KR100823684B1

KR100823684B1 - 바코드 ｄｎａ를 이용한 생물학적 표적 물질의 검출 방법

Info

Publication number: KR100823684B1
Application number: KR1020060123353A
Authority: KR
Inventors: 정상돈; 정명애; 홍효봉
Original assignee: 한국전자통신연구원
Priority date: 2006-12-06
Filing date: 2006-12-06
Publication date: 2008-04-21
Also published as: US7902122B2; US20090005255A1

Abstract

본 발명은 바코드 DNA를 이용한 생물학적 표적 물질의 검출 방법에 관한 것으로, 검출하고자 하는 생물학적 표적 물질과 적어도 일부 상보적인 제1 프로브가 자성 입자의 표면상에 부착되어 있는 분리용 자성 입자를 준비하고, 상기 표적 물질과 적어도 일부 상보적이지만 상기 제1 프로브와 상이한 제2 프로브가 고분자 입자의 표면상에 부착되어 있으며, 또한 인식 코드로서 상기 제2 프로브에 비해 적어도 3배 이상의 비율로 존재하며 미리 정해진 배열을 갖는 바코드 DNA가 고분자 입자의 표면상에 부착되어 있으며, 상기 바코드 DNA는 표지물질과 결합되어 있는 분석용 고분자 입자를 준비하는 단계; 상기 분리용 자성 입자, 상기 분석용 고분자 입자, 및 상기 표적 물질을 혼성화 반응용 버퍼하에서 반응시키는 단계; 그 반응물로부터 분리용 자성 입자 - 표적 물질 - 분석용 고분자 입자로 이루어진 복합체를 자성 분리기를 통해 분리하는 단계; 상기 분리된 복합체에 열을 가하여 상기 분석용 고분자 입자에 존재하는 바코드 DNA를 변성시키고, 원심분리를 통해 상기 복합체로부터 상기 분리용 자성 입자와 상기 분석용 고분자 입자를 제거하여 상기 바코드 DNA를 분리하는 단계; 및 상기 분리된 바코드 DNA에 결합되어 있는 표지물질로부터 신호를 검출하는 단계를 포함하는 바코드 DNA를 이용한 생물학적 표적 물질의 검출 방법이 제공된다.

바코드 DNA, 표적 물질, 신호 검출, 증폭, 프로브

Description

바코드 ＤＮＡ를 이용한 생물학적 표적 물질의 검출 방법{Method for detecting a biological target material using barcode DNA}

도 1은 본 발명에 사용되는 분리용 자성 입자를 나타낸 것이며,

도 2는 본 발명에 사용되는 분석용 고분자 입자를 나타낸 것이며,

도 3은 분리용 자성 입자, 표적 물질 및 분석용 고분자 입자가 결합하여 형성된 복합체를 나타낸 것이며,

도 4는 본 발명의 방법에 따라 바코드 DNA를 이용한 생물학적 표적 물질의 검출 방법을 개략적으로 나타낸 것이며,

도 5는 분리용 자성 입자 - 표적 물질 - 분석용 고분자 입자로 이루어진 복합체로부터 상기 분석용 고분자 입자에 존재하는 바코드 DNA를 분리하는 방법을 개략적으로 나타낸 것이며,

도 6은 본 실시예에 사용된 분리용 자성 입자를 촬영한 형광 현미경 사진(200배)이며,

도 7은 분리용 자성 입자, 표적 물질 및 분석용 고분자 입자가 결합하여 형성된 복합체를 촬영한 형광 현미경 사진(1000배)이며,

도 8은 펨토 몰 수준의 표적 DNA의 변화량에 따른 바코드 DNA 량의 검출량 변화를 그래프로 나타낸 것이며,

도 9는 분리용 자성 입자와 바코드 DNA가 결합된 형태를 TEM을 이용하여 촬영한 사진이며,

도 10은 바코드 DNA에 나노 자성 입자를 표지하는 방법을 모식적으로 나타낸 것이며,

도 11은 MALDI-TOF를 이용하여 분리된 제2 바코드 DNA를 분석한 결과이며,

도 12는 GMR(Giant Magneto Resistive) 센서를 이용하여 분리된 제2 바코드 DNA를 분석한 결과이며, 그리고

도 13은 FET를 이용하여 분리된 제2 바코드 DNA를 분석한 결과이다.

본 발명은 생물학적 표적 물질의 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 수행하지 않고도 극미량의 생체 물질(예, DNA)을 신속하고도 저렴한 비용으로 검출할 수 있는 바코드 DNA를 이용한 생물학적 표적 물질의 검출 방법에 관한 것이다.

바이오칩 또는 바이오센서는 고정화 담체 표면 위에 다양한 프로브를 예를 들어, DNA, 항체, 효소 또는 세포 자체를 고정화시켜 분석 대상물이 특이적으로 결합하도록 구성되어 있는 것으로, 이러한 바이오칩 또는 바이오센서를 이용하면 소 량의 시료로 질병의 진단, 고효율 스크리닝(High Throughput Screening; HTS), 효소활성측정 등의 실험을 대규모로 손쉽게 실시할 수 있다.

1980년대 이후에 본격적으로 개발되고 있는 이러한 장치들의 경우는 초기에는 대부분 고정화 담체에 결합시킬 수 있는 생체 물질의 양도 한계가 있었고 분석 시 주로 사용하는 동위 원소의 가격과 안전성 문제로 인하여 사용화에 많은 어려움이 있었다. 하지만, 1990년대 들어 동위 원소를 대체하여 형광물질을 사용하고 많은 종류 및 많은 양의 생체 물질을 고정화시킬 수 있는 방법들이 계속 발표되어 바이오 칩 또는 바이오센서의 개발은 비약적으로 발전하게 되었다.

하지만, 현재까지 개발된 바이오칩 또는 바이오센서는 다음과 같은 단점이 알려져 있다. 1) 무표지(label free) 분석방법의 경우 저렴한 비용으로 분석할 수 있는 장점이 있으나 선택성과 감도가 낮다는 단점이 있고, 2) 표지를 할 경우에는 단가가 상승할 뿐만 아니라 3) 실제 시료에서 분석하고자 하는 대상 이외에 다른 대상과도 결합할 수 있는 가능성이 있고 4) 감도를 높인다 할지라도 일반적인 분석방법을 동원하여 분석할 경우에는 분석대상이 DNA인 경우 PCR과 같은 고가의 증폭방법이 요구된다.

따라서, 이러한 문제점을 해결하고자 많은 노력들이 시도되어 왔었고, 최근 미국의 노스웨스턴 대학의 Mirkin 교수가 제안한 바코드 DNA를 이용한 신호의 증폭 이라는 개념이 소개된 이후에 아토(atto) 몰 수준의 극미량의 시료까지도 PCR없이 분석할 수 있게 되었다. 하지만, 이러한 분석방법도 금과 같이 비싼 재료를 사용하고 플랫폼을 제작하기가 매우 까다로워 Mirkin의 방법을 변형한 여러 가지 방법들이 소개되고 있다.

최근 소개되고 있는 방법들은 주로 2종의 짧은 DNA가 결합된 금-나노-입자(gold-nano-particle)(NRs)와 1종의 DNA가 결합된 자성 입자(MMPs)를 이용하고 있고 증폭된 DNA 신호는 칩 베이스드 검출법(chip-based-detection method)을 이용하여 분석한다. 전립선 특이 항원을 이용하여 분석된 결과는 아토 몰(10^-18M) 까지도 분석이 가능함을 보여주고 있다. 하지만, 현재 사용되고 있는 방법 또한 나노 입자 및 골드 입자를 사용하므로 이를 해소하기 위해 비용의 절감 및 분석 방법의 단순화를 위한 노력이 계속 되고 있다.

이에 본 발명의 목적은 보다 신속하고도 저렴한 비용으로 검출할 수 있는 바코드 DNA를 이용한 생물학적 표적 물질의 검출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 의하면,

검출하고자 하는 생물학적 표적 물질과 적어도 일부 상보적인 제1 프로브가 자성 입자의 표면상에 부착되어 있는 분리용 자성 입자를 준비하고,

상기 표적 물질과 적어도 일부 상보적이지만 상기 제1 프로브와 상이한 제2 프로브가 고분자 입자의 표면상에 부착되어 있으며, 또한 인식 코드(identification code)로서 상기 제2 프로브에 비해 적어도 3배 이상의 비율로 존재하며 미리 정해진 배열을 갖는 바코드 DNA가 고분자 입자의 표면상에 부착되어 있으며, 상기 바코드 DNA는 표지물질과 결합되어 있는 분석용 고분자 입자를 준비하는 단계;

상기 분리용 자성 입자, 상기 분석용 고분자 입자, 및 상기 표적 물질을 혼성화(hybridization) 반응용 버퍼하에서 반응시키는 단계;

그 반응물로부터 분리용 자성 입자 - 표적 물질 - 분석용 고분자 입자로 이루어진 복합체를 자성 분리기를 통해 분리하는 단계;

상기 분리된 복합체에 열을 가하여 상기 분석용 고분자 입자에 존재하는 바코드 DNA를 변성(denature)시키고, 원심분리를 통해 상기 복합체로부터 상기 분리용 자성 입자와 상기 분석용 고분자 입자를 제거하여 상기 바코드 DNA를 분리하는 단계; 및

상기 분리된 바코드 DNA에 결합되어 있는 표지물질로부터 신호를 검출하는 단계

를 포함하는 바코드 DNA를 이용한 생물학적 표적 물질의 검출 방법이 제공된다.

이하 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명의 생물학적 표적 물질의 검출 방법은 표적 물질과 상보적인 프로브가 표면상에 부착되어 있는 분리용 자성 입자와 인식 코드(identification code)로서 미리 정해진 배열을 갖는 DNA(바코드 DNA 또는 바이오 바코드 DNA라고도 칭한다)가 표면상에 부착되어 있는 분석용 고분자 입자를 이용하여 DNA와 같은 생체 물질을 검출하는 것을 기술적 특징으로 한다.

본 발명은 자성 입자 및 바코드 DNA가 부착된 고분자 입자를 사용하여 미량의 DNA와 같은 생체 물질을 감지할 수 있는 분석 방법을 제공한다. 본 발명에 사용되는 자성 입자는 분석하고자 하는 대상에 일부만 상보적인 제1 프로브로 코팅되어 있고, 고분자 입자는 배열은 다르지만 분석 대상 표적 물질(예, 표적 DNA)과 상보적으로 결합할 수 있는 제2 프로브 및 바코드 DNA와 상보적인 결합을 할 수 있는 DNA로 코팅되어 있다. 따라서, 표적 물질을 상기 두 입자가 혼합되어 있는 용액에 첨가하게 될 경우 표적 물질은 두 입자를 연결하는 고리 역할을 하게 된다. 연결을 이룬 입자들은 자석을 이용하여 분리하고, 분리된 자성/고분자 입자 복합체에 바코드 DNA와 상보적인 결합이 가능한 DNA를 첨가할 경우 결합된 DNA의 양은 자성/고분자 입자의 수에 비례하게 되며 동시에 결합된 표적 물질의 수와도 비례하게 된다. 이렇게 결합된 바코드 DNA를 다시 자성/고분자 입자 복합체에서 분리하여 분석하게 되면 실제 표적 물질을 분석한 것보다 훨씬 더 강력한 신호를 획득하게 되어 극미 량의 DNA 분석이 가능하게 될 뿐만 아니라 분리 및 분석이 동시에 이루어지게 되어 분석 시간 및 경비를 획기적으로 감축할 수 있게 된다.

본 발명에 있어서, 검출하고자 하는 생물학적 표적 물질은 올리고뉴클레오타이드 또는 단백질이 바람직하며, 보다 구체적으로는 DNA, RNA, 항원, 항체, 합텐 등을 포함한다.

본 발명의 방법은 시료로부터 검출하고자 하는 표적 물질을 분리해낼 수 있는 분리용 자성 입자와 상기 표적 물질의 분석 신호를 증폭할 수 있도록 제작된 분석용 고분자 입자를 사용한다. 아래에 본 발명에서 사용되는 분리용 입자와 분석용 입자에 대해 설명한다.

분리용 자성 입자

검출하고자 하는 생물학적 표적 물질과 적어도 일부 상보적인 제1 프로브가 자성 입자의 표면상에 부착되어 있는 분리용 자성 입자를 준비한다. 본 발명에 사용되는 분리용 자성 입자를 도 1에 나타내었다.

분리용 입자는 자성 입자 부분과 표적물질과 부분적으로 상보적으로 결합할 수 있는 제1 프로브로 구성된다. 상기 제1 프로브는 분리용 입자의 표면상에 부착된다. 상기 제1 프로브는 공유 또는 비공유 수단에 의해 상기 자성 입자에 결합될 수 있다.

상기 분리용 자성 입자의 표면상에 부착되는 제1 프로브는 올리고뉴클레오타이드 또는 단백질이 바람직하며, 보다 구체적으로는 DNA, RNA, PNA, 아프타머(aptamer), 항원, 항체, 합텐 등을 포함한다. 상기 제1 프로브는 상기 분리용 자성 입자의 표면상에 직접 부착되는 것도 가능하나, 표면 처리 물질로 상기 자성 입자의 표면을 처리한 후 이것을 링커로 하여 부착되는 것이 효율 면에서 더욱 바람직하다. 이와 같은 표면 처리 물질로서는 실란계, 에폭시계, 카르복실계, 아민계, 알데히드계 등의 물질이 가능하다. 보다 구체적으로는 아미노프로필트리에톡시실란(aminopropyltriethoxysilane; APTES), 글리시독시프로필트리메톡시실란(glycidoxypropyltrimethoxysilane; GPTS), 트리에톡시실란 운데칸산(triethoxysilane undecanoic acid; TETU), 폴리라이신(poly(lysine)), 4-트리메톡시실릴벤즈알데히드(4-trimethoxysilylbenzaldehyde) 등이 있다. 또한, 아비딘, 스트렙트아비딘으로 코팅하는 것이 가능하다.

분리용 입자를 코팅한 이후에는 표적 물질과 부분적으로 상보적인 제1 프로브를 결합시키게 되는데, 이러한 결합반응 이후에 남아 있는 반응 전구체는 다시 한번 분리 과정 후 폐기하여 분석에 영향이 주지 않도록 조치하는 것이 바람직하다. 이때 분리용 입자와 제1 프로브의 결합은 다양한 방법을 통해 이루어질 수 있다. 일 구현으로 제1 프로브가 DNA인 경우 DNA 말단을 바이오틴으로 그리고 분리용 입자는 스트렙트아비딘으로 코팅하고 두 물질을 반응시킴으로써 결합이 이루어질 수 있다. 이 외에도 아민-숙시닐 안하이드라이드, PNA-DNA 결합 및 기타 다양한 방법을 이용하여 분리용 입자와 제1 프로브의 결합이 이루어질 수 있다. 분리 결합반 응 이후에 남아 있는 반응 전구체의 분리는 자성 분리 입자를 사용함으로써 자석을 이용하여 분리하고 여액은 폐기하는 방법이 사용될 수 있으며, 또한 원심 분리를 이용하여 입자는 모으고 여액을 버리는 방법을 사용할 수 있다.

상기 제1 프로브는 검출하고자 하는 생물학적 표적 물질과 부분적으로 상보적이며, 바람직하게는 표적 물질과 적어도 30%의 상동성을 가지며, 보다 바람직하게는 적어도 40%의 상동성을 가지며, 가장 바람직하게는 40-60%의 상동성을 갖는다.

또한, 상기 제1 프로브는 다수로 존재할 수 있으며, 이에 한정하는 것은 아니나 상기 자성 입자의 표면상에 수십 내지 수백 개의 제1 프로브가 존재할 수 있다. 또한 상기 제1 프로브는 다양한 길이를 가질 수 있으며, 그 길이는 표적 물질, 프로브의 타입 등에 따라 달라질 수 있으며, 당해 기술분야의 통상의 숙련자는 주어진 조건에서 적절한 길이를 쉽게 정할 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 프로브가 DNA인 경우, 바람직하게 그 길이는 분석 표적 뉴클레오타이드의 최대 25% 또는 10mer 이상의 염기쌍을 갖는다. 한편, 상기 분리용 자성 입자를 형성하는 물질로는 자성을 가지며 상술한 바와 같은 프로브가 용이하게 부착될 수 있는 물질이 가능한바, 예를 들어 스트렙트아비딘, COOH, OH, ,SiOx, NH₂ 등을 표면에 노출시킬수 있는 고분자로 코팅된 자성 입자가 바람직하다. 특히, 상기 자성 입자는 초상자성(superparamagnetic) 특성을 갖는 것이 바람직하다. 상기 초상자성 특성을 갖는 자성 입자는 이에 한정하는 것은 아니나, 예를 들어, Iron-Oxide, Iron-Cobalt, Iron-Nickel와 같은 철 산화물 또는 전이 금속을 포함한다.

이들 자성 물질의 형상은 구형이 바람직하다. 본 발명에 사용되는 이러한 자성 물질의 크기는 분석 농도 및 분석 물질에 따라 변경 되어야 하므로 이를 한정하는 것은 곤란하다. 그럼에도 불구하고, 이들 자성 물질은 이에 한정하는 것은 아니나, 일반적인 자석을 이용해서 분리하기 위해서는 0.1 내지 100마이크로미터의 입경을 갖는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 1.0 내지 2.8 마이크로미터, 가장 바람직하게는 1.0마이크로미터의 입경을 갖는다.

분석용 고분자 입자

상기 표적 물질과 적어도 일부 상보적이지만 상기 제1 프로브와 상이한 제2 프로브가 고분자 입자의 표면상에 부착되어 있으며, 또한 인식 코드(identification code)로서 상기 제2 프로브에 비해 적어도 3배 이상의 비율로 존재하며 미리 정해진 배열을 갖는 바코드 DNA가 고분자 입자의 표면상에 부착되어 있으며, 상기 바코드 DNA는 표지물질과 부착되어 있는 분석용 고분자 입자를 준비한다. 본 발명에 사용되는 분석용 고분자 입자를 도 2에 나타내었다.

분석용 입자는 표적 물질과는 부분적으로 결합할 수 있으나 제1 프로브와 표적물질의 결합부위와는 다른 부분이 표적 물질과 결합하는 제2 프로브 및 신호 증폭용으로 사용되는 바코드 DNA로 구성된다. 상기 제2 프로브와 바코드 DNA는 분석용 입자의 표면상에 부착된다. 상기 제2 프로브 및 바코드 DNA는 공유 또는 비공유 수단에 의해 상기 고분자 입자에 결합될 수 있다.

상기 분석용 고분자 입자의 표면상에 부착되는 제2 프로브는 올리고뉴클레오타이드 또는 단백질이 바람직하며, 보다 구체적으로는 DNA, RNA, PNA, 아프타머(aptamer), 항원, 항체, 합텐 등을 포함한다. 상기 제2 프로브는 상기 분석용 고분자 입자의 표면상에 직접 부착되는 것도 가능하나, 표면 처리 물질로 상기 고분자 입자의 표면을 처리한 후 이것을 링커로 하여 부착되는 것이 효율 면에서 더욱 바람직하다. 이와 같은 표면 처리 물질로서는 실란계, 에폭시계, 카르복실계, 아민계, 알데히드계 등의 물질이 가능하다. 보다 구체적으로는 아미노프로필트리에톡시실란(aminopropyltriethoxysilane; APTES), 글리시독시프로필트리메톡시실란(glycidoxypropyltrimethoxysilane; GPTS), 트리에톡시실란 운데칸산(triethoxysilane undecanoic acid; TETU), 폴리라이신(poly(lysine)), 4-트리메톡시실릴벤즈알데히드(4-trimethoxysilylbenzaldehyde) 등이 있다. 또한, 아비딘, 스트렙트아비딘으로 코팅하는 것이 가능하다.

상기 제2 프로브는 검출하고자 하는 생물학적 표적 물질과 부분적으로 상보적이며, 바람직하게는 표적 물질과 적어도 25%의 상동성을 가지며, 보다 바람직하게는 40-50%의 상동성을 갖는다.

또한, 상기 제2 프로브는 다수로 존재할 수 있으며, 이에 한정하는 것은 아니나 상기 분석용 고분자 입자의 표면상에 수십 내지 수백 개의 제2 프로브가 존재할 수 있다. 또한 상기 제2 프로브는 다양한 길이를 가질 수 있으며, 그 길이는 표적 물질, 프로브의 타입 등에 따라 달라질 수 있으며, 당해 기술분야의 통상의 숙련자는 주어진 조건에서 적절한 길이를 쉽게 정할 수 있다. 예를 들어, 상기 제2 프로브가 DNA인 경우, 바람직하게 그 길이는 표적 DNA의 25% 정도 길이의 뉴클레오타이드일 수 있다.

한편, 상기 분석용 고분자 입자를 형성하는 물질로는 고분자이며 상술한 바와 같은 프로브가 용이하게 부착될 수 있는 물질이 가능한바, 예를 들어 실리카, 라텍스, PS(poly styrene), PEI(poly ethylene imine), 덱스트란 등이 바람직하다. 본 발명에 사용되는 이러한 고분자 물질의 분자량 및 크기는 분석 농도 및 분석 물질에 따라 변경 되어야 하므로 이를 한정하는 것은 곤란하다. 그럼에도 불구하고, 이들 고분자 물질은 이에 한정하는 것은 아니나, 분자량이 PEI 기준으로 60,000, 바람직하게 1,000,000 내외의 의 범위를 갖는 것을 사용할 수 있다. 또한, 그 형상은 구형이 바람직하다. 이들의 평균입경은 이에 한정하는 것은 아니나, 상기 고분자 입자는 0.1~1.0마이크로의 입경을 갖는 것이 바람직하다.

상기 분석용 고분자 입자의 표면상에 존재하는 바코드 DNA는 제2 프로브에 비해 훨씬 더 많은 양으로, 적어도 3배 이상의 비율로 존재한다. 고분자 입자이 표면상에 부착되는 바코드 DNA와 제2 프로브의 비율을 이에 한정하는 것은 아니나, 바코드 DNA:제2 프로브가 3:1 내지 1000:1의 비율로 존재하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 바코드 DNA는 제1 바코드 DNA 및 제2 바코드 DNA로 이루어진 이중 가닥의 형태를 가질 수 있다. 이러한 경우, 상기 제1 바코드 DNA는 한쪽 말단이 표지물질로 표지되며, 다른 한쪽 말단은 상기 분석용 고분자 입자의 표면상에 부착되지 않는다. 한편, 상기 제2 바코드 DNA는 상기 제1 바코드 DNA와 상보적이며 한쪽 말단이 상기 분석용 고분자 입자의 표면상에 부착된다. 상기 표지물질은 상업적으로 이용가능한 장치를 이용하여 검출될 수 있는 어떠한 표지물질일 수 있다. 상기 표지물질은 나노 사이즈의 자성 입자, 형광분석이 가능한 물질 또는 표면에 음전하를 뛰는 물질일 수 있다. 예를 들어, 상기 표지물질은 자성 나노 입자, 형광 물질, 양자 입자(quantum dot) 등을 포함한다.

분리용 입자에 결합하는 제1 프로브의 양은 분리용 입자 전체 수보다 많기만 하면 분석에 영향을 주지 않지만, 분석용 입자의 경우 입자 표면상에 부착되는 제2 프로브와 바코드 DNA의 비율을 분석 목적에 맞게 1:1000이상으로 조절하는 것이 바람직하다. 비율이 정확하거나 분석용 입자에 결합된 비율을 확인해야 하는 이유는 제2 프로브와 바코드 DNA의 비율 자체가 완성된 플랫폼의 신호의 증폭비가 될 수 있기 때문이다.

상기 두 입자의 제조가 완료되면, 상기 분리용 자성 입자, 상기 분석용 고분자 입자, 및 상기 표적 물질을 혼성화(hybridization) 반응용 버퍼하에서 반응시킨다. 표적 물질은 분리용 입자와 분석용 입자가 완성된 이후에 각 입자의 용액 속에 따로 첨가해도 되고 또는 두 가지 용액을 혼합한 후 투입해도 상관없다. 혼합 후에는 표적 물질이 분리용 입자와 분석용 입자 모두와 충분히 반응할 수 있는 시간동안 혼성화 반응시킨다.

혼성화 반응은 이에 한정하는 것은 아니나, 예를 들어, 실온에서 TE용액 또 는 이러한 혼성화 반응을 일으킬 수 있는 용액에서 1.5~2시간 동안 수행할 수 있다. 혼성화 반응이 완료되면, 도 3에 나타낸 바와 같은 분리용 자성 입자 - 표적 물질 - 분석용 고분자 입자로 이루어진 복합체가 형성된다.

그 다음, 그 반응물로부터 상기 분리용 자성 입자 - 표적 물질 - 분석용 고분자 입자로 이루어진 복합체를 자성 분리를 통해 분리한다. 자성 분리는 통상적인 자성 분리기를 이용하여 수행될 수 있다.

그 다음, 상기 분리된 복합체에 열을 가하여 상기 분석용 고분자 입자에 존재하는 바코드 DNA를 변성(denature)시켜 고분자 입자로부터 떨어뜨리고, 원심분리를 통해 상기 복합체로부터 상기 분리용 자성 입자와 상기 분석용 고분자 입자를 제거하여 상기 바코드 DNA를 분리한다.

상기 바코드 DNA를 변성시키는 경우 가열은 바코드 DNA의 Tm(융해온도) 이상의 온도에서 수행할 수 있다. 이러한 Tm은 당해 기술분야의 통상의 숙련자에 의해 쉽게 알 수 있을 뿐 아니라 간단히 계산될 수 있다.

그 다음, 상기 분리된 바코드 DNA에 결합되어 있는 표지물질로부터 신호를 검출한다. 표지물질로부터 신호 검출시 신호 검출방법은 당해 기술분야에 알려져 있는 바와 같이 상기 표지물질의 특성에 따라 달라질 것이다. 즉, 분리된 바코드 DNA는 다양한 방법으로 분석이 가능하다. 상기 바코드 DNA가 나노 자성 입자로 표지된 경우에는 GMR 센서를 이용하여 분석하고, 형광 및 일반적인 화학 분석을 이용하여 바코드 DNA의 양을 측정할 수 있다.

일 구현에 의하면, 프로브 DNA와 표적 DNA는 서로 일부만 상보적으로 결합할 수 있도록 제작되어 표적 DNA는 분석 대상물인 동시에 상기 2종류의 입자들이 결합할 수 있는 연결 고리 역할을 할 수 있게끔 되어 있다. 연결을 이룬 입자들은 자석을 이용하여 분리하고 분리된 자성/고분자 입자 복합체에 바코드 DNA와 상보적인 결합이 가능한 DNA를 첨가할 경우 결합된 DNA의 양은 자성/고분자 입자의 수에 비례하게 되며 동시에 결합된 표적 DNA의 수와도 비례하게 된다. 따라서, 바코드 DNA는 표적 DNA에 비해 훨씬 더 많은 양으로 존재하므로, 표적 DNA에 비해 훨씬 더 많은 양이 상기 분리된 자성/고분자 입자 복합체내에 존재하게 된다. 따라서, 자력을 이용하여 결합되지 않은 자유 입자들을 제거하게 되면 고분자 입자에 결합된 바코드 DNA의 수는 표적 DNA의 수에 비례하여 적게는 수십 배에서 많게는 수천 배에 이르게 된다. 이렇게 표적 DNA의 수에 비례하여 고분자 입자에 결합된 바코드 DNA를 다시 분리하여 분석하게 되면 표적 DNA의 수보다 증폭된 바코드 DNA의 양에 대한 신호를 얻을 수 있고 이를 역산하면 표적 DNA의 양을 간접적으로 확인할 수 있다. 분석방법은 결합된 바코드 DNA에 결합된 표지 물질(예, 자성 나노 입자, 형광 물질, 양자 입자 및 라벨 프리 방식) 또는 기타 라벨 프리 방식이 사용될 수 있다. 이러한 방식으로 미량의 DNA를 분석하게 될 경우, DNA의 양이 많지 않더라도 PCR과 같은 고가의 증폭 방법을 사용하지 않더라도 펨토(femto) 또는 아토 몰(atto mole)이하의 DNA도 분석할 수 있다.

종래의 입자를 이용한 생물학적 표적 물질 검출방법은 표적 물질을 시료로부터 분리하는 단순한 기능만을 강조한 반면에 2종류의 입자를 효과적으로 사용하여 분리와 분석이 동시에 이루어 지게 하여 시간 및 비용을 절감할 수 있도록 하였을 뿐만 아니라 바코드 물질을 이용한 감도의 획기적인 증가가 가능하게 하였다. 본 발명에 따라 제안된 플랫폼의 형태는 검출기(detector)의 종류에 상관없이 범용으로 사용이 가능할 뿐만 아니라 금과 같은 고가의 재료를 사용하지 않고, 극미량의 생체 물질(예, DNA)을 신속하고도 저렴한 비용으로 검출할 수 있는 장점이 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

실시예

표 1과 같은 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드와 지름이 2.8㎛의 자성 입자(분리용) 및 0.5㎛의 고분자 입자(분석용)를 준비하였다. 자성 입자는 코어가 산화철이 주성분이고 표면은 스트렙트아비딘으로 코팅되어 있는 invitrogen 사의 Dyna-280을 사용하였으며, 고분자 입자는 Bang's lab의 Silica Paritcle(CS01N/7659)로서, 실리카로 이루어진, 지름 0.5㎛의 구형이며 표면은 스트렙트아비딘으로 코팅되어 있는 것을 사용하였다. 상기 두 입자는 모두 스트렙트아비딘(streptavidin)으로 코팅되어 있어 말단이 바이오틴으로 되어 있는 올리고뉴클레오타이드들이 결합할 수 있도록 하였다.

[표 1]

DNA 종류	염기서열
제1 프로브	5'-biotin AAA AAA AAA AAAA-3'
제2 프로브	5'-biotin GGG GGG GGG GGGG-3'
제1 바코드 DNA(c-Barcode)	5'-biotin GCC TCC ACG CAC GTT GTG ATA TGT A-3'
제2 바코드 DNA(Barcode)	3'-CGG AGG TGC GTG CAA CAC TAT ACT T biotin-5'

표적 DNA는 제1 프로브와 제2 프로브의 말단과 부분적으로 상보적인 결합이 가능하도록 양 말단을 T와 C로 치환한 DNA를 사용하였다.

사용된 자성 입자에 결합된 스트렙트아비딘의 양을 고려하여 제1 프로브를 희석하여 자성 입자와 혼합한 후(자성 입자 6.0⁵x10⁷ paritcle당 200 pmole), 반응하지 않은 제1 프로브 DNA와 여분의 자성 입자를 자성 분리기(magnetic seperator)(Invitrogen, Dynal MPC)를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 분리하여 제거하였다.

분석용 실리카 입자에는 제2 프로브 DNA, 제1 바코드 DNA(c-Barcode) 및 제2 바코드 DNA(Barcode)가 결합되도록 적용하였다. 이때 불필요한 경쟁 반응이 일어나지 않도록 제2 프로브 DNA, 제1 바코드 DNA(c-Barcode) 및 제2 바코드 DNA(Barcode)의 순서로 적용하였다. 먼저 제2 프로브 DNA를 적용된 실리카 비드의 농도와 동일하게 적용한후(약 3.7 femto 대 3.7 atto mole의 비율로), 완전히 스트렙트아비딘-바이오틴반응이 종료되면(10mM Tris-HCL, 1.0 mM EDTA, 1M Nacl 용액에서 15분이상 반응), 그 다음 제1 바코드 DNA를 적용하였다.

제1 바코드 DNA의 결합이 종료된 후, 제2 바코드 DNA를 적용하는데 이때 적용하는 제2 바코드 DNA의 양은 제1 바코드 DNA의 양보다 많은 것이 바람직하다. 제2 바코드 DNA가 과량으로 적용하여도 나중에 제2 바코드 DNA의 분리 과정에서 제거되므로 과량은 별다른 문제가 되지 않는다.

상기 제2 바코드 DNA는 도 10에 나타낸 바와 같이, 나노 사이즈의 자성 입자로 표지된 것을 사용하였다. 참고로, 나노 사이즈의 자성 입자에 DNA를 붙이는 반응은 EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodimide hydrochloride)를 이용하여 수행되었다. 나노 사이즈의 표면은 카르복시기로 덮혀져 있는데 EDC의 한쪽은 나노 비드와 한쪽은 아민과 결합한다. 따라서, DNA의 끝을 아민으로 치환하게 되면 DNA와 나노 비드는 결합하게 된다.

상기 분석용 실리카 입자에 상기 나노 비드로 표지된 제2 바코드 DNA를 결합시켰다. 실리카 입자와 나노 비드로 표지된 제2 바코드 DNA는 1:1000의 비율로 결합하도록 조절하였다. 반응은 TE버퍼를 사용하였으며 반응 시간은 2시간이었다.

분리용 입자와 분석용 입자가 완성되면 상기 2 입자를 혼합한 후 바로 표적 DNA를 넣어주어 반응시켰다. 이때 상기 분리용 입자와 분석용 입자는 1:1의 비율로 혼합되도록 하였으며 반응은 TE버퍼나 B/W 버퍼를 사용하였으며 반응 시간은 2시간 이었으며 실온에서 10분 마다 한번씩 가볍게 손으로 툭툭 쳐주는 정도로 침전을 방지하였다.

혼합후 반응이 완료되면 표적 DNA가 상기 두 입자와 결합하여 도 3에 나타낸 바와 같은 플랫폼이 만들어진다. 한편, 이러한 반응이 이루어지지 않은 분리용 입자의 형광 현미경 사진(200배)을 도 6에 나타내었으며, 도 7에는 실제 이러한 과정을 거쳐 완성된 플랫폼을 염색하여 촬영한 형광 현미경 사진(1000배)을 나타내었다.

플랫폼이 완성되면 분석용 입자에 결합되어 있는 제2 바코드 DNA를 분리하여 분석한다(도 5 참조). 본 실시예에서는 제1 바코드 DNA와 제2 바코드 DNA의 Tm보다 높은 온도를 적용하여 분리하였다. 우선, 분리용 입자와 분석용 입자를 분리시킨(45℃이상, 30분 가열)후 다시 분리용 입자는 상기와 같은 방법으로 자성 분리기(Invitrogen, Dynal MPC)를 이용하여 분리하고 분석용 입자만 수거하였다. 그 다음, 분석용 입자로부터 제2 바코드 DNA가 분리될 수 있도록 Tm이상의 온도를 가하여 분리하였으며(80℃이상, 30분 가열), 제2 바코드가 제거된 분석용 입자는 원심분리(12000rpm, 30초)를 통해 시료에서 제거되었다.

본 실시예에서 사용된 플랫폼을 이용하여 분리/증폭된 제2 바코드 DNA를 분광/자성/질량/크로마토그래프 분석 등을 이용하여 분석하였다. 이러한 실험은 표적 DNA의 양을 펨토 몰 수준에서 변화시키면서 수행하였으며 이러한 표적 DNA의 양 변화에 따른 바코드 DNA의 검출량을 분석하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다. 질량 분석은 MLADi-TOF를 이용하여 분석을 시행하였으며(도 11), 자성 분석의 경우는 GMR 센서를 이용하여 저항값을 이용하여 측정하였으며(도 12), 그리고 FET의 경우는 소오스에서 드래인으로 흐르는 전류의 값을 전압으로 바꾸어 측정하였다(도 13). 이때 컨트롤 값은 센서 표면에 DNA를 고정화 시키기전의 값을 의미한다.

도 8로부터 알 수 있는 바와 같이, 표적 DNA의 양이 펨토 몰 수준으로 증가하여도, 이에 비례하여 바코드 DNA의 검출 량이 증가하는 것으로 나타나, 본 발명에 따른 생물학적 표적 물질 검출 방법은 매우 우수한 검출 감도를 나타냄을 확인할 수 있었다.

본 발명의 방법에 따라 미량의 DNA를 분석하게 될 경우, DNA의 양이 많지 않더라도 PCR과 같은 고가의 증폭 방법을 사용하지 않고도 펨토(femto) 또는 아토 몰(atto mole) 이하의 DNA를 분석할 수 있다.

Claims

검출하고자 하는 생물학적 표적 물질과 적어도 30% 상동성을 갖는 제1 프로브가 자성 입자의 표면상에 부착되어 있는 분리용 자성 입자를 준비하고,

상기 표적 물질과 적어도 25% 상동성을 갖지만 상기 제1 프로브와 상이한 제2 프로브가 고분자 입자의 표면상에 부착되어 있으며, 또한 인식 코드(identification code)로서 상기 제2 프로브에 비해 적어도 3배 이상의 비율로 존재하며 미리 정해진 배열을 갖는 바코드 DNA가 고분자 입자의 표면상에 부착되어 있으며, 상기 바코드 DNA는 표지물질과 결합되어 있는 분석용 고분자 입자를 준비하는 단계;

상기 분리용 자성 입자, 상기 분석용 고분자 입자, 및 상기 표적 물질을 혼성화(hybridization) 반응용 버퍼하에서 반응시키는 단계;

그 반응물로부터 분리용 자성 입자 - 표적 물질 - 분석용 고분자 입자로 이루어진 복합체를 자성 분리기를 통해 분리하는 단계;

상기 분리된 복합체에 열을 가하여 상기 분석용 고분자 입자에 존재하는 바코드 DNA를 변성(denature)시키고, 원심분리를 통해 상기 복합체로부터 상기 분리용 자성 입자와 상기 분석용 고분자 입자를 제거하여 상기 바코드 DNA를 분리하는 단계; 및

상기 분리된 바코드 DNA에 결합되어 있는 표지물질로부터 신호를 검출하는 단계

를 포함하는 바코드 DNA를 이용한 생물학적 표적 물질의 검출 방법.
제 1항에 있어서, 상기 표적 물질은 DNA, RNA 또는 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 제1 프로브는 DNA, RNA 또는 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 제2 프로브는 DNA, RNA 또는 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 자성 입자는 초상자성(superparamagnetic) 특성을 갖는 것임을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 초상자성 특성을 갖는 자성 입자는 Iron-Oxide, Iron-Cobalt, Iron-Nickel 및 전이금속으로 구성된 그룹으로부터 선택된 금속으로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 자성 입자는 1.0~2.8마이크로미터의 입경을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 고분자 입자는 실리카, 라텍스, PS(poly styrene), PEI(poly ethylene imine) 및 덱스트란으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 고분자 물질로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 고분자 입자는 0.1-1.0마이크로미터의 입경을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 바코드 DNA는 제1 바코드 DNA 및 제2 바코드 DNA로 이루어진 이중 가닥의 형태를 가지며, 여기서 상기 제1 바코드 DNA는 한쪽 말단이 나노 입자로 표지되어 있으며 다른 한쪽 말단은 상기 분석용 고분자 입자의 표면상 에 부착되어 있지 않으며, 그리고 상기 제2 바코드 DNA는 상기 제1 바코드 DNA와 상보적이며 한쪽 말단이 상기 분석용 고분자 입자의 표면상에 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 분석용 고분자 입자의 표면상에 바코드 DNA 대 제2 프로브는 3:1 내지 1000:1의 비율로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 분리된 복합체에 열을 가하여 상기 분석용 고분자 입자에 존재하는 바코드 DNA를 변성시키는 경우 가열은 바코드 DNA의 Tm(융해온도) 이상의 온도에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 표지물질은 나노 사이즈의 자성 입자, 형광분석이 가능한 물질 또는 표면에 음전하를 띄는 물질인 것을 특징으로 하는 방법.