合相補体は、少なくとも第１および第２の部分の配列を有する標的認識オリゴヌクレオチドを備え、第１の部分は、標的核酸の第１の部分に相補的であり、第２の部分は、ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的であり、基体の特異的結合相補体は、標的核酸の第２の部分に相補的である少なくとも一部分を有する標的認識オリゴヌクレオチドを備える。
本実施形態の別の態様において、検出プローブは、上述したデンドリマーナノ粒子を備える。
本発明のさらに別の実施形態において、それぞれが少なくとも２つの結合部位を有する、試料中の１つまたは複数の標的検体の存否を検出するための方法であって、
それぞれが（ｉ）磁性微粒子、および（ｉｉ）特異的標的検体の第１の結合部位に結合する、磁性微粒子に結合された第１の特異的結合対の第１の構成要素を備えた１つまたは複数の種類の捕獲プローブを提供するステップと、
それぞれが、（ｉ）ナノ粒子、（ｉｉ）標的検体の第２の結合部位に結合する、ナノ粒子に結合された第２の特異的結合対の第１の構成要素、（ｉｉｉ）ナノ粒子に結合した少なくとも１種類のオリゴヌクレオチド、および（ｉｖ）それぞれが特定の種類のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的であり、特定の標的検体に対するマーカとして機能する所定の配列を有する少なくとも１種類のＤＮＡバーコードを備えた、それぞれの標的検体に対する１つまたは複数の種類の検出プローブを提供するステップと、
標的検体とプローブの特異的結合相互作用を可能にし、標的検体の存在下で磁性微粒子に結合した凝集複合体を形成するのに有効な条件下で、試料を捕獲プローブおよび検出プローブに接触させるステップと、
未結合検出プローブを磁性微粒子から洗浄するステップと、
複合体中のＤＮＡバーコードの存否を検出し、ＤＮＡバーコードの検出は、標的検体の存否を示すステップと、を含む方法が提供される。
本実施形態の１態様において、該方法は、前記検出ステップの前に、
磁界を印加することによって凝集複合体を分離するステップと、
ＤＮＡバーコードを脱ハイブリダイズさせ、凝集複合体から剥離させるのに有効な条件を凝集複合体に施すステップと、
剥離されたＤＮＡバーコードを分離するステップと、をさらに含む。
本実施形態の別の態様において、本発明は、剥離されたＤＮＡバーコードを増幅させるステップをさらに含む。
本実施形態の別の態様において、該方法は、
ＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが結合した基体を提供するステップと、
オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子を提供し、ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部が、ＤＮＡバーコードの少なくとも一部に相補的である配列を有するステップと、
ＤＮＡバーコードの少なくとも第１の部分を基体に結合した相補的なオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ、ＤＮＡバーコードの第２の部分をナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドのいくつかにハイブリダイズさせることを可能にするのに有効な条件下で、ＤＮＡバーコードと、基体に結合したオリゴヌクレオチドと、ナノ粒子とを接触させるステップと、をさらに備える。
本実施形態の別の態様において、検出の前に、ＰＣＲによってＤＮＡバーコードを増幅する。
本実施形態の別の態様において、該方法は、凝集複合体を分析する前に、凝集複合体を分離するステップをさらに含む。
本実施形態の別の態様において、磁界を凝集複合体に印加することによって凝集複合体を分離する。
本実施形態の別の態様において、ナノ粒子は、金ナノ粒子または半導体ナノ粒子の如き金属ナノ粒子である。
本実施形態の別の態様において、特異的結合対は、抗体および抗原、受容体およびリガンド、酵素および基体、薬物および標的分子、アプタマーおよびアプタマー標的、少なくとも部分的に相補的なオリゴヌクレオチドの２つの鎖である。
本実施形態の別の態様において、ＤＮＡバーコードをビオチニル化、放射性標識または蛍光標識することができる。
任意の実施形態において、少なくとも２種類の粒子複合体プローブを提供し、第１の種類のプローブは、標的検体上の第１の結合部位に対する特異的結合相補部分を有し、第２の種類のプローブは、プローブ上の第２の結合部位に対する特異的結合相補部分を有する。それぞれが標的検体上の異なる結合部位に対する特異的結合相補部分を有する複数の粒子複合体プローブを提供する。
特異的結合相補体および標的検体は、特異的結合対の構成要素であり、これは、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、ポリペプチド、抗体、抗原、炭水化物、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬物、ウイルス、多糖類、脂質、リポ多糖、糖タンパク質、リポタンパク質、核タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗体、免疫グロブリン、アルブミン、ヘモグロビン、凝固因子、ペプチドおよびタンパク質ホルモン、非ペプチドホルモン、インターロイキン、インターフェロン、サイトカイン、腫瘍に特異的なエピトープを含むペプチド、細胞、細胞表面分子、微生物、微生物の断片、部分、成分または生成物、小有機分子、核酸およびオリゴヌクレオチド、上記の物質のいずれかの代謝物質または抗体を含む。
核酸およびオリゴヌクレオチドは、遺伝子、ウイルスＲＮＡおよびＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、真菌ＤＮＡ、哺乳類ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、一本鎖および二本鎖核酸、天然および合成核酸、ならびにアプタマーを含む。
標的検体は、核酸であり、特異的結合相補体は、オリゴヌクレオチドである。あるいは、標的検体は、タンパク質またはハプテンであり、特異的結合相補体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含む抗体である。あるいは、標的検体は、ゲノムＤＮＡ試料からの配列であり、特異的結合相補体は、ゲノム配列の少なくとも一部に相補的である配列を有するオリゴヌクレオチドである。ゲノムＤＮＡは、真核、細菌、真菌またはウイルスＤＮＡでありうる。
特異的結合相補体および標的検体は、抗体−リガンド対の構成要素である。
その第１の結合部位に加えて、第２の結合部位を含むように標的検体を修飾した。
この方法は、凝集複合体を除去する濾過ステップをさらに含むことができ、濾過ステップは、凝集複合体を分析する前に実施する。濾過ステップは、ＤＮＡバーコードを含まない試料成分を除去する膜を含む。
本発明の他の実施態様において、試料中の１つまたは複数の標的検体の存否を検出するための方法であって、
結合したオリゴヌクレオチド、特定の標的検体の１つまたは複数の特異的結合相補体、および特定の標的検体に対するマーカとして機能する１つまたは複数のＤＮＡバーコード
をそれぞれ備えた少なくとも１つまたは複数の種類の粒子複合体プローブを提供し、ＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部は、ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかに対してハイブリダイズされるステップと、
標的検体と粒子複合体プローブとの特異的結合相互作用を可能にし、標的検体の存在下で凝集複合体を形成するのに有効な条件下で、試料を粒子複合体プローブに接触させるステップと、
凝集複合体形成が生じたかどうかを確認するステップと、を含む方法が提供される。
本発明の本態様において、本明細書に記載されている任意の方法を用いて、観察可能なシグナルを検出することが可能である。例えば、バーコードＤＮＡの直接的検出、ＢＰＣＲ増幅バーコードＤＮＡの検出、１つまたは複数の種類の検出プローブの凝集の検出（例：目視検査、蛍光、比色、電気化学、電子、濃度測定および放射活性等による）、あるいはバーコードＤＮＡの少なくとも一部に相補的である配列、および検出可能なシグナル部分（例：蛍光標識）を備えたレポータヌクレオチドを使用することによる。
十分な複合体が存在すると、バックグラウンド基体があろうとなかろうとこの複合体を視覚的に確認することができる。検出可能な変化の確認を可能にする任意の基体を使用することができる。好適な基体には、透明固体表面（例：ガラス、石英、プラスチック、および他のポリマー）、不透明固体表面（例：ＴＬＣシリカプレート、ろ紙、ガラス繊維フィルタ、ニトロセルロース膜、ナイロン膜などの白色固体表面）、および導電性固体表面（例：酸化インジウムスズ（ＩＴＯ））が含まれる。基体は、任意の形または厚さとすることができるが、通常平坦で薄い。ガラス（例：スライドガラス）またはプラスチック（例：マイクロタイタープレートのウェル）などの透明基体が好ましい。
本発明の１態様において、試料中の標的検体、例えば抗体の存在を検出するための方法が提供される。下記の実施例に示される免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）または免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）などの抗体は、適切なハプテン（ＩｇＧ１の場合はビオチン、ＩｇＥの場合はジニトロフェニル（ＤＮＰ）；図１Ａ）で修飾されたオリゴヌクレオチド鎖で予めハイブリダイズされたオリゴヌクレオチド修飾プローブにより検出することができる１３，１４。下記の実施例に示される概念実証検定におけるＤＮＡ配列は、ＩｇＧ１およびＩｇＥとのプローブ反応から形成する２つの異なる凝集体が、異なる温度で融解することが保証されるように設計した（図１Ｂ）。ＩｇＧ１用プローブは、ＩｇＥ用プローブよりも長い配列を有し、Ｇ、Ｃ塩基含有量が高い。したがって、前者の配列は、後者の配列よりも高い温度で融解する。このような配列の差異により、どの標的がプローブと反応してナノ粒子凝集体を形成したかを同定するための暗号として使用することができる異なる融解特性を有するプローブを調製することが可能となる。３つの異なるシステム、すなわち（１）１つの標的抗体（ＩｇＧ１またはＩｇＥ）が存在する２つのプローブ、（２）２つの異なる標的抗体が存在する２つのプローブ、および（３）標的抗体が存在しない対照について検討した。
本発明の本態様において、試料中の標的検体、例えば抗体の存在を検出するための方法であって、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子プローブを、標的検体を含有する可能性のある試料と接触させるステップを含む方法が提供される。ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ハイブリダイゼーションの結果、レポータオリゴヌクレオチドの第１の部分と結合する。リポータオリゴヌクレオチドの第２の部分は、ハイブリダイゼーションの結果、検体に対する特異的結合相補体（例：抗原）が結合したオリゴヌクレオチドと結合する。接触は、検体とナノ粒子プローブとの間の特異的結合相互作用を可能にするのに有効な条件下で行う。標的検体の存在下で、ナノ粒子凝集体を生成する。このような凝集体は、任意の好適な手段によって検出することができる。
本発明の別の態様において、粒子複合体プローブ、好ましくはナノ粒子複合体プローブを使用する。これらの粒子複合体は、実際の検定が実施される前、または検定が実施されている間に所定位置で生成されうる。これらの複合体は、オリゴヌクレオチドが結合した粒子、好ましくはナノ粒子と、ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に結合したレポータオリゴヌクレオチドと、標的検体の特異的結合相補体とを含む。特異的結合相補体は、ナノ粒子と直接的または間接的に結合することができる。例えば、特異的結合相補体を、リンカーまたはオリゴヌクレオチドと結合することができ、次いで、標識したリンカーまたはオリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合する。１実施形態において、ＤＮＡバーコードまたはレポータオリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの部分を有する配列を有し、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子と、特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドとをハイブリダイゼーションを介して結合させる。ナノ粒子が結合したオリゴヌクレオチドは、レポータオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的である配列を有し、特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドは、レポータオリゴヌクレオチドの第２の部分に相補的である配列を有する。レポータオリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの部分を有し、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子と、特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドとをハイブリダイゼーションを介して結合させる。標的検体を含有する試料に採用されると、ナノ粒子複合体は、標的検体に結合し、凝集が生じる。凝集体を分離し、さらなる溶融分析を施して、上述のような多数の標的が存在する特定の標的検体を識別することができる。あるいは、凝集体を脱ハイブリダイズして、レポータオリゴヌクレオチドを剥離させることが可能である。これらのレポータオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡバーコードは、場合によって、増幅され、次いで任意の好適な検出プローブを使用する任意の好適なＤＮＡ検出システムによって検出されうる。
本発明を実施する際に、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子を、標的検体に対する特異的結合相補体で修飾されたオリゴヌクレオチド、およびレポータオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることによってナノ粒子複合体プローブを調製する。ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、レポータオリゴヌクレオチドの第１の部分と相補的である配列を有する。特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドは、レポータオリゴヌクレオチドの第２の部分と相補的である配列を有する。成分間のハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な条件下で、レポータオリゴヌクレオチドは、ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部および特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、ナノ粒子複合体プローブを形成する。成分の十分なハイブリダイゼーションを可能にするナノ粒子複合体溶液を調製する際に、任意の好適な溶媒およびハイブリダイゼーション条件を用いることができる。成分を、０．３Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）からなるリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中で室温にて約２〜３時間ハイブリダイズさせることが好ましい。ハイブリダイゼーション混合物中のナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合物の濃度は、約２ｎＭから約５０ｎＭ、好ましくは約１３ｎＭである。ハプテン修飾オリゴヌクレオチドの濃度は一般に、約５０から約９００ｎＭ、好ましくは約３００ｎＭである。レポータオリゴヌクレオチドの濃度は一般に、約５０〜約９００ｎＭ、好ましくは約３００ｎＭである。未反応のハプテン修飾オリゴヌクレオチドおよびレポータオリゴヌクレオチドは、任意の好適な手段、好ましくはハイブリダイゼーション混合物を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、２０分間）し、続いて上清のデカンテーションによって任意選択で除去してよいが、除去することが好ましい。調製した複合体は、０．３Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７〜７．４）、０．０１％アジド溶液中で４〜６℃で保存した。
試料中の標的検体、例えば抗体の存在を検出するための典型的な検定は以下の通りである。オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子、レポータオリゴヌクレオチド、および標的検体に対する特異的結合相補体を有するオリゴヌクレオチドからなるナノ粒子複合体プローブを含有する溶液を、標的タンパク質を含有すると考えられる試料水溶液と混合する。
試料水溶液中の総タンパク質含有量は一般に、約５から約１００ｕｇ／ｍｌ、通常は約４３ｕｇ／ｍｌである。反応混合物中のナノ粒子の濃度は一般に、約２から約２０ｎＭ、通常は約〜１３ｎＭである。得られる混合物の総体積は一般に、約１００から約１０００ｕＬ、好ましくは約４００ｕＬである。標的検体を含有すると考えられる試料水溶液を調製する際に、任意の好適な溶媒、好ましくは、０．３Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７〜７．４）からなるＰＢＳを用いることができる。
次いで、得られた検定混合物を、特異的結合対、例えばタンパク質−ハプテンの複合体形成を容易にするのに十分な、約３５から約４０℃の温度、好ましくは３７℃で、約３０から約６０分の間、好ましくは約５０分間インキュベートする。標的タンパク質が存在する場合、粒子の凝集が起き、沈殿とともに金ナノ粒子プラズモンバンドのシフトおよび赤色から紫色への変色をもたらす。ハイブリダイズした生成物を遠心分離し（例：３０００ｒｐｍで２分間）、未反応成分を含有する上清を分析の前にデカンテーションする。
所望の場合には、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子、レポータオリゴヌクレオチド、およびハプテン修飾オリゴヌクレオチドの全てを、標的検体を含有すると考えられるサンプルと混合することにより、検定混合物内で所定位置でナノ粒子複合体プローブを調製してもよい。すべての成分、特に相補ＤＮＡ鎖間の完全なハイブリダイゼーションを確実にするため、検定混合物を−１５℃で２０分間インキュベートしてハイブリダイゼーションを促進させ（ベケル社（Ｂｏｅｋｅｌ）製Ｔｒｏｐｉｃｏｏｌｅｒ（登録商標）Ｈｏｔ／Ｃｏｌｄ Ｂｌｏｃｋ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）、４℃で２４時間保存する。しかし、本発明を実施する際に、検定反応を実施する前にナノ粒子複合体プローブを調製し、ナノ粒子複合体プローブ内のＤＮＡバーコードの量を増加させることが好ましい。
どのタンパク質が存在するかを判定するために、温度の関数として２６０ｎｍにおける吸光度をモニターする、凝集体の融解分析を溶液中で実施することができる。例えば、１つまたは２つの既知の標的検体：ＩｇＧ１およびＩｇＥを含有する試料の分析を説明する実施例３の図２を参照されたい。実施例３で説明するように、前述のプロトコルによりＩｇＧ１をプローブで処理すると、溶液はピンクがかった青色に変わり、したがってナノ粒子凝集体の形成が示される。標的タンパク質は存在しないがバックグラウンドタンパク質が存在する対照実験では、識別可能な沈殿は認められない。溶液の融解分析から、融解温度（Ｔｍ）５５℃とともに鋭い相転位が示される。これは、ＩｇＧ１標的について予想された相転位である（図２Ａ（破線））。新たなプローブ溶液にＩｇＥを添加すると、同様の変色が観察されるが、融解分析から、この標的について予想される相転位であるＴｍ３６℃を伴う曲線が得られる（図２Ａ（実線））。有意には、プローブ溶液に両方のタンパク質標的を添加すると、溶液は濃紫色に変化し、融解分析から、２つの明確な相互作用が示される。この曲線の一次導関数は、それぞれ３６および５５℃に中心のある２つのピークを示す（図２Ｂ）。これは、２つの別個の会合体が形成し、オリゴヌクレオチドバーコードに由来するその融解特性を用いて２つのタンパク質標的を区別することが可能であることを実証する。
本発明の別の態様において、上記の凝集方法戦略の変形を用いて、前述のシステムの感度を高め、ある溶液中で調べることが可能な標的の数を増加させることができる。例えば、実施例４の図３を参照されたい。この戦略により、特定の標的検体に割り当てられたＤＮＡバイオバーコードまたは独自のレポータオリゴヌクレオチドにより、タンパク質標的を間接的に検出することができる。一般に、標的検体用のレポータオリゴヌクレオチドの好適な長さ、ＧＣ含量、および配列、ならびに選択は、検定の前に予め定められる。例えば、１２ｍｅｒのオリゴヌクレオチドは、４１２種類の異なる配列を有し、その多くを用いて図１Ａに示すように対象の多価タンパク質用のバーコードを調製することができる。検定のこの変形では、形成する凝集体の融解特性を溶液中では測定せず、遠心分離（例：
３０００ｒｐｍで２分間）により、未反応のプローブおよび標的分子から凝集体内のレポータオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡバイオバーコードを分離する。次いで、任意の好適な手段によって、例えば、溶液に水を加えることによって凝集体を変性させ、レポータオリゴヌクレオチドまたはバーコードを遊離させる。レポータオリゴヌクレオチドが少量である場合、当技術分野で知られている方法によって増幅することができる。例えば、サンブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版１９８９）およびビー ディー ヘイムズとエス ジェイ ヒギンズ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ）編集、Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ １（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９９５）を参照のこと。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅が好ましい。粒子およびタンパク質を、任意の好適な手段、例えば、遠心濾過装置（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）製Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）ＹＭ−１００、３５００ｒｐｍで２５分間）によってレポータオリゴヌクレオチドから分離することができる。レポータオリゴヌクレオチドを分離すると、オリゴヌクレオチドアレイ上に捕獲し、多くの好適なＤＮＡ検出検定のうちの１つを用いて同定することができる（図３）。ＩｇＧ１およびＩｇＥが関与する、本明細書に記載の実施例の場合に、対象のバーコード（図１のＡ３およびＢ３）の半分と相補的であるオリゴヌクレオチドで機能化された（直径２５０μｍのスポット）顕微鏡用スライド上にレポータオリゴヌクレオチドを捕獲する。バーコードがオリゴヌクレオチドアレイによって捕獲されると、バーコードの残りの部分と相補的であるＤＮＡ修飾粒子をアレイとハイブリダイズさせることができる（実験の項を参照のこと）。標準的なスキャン測定手法［１１］（写真現像溶液による処理を含む）によって現像すると、フラットベッドスキャナを用いて結果を定量することが可能である（図４）１１。ＩｇＧ１が存在する場合、ＩｇＧ１のために設計されたスポットのみが測定可能なシグナルを示す。同様に、ＩｇＥが、存在する唯一のタンパク質である場合、ＩｇＥのために設計されたスポットのみがシグナルを示す。最後に、両方のタンパク質が存在する場合、両スポットが強いシグナルを示す。
本実施形態の１態様において、それぞれの種類の粒子複合体プローブにおけるＤＮＡバーコードは、異なる配列であり、特定の標的検体に対する識別子として機能する配列を有する。
本実施形態の別の態様において、該方法は、
凝集複合体を分離するステップと、
凝集複合体を分析して、異なる配列を有する１つまたは複数のＤＮＡバーコードの存在を判断するステップと、をさらに含む。
本実施形態の別の態様において、該方法は、
凝集複合体を分離するステップと、
凝集複合体を脱ハイブリダイズさせ、ＤＮＡバーコードを剥離させるのに有効な条件を凝集複合体に施すステップと、
ＤＮＡバーコードを分離するステップと、
異なる配列を有する１つまたは複数のＤＮＡバーコードの存在を検出し、それぞれのＤＮＡバーコードは、試料中の特定の標的検体の存在を示すステップと、をさらに含む。
本実施形態の別の態様において、該方法は、
凝集複合体を分離するステップと、
凝集複合体を脱ハイブリダイズさせ、ＤＮＡバーコードを剥離させるのに有効な条件を凝集複合体に施すステップと、
ＤＮＡバーコードを分離するステップと、
分離されたＤＮＡバーコードを増幅するステップと、
異なる配列を有する１つまたは複数の増幅ＤＮＡバーコードの存在を検出し、それぞれのＤＮＡバーコードは、試料中の特定の標的検体の存在を示すステップと、をさらに含む。
本実施形態の別の態様において、標的は、３つ以上の結合部位を有し、少なくとも２種類の粒子複合体プローブが提供され、第１の種類のプローブは、標的検体上の第１の結合部位に対する特異的結合相補部分を有し、第２の種類のプローブは、プローブ上の第２の結合部位に対する特異的結合相補部分を有する。複数の粒子複合体プローブを提供することができ、それぞれの種類のプローブは、標的検体上の異なる結合部位に対する特異的結合相補部分を有する。
本実施形態の別の態様において、特異的結合相補体および標的検体は、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、ポリペプチド、抗体、抗原、炭水化物、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬物、ウイルス、多糖類、脂質、リポ多糖、糖タンパク質、リポタンパク質、核タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗体、免疫グロブリン、アルブミン、ヘモグロビン、凝固因子、ペプチドおよびタンパク質ホルモン、非ペプチドホルモン、インターロイキン、インターフェロン、サイトカイン、腫瘍に特異的なエピトープを含むペプチド、細胞、細胞表面分子、微生物、微生物の断片、部分、成分または生成物、小有機分子、核酸およびオリゴヌクレオチド、上記の物質のいずれかの代謝物質または抗体を含む特異的結合対の構成要素である。
核酸およびオリゴヌクレオチドは、遺伝子、ウイルスＲＮＡおよびＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、真菌ＤＮＡ、哺乳類ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、一本鎖および二本鎖核酸、天然および合成核酸、ならびにアプタマーを含む。
１態様において、標的検体は、核酸であり、特異的結合相補体は、オリゴヌクレオチドでありうる。あるいは、標的検体は、タンパク質またはハプテンであり、特異的結合相補体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含む抗体でありうる。
本実施形態の別の態様において、標的検体は、ゲノムＤＮＡ試料からの配列であり、特異的結合相補体は、ゲノム配列の少なくとも一部に相補的である配列を有するオリゴヌクレオチドでありうる。
本実施形態の別の態様において、ゲノムＤＮＡは、真核、細菌、真菌またはウイルスＤＮＡでありうる。
別の態様において、特異的結合相補体および標的検体は、抗体−リガンド対の構成要素でありうる。
本実施形態の別の態様において、１つまたは複数のＤＮＡバーコードの存在に対する検出ステップは、
ＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが結合した基体を提供するステップと、
オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子を提供し、ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの少なくとも一部に相補的である配列を有するステップと、
少なくとも相補的オリゴヌクレオチドが基体に結合したＤＮＡバーコードの第１の部分、およびオリゴヌクレオチドのいくつかがナノ粒子に結合したＤＮＡバーコードの第２の部分のハイブリダイゼーションを可能にするのに有効な条件下で、ＤＮＡバーコードと、基体に結合したオリゴヌクレオチドと、ナノ粒子とを接触させるステップと、
検出可能な変化を確認するステップと、を含む。
本実施形態の別の態様において、基体は、１つまたは複数の異なる種類のＤＮＡバーコードの検出を可能にする配列で、そこに結合された複数の種類のオリゴヌクレオチドを備える。
本実施形態の別の態様において、検出可能な変化は、基体上の暗領域の形成である。
本実施形態の別の態様において、検出可能な変化は、光学スキャナで確認される。
本実施形態の別の態様において、基体を銀染料に接触させて、検出可能な変化を生じさせる。
本実施形態の別の態様において、ＤＮＡバーコードが、基体に結合した相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることを可能にするのに有効な条件下で、ＤＮＡバーコードを基体に接触させ、続いて、ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかが、基体上のＤＮＡバーコードの配列の一部にハイブリダイズすることを可能にするのに有効な条件下で、基体に結合したＤＮＡバーコードをオリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子に接触させる。
本実施形態の別の態様において、ＤＮＡバーコードが、ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかにハイブリダイズすることを可能にするのに有効な条件下で、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子にＤＮＡバーコードを接触させ、続いて、ナノ粒子に結合したＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部が、基体に結合した相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることを可能にするのに有効な条件下で、ナノ粒子に結合したＤＮＡバーコードを基体に接触させる。
本実施形態の別の態様において、接触ステップの前にＤＮＡバーコードを増幅させる。
本実施形態の別の態様において、少なくとも２種類の粒子複合体プローブが提供され、第１の種類のプローブは、標的検体の第１の結合部位に対する特異的結合相補部分を有し、第２の種類のプローブは、標的検体の第２の結合部位に対する特異的結合相補部分を有する。
先に述べたように、核酸およびオリゴヌクレオチドは、遺伝子、ウイルスＲＮＡおよびＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、真菌ＤＮＡ、哺乳類ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、一本鎖および二本鎖核酸、天然および合成核酸、ならびにアプタマーを含む。
本発明の別の実施形態において、上述の粒子複合体プローブを備えたキットが提供される。
本実施形態の別の態様において、少なくとも２つの結合部位をそれぞれ有する、試料中の１つまたは複数の標的検体の存否を検出するためのキットが提供される。該キットは、
（ｉ）ナノ粒子、（ｉｉ）ナノ粒子に結合した特異的結合対の構成要素、（ｉｉｉ）ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチド、および（ｉｖ）オリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的であり、所定の配列を有するＤＮＡバーコードを備えた、それぞれの標的検体に対する１つまたは複数の種類の検出プローブを含む。
本実施形態の別の態様において、該キットは、
（ｉ）基体、（ｉｉ）標的検体の第１の結合部位に結合する、基体に結合された第１の特異的結合対の第１の構成要素を備えた少なくとも１種類の捕獲プローブ、および
（ｉ）ナノ粒子と、（ｉｉ）標的検体の第２の結合部位に結合する、ナノ粒子に結合された第２の特異的結合対の第１の構成要素と、（ｉｉｉ）ナノ粒子に結合した少なくとも
１種類のオリゴヌクレオチドと、（ｉｖ）特定の種類のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的である所定の配列をそれぞれ有する少なくとも１種類のＤＮＡバーコードとを備えた少なくとも１種類の検出プローブを含む。
任意の好適な基体をキットで使用することができる。基体は、磁性微粒子など、磁性であることが好ましい。
本実施形態の別の態様において、該キットは、
（ｉ）磁性微粒子、（ｉｉ）標的検体の第１の結合部位に結合する、基体に結合された第１の特異的結合対の第１の構成要素を備えた少なくとも１種類の捕獲プローブ、および
（ｉ）ナノ粒子と、（ｉｉ）標的検体の第２の結合部位に結合する、ナノ粒子に結合された第２の特異的結合対の第１の構成要素と、（ｉｉｉ）ナノ粒子に結合した少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドと、（ｉｖ）特定の種類のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的である所定の配列をそれぞれ有する少なくとも１種類のＤＮＡバーコードとを備えた少なくとも１種類の検出プローブを含む。
本実施形態の別の態様において、該キットは、
オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的検体に対する特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドを備え、ＤＮＡバーコードは、少なくとも２つの部分を有する配列を有し、粒子に結合されたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分に相補的である配列を有し、特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分に相補的である配列を有し、ＤＮＡバーコードは、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部および特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする粒子複合体プローブを含む少なくとも１つの容器、ならびに検出可能な変化を確認するための任意選択の基体を含む。
本実施形態の別の態様において、該キットは、
オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および特定の標的検体に対する特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドを備え、（ｉ）ＤＮＡバーコードは、少なくとも２つの部分を有する配列を有し、（ｉｉ）粒子に結合されたオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかは、ＤＮＡバーコードの第１の部分に相補的である配列を有し、（ｉｉｉ）特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分に相補的である配列を有し、（ｉｖ）それぞれの種類の粒子複合体プローブにおけるＤＮＡバーコードは、異なる配列であり、特定の標的検体に対する識別子として機能する配列を有する１種類の粒子複合体プローブを収容した少なくとも１つまたは複数の容器を含み、該キットは、場合によって、検出可能な変化を確認するための基体を含む。
本実施形態の別の態様において、該キットは、
少なくとも１対の容器および検出可能な変化を確認するための任意選択の基体を含み、
該対の第１の容器は、オリゴヌクレオチドが結合した粒子、および少なくとも２つの部分からなる配列を有するＤＮＡバーコードを備えた粒子プローブを含み、粒子に結合されたオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかは、ＤＮＡバーコードの第１の部分に相補的である配列を有し、
該対の第２の容器は、ＤＮＡバーコードの第２の部分に相補的である配列を有するオリゴヌクレオチドであって、標的検体の特異的結合対相補体と共有結合するために使用することができる部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。
本実施形態の別の態様において、該キットは、
少なくとも２対以上の容器を含み、
それぞれの対の該第１の容器は、オリゴヌクレオチドが結合した粒子、および少なくと
も２つの部分からなる配列を有するＤＮＡバーコードを有する粒子複合体プローブを含み、粒子に結合されたオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかは、少なくとも２つの部分を有するＤＮＡバーコードの第１の部分に相補的である配列を有し、
それぞれの対の該第２の容器は、ＤＮＡバーコードの第２の部分に相補的である配列を有するオリゴヌクレオチドであって、標的検体の特異的結合対相補体と共有結合するために使用することができる部分を有するオリゴヌクレオチドを含み、
粒子複合体プローブの種類についてのＤＮＡバーコードは、異なる配列であり、標的検体に対する識別子として機能する配列を有し、該キットは、場合によって、検出可能な変化を確認するための基体を含む。
本実施形態の別の態様において、該キットは、
第１の容器および少なくとも２対以上の容器を含み、
該第１の容器は、オリゴヌクレオチドが結合した粒子を有する粒子複合体プローブを含み、
該対の第１の容器は、少なくとも２つの部分からなる配列を有するＤＮＡバーコードを含み、粒子に結合されたオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかは、ＤＮＡバーコードの第１の部分に相補的である配列を有し、
それぞれの対の該第２の容器は、ＤＮＡバーコードの第２の部分に相補的である配列を有するオリゴヌクレオチドであって、標的検体の特異的結合対相補体と共有結合するために使用することができる部分を有するオリゴヌクレオチドを含み、
それぞれの対の容器の該第１の容器内に存在するＤＮＡバーコードは、標的検体に対する識別子として機能し、別の対の容器内のＤＮＡバーコードと異なる配列を有し、該キットは、場合によって、検出可能な変化を確認するための基体を含む。
本実施形態の別の態様において、該キットは、
特定の標的検体の存在に対する識別子として機能するオリゴヌクレオチド配列を含む。
上記キットに、検査をまとめ、また実施するための使用説明書を含めることができる。
数詞を表さないものは、そのものが１つまたは複数であることを指すことに留意されたい。例えば、「１つの特性」とは、１つまたは複数の特性あるいは少なくとも１つの特性を指す。このように、用語「１つの（ａまたはａｎ）」、「１つまたは複数の」、および「少なくとも１つの」は、本明細書では同義的に使用される。用語「からなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、同義的に使用されていることにも留意されたい。以下の実施例は、例示を目的とするものにすぎず、本発明の趣旨または範囲を限定するものと決して解釈すべきではない。
オリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子の調製
Ａ．金ナノ粒子の調製
オリゴヌクレオチド修飾した１３ｎｍの金粒子を、文献の方法によって調製した（〜１１０個のオリゴヌクレオチド／粒子）１８〜２０。金コロイド（直径１３ｎｍ）は、フレンス（Ｆｒｅｎｓ）、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｈｙｓ．Ｓｃｉ．、第２４１巻、２０頁（１９７３年）およびグラバール（Ｇｒａｂａｒ）、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、第６７巻、７３５頁（１９９５年）に記載のようにＨＡｕＣｌ４のクエン酸塩の還元によって調製した。簡潔に説明すると、すべてのガラス器具を王水（ＨＣｌを３部、ＨＮＯ３を１部）で洗浄し、ナノピュア水ですすぎ、次いで使用前にオーブンで乾燥した。ＨＡｕＣｌ４およびクエン酸ナトリウムは、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から購入した。ＨＡｕＣｌ４の水溶液（１ｍＭ、５００ｍＬ）を撹拌しながら還流させ、次いで３８．８ｍＭクエン酸３ナトリウム溶液５０ｍＬを素早く加えると、溶液の色が淡黄色から深赤色に変化した。変色後、溶液をさらに１５分還流し、室温まで冷却させ、続いてＭｉｃｒｏｎ Ｓｅｐａｒａ
ｔｉｏｎｓ社の０．４５μｍナイロンフィルタで濾過した。金コロイドの特徴は、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ社の８４５２Ａダイオードアレイ分光光度計を用いる紫外可視分光法、およびＨｉｔａｃｈｉ ８１００透過型電子顕微鏡を用いる透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によって明らかにした。直径１３ｎｍの金粒子の典型的な溶液は、５１８〜５２０ｎｍに中心がある特徴的な表面プラズモンバンドを示した。直径１３ｎｍの金粒子は、１０〜７２ヌクレオチドの範囲の標的およびプローブオリゴヌクレオチド配列と凝集した場合に目に見える変色を生じる。
Ｂ．オリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドは、ホスホアミダイト化学反応を用いる単一カラム式のＭｉｌｌｉｇｅｎｅ Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ＤＮＡ合成装置を用い、１マイクロモルのスケールで合成した。エクスタイン エフ（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ Ｆ．）（編）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９９１年）。すべての溶液はＭｉｌｌｉｇｅｎｅ社から購入した（ＤＮＡ合成用）。平均カップリング効率は９８から９９．８％まで変化し、最後のジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基はオリゴヌクレオチドから切断せず、精製に役立てた。
３’チオール−オリゴヌクレオチドの場合には、Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ３
Ｓ−Ｓ ＣＰＧ支持体をＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社から購入し、自動合成装置で使用した。最後のジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基は除去せず、精製に役立てた。合成後、担持されたオリゴヌクレオチドを濃水酸化アンモニウム１ｍＬ中に５５℃で１６時間置き、固体支持体からオリゴヌクレオチドを切断し、塩基から保護基を除去した。
アンモニアを蒸発させた後、２５４ｎｍにおけるＤＮＡの紫外シグナルをモニターしながら、流速１ｍＬ／分で０．０３Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）、ｐＨ７および９５％ＣＨ３ＣＮ／５％０．０３Ｍ ＴＥＡＡの１％／分グラジエントによるＨＰ ＯＤＳ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ（登録商標）カラム（５μｍ、２５０×４ｍｍ）を用いた分取用逆相ＨＰＬＣによってオリゴヌクレオチドを精製した。ＤＭＴ保護された１２塩基の修飾オリゴマーの保持時間は３０分であった。続いて、精製オリゴヌクレオチドを８０％酢酸溶液中に３０分間浸漬することによってＤＭＴを切断し、続いて蒸発させた。オリゴヌクレオチドを水５００μＬ中に再分散させ、その溶液を酢酸エチル（３×３００μＬ）で抽出した。溶媒の蒸発後、オリゴヌクレオチド（１０ＯＤ）を５０℃において一晩、０．０４Ｍ ＤＴＴ、０．１７Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８）溶液１００μＬ中に再分散させ３’ジスルフィドを切断した。この溶液（＜１０ＯＤ）の一定量を脱塩用ＮＡＰ−５カラムにより精製した。オリゴヌクレオチドの量は、２６０ｎｍにおける吸光度によって決定した。純度は、２５４ｎｍにおけるＤＮＡの紫外シグナルをモニターしながら、流速１ｍＬ／分で１０ｍＭ ＮａＯＨ（ｐＨ１２）および１０ｍＭ ＮａＯＨの２％／分グラジエントによるＤｉｏｎｅｘ Ｎｕｃｌｅｏｐａｃ（登録商標）ＰＡ−１００カラム（２５０×４ｍｍ）を用いるイオン交換ＨＰＬＣによって評価した。保持時間（Ｔｒ）が１８．５、１８．９および２２分である３本のピークが観察された。Ｔｒ＝２２．０分の主要な単一ピークはジスルフィドによるものとされ、面積で７９％であった。より短い１８．５および１８．９分という保持時間の２本のピークは、面積がそれぞれ〜９％および１２％であり、酸化された不純物および残留チオールオリゴヌクレオチドによるものとされた。
５’アルキルチオール修飾オリゴヌクレオチドは、以下のプロトコルを用いて調製した。１）ＣＰＧに結合し、脱トリチル化されたオリゴヌクレオチドは、標準的手順を用いる自動ＤＮＡ合成装置（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ）で合成した；２）ＣＰＧカートリッジを取り外し、使い捨てタイプのシリンジを両端に接続した；３）５−Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６−ホスホアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）２０μＭを含有する乾燥
アセトニトリル溶液２００μＬを標準的「テトラゾール活性化剤溶液」２００μＬと混合し、シリンジのうち１本を経由してオリゴヌクレオチド−ＣＰＧが入ったカートリッジ中に導入した；４）同溶液を、カートリッジ内でゆっくりと１０分間前後運動させ、次いで排出し、続いて乾燥アセトニトリル（２×１ｍＬ）で洗浄した；５）ＴＨＦ／ピリジン／水に溶かした０．０２Ｍヨウ素７００μＬで中間体のホスファイトを酸化し（３０秒）、続いてアセトニトリル／ピリジン（１：１、２×１ｍＬ）および乾燥アセトニトリルで洗浄した。次いで、３’−アルキルチオールオリゴヌクレオチドで記載したように、トリチルオリゴヌクレオチド誘導体を分離し精製した。次いで、乾燥オリゴヌクレオチドサンプルに５０ｍＭ ＡｇＮＯ３溶液１５μＬ（１０ＯＤの場合）を加えることによって（２０分間）トリチル保護基を切断すると、乳白色の懸濁液が得られた。ＤＴＴの１０ｍｇ／ｍＬ溶液２０μＬを加えることによって過剰の硝酸銀を除去すると（５分の反応時間）、直ちに黄色の沈殿を生成し、これを遠心分離によって除去した。次いで、オリゴヌクレオチド溶液（＜１０ＯＤ）の一定量を精製のために脱塩用ＮＡＰ−５カラムに移した。得られた５’アルキルチオールオリゴヌクレオチドの最終的な量および純度は、３’アルキルチオールオリゴヌクレオチドについて前述した技法を用いて評価した。イオン交換ＨＰＬＣによって２本の主要ピークが観察され、保持時間は１９．８分（チオールのピーク、面積で１６％）および２３．５分（ジスルフィドのピーク、面積で８２％）であった。
Ｃ．オリゴヌクレオチドの金粒子への取り付け
金コロイドの水溶液１ｍＬ（１７ｎＭ）を、水に溶かした過剰（３．６８μＭ）のチオール−オリゴヌクレオチド（長さ２２塩基）と混合し、混合物を室温に１２〜２４時間放置した。次いで、溶液を０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）とし、４０時間放置した。この「エージング」ステップは、チオール−オリゴヌクレオチドによる表面被覆率を増大させ、金表面からオリゴヌクレオチド塩基を解離させるために設計された。次に、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５４１４において１４，０００ｒｐｍで約２５分間溶液を遠心分離すると、（２６０ｎｍにおける吸光度が示すように）大部分のオリゴヌクレオチドを含有する極めて淡いピンク色の上清が（５２０ｎｍにおける吸光度が示すように）７〜１０％のコロイド状の金とともに、およびチューブの底には堅くしまり暗色のゼラチン状の残渣が得られた。上清を除去し、緩衝液（１０ｍＭリン酸塩、０．１Ｍ ＮａＣｌ）約２００μＬ中に残渣を再懸濁し、再度遠心分離した。上清溶液を除去後、残渣を緩衝液（１０ｍＭリン酸塩、０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％ＮａＮ３）１．０ｍＬ中に入れた。得られた赤色のマスター溶液は、室温で数ヶ月の放置、シリカ薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）プレート上へのスポッティング（実施例４を参照のこと）、および１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、または高濃度のサケ***ＤＮＡを含有する溶液への添加に際して安定であった（すなわち、赤色のままであり凝集しなかった）。
ハプテン修飾オリゴヌクレオチドの調製
ハプテン修飾オリゴヌクレオチドは、標準的な固相ＤＮＡ合成手順を用い、Ａ１の場合にはビオチン−トリエチレングリコールホスホアミダイトおよびＢ１の場合には２，４−ジニトロフェニル−トリエチレングリコールホスホアミダイト（Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ社）で調製した２１。
ビオチン修飾オリゴヌクレオチドは、以下のプロトコルを用いて調製した：ＣＰＧに結合し、脱トリチル化されたオリゴヌクレオチドは、標準的手順２１を用いる自動ＤＮＡ合成装置（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ）で合成した。次いで、ＣＰＧカートリッジを取り外し、使い捨てタイプのシリンジを両端に接続した。ビオチン−トリエチレングリコールホスホルアミダイト２０μｍｏｌｅを含有する乾燥アセトニトリル溶液２００μＬを標準的「テトラゾール活性化剤溶液」２００μＬと混ぜ、シリンジのうち１本を経由してオリゴヌクレオ
チド−ＣＰＧが入ったカートリッジに導入した。同溶液を、カートリッジ内でゆっくりと１０分間前後運動させ、次いで排出し、続いて乾燥アセトニトリル（２×１ｍＬ）で洗浄した。その後、ＴＨＦ／ピリジン／水に溶かした０．０２Ｍヨウ素７００μＬで中間体のホスファイトを酸化し（３０秒）、続いてアセトニトリル／ピリジン（１：１、２×１ｍＬ）および乾燥アセトニトリルで洗浄し、続いて窒素流でカラムを乾燥した。トリチル保護基は除去せず、精製に役立てた。担持されたオリゴヌクレオチドを濃水酸化アンモニウム１ｍＬ中に５５℃で１６時間置き、固体支持体からオリゴヌクレオチドを切断し、塩基から保護基を除去した。アンモニアを蒸発後、２５４ｎｍにおけるＤＮＡの紫外シグナルをモニターしながら、流速１ｍＬ／分で０．０３Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）、ｐＨ７および９５％ＣＨ３ＣＮ／５％０．０３ＭのＴＥＡＡの１％／分グラジエントによるＨＰ ＯＤＳ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ（登録商標）カラム（５μｍ、２５０×４ｍｍ）を用いる分取用逆相ＨＰＬＣによってオリゴヌクレオチドを精製した。ＤＭＴで保護されたオリゴヌクレオチドの保持時間は〜３２分であった。続いて、精製オリゴヌクレオチドを８０％酢酸溶液中に３０分間浸漬することによってＤＭＴを切断し、続いて蒸発させた。オリゴヌクレオチドを水５００μＬ中に再分散させ、その溶液を酢酸エチル（３×３００μＬ）で抽出し乾燥した。同様のプロトコルを用い、２，４−ジニトロフェニル−トリエチレングリコールホスホアミダイトを用いてＤＮＰ修飾オリゴヌクレオチドを合成した。
ナノ粒子複合体プローブを用いるアッセイ
オリゴヌクレオチドで修飾した１３ｎｍの金粒子を、実施例１に記載のように調製した。ハプテン修飾オリゴヌクレオチドを、標準的な固相ＤＮＡ合成手順２１を用い、Ａ１の場合にはビオチン−トリエチレングリコールホスホアミダイトおよびＢ１の場合には２，４−ジニトロフェニル−トリエチレングリコールホスホアミダイト（Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ社）で実施例２に記載のように調製した。本研究で用いるＰＢＳ緩衝溶液は、０．３Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）からなる。ＩｇＥおよびＩｇＧ１は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社（米国ウィスコンシン州ミルウォーキー）から購入し、使用前に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０およびバックグラウンドタンパク質（１０ｕｇ／ｍｌリゾチーム、１％ウシ血清アルブミン、および５．３ｕｇ／ｍｌ抗ジゴキシン；各１０ｕＬ）を含む０．３Ｍ ＰＢＳ緩衝液に溶かした（最終濃度：４．３×１０−８ｂ／μｌ）。
プローブを調製するため、オリゴヌクレオチド修飾粒子（１３ｎＭ、３００μＬ）を、図１に配列を示すハプテン修飾相補オリゴヌクレオチド（１０μＭを１０μＬ）およびバイオバーコードＤＮＡ（１０μＭを１０μＬ）と室温で２〜３時間ハイブリダイズさせた。未反応のハプテン修飾オリゴヌクレオチドおよびバイオバーコードを、ナノ粒子プローブの遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、２０分）および続く上清のデカンテーションによって除去した。
ＩｇＥおよび／またはＩｇＧ１の典型的なアッセイでは、プローブ（〜１３ｎＭ）を含有する溶液に標的タンパク質（各々４３μｇ／ｍｌを４０μｌ）を加え、混合物を３７℃で５０分間インキュベートしてタンパク質−ハプテン複合体形成を促進した。すべての成分、特に相補ＤＮＡ鎖間の完全な反応を確実にするため、溶液を−１５℃で２０分間インキュベートしてハイブリダイゼーションを促進し（Ｂｏｅｋｅｌ社製Ｔｒｏｐｉｃｏｏｌｅｒ（登録商標）Ｈｏｔ／Ｃｏｌｄブロックインキュベータ）、４℃で２４時間保存した。標的タンパク質が存在する場合には、粒子凝集が起こり、沈殿とともに金ナノ粒子プラズモンバンドのシフトおよび赤色から紫色への変色をもたらす。ハイブリダイズした生成物を遠心分離し（３０００ｒｐｍで２分間）、未反応成分を含有する上清を分析に先立ってデカンテーションにより除去した。どのタンパク質が存在するかを決定するため、温度
の関数として２６０ｎｍにおける吸光度をモニターする融解分析を溶液中で行う（図２）。前述のプロトコルによりＩｇＧ１をプローブで処理する場合、溶液はピンクがかった青色に変化し、ナノ粒子凝集体の生成を示す。標的タンパク質は存在しないがバックグラウンドタンパク質が存在する対照実験では、識別可能な沈殿は認められない。溶液の融解分析は、融解温度（Ｔｍ）５５℃とともに鋭い相転位を示している。これは、ＩｇＧ１標的についての予想相転位である（図２Ａ（点線））。新たなプローブ溶液にＩｇＥを添加すると、同様の変色が観察されるが、融解分析からは、この標的について予想される相転位であるＴｍ３６℃を伴う曲線が得られる（図２Ａ（実線））。注目すべきことに、プローブ溶液に両方のタンパク質標的を添加すると、溶液は濃紫色に変化し、融解分析は、２つの明確なトランザクションを示す。この曲線の一次導関数は、それぞれ３６および５５℃に中心のある２つのピークを示す（図２Ｂ）。このことは、２つの別個の会合体が生成し、オリゴヌクレオチドバーコードに由来するそれらの融解特性を用いて２つのタンパク質標的を区別することが可能であることを示している。
ナノ粒子複合体プローブを用いるアッセイ
この戦略の変形形態を用い、前述のシステムの感度を増加させ、１溶液中で調べることが可能である標的数を増やすことが可能である（図３）。この戦略により、ＤＮＡバイオバーコードを用いてタンパク質標的を間接的に検出することが可能である。１２ｍｅｒオリゴヌクレオチドは、４１２種類の異なる配列を有し、それらの多くを用いて図１Ａに示すように目的の多価タンパク質用のバーコードを調製することが可能である。アッセイのこの変形形態では、生成する凝集体の融解特性を溶液中では測定せず、遠心分離（３０００ｒｐｍで２分間）により未反応のプローブおよび標的分子から凝集体内のＤＮＡバイオバーコードを分離する。次いで、溶液に水を加えることによって凝集体を変性させ、複合体形成したＤＮＡを遊離させる。粒子およびタンパク質は、遠心濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）ＹＭ−１００、３５００ｒｐｍで２５分間）によってＤＮＡバーコードから分離することが可能である。ＤＮＡバーコードを分離したら、それらをオリゴヌクレオチドアレイ上に捕獲し、多くのＤＮＡ検出アッセイのうちの１つを用いて同定することが可能である（図３）。本願明細書に記載のＩｇＧ１およびＩｇＥに関する実施例の場合には、該バーコードの半分と相補的であるオリゴヌクレオチドで機能化された（直径２５０μｍのスポット）顕微鏡用スライド上にバーコードを捕獲する（図１のＡ３およびＢ３）。バーコードがオリゴヌクレオチドアレイによって捕獲されると、バーコードの残りの部分と相補的であるＤＮＡ修飾粒子をアレイとハイブリダイズさせることが可能である（実験の項を参照）。標準的なスキャン測定の手法［１１］（写真現像溶液による処理を含む）により現像されれば、フラットベッドスキャナを用いて結果を定量することが可能である（図４）１１。ＩｇＧ１が存在する場合には、ＩｇＧ１のために設計されたスポットのみが測定可能なシグナルを示す。同様に、ＩｇＥが存在する唯一のタンパク質である場合には、ＩｇＥのために設計されたスポットのみがシグナルを示す。最後に、両方のタンパク質が存在する場合には、両スポットが強いシグナルを示す。
スキャン法によるＤＮＡバイオバーコード検出の場合には、ＤＮＡ／金ナノ粒子会合体をポリスチレンの１．５ｍＬバイアル中で遠心分離し（３０００ｒｐｍで２分間）、上清を除去した。凝集体にＰＢＳ緩衝溶液（７００μｌ）を加え、この手順を繰り返して未反応タンパク質およびアッセイ成分から凝集体を確実に分離した。次いで、凝集体の入ったバイアルに水５００μｌを加えて凝集体を変性させた。マイクロアレイを用意し、文献の方法に従ってＤＮＡハイブリダイゼーション法を用いた１１、２２。分離したＤＮＡバイオバーコードを、Ａ２修飾ナノ粒子またはＢ２修飾ナノ粒子（２ｎＭ）と予め混合し、ＤＮＡマイクロアレイに曝露し、ハイブリダイゼーション用チャンバ（ＧＲＡＣＥ ＢＩＯ−ＬＡＢＳ社）中で室温で３時間インキュベートした。次いで、０．３Ｍ ＮａＮＯ３および１０ｎＭのＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ４）でアレイを洗浄し、室
温で３分間Ｓｉｌｖｅｒ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ社）中に浸した。スライドを水で洗浄し、次いでフラットベッドスキャナで分析した
ナノ粒子複合プローブを用いたアッセイ
バイオバーコードＰＣＲ（ＢＰＣＲ）プロトコルを実行して、タンパク質標的である遊離前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を３ａＭの感度で検出した（図６）。これはＰＳＡを検出するための現行の従来の臨床アッセイよりも感度が６桁大きい（４６）。ｐＨ９．０の１３ｎｍ金ナノ粒子水溶液（コロイド懸濁液中の１０ｍｌの１３ｎＭ溶液、クエン酸（〜３８ｍＭ）で安定化させた）にポリクローナル抗ＰＳＡ抗体（７μｇ）を添加することによってナノ粒子検出プローブを調製した。２０分後、抗ＰＳＡ修飾ナノ粒子をアルキルチオールでキャップしたバーコードＤＮＡ捕獲鎖（０．２ＯＤ；５’ＣＡＡ ＣＴＴ ＣＡＴ ＣＣＡ ＣＧＴ ＴＣＡ ＡＣＧ ＣＴＡ ＧＴＧ ＡＡＣ ＡＣＡ ＧＴＴ ＧＴＧ Ｔ−Ａ１０−ＳＨ３’配列番号９）と１２時間反応させ、次いでｐＨ７の ０．１ＭのＮａＣｌ／０．０１Ｍリン酸緩衝液まで塩で安定化させた。続いて、この溶液を１ｍｌの１０％ＢＳＡ溶液で２０分間処理して金ナノ粒子を不活化および安定化させた。この最終溶液を４℃で１時間遠心分離し（２０，０００ｇ）、上清を除去した。この遠心分離手順を繰り返してさらに精製した。次いで、このＰＳＡ特異的バーコードＤＮＡ鎖（１ＯＤ；５’ＡＣＡ ＣＡＡ ＣＴＧ ＴＧＴ ＴＣＡ ＣＴＡ ＧＣＧ ＴＴＧ ＡＡＣ ＧＴＧ
ＧＡＴ ＧＡＡ ＧＴＴ Ｇ３’ 配列番号１０）をナノ粒子と調整したバーコードＤＮＡ捕獲鎖と反応させ、同様の遠心分離手順を用いて精製した。
アミノ基で官能化した直径１μｍの磁性微粒子をＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社から入手した。次いで、市販のグルタルアルデヒド−アミンカップリング化学反応を用いこれらをタンパク質と結合させた。ＵＶ−ｖｉｓ分光分析によってタンパク質が粒子に結合する前後の２７０ｎｍでの吸光度を比較することによってカップリング効率は９０％であると決定した。この粒子、すなわち磁性捕獲プローブを使用前に４０ｍｌの０．１ＭのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中に懸濁させた。
典型的なＰＳＡ検出試験では（図６Ｂ）、モノクローナル抗ＰＳＡ抗体で官能化した磁性捕獲プローブの水分散液（５０μｌの３ｍｇ／ｍｌ磁性プローブ溶液）を遊離ＰＳＡ（１０μｌのＰＳＡ）の水溶液（０．１ＭのＰＢＳ）と混合し、３７℃で３０分間撹拌した（図６Ｂのステップ１）。磁界を加えることによって、ＰＳＡ結合磁性検出プローブを未結合のＰＳＡから容易に分離することができる。磁気分離を生じさせるために、このアッセイ溶液を入れた１．５ｍｌの管を室温でＢｉｏＭａｇ（登録商標）微小遠心管分離器（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に入れる。１５秒後、磁性捕獲プローブ−ＰＳＡハイブリッドが管の壁上に濃縮される。上清（未結合のＰＳＡ分子の溶液）を除去し、この時点では管の側部でペレット状である磁性捕獲プローブを５０μｌの０．１ＭのＰＢＳに再懸濁させる（２回繰り返す）。次いで、ポリクローナル抗ＰＳＡ 抗体およびハイブリッドバーコードＤＮＡ鎖で官能化したナノ粒子検出プローブ（１ｎＭで５０μｌ）を添加する。この検出プローブは捕獲プローブ上に固定化されたＰＳＡと反応し、シグナル増幅およびタンパク質同定用のＤＮＡ鎖を提供する（図６Ｂのステップ２）。この溶液を３７℃で３０分間激しく撹拌する。次いで、磁気分離器を用いてこの磁性微粒子を０．３ＭのＰＢＳで洗浄し、磁性微粒子を分離した。このステップを４回（各時１分間を要する）繰り返し、（ＰＳＡ結合ナノ粒子検出プローブとともに）磁性捕獲プローブを除くすべてを除去する。最後の洗浄ステップ後、磁性捕獲プローブをナノピュア（１８ＭΩ）水（５０μｌ）中に再懸濁させてナノ粒子検出プローブ表面からバーコードＤＮＡ鎖を２分間脱ハイブリダイズさせる。ここで、脱ハイブリダイズさせたバーコードＤＮＡは容易に分離され、磁気分離器を用いてプローブから収集される（図６Ｂのステップ３）。
バーコードＤＮＡ増幅のために（図６Ｂのステップ４）、分離したバーコードＤＮＡを適したプライマーを含んだＰＣＲ反応混合物（最終容量２０μｌ）に添加し、次いで以下の手順に従ってこの溶液を熱サイクル試験する。０．３μｌの適したプライマー（各２５μＭ、プライマー１：５’ＣＡＡ ＣＴＴ ＣＡＴ ＣＣＡ ＣＧＴ ＴＣＡ ＡＣ３’配列番号１１、プライマー２：５’ＡＣＡ ＣＡＡ ＣＴＧ ＴＧＴ ＴＣＡ ＣＴＡ ＧＣ３’配列番号１２）、０．４μｌのＤＭＳＯ（最終濃度２％）、およびＥａｓｙＳｔａｒｔ（商標）系（５Ｕ／μｌ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）と互換性があることが示されるポリメラーゼである０．１μＬのＴａｑＤＮＡポリメラーゼとともに、遊離バーコードＤＮＡのアリコート（８．９μｌ）をＥａｓｙＳｔａｒｔ（商標）Ｍｉｃｒｏ２０ＰＣＲ Ｍｉｘ−ｉｎ−Ａ−Ｔｕｂｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、カリフォルニア州サンディエゴ）の１番上のワックス層に加えて最終容量を２０μｌとする。ＰＣＲ反応混合物の最終濃度は次の通り：プライマー１および２は０．３７μＭ；ｄＮＴＰ混合物は０．２ｍＭ；ＰＣＲ緩衝液は１Ｘ；およびＭｇＣｌ２は２ｍＭ。次いで、ＰＣＲ管を熱サイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）に装填し、９４℃で７分間「ホットスタート」に供し、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間および７２℃で１分間を２５回熱サイクルにかけ、最終的に７２℃で７分間熱サイクルにかけた後で４℃でソークした。
まず対照試験を行って、ＰＣＲ増幅後にプライマーの二量体形成を評価した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加して偽のハイブリダイズしたプライマーの融点を下げ、プライマーの二量体形成および増幅の可能性を最小化した。（図７、レーン１〜５およびレーン６〜１０では０〜２％左から右に０．５％増大）。また、熱サイクルの回数を２５に設定した。図７に示すように、バーコードＤＮＡ単位複製配列（レーン１〜５）を有する明白なバンドが存在する一方で、ポリメラーゼの存在下でプライマーのみを熱サイクルにかけたときにはバンドが観察されない（レーン６〜１０）。したがって、バーコードＤＮＡについて増幅を維持している間はその濃度では観察できるバンドの痕跡が存在しないので（図７、レーン１０）、２％ＤＭＳＯをＢＰＣＲ反応すべてに添加した。
このバーコードＤＮＡ単位複製配列をエチジウムブロマイドで染色し、ゲルローディングダイと混合した。次いで、ゲル電気泳動を行って増幅が生じたかどうかを決定した（図８、パネルＡおよびＣ）。すべての電気泳動試験について、ＰＣＲ混合物のアリコート（１５μｌ）をエチジウムブロマイド（１ｍｇ）で染色し、ゲル電気泳動ローディングダイ（３μｌ、６Ｘ、Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マジソン）と混合し、１Ｘ ＴＡＥランニング緩衝液中でゲル電気泳動を行った（２％アガロースゲル、１１０Ｖ、３５分間）。バーコード標準液（１μｌ、６μＭのバイオバーコード二本鎖）を基準用のゲルに添加した。バイオバーコードＤＮＡを０．３ＭのＰＢＳ中のその相補鎖に加えることによってこのバイオバーコード標準液（４０ｍｅｒ）を作成した。ゲル画像およびバンド強度の決定はすべてＫｏｄａｋＤＣ−１２０デジタルカメラおよびＫｏｄａｋ ＩＤ２．０．２イメージングソフトウェアを用いて行った。電気泳動後、エチジウムブロマイドにゲルを３５分間浸漬することによって（１Ｘ ＴＡＥランニング緩衝液中の０．５μｇ／ｍｌ）ゲルのバンドもエチジウムブロマイドで染色し、電気泳動を得る前にエチジウムブロマイドをＰＣＲ反応に添加した場合の結果と同様の定量的な結果が得られた。
エチジウムブロマイドで染色されたバンドの相対強度により、ＰＳＡ相対濃度を推定することが可能となる（図８、パネルＢおよびＤ）。ＰＣＲ単位複製配列の染色強度は３００ａＭ、３ｆＭ、３０ｆＭ、３００ｆＭ、３ｐＭおよび３０ｐＭのレーン３〜８のＰＳＡ濃度をそれぞれ表す。ＰＳＡが存在しないときにＢＰＣＲはごく僅かしかシグナルを発生しなかったので（図８、パネルＡのレーン１および２、パネルＣのレーン１）、ナノ粒子プローブの磁性プローブに対する非特異的結合は無視してよいものでった。パネルＢによれば、対照バンドの強度はＰＳＡが存在しているバンドよりも少なくとも８倍低い。低い
濃度（図８、パネルＢ、それぞれ３ａＭ〜３００ｆＭ、レーン２〜７）ＰＳＡ検出を表すグラグでは、３ａＭ（レーン２）に相当するゲルバンドは陰性対照（レーン１）よりも２．５倍高い相対強度を有する。
ナノ粒子複合プローブを用いたアッセイ
ゲル電気泳動を定期的に用いてアッセイの結果を分析したが、一般にスキャン法はより高い感度を提供し、ゲルベースの方法よりも実施が容易である。したがって、スキャンアッセイの結果をここで報告する。標的バーコード配列（４０ｍｅｒ）の半分と相補的であるチップ固定化ＤＮＡ２０ｍｅｒを用いて、増幅されたバーコードＤＮＡ配列を捕獲し、金ナノ粒子を用いてサンドイッチアッセイフォーマットの配列の他方の半分を標識した。バーコードＤＮＡとチップ表面と金ナノ粒子プローブとの間をハイブリダイズするためには、この増幅された二本鎖バーコードＤＮＡをまず変性させなければならない。このため、バーコードＤＮＡ単位複製配列を元のＰＣＲ管から取り出し、金ナノ粒子プローブの溶液（５μｌ、０．３ＭのＰＢＳ中１０ｎＭ）に（５μｌ）添加した。この溶液を０．３ＭのＰＢＳ（９０μｌ）を用いて清潔な０．２ｍｌＰＣＲ管の中で最終容量１００μｌまで希釈した。バーコードＤＮＡ一本鎖（４０ｍｅｒ）およびナノ粒子結合相補体（２０ｍｅｒ）をハイブリダイズさせるために、ＰＣＲ管をサーマルサイクラーに加え、９５℃まで３分間加熱してバーコードＤＮＡ二本鎖を変性させ、次いで、４５℃のハイブリダイゼーション温度間で２分間冷却してナノ粒子プローブをそのバーコードＤＮＡ相補配列に結合した。この混合物をＰＣＲ管から取り出して、捕獲鎖（２０ｍｅｒ）が固定化されたマイクロアレイ化した（ＧＭＣ４１７ Ａｒｒａｙｅｒ、Ｇｅｎｅｔｉｃ ＭｉｃｒｏＳｙｓｔｅｍｓ社）チップに加えた。１００μｌハイブリダイゼーションウェル（Ｇｒａｃｅ ＢｉｏＬａｂｓ社、オレゴン州ベンド）を有するアレイの活性領域の上に各実験用の試験溶液を湿度室中で４５分間閉じ込めた。ハイブリダイゼーション後、ｐＨ７．０の０．１ＭのＮａＮＯ３／０．０１Ｍのリン酸緩衝液で４５℃でチップを濯いで余分な金粒子を除去した（２回繰り返した）。次いで、ナノ粒子プローブをハイブリダイズさせたチップを銀増強液を用いて銀増幅に供し（反応時間６分、Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ社、カリフォルニア州レディング）、ナノピュア（１８ＭΩ）水で濯ぎ、ベンチトップ型遠心分離を用いて乾燥させた。金ナノ粒子を結合した後に銀増幅を行うことにより、現像されたスポットから散乱される光を測定するＶｅｒｉｇｅｎｅ ＩＤシステム（Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ社）を用いて読み取ることのできるグレースポットが得られる１１，５１。この方法を用いれば、３００ｆＭ〜３ａＭの標的ＰＳＡ濃度を容易に検出すうることができる（図９）。３ａＭの試料は試料全体中の１８個のタンパク質分子と相関する。非相補的な捕獲ＤＮＡ（５’ＳＨ−Ｃ６−Ａ１０−ＧＧＣＡＧＣＴＣＧＴＧＧＴＧＡ−３’ 配列番号１３）を有する（図９、スポット鋳型）対照スポットからシグナルがないことおよびＰＳＡが存在しないときに（図９、対照）識別可能なシグナルが殆どないという観察結果から明らかなように、バーコードＤＮＡ配列に対する選択性は優れている。
ＢＰＣＲを用いたタンパク質検出の理論的限界
ＢＰＣＲを用いたタンパク質検出の論理的下限を試験するために、ＰＣＲ増幅についてのバーコードＤＮＡ濃度の希釈系列を用いてＰＣＲ／ゲル電気泳動を実施した（図１０）。バーコードＤＮＡ単位複製配列が存在したときのシグナルは、たった３０コピーのＤＮＡバーコードをＰＣＲ反応に加えた場合（レーン９）でも対照バンド（レーン１０）から完全に識別可能である。各ナノ粒子プローブが約５０本のバーコードＤＮＡ鎖を有すると仮定すれば、理論的にはＢＰＣＲは結合した単一のナノ粒子プローブで検出シグナルを発生することができる。
複合培地中のＰＳＡの検出
臨床セッティングにより匹敵する試料溶液におけるＢＰＣＲ増幅法の適用可能性を実証するために、ＰＳＡ標的をヤギ血清に溶解することによって実施例５および６に記載のようなアッセイを行い、ＢＰＣＲ増幅ステップ後にバーコードを検出した。ＰＳＡを０．１ＭのＰＢＳ中に連続的に希釈し、次いで未希釈のヤギ血清（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社、オハイオ州オーロラ）に添加した。このヤギ血清は１Ｘの生理食塩緩衝液（例：イオン強度およびｐＨに関する限り、任意の生物系）を効果的に模倣する。
データは、複合培地中で本発明の方法は３０ａＭもの低さの濃度の標的検体（ここではＰＳＡ）を検出することができることを実証している。この濃度で生じたシグナルは対照実験とは明白に識別できる（図１１）。汚染成分の大半を除去することのできる膜でバーコードＤＮＡ試料を濾過する任意のステップを導入することによって、バックグラウンドシグナルを低減することができる。この任意の濾過ステップは、例えば、大きさ（分子量）、形状、電荷または疎水性／親水性などの任意の方法によって不純物からバーコードＤＮＡを分離することが可能である。
バーコードＤＮＡ（ＢＰＣＲ増幅されていない）の直接検出および測定
金ナノ粒子（ＮＰ）プローブを実質的に実施例５に記載のように調製した。簡単に言えば、ＰＳＡ（３．５μｇ）へのポリクローナル抗体（Ａｂ）を３０ｎｍの金ＮＰ水溶液（ｐＨ９．０の４０ｐＭのＮＰ溶液１ｍｌ）に添加した。２０分後、Ａｂ修飾ＮＰをアルキルチオールでキャップしたバーコードＤＮＡ捕獲鎖（３０ｎｍの金粒子について１ＯＤ；５’−ＣＡＡ ＣＴＴ ＣＡＴ ＣＣＡ ＣＧＴ ＴＣＡ ＡＣＧ ＣＴＡ ＧＴＧ ＡＡＣ ＡＣＡ ＧＴＴ ＧＴＧＴ−Ａ１０−（ＣＨ２）３−ＳＨ ３’）と１６時間反応させ、次いで塩で０．１ＭのＮａＣｌに安定化させた。この溶液を０．３ｍｌの１０％ＢＳＡ溶液で３０分間処理し、金ＮＰを安定化し、安定化させた。この最終溶液を４℃で１時間遠心分離し（２０，０００ｇ）、上清を除去した。この遠心分離手順を繰り返してさらに精製した。最終的なＮＰプローブをｐＨ７．４の０．１ＭのＮａＣｌ／０．０１Ｍのリン酸緩衝液に再分散させた。次いで、ＰＳＡ特異的バーコードＤＮＡ鎖（１ＯＤ；５’−ＡＣＡ ＣＡＡ ＣＴＧ ＴＧＴ ＴＣＡ ＣＴＡ ＧＣＧ ＴＴＧ ＡＡＣ ＧＴＧ
ＧＡＴ ＧＡＡ ＧＴＴ Ｇ−３’）をＮＰに調整したバイオバーコードＤＮＡ捕獲鎖とハイブリダイズさせ、同様の遠心分離手順を用いて精製した。オリゴヌクレオチドのローディングをデマースら（Ｄｅｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ．）（エル エム デマースら（Ｌ．Ｍ．Ｄｅｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ．）、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．第７２号、５５３５頁（２０００年）を参照）の方法に従って決定した。アミノ基で官能化した直径１μｍのＭＭＰをＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社から入手した。ｍＡｂとＰＳＡに市販のグルタルアルデヒド−アミンカップリング化学反応を用いてＭＭＰを結合させた。ＭＭＰへタンパク質をカップリングする前後の２７０ｎｍでの吸光度を比較することによって、カップリング効率はＵＶ−ｖｉｓ分光分析により９０％であると決定した。このＭＭＰを使用前に４０ｍｌの０．１ＭのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させた。
チップ型アッセイを用いて実施例６に全般に記載のように溶液中のバーコードＤＮＡの量を直接測定したが、ＢＰＣＲによる増幅ステップは用いなかった。ＰＣＲを用いなかったので、この方法はＰＣＲ増幅中に形成される二本鎖ＤＮＡを変性させなくて済む。このため、バーコードＤＮＡのタンパク質検出および分離の後、分離したバーコード試料のアリコート（１０μｌ）を０．６ＭのＰＢＳ（８５μｌ）および１３ｎｍの金検出プローブ（５μｌ、５００ｐＭの最終濃度、上記と同配列）と混合した。上記のような適した捕獲鎖がアレイ化されたＶｅｒｉｇｅｎｅオンチップハイブリダイゼーション室のウェルにこの混合物を加えた。この試料を４２℃で２時間インキュベートした。インキュベート後、反応混合物を取り出し、チップを０．５ＭのＮａＮＯ３／０．０１Ｍリン酸緩衝液で洗浄
して余分な金ナノ粒子を除去した。すべて上記のように、表面固定化金粒子を銀増強液（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ社）で６分間染色し、ナノピュア水で洗浄し、Ｖｅｒｉｇｅｎｅ ＩＤシステムで画像化した。
この例では３０ｎｍの金ＮＰを用いたが、１３ｎｍの金ＮＰをバーコードＤＮＡの直接検出のためのこの手順に使用することも想定される。それにかかわらず、タンパク質検出ステップにおいてＮＰプローブの大きさを大きくすることによって各ＮＰについてのＤＮＡ鎖の数を著しく増大させることができ、直接検出が容易になる（理論上、１００本のＤＮＡ鎖が１３ｎｍの金ＮＰに付着されていると仮定すれば、５３２本ものＤＮＡ鎖が各３０ｎｍの金ＮＰ上にあると考えられる）。特定のナノ粒子プローブの大きさを調節してある種の特徴を最適化することができる。
この結果（図１２）はＢＰＣＲ増幅を行わずに３０ｎｍの金ＮＰ（２０ｐＭで）を用いてＰＳＡ標的が３０アトモルもの低い濃度で直接的に検出可能であったことを実証している。これはＢＰＣＲ増幅法よりも桁違いの感度損があることを示しているが、この方法は依然として非常に感度があり、ＰＣＲステップが不要なことで費用、労力および時間が著しく低減される。
ゼプトモル濃度での標的核酸配列の直接検出
この実験のために、生物テロ用途および生物戦争用途に重要であり、文献６３，６７〜６９で十分に試験されているため、炭疽菌の致死因子に関係するＤＮＡ配列（５’−ＧＧＡ ＴＴＡ ＴＴＧ ＴＴＡ ＡＡＴ ＡＴＴ ＧＡＴ ＡＡＧ ＧＡＴ−３’；配列番号１４）を最初の標的として選択した。２つの対照ＤＮＡ配列［１μＬの１０ ｐＭ（５’−ＣＴＡ ＴＴＡ ＴＡＡ ＴＡＡ ＡＡＴ ＡＴＴ ＴＡＴ ＡＴＡ ＧＣＡ−３’；配列番号１５）および１μＬの１０ｐＭの対照２（５’−ＧＡＡ ＴＴＡ ＴＡＧ ＴＴＡ ＡＣＴ ＡＴＡ ＧＣＴ ＡＡＧ ＧＡＴ−３’；配列番号１６）を２０μＬの試験試料各々に添加した。使用前に、ハイブリダイゼーションによりナノ粒子プローブにバーコードＤＮＡをロードした（４００ｐＭで２０ｎｍのプローブ；２００ｐＭで３０ｎｍのプローブ）。バーコードＤＮＡを１０μＭの濃度で導入して適したハイブリダイゼーション緩衝液中でハイブリダイゼーションを行った。続いて、この粒子を遠心分離し、ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。次いで、プローブを保存用緩衝液中で懸濁させ、使用時まで保存した。
ＭＭＰについては、ポリアミン官能化したポリスチレン粒子を、ＭＭＰ上の１級アミンおよび標的配列の特異的認識結合部位を形成するオリゴヌクレオチド上のチオール基と反応するスルホスクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート（スルホ−ＳＭＰＢ）二官能性リンカーと反応させることによって、アルキルチオールでキャップされたＤＮＡと結合した。使用前に、それを含んだ溶液に１０％ＢＳＡを添加することによって、ウシ血清アルブミンでＭＭＰを不活化した。次いで、このプローブを遠心分離し、ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、２ｍｇ／ｍＬで再懸濁させて活性プローブを得た（図１３Ａ）。
一本鎖形態で標的ＤＮＡを含んだ溶液に５０μＬのＭＭＰプローブ（２ｍｇ／ｍＬで）を添加することによってこのアッセイを行った。この系を室温で１０分間放置した。１０分の放置期間後、５０μＬのＮＰプローブ［４００ｐＭで５０μＬ（２０ｎｍのＮＰプローブ溶液）または２００ｐＭで５０μＬ（３０ｎｍのＮＰプローブ溶液］をこの溶液に加え、５０分間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、この反応容器（ＢｉｏＭａｇ ｍｕｌｔｉ−６微小遠心管分離器、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ペンシルバニア州ウォリントン）に磁界を加えたところ、ＭＭＰおよびＮＰならびに未反応のＭＭＰでサンドイッチされた標的ＤＮＡ鎖が反応容器の壁へ引き寄せられた。未反応の反応溶液成
分、特にＭＭＰに特異的にハイブリダイズされなかったＮＰが残っている場合にはＰＢＳ緩衝液で数回洗い流した。次いで、磁界を取り除き、５０μｌのナノピュア水（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、アイオワ州ドゥビューク）をこの反応容器に加え、この系を５５℃まで３分間加熱してバーコードＤＮＡを放出した。磁界を再度導入して、検出のためにバーコードＤＮＡを残しながら、溶液からＭＭＰをすべて除去した。
最終の反応溶液中のバーコードＤＮＡの量を分析し、同定するために、スキャン法を用いた６７。スキャン法とはオリゴヌクレオチド修飾金ＮＰプローブ（５’−ＴＣＴ ＣＡＡ ＣＴＣ ＧＴＡ ＧＣＴ−Ａ１０−ＳＨ−３’−金；配列番号１７）およびＮＰで促進されるシグナル増幅用の銀（１）の還元に依存するチップ型ＤＮＡ検出法である。この特定のアッセイのために、ＤＮＡマイクロアレイ装置（スポット径は１７５μｍで、２つのポット間の距離は３７５μｍである；ＧＭＳ４１７ Ａｒｒａｙｅｒ、Ｇｅｎｅｔｉｃ
ＭｉｃｒｏＳｙｓｔｅｍｓ社、マサチューセッツ州ウォバーン）を用いて、マレイミド修飾ガラスチップを５’捕獲ＤＮＡ鎖（５’−ＳＨ−Ａ１０−ＣＧＴ ＣＧＣ ＡＴＴ ＣＡＧ ＧＡＴ−３’；配列番号１８）でスポットした。この表面の非スポット領域をＡ１０配列（１０μＭの５’−ＳＨ−ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ Ａ−３’；配列番号１９）で一晩不活化した。チップ表面をバーコードＤＮＡ溶液に接触させたら、標的配列溶液と混合したＮＰプローブをバーコード／捕獲ＤＮＡ修飾チップに添加した。あるチップ上のスポットをＮＰプローブおよび標的ＤＮＡ鎖で標識した。次いで、このスポット化したチップを銀増強液（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ社、カリフォルニア州レディング）に曝露してシグナルをさらに増強した。次いで、現像されたスポットをＶｅｒｉｇｅｎｅ ＩＤ（同定）システム（Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ社、イリノイ州ノースブルック）を用いて読み取った。このＶｅｒｉｇｅｎｅ ＩＤシステムは現像されたスポットから散乱された光を測定し、アッセイ用に永久的な記録を提供する。図１４Ａは「増幅された」バーコードＤＮＡの検出に使用される２０ｎｍのＮＰプローブを示す。５ｆＭ〜５０ａＭまでの標的ＤＮＡ濃度についてのスポット強度は対照スポットよりも強いことは明白である。各濃度のスポット強度を測定するために、３つのスポットをチップ上にパターン化し、Ｖｅｒｉｇｅｎｅ ＩＤシステムで画像化した。このスポットのグレーレベルをグラフィックソフトウェア（Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ）を用いて算出し、このスポット強度グラフを図１５に示す。このグラフは２０ｎｍのＮＰプローブは５０ａＭにおいて標的ＤＮＡをはっきりと検出することができるが、５ａＭの濃度においてはバックグラウンドとシグナルを区別することができないことを示している。
３０ｎｍのＮＰプローブをＤＮＡ−ＢＣＡ検出に用いた場合、５００ｚＭもの低さの標的ＤＮＡ濃度が検出された（図１４Ｂ）。２０ｎｍのＮＰプローブと３０ｎｍのＮＰプローブについての検出限界のこの差は、異なる表面積のＮＰプローブ上にあるバーコードＤＮＡ鎖の絶対数の差に起因するものと思われる。この強度グラフはすべての試料濃度で３０ｎｍのＮＰプローブシステムは２０ｎｍのＮＰプローブシステムよりも強いスポットシグナルを提供することを示唆している（図１５）。５００ｚＭで２０μＬの試料容量であれば、約１０本の標的ＤＮＡ鎖の総試料数を表し、フルオロフォアプローブと組み合わせたＰＣＲベースの方法を利用するアッセイに匹敵する感度を提供する５８〜６０。
単純化したレポータベースのバイオバーコードアッセイ
前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の検出は、実施例８との一貫性を保つために例示的な例として用いる。臨床的に有意なレベルのＰＳＡはこの癌マーカに現在使用される試験の検出限界に近いので、ＰＳＡをこの実施例のために選択した。したがって、感度の高い方法が望ましい。基体と以下に記載のように調製される検出プローブとを混合して後で以下に記載のように使用されるそれに対応する試薬「カクテル」を形成することによって、同じ培地
中の多様な標的検体の検出に対するこの例の一般化を実施することができる。同じ基体上の異なる標的検体のために空間的に分離された結合ゾーンを形成することなどの代替的な実施も実用的であり、本発明の特定の使用に望ましいであろう。先に記載の実施例との一貫性を保つために磁性基体を記載するが、他のタイプの基体が本発明の特定の使用にとってはより適する場合もあり得る。
ａ）基体の作成
グルタルアルデヒド−アミンカップリング化学反応を用いてＰＳＡのある抗原決定基に特異的なモノクローナル抗体（Ｍａｉｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、マサチューセッツ州メイン）をアミノ官能化磁性微粒子（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社．、ペンシルバニ州ウォリントン）と結合することによって、磁性微粒子検出プローブ（ＭＭＰ）を調製した。アミノ官能化ＭＭＰ（５ｍｇ）をピリジン洗浄緩衝液 （ＰＷＢ）中の５ｍｌの５％グルタルアルデヒドで室温にて３時間活性化した。次いで、活性化されたＭＭＰを磁気的に分離し、上清を除去した。この磁気分離ステップを２回繰り返し、ＭＭＰをＰＷＢ中で再懸濁させた。次いで、このモノクローナル抗体（７５０μｇ）をＭＭＰに添加し、この溶液を室温で１０時間混合した。１ｍｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をＭＭＰ溶液に添加して室温でさらに１０時間混合することによって、非特異的結合部位を遮断した。この磁気分離ステップを２回繰り返し、ＭＭＰを５ｍｌのＰＷＢに再懸濁させた。次いで、３ｍｌのグリシン溶液（ｐＨ８．０で１Ｍ）を得られた溶液に添加して未反応のグルタルアルデヒドをすべて消光し、３０分間撹拌した。磁気分離ステップ（２回繰り返した）後、５ｍｌの洗浄緩衝液をモノクローナル抗体官能化ＭＭＰとともに激しく混合し、ＭＭＰを再度磁気的に分離した（この洗浄ステップを３回繰り返した）。最後に、ＭＭＰプローブを０．１５Ｍのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中に再懸濁させた。タンパク質をＭＭＰにカップリングさせる前後の２８０μｍでの吸光度を比較することによって、ＵＶ−ｖｉｓ分光分析によってカップリング効率は９０％であると決定した。
ｂ）プローブの調製
直径１μｍのアミノ官能化ポリスチレン微粒子（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ペンシルバニア州ウォリントン）を用いて検出プローブを調製した。アミノ官能化ポリスチレン微粒子の１．２５％水性懸濁液１ｍｌを１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去した。次いで、このペレットをＰＢＳ中に再懸濁させ、遠心分離ステップをもう１回繰り返した。得られたポリスチレン粒子のペレットをｐＨ７．４のＰＢＳ中の１ｍｌの８％グルタルアルデヒド中に再懸濁させ、ロッキングシェーカーで５時間混合した。次いで、この粒子を１０，０００ｒｐｍで５分間沈殿させ、上清を捨てた（このステップを２回繰り返した）。得られたペレットをＰＢＳ中に再懸濁させ、ＰＳＡ用の１０μｇのポリクローナル抗体（Ｍａｉｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、マサチューセッツ州メイン）を添加して、ロッキングシェーカーで室温にて一晩反応させた。加えた抗体の量は表面部位が多数のオリゴヌクレオチドを次ステップで同じ粒子に付着させるのに使用可能であるように粒子表面を完全に修飾するのに要する抗体の量の２０〜３０倍未満である。先に記載のような懸濁および沈殿によって、これらの粒子を１０，０００ｒｐｍで５分間沈殿させ、ＰＢＳで２回洗浄した。
前ステップからのペレット状の活性化微粒子を１ｍｌの１００μＭの適した３’アミノ−官能化オリゴヌクレオチド中に再懸濁させ、ロッキングシェーカーで室温にて一晩反応させることによって、オリゴヌクレオチド官能化微粒子を調製した。以下のパラグラフに記載のオリゴヌクレオチドおよび方法を用いて、以前の発明のものに類似する「バーコード」検出プローブを調製した。標的検体の同定がヌクレオチド配列にコードされない検出プローブの場合、任意の配列を有する蛍光標識３’−アミノで官能化した３０塩基のオリゴヌクレオチドを用いた。上記のような懸濁および沈殿によって、反応した粒子を１０，０００ｒｐｍで５分間沈殿させ、ＰＢＳで２回洗浄した。得られたペレットを１ｍｌの０
．２Ｍエタノールアミンに再懸濁させて微粒子上の未反応のグルタルアルデヒド部位すべてを室温で３０分間不活化し、１０，０００ＲＰＭで５分間沈殿させ、上清をデカンテーションによって除去した。続いて、ウシ血清アルブミン（１０％ＢＳＡ）溶液を添加して粒子表面のタンパク質に不活性の領域をさらに安定化させた。遠心分離ステップを２回繰り返して上清を除去し、ペレットを１ｍｌの０．１５ＭのＰＢＳ溶液中に再懸濁させた。ジスルフィドが結合した蛍光標識した化学的に切断可能なオリゴヌクレオチドを同様に活性化微粒子に付着させたが、アミノ官能化オリゴヌクレオチドとの最初の反応は省略した；不活化ステップにおいてチオエタノールアミンをエタノールアミンに置換した；ジスルフィドへの酸化によって、蛍光標識した３’チオール官能化オリゴヌクレオチドを得られたチオール基にカップリングした。
１ｍｌの３’アミノ官能化オリゴヌクレオチド５’ＣＧＴＣＧＣＡＴＴＣＡＧＧＡＴＴＣＴＣＡＡＣＴＣＧＴＡＧＣＴ−Ａ１０−Ｃ６−アミン３’（配列番号２０）の１００μＭの溶液中のペレット状の微粒子をグルタルアルデヒドで活性化した前ステップの微粒子に再懸濁させることによって、以前の発明のものに類似する「バーコード」検出プローブを調製し、ロッキングシェーカーで室温にて一晩反応させた。同じオリゴヌクレオチド対または単一のオリゴヌクレオチドをすべての標的検体に用いてもよい。先に記載したような懸濁および沈殿によって、これらの粒子を１０，０００ＲＰＭで５分間沈殿させ、ＰＢＳで２回洗浄した。得られたペレットを１ｍｌの０．２Ｍエタノールミンに再懸濁させて微粒子上の未反応グルタルアルデヒドすべてを室温で３０分間不活化し、１０，０００ＲＰＭで５分間沈殿させ、デカンテーションにより上清を除去した。続いて、ウシ血清アルブミン（１０％ＢＳＡ）溶液を添加して、粒子表面のタンパク質に不活性の領域をさらに安定化させた。遠心分離ステップを２回繰り返して上清を除去し、ペレットを１ｍｌの０．１５ＭのＰＢＳ溶液中に再懸濁させた。次いで、２００μｌの５ｍｇ／ｍｌのポリスチレンプローブ粒子の懸濁液を２００μｌの相補的なＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、オレゴン州ユージン）で標識したオリゴヌクレオチド５’ＡＧＣＴＡＣＧＡＧＴＴＧＡＧＡＡＴＣＣＴＧＡ−ＡＴＧＣＧＡＣＧ３’（配列番号２１、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（アイオワ州コーラルビル）から購入、または文献の方法３５を用いて合成および精製）の３３μＭ溶液と併せ、ポリスチレン粒子上の相補的オリゴヌクレオチド鎖にハイブリダイズさせた。次いで、使用前に懸濁および沈殿によってこの粒子を洗浄した。１００μｌの５００μｇ／ｍｌ粒子懸濁液を沈殿させ、上清を廃棄し、ペレットを１００μｌのナノピュア水に再懸濁させることにより脱ハイブリダイズさせることによって、各粒子に対するオリゴヌクレオチドローディングを決定した。この粒子を沈殿により除去し、ＳＰＥＸ Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ−３分光光度計（ＪＯＢＩＮ ＹＶＯＮ社）を用いて５０μｌの蛍光マイクロキュベット（Ｓｔａｒｎａ Ｃｅｌｌｓ社、カリフォルニア州アタスカデロ）において、溶液中の放出されたオリゴヌクレオチドの蛍光度を測定した。純粋なＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識したバーコードＤＮＡ溶液についての較正曲線に対して、測定された試料の蛍光度を比較することにより定量化した。各ポリスチレン粒子に対するバーコードＤＮＡ鎖の平均数は〜１．１×１０５であると決定した。
ｃ）ＰＳＡ試験（反応）
１０μｌの臨床試料またはＰＳＡを含んだ較正標準（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、ウィスコンシン州ミルウォーキー）を１．５ｍＬ ＢｉｏＭａｇ（登録商標）微小遠心管中のモノクローナル抗ＰＳＡ抗体（５００μｇ／ｍｌ）で官能化したＭＭＰプローブ５０μｌに添加し、この溶液をオービタルシェーカーを用いて３７℃で２３分間振盪した（図１８のステップ１）。次いで、このアッセイ溶液を入れた管をＢｉｏＭａｇ（登録商標）微小遠心管分離器（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に室温で設置した。１５秒後、ＭＭＰ−ＰＳＡハイブリッドが管の壁上に濃縮された。上清を除去し、ＭＭＰを５０μｌの０．１Ｍ ＰＢＳに再懸濁させた（２回繰り返した）。次いで、上記のいずれかのタイプの
検出プローブ（１．２５ｍｇ／ｍｌで５０μｌをこの溶液に加え（図１８のステップ１）、３７℃で２３分間激しく撹拌した。次いで、上記のような磁気分離器を用いて反応混合物から磁性微粒子を分離し、０．１５ＭのＰＢＳで２回洗浄した（図１８のステップ２）。
ｄ）ＰＳＡ試験（バーコード検出版）
磁性微粒子をナノピュア（１８ＭΩ）水（５０μｌ）に再懸濁させて、ポリスチレンプローブ表面上の相補的オリゴヌクレオチドから蛍光標識したバーコードオリゴヌクレオチドを脱ハイブリダイズした。この磁性微粒子を磁気分離器を用いて懸濁液から除去し（図１８のステップ３）、ＳＰＥＸ Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ−３分光蛍光計（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７については６５０ｎｍ励起／６６５ｎｍ発光）を用いて６６０〜６７０ｎｍのスペクトル域にわたる放出されたオリゴヌクレオチドの蛍光発光積分強度を測定した。６６０〜６７０ｎｍのスペクトル域にわたる蛍光発光積分強度を決定し、最初の培地のＰＳＡ濃度の尺度として用いた。
ｅ）ＰＳＡ試験（化学的放出版）
磁性微粒子をジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含むＰＢＳ（５０μｌ）に再懸濁させ、５０℃で１０分間加熱してポリスチレンプローブ表面から蛍光標識したオリゴヌクレオチドを放出した。磁気分離器を用いてこの懸濁液から磁性微粒子を除去し（図１８のステップ３）、ＳＰＥＸ Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ−３分光蛍光計（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７については６５０ｎｍ励起／６６５ｎｍ発光）を用いて６６０〜６７０ｎｍのスペクトル域にわたる放出されたオリゴヌクレオチドの蛍光発光積分強度を測定した。６６０〜６７０ｎｍのスペクトル域にわたる発光積分強度を決定し、最初の培地のＰＳＡ濃度の尺度として用いた。
ｆ）ＰＳＡ試験（ｉｎ−ｓｉｔｕ検出版）
磁性微粒子をＰＢＳに再懸濁させて、粒子が結合したオリゴヌクレオチドの蛍光発光積分強度をＳＰＥＸＦｌｕｏｒｏｌｏｇ−３分光蛍光計（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７については６５０ｎｍ励起／６６５ｎｍ発光）を用いて測定した。
磁性微粒子の蛍光度も標準的な手順に従ってフローサイトメータを用いて決定した。
ｇ）ＰＳＡ試験（結果）
３０ａＭ〜３００ｆＭ濃度範囲にわたるすべての標的検体濃度をそれに対応する陰性対照から容易に微分することができる（図１９Ａ）。重要なことは、上記の本発明の改善はこれまでの発明の３０ａＭの標的濃度の感度を保持したが、４時間以上から５０分未満までのアッセイの合計時間の短縮を可能にし、またステップ数および必要な機器類の複雑さを大幅に低減した。
粒子が結合した分子の化学的放出
図２０から２２に示したように、蛍光アッセイを構成した。メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は検出用の標的検体として機能した。ポリＴで標識した磁性ビーズは３’−ポリＡ標的検体を捕獲してそれらを磁性支持体に対して固定化し、試料液からそれらを分離する。使用した検出試薬はｍＲＮＡ標的の５’末端と相補的なオリゴヌクレオチドで官能化された金ナノ粒子から構成した。この相補的なオリゴヌクレオチドはレポータ部分および選択的結合化合物の両方として機能し、金−チオール結合を介して金ナノ粒子に結合した。検出試薬を溶液に添加し、ｍＲＮＡ標的を該相補的レポータ部分に結合させてポリＴ標識ビーズ−標的ｍＲＮＡ検体−相補的オリゴヌクレオチド結合化合物−金ナノ粒子のサンドイッチを形成した。洗浄後、形成されたサンドイッチ構造を含んだ水にジチオスレイトール（ＤＴＴ）を加え、５０℃になるまで１０分間加熱した。この水と熱によって、標的
ｍＲＮＡ分子によって一緒にされている磁性微粒子構造体および金ナノ粒子構造体を脱ハイブリダイズさせた。このＤＴＴは１３ｎｍ金ナノ粒子表面上のチオール化されたＤＮＡレポータ部分と置き換わって、磁性微粒子および金粒子を除去した後で次の検出のためにＤＮＡレポータを溶液に放出する。蛍光光度計を用いて溶液放出されたプローブ配列を検出できるように蛍光分子（Ａｌｅｘａ４８８）をそのチオール基近傍に加えた。図２３に示すように、６ｐＭまで低下する標的ｍＲＮＡ濃度が検出され、約１ｎＭの濃度でＡｌｅｘａ４８８で標識されたｍＲＮＡプローブ鎖が放出されたことを表す；これは５０μＬ容量中のＡｌｅｘａ４８８ダイの蛍光光度計測検出の限界である。この実施例は本発明が主張する検出方法を核酸標的検出に使用することは標的配列を酵素増幅しなくてもポリメラーゼ連鎖反応と同じほど感度があり得ることを実証する。
上記開示は本発明のある特定の実施形態を強調するものであり、それと同等の改変例および代替例はすべて添付の特許請求の範囲に定める本発明の精神および範囲内にあることを理解されたい。

Figure 2007537450
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ＤＮＡ／Ａｕナノ粒子ベースのタンパク質検出スキームを示す図。（Ａ）はハプテン修飾ナノ粒子プローブの調製を示す。（Ｂ）はタンパク質結合プローブを用いたタンパク質検出を示す。配列Ａには９個のＧ，Ｃ対があり、配列ＢにはＧ、Ｃ対が２対しかないことに留意されたい。 ＤＮＡおよびタンパク質によって連結された金ナノ粒子凝集体についての熱変性プロファイルを示す図。２６０ｎｍにおける吸光度を上昇する温度（毎分１℃、１分の保持時間）の関数としてモニターした。各紫外可視スペクトルを、凝集体を懸濁させるために絶え間なく撹拌しながら測定した。融解分析を行う前に、すべての凝集体を０．３Ｍ ＰＢＳ１ｍｌに懸濁した。Ａ）１つの標的抗体を含む２つのプローブは、ＩｇＥ（実線）、ＩｇＧ１（点線）を示す；すべてのデータは正規化されている；（Ｂ）両標的抗体を含む２つのプローブを示す。挿入図；熱変性曲線の一次導関数。 タンパク質のバイオバーコードとしてＤＮＡを用いる、アレイ型のタンパク質検出スキームを示す図。 ＤＮＡバイオバーコードのスキャン測定によるＤＮＡアレイ検出を示す図。左のカラムはＩｇＧ１に関するバイオバーコードの検出用であり、右のカラムはＩｇＥに関するバイオバーコード用である。捕獲オリゴヌクレオチドは、ＩｇＧ１システムの場合には５’チオール修飾−ＡＴＡＡＣＴＡＧＡＡＣＴＴＧＡ（配列番号１）であり、ＩｇＥシステムの場合には５’チオール修飾−ＴＴＡＴＣＴＡＴＴＡＴＴ（配列番号２）である。各スポットは直径が約２５０ｕｍであり、Ｅｐｓｏｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ １６４０ＸＬフラットベッドスキャナ（米国エプソン社（Ｅｐｓｏｎ Ａｍｅｒｉｃａ）［米国カリフォルニア州ロングビーチ（Ｌｏｎｇｂｅａｃｈ）所在］）でグレースケールにより読み取る。これらのアッセイについて検討したが、同アッセイは２０ｎＭから７００ｎＭの標的濃度範囲にわたって比較的有効である。 一般的なタイプの免疫ＰＣＲベースの検体検出スキームを示す図。 バーコードＰＣＲ （ＢＰＣＲ）プロトコルを用いて標的検体である前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を検出する図。パネルＡは設計および調製を示す。パネルＢはＰＳＡ検出ならびにバーコードＤＮＡの増幅および同定を示す。 プライマー−二量体形成、ＤＮＡバーコード増幅、および２５回のサーマルサイクルを用いてＤＭＳＯ濃度を上昇させることの効果を評価するための対照試験を示す図。レーン１から５はＰＣＲ反応混合物中に存在するＤＮＡバーコードを有するものであり、レーン６から１０にはＤＮＡバーコードが存在しない。ＤＭＳＯはレーン１から５および６から１０まで上昇されていることに留意されたい（０．５％の上昇で０〜２％）。 ＰＣＡ検出後にＰＣＲで増幅したバーコードＤＮＡを示す電気泳動画像およびバンドの相対強度グラフ。パネルＡのレーン１および２は対照試験（レーン１：ＰＳＡのないバックグラウンドのタンパク質の抗ジニトロフェニルおよびβガラクトシダーゼ、レーン２：タンパク質無し）。レーン３から８まで、試料（１０μｌ）中のＰＳＡ濃度はそれぞれ３００ａＭ、３ｆＭ、３０ｆＭ、３００ｆＭ、３ｐＭおよび３０ｐＭである。ＰＳＡ用の標準的なバイオバーコードＤＮＡ４０ｍｅｒをレーン９で行ってＰＣＲ後の他のゲルバンドと比較した。パネルＢはＢＰＣＲ後のゲル電気泳動のバンドの相対強度グラフである。パネルＣはＰＳＡの低濃度の検出である。濃度はレーン２（３ａＭ）からレーン７（３００ｆＭ）まで１０ｘ希釈液で３ａＭ〜３００ｆＭである。バックグラウンドタンパク質のみの陰性対照をレーン１に示し、標準的なバーコード４０ｍｅｒ（６μＭバイオバーコード二本鎖）を最初のレーン（レーンＣ）に示す。パネルＤはＢＰＣＲ後のゲル電気泳動のバンドの相対強度グラフである。 ＰＳＡ特異的バーコードＤＮＡのスキャン検出を示す図。ＰＳＡ濃度（試料容量１０ｍｌ）は３００ｆＭから３ａＭまで変化し、ＰＳＡを加えていない（対照）陰性対照試料を示す。７例の試料すべてにつき、２ｍｌの抗ジニトロフェニル（１０ｐＭ）および２ｍｌのβ−ガラクトシダーゼ（１０ｐＭ）をバックグラウンドタンパク質として加えた。３０ｎｍのＮＰプローブを用いたＰＳＡ（３０ａＭおよび対照）のＰＣＲなしの検出も示す（挿入図）。Ｖｅｒｉｇｅｎｅ ＩＤシステムを用いてチップを画像化した。 ＢＰＣＲの理論的検出限界を示す図。左のパネルでは、ゲル画像はＰＣＲ後のバンドを示しており、バーコードＤＮＡ濃度は始まりから減少している。レーン１：３×１０９コピー、レーン２：３×１０８コピー、レーン３：３×１０７コピー、レーン４：３×１０６コピー、レーン５：３×１０５コピー、レーン６：３×１０４コピー、レーン７：３×１０３コピー、レーン８：３×１０２コピー、レーン９：３×１０１コピー、レーン１０：バーコードＤＮＡなし。右のパネルはゲル電気泳動のバンドの相対強度グラフである。 ＰＳＡを複合ヤギ血清培地に溶解したＰＳＡ特異的バーコードＤＮＡの検出を示す図。各パネルはＢＰＣＲで増幅されたバーコードＤＮＡによって生成されたシグナルを種々の検体濃度（３ｐＭ〜３ａＭ）で示す。 ３０ｎｍのＮＰプローブを用いたＰＳＡのＰＣＲなしの検出を示す図。各パネルおよび棒グラフの関連する相対強度値は、バーコードＤＮＡ（すなわち、非ＢＰＣＲ増幅された）の直接検出によって生成されたシグナルを種々の濃度（３０ａＭ〜３ｐＭ、対照）で示す。Ｖｅｒｉｇｅｎｅ ＩＤシステム（Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ社、イリノイ州ノースブルック）を用いてチップを画像化した。 ＤＮＡ−ＢＣＡアッセイを示す図。（Ａ）ナノ粒子および磁性微粒子プローブの調製。（Ｂ）ナノ粒子ベースのＰＣＲなしのＤＮＡ増幅スキーム。 Ｖｅｒｉｇｅｎｅ ＩＤシステムによる増幅された炭疽菌バーコードＤＮＡ検出を示す図。（Ａ）２０ｎｍのＮＰプローブを用いた炭疽菌バーコードＤＮＡ検出。（Ｂ）３０ｎｍのＮＰプローブを用いた炭疽菌バーコードＤＮＡ検出。 ２０ｎｍおよび３０ｎｍのＮＰプローブに関する銀増強後のバーコードＤＮＡおよびＮＰプローブのサンドイッチされたスポットを示す強度グラフ。 「ユニバーサル」ナノ粒子プローブ検出スキームの１実施形態を示す図。（Ａ）１つ以上の標的核酸配列に特異的なユニバーサルプローブを合成した。この標的認識ＤＮＡを用いて標的に対するプローブの特異性を制御することができる。このプローブは単一または複数の標的核酸配列が所与の試験溶液中に存在するアッセイ系において用いることができる。（Ｂ）このユニバーサルプローブは、磁性微粒子またはスライドガラスなどの基体に結合した第２のタイプの認識オリゴヌクレオチドと併せて用いられる。第２のタイプの認識オリゴヌクレオチド、ユニバーサルプローブ、および標的核酸を含むと考えられる試験溶液をハイブリダイゼーションおよび複合体形成を可能にする条件下で混合、反応させた。この複合体を未反応のユニバーサルプローブおよび試験溶液から分離し、レポータオリゴヌクレオチドを検出する。 ユニバーサルナノ粒子プローブの別の実施形態を、デンドリマープローブ、増幅されたデンドリマープローブおよびデンドリマー−ナノ粒子ハイブリッドプローブとともに示す図。第１のタイプのデンドリマープローブは認識オリゴヌクレオチド配列およびバーコードＤＮＡなどのレポータオリゴヌクレオチドと相補的な核酸配列を含む。第１のタイプのデンドリマープローブ上の認識オリゴヌクレオチド配列を第２のタイプのデンドリマープローブにハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーション条件下で、これは必要に応じて延長することのできるデンドリマープローブ複合体（またはマトリクス）を生成する。第２のタイプのデンドリマープローブは複数のデンドリマープローブおよび機能を結合して、マトリクス全体に含まれたレポータオリゴヌクレオチドの量を増幅することができる。同様に、錯体形成のより多くの部位に第２のタイプのデンドリマーを提供するため、またはより多くのレポータオリゴヌクレオチドを提供するために、第１のタイプのデンドリマー上に存在する認識オリゴヌクレオチドの量を増大または低減することができる。第１または第２のタイプのデンドリマープローブを、特定のアッセイの要求に応じて、金ナノ粒子プローブ、またはハイブリッドプローブ複合体（またはマトリクス）システムを生成するための磁性微粒子プローブなどの他の粒子プローブとともに用いることができる。 フルオロフォアベースのバイオバーコード増幅アッセイを示す図。各ポリスチレンプローブ用のバーコードＤＮＡは約１．１×１０５、アッセイの総時間は約５０分であった。 前立腺特異抗原（ＰＳＡ）（１０μＬ試料）用の蛍光シグナル（Ａｌｅｘａ−６４７を示す図。感度は約３０ａＭ ＰＳＡであった。マイクロ蛍光光度計セル（５０マイクロＬ容量）をＡｌｅｘａ−６４７とともに用いた。 本発明の例示的アッセイを示す略図。金ナノ粒子プローブの表面上のプローブ鎖はレポータ部分も表す。ｍＲＮＡ 特異的標的配列およびレポータ部分用のプローブとして二重にするチオール化オリゴヌクレオチドを、金ナノ粒子表面に共有結合させた。図示のように、金ナノ粒子表面の次の球は蛍光読み取り用のフルオロフォアまたはスキャンによる金ナノ粒子の標識に用いることのできる「ユニバーサル」ＤＮＡ配列のいずれかを表す。 偽のｍＲＮＡ標的の検出を示す略図。プローブは図２０と同様である。蛍光読み取りを用いて、検出されたｍＲＮＡ標的に特異的な、ＤＴＴが放出された蛍光標識プローブを検出した。 任意の標準的な方法を用いて逐次読み取られる、高密度マイクロアレイ上にソートされた多数の核酸標的配列の多重検出を示す略図。重要なことは、この球は、蛍光読み出し法を表すことができるか、スキャン法で「ユニバーサル」金ナノ粒子プローブを用いて探査が可能なユニバーサル捕獲配列を表すことができる。 図２０に示したような偽のｍＲＮＡ配列検出後に放出された蛍光標識プローブ鎖の蛍光光度計測検出を示す図。６ｐＭの蛍光４の検出限界は、Ａｌｅｘａ４８８に対して約１ｎＭの蛍光検出限界の光において検出事象当たり約１００個の蛍光標識レポータ部分を放出する１３ｎｍのプローブを用いると可能な限り低くなる。

Claims (50)

  1. それぞれが試料中の特異的結合相補体との特異的結合相互作用のための少なくとも２つの結合部位を有する、試料中の１つまたは複数の標的検体の存在を検出するための方法であって、
    ａ）該特定の標的検体の少なくとも第１の結合部位に結合する特定の標的検体の少なくとも１つの特異的結合相補体が結合した少なくとも１種類の捕獲基体を提供するステップと、
    ｂ）（ｉ）特定の標的検体に対する少なくとも１つの特異的結合相補体と、（ｉｉ）場合によってはレポータ標識で標識される複数のＤＮＡバーコードとが結合した微粒子からなる少なくとも１種類の微粒子検出プローブを提供するステップであって、該微粒子検出プローブに結合した特異的結合相補体は、該標的検体の少なくとも第２の結合部位に結合するステップと、
    ｃ）標的検体を該捕獲基体上に固定するように、捕獲基体に結合した該特異的結合相補体に対する特定の該標的検体の結合を可能にするのに有効な条件下で、標的検体を含有すると思われる試料に捕獲基体を接触させるステップと、
    ｄ）該標的検体と、該検体に対する該微粒子検出プローブに結合した該特異的結合相補体との結合を可能にし、該捕獲基体上の標的検体の存在下で複合体を形成するのに有効な条件下で、少なくとも１種類の微粒子検出プローブに、固定された標的検体を接触させるステップと、
    ｅ）場合によって、該捕獲基体を分離し、洗浄して、未結合の微粒子検出プローブを除去するステップと、
    ｆ）該試料中の特定の標的検体の存在を示す該ＤＮＡバーコードの存在を検出するステップと、からなる方法。
  2. 前記標的検体は、タンパク質またはハプテンであり、その特異的結合相補体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体からなる抗体である請求項１に記載の方法。
  3. 前記標的検体は、核酸分子である請求項１に記載の方法。
  4. それぞれのＤＮＡバーコードは、検出可能なレポータ基で標識される請求項１に記載の方法。
  5. 前記検出可能なレポータ基は、蛍光体、発色団、酸化還元基、電気特性を有する基、放射性基、触媒基またはラマン標識からなる請求項１に記載の方法。
  6. 微粒子を複数のＤＮＡバーコードで標識する請求項１に記載の方法。
  7. 前記標的検体を固定した後で、前記捕獲基体を微粒子検出プローブに接触させる前に捕獲基体を洗浄するステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
  8. 前記検出ステップの前で、前記分離および洗浄ステップの後に、
    ａ）前記ＤＮＡバーコードを前記微粒子検出プローブから剥離させるのに有効な条件を複合体に施すステップと、
    ｂ）前記検出の前に、場合によって、該ＤＮＡバーコードを増幅させるステップと、をさらに含む請求項１に記載の方法。
  9. 前記検出前に、剥離されたＤＮＡバーコードを基体に固定する請求項８に記載の方法。
  10. 前記ＤＮＡバーコードを前記微粒子に直接結合させる請求項１に記載の方法。
  11. 化学剥離剤によって、前記ＤＮＡバーコードを前記微粒子検出プローブから剥離させる請求項１０に記載の方法。
  12. 前記微粒子は、それに結合したオリゴヌクレオチドをさらに備え、前記ＤＮＡバーコードは、該微粒子に結合した該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部に対してハイブリダイズされる請求項１に記載の方法。
  13. 前記ＤＮＡバーコードを脱ハイブリダイゼーションによって剥離させる請求項１２に記載の方法。
  14. 前記捕獲基体は、磁性基体である請求項１に記載の方法。
  15. 前記分離は、前記磁性基体に磁界を受けさせることからなる請求項１４に記載の方法。
  16. 前記分離および洗浄ステップの後で、前記検出ステップの前に、前記ＤＮＡバーコードを剥離させるのに有効な条件を複合体に施すステップをさらに含む請求項１５に記載の方法。
  17. 前記分離は、濾過、沈降、浮揚または流動からなる請求項１に記載の方法。
  18. 前記濾過ステップは、ＤＮＡバーコードを含まない試料成分を除去する膜からなる請求項１７に記載の方法。
  19. 前記微粒子は、ポリマー、ガラス、金属、半導体またはセラミックである請求項１に記載の方法。
  20. 前記ポリマーは、ポリスチレンからなる請求項１９に記載の方法。
  21. 前記特異的結合対は、抗体および抗原である請求項１に記載の方法。
  22. 前記特異的結合対は、受容体またはリガンドである請求項１に記載の方法。
  23. 前記特異的結合対は、酵素および競合阻害剤である請求項１に記載の方法。
  24. 前記特異的結合対は、薬物および標的分子である請求項１に記載の方法。
  25. 前記特異的結合対は、少なくとも部分的に相補的なオリゴヌクレオチドの２つの鎖である請求項１に記載の方法。
  26. 前記ＤＮＡバーコードはビオチン化されている請求項１に記載の方法。
  27. 前記ＤＮＡバーコードは放射活性標識されている請求項１に記載の方法。
  28. 前記ＤＮＡバーコードは蛍光標識されている請求項１に記載の方法。
  29. 前記標的は、３つ以上の結合部位を有する請求項１に記載の方法。
  30. 少なくとも２種類の微粒子検出プローブを提供し、第１の種類のプローブは、前記標的検体上の第１の結合部位に対する特異的結合相補部分を有し、第２の種類のプローブは、
    前記標的検体上の第２の結合部位に対する特異的結合相補部分を有する請求項１に記載の方法。
  31. 複数の微粒子検出プローブを提供し、それぞれの種類のプローブは、前記標的検体上の異なる結合部位に対する特異的結合相補部分を有する請求項３０に記載の方法。
  32. 前記特異的結合相補体および標的検体は、特異的結合対の構成要素である請求項１に記載の方法。
  33. 特異的結合対の構成要素は、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、ポリペプチド、抗体、抗原、炭水化物、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬物、ウイルス、多糖類、脂質、リポ多糖、糖タンパク質、リポタンパク質、核タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗体、免疫グロブリン、アルブミン、ヘモグロビン、凝固因子、ペプチドおよびタンパク質ホルモン、非ペプチドホルモン、インターロイキン、インターフェロン、サイトカイン、腫瘍に特異的なエピトープからなるペプチド、細胞、細胞表面分子、微生物、微生物の断片、部分、成分または生成物、小有機分子、核酸およびオリゴヌクレオチド、前記物質のいずれかの代謝物質または抗体からなる請求項３２に記載の方法。
  34. 核酸およびオリゴヌクレオチドは、遺伝子、ウイルスＲＮＡおよびＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、真菌ＤＮＡ、哺乳類ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、一本鎖および二本鎖核酸、ならびに天然および合成核酸からなる請求項３３に記載の方法。
  35. 前記標的検体は核酸であり、前記特異的結合相補体はオリゴヌクレオチドである請求項１に記載の方法。
  36. 前記標的検体は、タンパク質またはハプテンであり、前記特異的結合相補体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体からなる抗体である請求項１に記載の方法。
  37. 前記標的検体は、ゲノムＤＮＡ試料からの配列であり、前記特異的結合相補体はオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドは、該ゲノム配列の少なくとも一部に相補的である配列を有する請求項１に記載の方法。
  38. 前記ゲノムＤＮＡは、真核、細菌、真菌またはウイルスＤＮＡである請求項３７に記載の方法。
  39. 前記標的検体は、エピソームＤＮＡ試料からの配列であり、前記特異的結合相補体はオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドは、該エピソームＤＮＡ配列の少なくとも一部に相補的である配列を有する請求項１に記載の方法。
  40. 前記特異的結合相補体および標的検体は、抗体−リガンド対の構成要素である請求項１に記載の方法。
  41. その第１の結合部位に加えて、第２の結合部位を含めるように前記標的検体を修飾した請求項１に記載の方法。
  42. それぞれが試料中の特異的結合相補体との特異的結合相互作用のための少なくとも２つの結合部位を有する、試料中の１つまたは複数の標的検体の存在を検出するための方法であって、
    ａ）該特定の標的検体の少なくとも第１の結合部位に結合する特定の標的検体の少なくとも１つの特異的結合相補体が結合した少なくとも１種類の捕獲基体を提供するステップと、
    ｂ）（ｉ）特定の標的検体に対する少なくとも１つの特異的結合相補体と、（ｉｉ）蛍光標識した複数のＤＮＡバーコードとが結合した微粒子からなる少なくとも１種類の微粒子検出プローブを提供するステップであって、該微粒子検出プローブに結合した特異的結合相補体は、該標的検体の少なくとも第２の結合部位に結合するステップと、
    ｃ）標的検体を該捕獲基体上に固定するように、捕獲基体に結合した該特異的結合相補体に対する特定の該標的検体の結合を可能にするのに有効な条件下で、標的検体を含有すると思われる試料に捕獲基体を接触させるステップと、
    ｄ）場合によって、該捕獲基体を洗浄して、未結合材料を除去するステップと、
    ｅ）該標的検体と、検体に対する該微粒子検出プローブに結合した該特異的結合相補体との結合を可能にし、該捕獲基体上の標的検体の存在下で複合体を形成するのに有効な条件下で、少なくとも１種類の微粒子検出プローブに、固定された標的検体を接触させるステップと、
    ｆ）場合によって、該捕獲基体を分離し、洗浄して、未結合の微粒子検出プローブを除去するステップと、
    ｇ）該試料中の特定の標的検体の存在を示す該ＤＮＡバーコードからの蛍光シグナルの存在を検出するステップと、からなる方法。
  43. それぞれが試料中の特異的結合相補体との特異的結合相互作用のための少なくとも２つの結合部位を有する、試料中の１つまたは複数の標的検体の存在を検出するための方法であって、
    ａ）該特定の標的検体の少なくとも第１の結合部位に結合する特定の標的検体の少なくとも１つの特異的結合相補体が結合した少なくとも１種類の捕獲基体を提供するステップと、
    ｂ）（ｉ）特定の標的検体に対する少なくとも１つの特異的結合相補体と、（ｉｉ）蛍光標識した複数のＤＮＡバーコードとが結合した微粒子からなる少なくとも１種類の微粒子検出プローブを提供するステップであって、該微粒子検出プローブに結合した特異的結合相補体は、該標的検体の少なくとも第２の結合部位に結合するステップと、
    ｃ）標的検体を該捕獲基体上に固定するように、捕獲基体に結合した該特異的結合相補体に対する特定の該標的検体の結合を可能にするのに有効な条件下で、標的検体を含有すると思われる試料に捕獲基体を接触させるステップと、
    ｄ）場合によって、該捕獲基体を洗浄して、未結合材料を除去するステップと、
    ｅ）該標的検体と、検体に対する該微粒子検出プローブに結合した該特異的結合相補体との結合を可能にし、該捕獲基体上の標的検体の存在下で複合体を形成するのに有効な条件下で、少なくとも１種類の微粒子検出プローブに、固定された標的検体を接触させるステップと、
    ｆ）場合によって、該捕獲基体を分離し、洗浄して、未結合の微粒子検出プローブを除去するステップと、
    ｇ）分離、洗浄された該捕獲基体に、該ＤＮＡバーコードを剥離させるのに有効な条件を施すステップと、
    ｈ）該試料中の特定の標的検体の存在を示す該ＤＮＡバーコードの蛍光シグナルの存在を検出するステップと、からなる方法。
  44. それぞれが試料中の特異的結合相補体との特異的結合相互作用のための少なくとも２つの結合部位を有する、試料中の１つまたは複数の標的検体の存在を検出するための方法であって、
    ａ）該特定の標的検体の少なくとも第１の結合部位に結合する特定の標的検体の少なくとも１つの特異的結合相補体が結合した少なくとも１種類の捕獲基体を提供するステップ
    と、
    ｂ）（ｉ）特定の標的検体に対する少なくとも１つの特異的結合相補体と、（ｉｉ）レポータ標識からなる複数のＤＮＡバーコードとが結合した微粒子からなる少なくとも１種類の微粒子検出プローブを提供するステップであって、該微粒子検出プローブに結合した特異的結合相補体は、該標的検体の少なくとも第２の結合部位に結合するステップと、
    ｃ）標的検体を該捕獲基体上に固定するように、捕獲基体に結合した該特異的結合相補体に対する特定の該標的検体の結合を可能にするのに有効な条件下で、標的検体を含有すると思われる試料に捕獲基体を接触させるステップと、
    ｄ）場合によって、該捕獲基体を洗浄して、未結合材料を除去するステップと、
    ｅ）該標的検体と、検体に対する該微粒子検出プローブに結合した該特異的結合相補体との結合を可能にし、該捕獲基体上の標的検体の存在下で複合体を形成するのに有効な条件下で、少なくとも１種類の微粒子検出プローブに、固定された標的検体を接触させるステップと、
    ｆ）場合によって、該捕獲基体を分離し、洗浄して、未結合の微粒子検出プローブを除去するステップと、
    ｇ）分離、洗浄された該捕獲基体に、該ＤＮＡバーコードを剥離させるのに有効な条件を施すステップと、
    ｈ）該試料中の特定の標的検体の存在を示す該ＤＮＡバーコードのレポータ標識の存在を検出するステップと、からなる方法。
  45. それぞれが試料中の特異的結合相補体との特異的結合相互作用のための少なくとも２つの結合部位を有する、試料中の１つまたは複数の標的検体の存在を検出するための方法であって、
    ａ）該特定の標的検体の少なくとも第１の結合部位に結合する特定の標的検体の少なくとも１つの特異的結合相補体が結合した少なくとも１種類の捕獲基体を提供するステップと、
    ｂ）（ｉ）特定の標的検体に対する少なくとも１つの特異的結合相補体と、（ｉｉ）場合によってはレポータ標識で標識される複数のＤＮＡバーコードとが結合した粒子からなる少なくとも１種類の粒子検出プローブを提供するステップであって、該粒子検出プローブに結合した特異的結合相補体は、該標的検体の少なくとも第２の結合部位に結合するステップと、
    ｃ）標的検体を該捕獲基体上に固定するように、捕獲基体に結合した該特異的結合相補体に対する特定の該標的検体の結合を可能にするのに有効な条件下で、標的検体を含有すると思われる試料に捕獲基体を接触させるステップと、
    ｄ）場合によって、該捕獲基体を洗浄して、未結合材料を除去するステップと、
    ｅ）該標的検体と、検体に対する該粒子検出プローブに結合した該特異的結合相補体との結合を可能にし、該捕獲基体上の標的検体の存在下で複合体を形成するのに有効な条件下で、少なくとも１種類の粒子検出プローブに、固定された標的検体を接触させるステップと、
    ｆ）場合によって、該捕獲基体を分離し、洗浄して、未結合の粒子検出プローブを除去するステップと、
    ｇ）化学剥離剤によって、該ＤＮＡバーコードを該粒子検出プローブから剥離させるステップと、
    ｈ）該試料中の特定の標的検体の存在を示す該ＤＮＡバーコードの存在を検出するステップとからなる方法。
  46. 前記粒子は、ナノ粒子または微粒子である請求項４５に記載の方法。
  47. それぞれが試料中の特異的結合相補体との特異的結合相互作用のための少なくとも２つの結合部位を有する、試料中の１つまたは複数の標的検体の存在を検出するための方法で
    あって、
    ａ）該特定の標的検体の少なくとも第１の結合部位に結合する特定の標的検体の少なくとも１つの特異的結合相補体が結合した、該試料から分離可能な少なくとも１種類の捕獲基体を提供するステップと、
    ｂ）標的検体を該捕獲基体上に固定するように、捕獲基体に結合した該特異的結合相補体に対する特定の該標的検体の結合を可能にするのに有効な条件下で、標的検体を含有すると思われる試料に捕獲基体を接触させるステップと、
    ｃ）場合によって、該捕獲基体、およびそれに結合した標的検体を、該試料から分離するステップと、
    ｄ）（ｉ）特定の標的検体に対する少なくとも１つの特異的結合相補体と、（ｉｉ）場合によってレポータ標識で標識される複数のオリゴヌクレオチドとが結合した粒子からなる少なくとも１種類の粒子検出プローブを提供するステップであって、該粒子検出プローブに結合した特異的結合相補体は、該標的検体の少なくとも第２の結合部位に結合するステップと、
    ｅ）該標的検体と、検体に対する該粒子検出プローブに結合した該特異的結合相補体との結合を可能にし、該捕獲基体上の標的検体の存在下で、標的検体、捕獲基体および粒子検出プローブを備えた複合体を形成するのに有効な条件下で、少なくとも１種類の粒子検出プローブに、固定された標的検体を接触させるステップと、
    ｆ）場合によって、未結合の粒子検出プローブから該複合体を分離するステップと、
    ｇ）該試料中の特定の標的検体の存在を示す該複合体の存在を検出するステップと、からなる方法。
  48. ２つ以上の標的検体の第１の結合部位に対応する前記特異的結合相補体を同じ基体に結合させる請求項４７に記載の方法。
  49. 前記基体に結合する１つの標的検体の第１の結合部位に対応する前記特異的結合相補体を、異なる標的検体の第１の結合部位に対応する特異的結合相補体である該基体の異なる物理的領域に局在化させる請求項４８に記載の方法。
  50. 前記検出前に、前記オリゴヌクレオチドを前記検出プローブから剥離させる請求項４９に記載の方法。
JP2007513328A 2004-05-12 2005-05-12 バイオバーコードに基づく標的検体の検出 Pending JP2007537450A (ja)

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