KR20150144644A

KR20150144644A - Dna 검출용 바이오센서 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20150144644A
Application number: KR1020140073748A
Authority: KR
Inventors: 이재준; 만부부 라만 모하마드
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2014-06-17
Filing date: 2014-06-17
Publication date: 2015-12-28

Abstract

본 발명은 DNA 검출용 바이오센서 및 이의 제조방법으로써, 보다 상세하게는 전도성 투명기판 전극에 폴리 싸이오닌이 코팅된 금 나노입자를 형성하여 제조된 DNA 검출용 바이오센서 및 이의 제조방법에 관한 것으로 종래의 PCR 등에 의한 유전자 분석에 비해 경제적이고 효율적인 분석방법을 제공하며 단일 가닥의 DNA를 검출함에 있어서 뛰어난 검출 감도와 안정성을 갖고 있다.

Description

DNA 검출용 바이오센서 및 이의 제조방법{Biosensor for DNA Detection and method for manufacturing the same}

본 발명은 DNA 검출용 바이오센서 및 이의 제조방법으로써, 보다 상세하게는 전도성 투명기판 전극에 폴리 싸이오닌이 코팅된 금 나노입자를 형성하여 제조된 DNA 검출용 바이오센서 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

질병의 조기진단을 위해 생체시료 속에 존재하는 미량의 질병지표물질을 고감도로 감지하는 기술이 점점 더 중요하게 되고 있다. 이를 위해 immuno-PCR, Bio-barcode assay, Liposome-PCR 등과 같이 fM 농도 이하까지도 측정할 수 있는 기술이 최근에 많이 개발되고 있다.

예컨대, DNA 검출과 관련하여 종래의 검출 방법으로는 형광물질을 DNA 분자에 결합시켜 형광의 빛을 검출하는 Label 기법을 기반으로 한다.

이와 같은 형광물질을 기반으로 하는 검출방법은 복잡한 시료 준비과정, 복잡한 광학 시스템 그리고 특수하고 복잡한 분석을 요구하며, 경제적으로 불리한 단점을 포함한다.

이로 인하여 별도의 표식 없이 측정이 가능한 Label-Free 기법에 대한 연구가 활발히 진행 중이다.

상기 Label-Free 기법의 하나의 방법으로서 전기화학적 바이오센서를 이용할 수 있다. 일반적으로 바이오센서는 생물체와 관련된 물질이 센서의 구성요소로 사용되거나 분석대상이 될 때 사용된다. 그 중 전기화학적 바이오센서는 전기화학적 방법이 지니는 분석 능력과 생물학적 인식과정(biological recognition process)의 특이성(specificity)을 결합시킨 것이라 볼 수 있다.

즉, 생물학적 특이성을 지니는 물질(bio-specific reagent)인 효소, 항원, 항체, 생화학 물질 등을 전극표면에 고정시키거나 함유하게 함으로써 생물학적 인식현상을 정량적인 전류 혹은 전위 변화로 변환시키는 장치이다.

예컨대, 항체와 같은 생체분자의 특정 표적물질에 대한 선택적 결합을 이용할 수 있다. 가장 많이 보고되고 있는 것으로 항원-항체의 면역반응에 기반한 면역결합센서(immunosensor)이다. 항체는 항원에 대한 결합자리의 입체 특이성에 기인한 놀라운 선택성을 지니고, 또 항원과 매우 큰 결합 평형상수를 가지고 결합한다. 면역결합센서에서는 이와 같은 항체를 전극표면에 고정시키고 표적물질 자체 혹은 제2의 항체에 표지물질로 라벨을 붙이는 방법으로 표적물질과의 특이결합의 결과물을 전류측정 혹은 전위차 측정법의 방법으로 전기적 신호로 변환시킬 수 있도록 한다.

또 다른 형태로서, 핵산의 인식작용을 이용한 것으로, DNA 혼성(hybridization) 바이오센서를 들 수 있다.

이는 DNA 염기 짝지음에 기반한 센서로서, 특정한 서열을 갖는 단일 가닥의 DNA를 전극 표면에 고정하고, 고정된 단일 가닥 서열과 상보적으로 결합할 수 있는 서열을 지니는 시료중의 단일 가닥 DNA와의 혼성화에 의해 전기적 신호가 변환하는 형태라고 할 수 있다.

이는 DNA와의 서열에 대해서 선택적인 특이성을 기대할 수 있을 뿐 아니라 간편하고, 빠른 분석이 가능하기 때문에 유전질환의 임상 진단부터 범죄 수사까지 다양하게 그 응용 가능성을 지닌다.

이러한 DNA 검출용 바이오센서에 관한 종래의 기술로서, 공개특허공보 제 10-2012-0093630호(2012.08.23.)는 프로브 DNA를 유기박막트랜지스터에 형성하여 얻어지는 DNA 센서 및 이의 제조방법에 관한 기술에 관해 기재되어 있고, 또한 등록특허공보 제10-1293666호(2013.07.31.)는 기판상에 형성된 금속 나노닷에만 선택적으로 DNA층과 단백질층을 순차적으로 반복하여 쌓아올려 3차원 단백질 다층 나노구조체를 제조하는 방법 및 이를 이용한 바이오센서에 관한 기술에 관해 기재되어 있다.

그러나, 상기와 같은 종래기술을 포함하여, DNA 검출을 위한 바이오센서의 제조를 위한 다양한 방법들이 제시되었지만, 전기화학적 측정방법에 의한 간단하고 소형화된 전극을 이용함으로써, DNA 검출을 위한 준비공정 및 측정과정이 단순하면서도, 불순물을 포함하는 용액상에서 보다 안정적이고 재현성이 있는 DNA 검출 바이오센서 및 이를 이용하여 임상적으로 의미가 있는 특정 유전자의 존재 유무를 종래의 PCR 기법 등의 기존 방법에 비해 보다 간편하고 빠르게 확인할 수 있는 전기화학적 분석 방법에 대한 연구의 필요성은 지속적으로 요구되고 있는 실정이다.

공개특허공보 제10-2012-0093630호(2012.08.23.) 등록특허공보 제10-1293666호(2013.07.31.)

본 발명은 DNA 검출을 위한 준비공정 및 측정과정이 단순하면서도, 불순물을 포함하는 용액상에서 보다 안정적이고 재현성이 있으며, 특정 유전자의 존재 유무를 종래의 PCR 기법 등의 기존 방법에 비해 보다 간편하고 빠르게 확인할 수 있는 바이오센서용 전극 및 이의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 제조된 전극을 이용하여, 수용액상에서 보다 안정적이고 재현성이 있는 DNA 감지 장치를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 DNA 감지 장치를 이용하여 보다 신속하고 경제적인 방법에 의해 안정적이고 재현성이 있게 DNA를 분석하는 방법을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 전도성 투명 전극에 금 나노입자가 형성되어 분산되도록 하는 단계; b) 상기 금 나노입자가 형성된 투명 전극 표면에 싸이오닌의 중합을 통해 폴리 싸이오닌이 코팅된 금 나노입자가 형성되도록 하는 단계; 및 c) 상기 폴리 싸이오닌에 프로브 DNA를 연결시키는 단계;를 포함하는 바이오센서용 전극의 제조방법을 제공한다.

일 실시예로서, 상기 전도성 투명 전극은 ITO, IZO, ATO, FTO, (SnO2), (ZnO) 에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

일 실시예로서, 상기 금 나노입자는 금 전구체를 전기화학적으로 환원시키거나, 또는 폴리올법, 또는 환원제의 존재 하에서 환원시킴으로써, 형성될 수 있다.

일 실시예로서, 상기 폴리 싸이오닌은 싸이오닌이 포함된 수용액에서 전기화학적 중합반응을 통하여 형성될 수 있다.

일 실시예로서, 상기 c) 단계는 b) 단계에서 얻어지는, 폴리 싸이오닌 코팅된 금 나노입자가 형성된 전극을 프로브 DNA 전구체를 포함하는 수용액에 침지하는 단계를 포함할 수 있다.

일 실시예로서, 상기 c) 단계에서의 프로브 DNA는 측정하고자 하는 특정 DNA에 상보적으로 상응하는 단일가닥 DNA일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조되는 바이오센서용 전극을 제공한다.

또한, 본 발명은 측정하고자 하는 특정한 DNA가 포함된 용액을 저장하는 용액 저장조, 본 발명에서의 상기 바이오센서용 전극을 포함하는 작동 전극, 상기 작동전극에 대응하는 상대(counter) 전극, 및 기준전극을 포함하는 DNA 감지 장치를 제공한다.

또한, 본 발명은 전극 표면에 금 나노입자가 형성되어 분산된 전도성 투명전극을 포함하며, 상기 금 나노입자는 폴리 싸이오닌이 코팅되어 있고, 상기 폴리 싸이오닌은 단일가닥(single strand) 프로브 DNA와 공유결합으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 바이오센서용 전극을 제공한다. 이 경우에 상기 전도성 투명전극은 ITO이고, 상기 폴리 싸이오닌은 전기화학적 중합방법에 의해 형성될 수 있으며, 상기 바이오센서용 전극은 DNA 감지용 장치에 적용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 감지용 장치를 이용하여 전기화학적 방법을 통해 상기 단일가닥(single strand) 프로브 DNA와 상보적으로 상응하는 DNA를 분석하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, DNA 검출을 위한 준비공정 및 측정과정이 단순하면서도, 특정 유전자의 존재 유무를 종래의 PCR 기법 등의 기존 방법에 비해 보다 간편하고 빠르게 확인할 수 있는 바이오센서용 전극 및 이의 제조방법을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 전극을 이용하여 불순물을 포함하는 용액상에서 보다 안정적이고 재현성이 있게 측정이 가능한 DNA 검출용 장치를 제조할 수 있으며, 상기 DNA 검출용 장치는 감지하고자 하는 특정 유전자의 단일가닥 DNA를 뛰어난 감도와 선택성으로 검출이 가능하다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서용 전극을 제조하기 위한 방법 및 이에 의해 DNA를 검출하는 과정을 도시한 그림이다.
도 2의 (A)는 본 발명의 일 실시예에 따른 산화인듐주석 박막에 금 나노입자가 증착된 순환전압전류(CV) 곡선을 도시한 그림이며, (B)는 금 나노입자의 주사전자현미경(SEM) 사진을 도시한 그림이고, (C)는 산화인듐주석 박막에 금 나노입자가 증착된 전극에 싸이오닌이 전기화학적 결합을 한 후의 순환전압전류(CV) 곡선을 도시한 그림이며, (D)는 금 나노입자에 폴리 싸이오닌이 코팅된 산화인듐주석 전극의 주사전자현미경 사진을 도시한 그림이다.
도 3의 (A)는 본 발명의 일 실시예에 따른 전극에 있어, ITO 전극, ITO 전극에 금 나노입자가 증착된 전극, 폴리 싸이오닌으로 코팅된 금 나노 입자가 증착된 ITO 전극의 순환전압전류(CV) 곡선을 도시하고, (B)는 이들의EIS(electrochemical Impedance Spectroscopy) 스펙트럼을 도시화한 그림이다.
도 4의 (A)는 본 발명의 일 실시예에 따른 전극에 있어, 폴리 싸이오닌으로 코팅된 금 나노 입자가 증착된 ITO 전극, 이에 프루브 DNA가 결합된 전극, 상기 프루브 DNA에 상보적 DNA가 결합된 형태의 전극의 전압에 따른 전류 밀도를 도식화하였고, 도 4의 (B)는 프로브 DNA와 표적 DNA의 혼성화에 따른 전류밀도의 변화량을 나타낸 그래프이며, 도 4의 (C)는 단일 가닥 DNA의 검출 범위를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 본문에 개시되어 있는 본 발명의 다양한 형태로 실시될 수 있으며 본문에 설명된 실시 예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.

본 발명을 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다.

또한, 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 설시된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 본 발명에 따른 바이오센서용 전극의 제조방법 및 이를 이용하여 DNA를 검출하는 과정을 도시한 것이다.

이를 보다 상세하게 설명하면, 본 발명은 a) 전도성 투명 전극에 금 나노입자가 형성되어 분산되도록 하는 단계; b) 상기 금 나노입자가 형성된 투명 전극 표면에 싸이오닌의 중합을 통해 폴리 싸이오닌이 코팅된 금 나노입자가 형성되도록 하는 단계; 및 c) 상기 폴리 싸이오닌에 프로브 DNA를 연결시키는 단계;를 포함하여 이루어진다.

본 발명에서 상기 전도성 투명 전극은 금나노입자가 형성되어 분산될 수 있으며, 전도성을 가진 재료인 경우에 그 종류에 제한되지 않고 사용될 수 있으며, 바람직하게는 ITO, IZO, 안티몬을 함유하는 산화주석(ATO:Antimony Tin Oxide), 불소가 함유된 불소산화주석(FTO: Fluorine Tin Oxide), (SnO2), (ZnO) 등의 금속 산화물, 반도체물질 들 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 더욱 바람직하게는 ITO, 또는 불소가 함유된 불소산화주석(FTO: Fluorine Tin Oxide)이 사용될 수 있다.

예컨대, 상기 불소산화주석(FTO)은 고온에 대한 안전성이 높고 저저항성 및 고투과율을 갖는 장점이 있고, 산화인듐주석(ITO)의 경우, 비저항이 낮고 패터닝(patterning)에 필요한 에칭(etching)특성이 우수한 장점이 있다.

한편, 본 발명에서 사용되는 전도성 투명전극은 본 발명에서는 이를 전기화학적 센서로서 이용하지만, 그 용도는 이에 제한되지 않고 투명 전극으로서 사용할 수 있는 다양한 디스플레이 소자, 바이오 센서 등에 이용될 수 있다.

따라서, 본 발명에서 제조되는, 전도성 투명전극에 금 나노입자 및 폴리싸이오닌 및 프로브 DNA가 형성된 전극은 전기화학적 센서의 용도 뿐만 아니라, 투명 전극으로서 사용할 수 있는 다양한 유기반도체 소자 및 바이오 센서 등에 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에서의 금 나노입자를 형성하기 위한 환원반응은 그 종류에 제한되지 않고 금 나노입자가 형성되어 상기 전도성 투명전극상에 부착될 수 있으면 어느 것이나 사용가능하나, 바람직하게는 금 전구체를 전기화학적으로 환원시키거나, 또는 폴리올법, 또는 환원제의 존재 하에서 환원시킴으로써 제조할 수 있다.

일반적으로, 금속 나노입자는 금속나노 입자를 형성하기 위한 금속전구체의 환원에 의해 얻어질 수 있고, 더욱 바람직하게는 전기화학적 환원에 의해 금 나노입자가 형성될 수 있다.

본 발명에서 금 나노입자의 제조를 위해 사용되는, 금 전구체는 금 이온으로서 1가(Au(I)) 또는 3가의 금(Au(Ⅲ)) 이온을 함유하는 형태라면 제한되지 않고 사용될 수 있으며, 바람직하게는 염화금산(HAuCl₄)이 사용될 수 있고, 상기 금 이온을 포함하는 수용액에서 금나노입자를 제조하는 경우에 염화금산(HAuCl₄)수용액이 사용될 수 있다.

본 발명에서는 상기 전기화학적 환원을 이용하여 금 전구체 수용액내 금이온이 금 나노입자로 환원되기 위해 특정값 이하의 전압을 가하여 일정시간동안 환원시킴으로써 이루어질 수 있다.

한편, 본 발명에서 상기 금 나노입자의 형성을 위해 가해주는 전압은 Ag/AgCl 기준전극 대비값을 의미한다. 따라서, 본 발명에서의 금 나노 입자 형성을 위해 가해주는 전압은 별다른 제한이 없는 한, 상기 Ag/AgCl 기준전극 대비값임을 의미하는 것으로 보아야 한다.

이 경우에 바람직한 전압은 금이온이 금 나노입자로 환원될 수 있는 범위로서, -0.45 V이하, 바람직하게는 -0.5 V이하의 전압을 가하여 줄 수 있고, 더욱 바람직하게는 -0.55 V이하의 전압을 가해줄 수 있다

또한 상기 전압을 0.2 V에서 1.3V 사이에 1 내지 50회의 사이클을 주어 금 나노 입자를 제조할 수 있다.

또한, 상기 전기화학적 환원반응에 의한 금 나노입자를 제조하는데 있어서, 환원제를 추가적으로 사용할 수 있으며, 환원제로는 시트르산, 아스코르브산, 소듐 보로하이드라이드, 히드록시메틸, 포스포늄 클로라이드 등이 사용될 수 있으며, 상기 환원제는 필요한 경우 2 개 이상의 환원제를 혼합하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 히드록실아민 및 구연산을 사용할 수 있고, 구연산은 환원제로서 뿐만 아니라 금 나노입자의 표면에 달라붙어 나노 입자가 서로 엉기는 것을 방지하는 역할도 한다.

또한 본 발명에서 상기 환원반응은 전해질이 포함된 상태에서 이루어질 수 있다. 이때 사용될 수 있는 전해질로서는 전기 화학적 산화 환원반응에서 사용될 수 있는 것이면 그 종류에 제한되지 않으며, 바람직하게는 테트라알킬 암모늄염, 알킬 이미다졸염 등이 사용될 수 있고, 이들의 짝염으로서 테트라플루오르보레이트, 헥사플루오르포스페이트 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 상기 염화금산 수용액의 농도는 0.01 mM 내지 10 mM 의 범위일 수 있고, 바람직하게는 0.05 mM 내지 2 mM 의 범위일수 있다.

또한 상기 전기화학적 환원조건은 -0.5 V 이하의 전압을 5 내지 600초 동안 가하여 줌으로써 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 전기화학적 환원은 전도성 투명전극를 작동전극으로 하고, 상기 작동전극에 대응하는 상대(counter) 전극 및 기준전극을 포함하는 3전극 시스템에 의해 환원반응이 일어날 수 있다.

상기 상대전극은 백금전극이 사용될 수 있고, 기준전극은 통상적으로 사용가능한 Ag/AgCl 전극이 사용될 수 있다.

하기 반응식(1) 내지 반응식(2)는 본 발명에서의 일 실시예로서 상기 작동전극으로서 전도성투명전극 표면에 염화금산 수용액의 환원반응을 나타내고 있다.

(1)

(2)

상기 염화금산 수용액은 반응식(1)에 의해 3가의 금이온이 1가의 금이온으로 환원가능하며, 이후에 1가의 금이온은 반응식 (2)에 의해 금 나노 입자로 환원되어 전극 표면에 형성된다.

상기 환원반응에 의해 형성되는 금 나노입자의 직경은 30 내지 5000 nm의 범위일 수 있으며, 바람직하게는 50 내지 1000 nm일 수 있다. 일반적으로 환원반응의 시간이 길어질수록 직경이 크게 되나, 앞서 기재한 바와 같이 금속산화물이 환원된 후에 그 환원반응이 계속되면 입자가 탈착에 이르게 되거나 또는 표면에 형성된 입자의 크기의 균일도가 다르게 될 우려가 있으므로, 초과적인 환원반응이 더 일어나지 않도록 해야 한다.

본 발명에서 상기 금 나노입자가 형성된 투명 전극 표면에 싸이오닌의 중합을 통해 폴리 싸이오닌이 코팅된 금 나노입자가 형성되도록 하는 단계는 싸이오닌이 포함된 수용액에서 전기화학적 중합반응을 통하여 폴리 싸이오닌을 형성하는 것일 수 있다.

상기 폴리 싸이오닌(polythionine)은 고분자내 아미노기를 포함함으로써, 금 원자와 상기 아미노기의 질소원자가 배위결합이 가능하여 금 나노입자와 폴리 싸이오닌간의 결합력을 증대시킬 수 있다.

상기 폴리 싸이오닌은 싸이오닌 모노머를 중합함으로써 얻어질 수 있으며, 바람직하게는 전극의 표면에 싸이오닌(thionine, C14H13N3O2S) 모노머의 전기화학적 중합(electropolymerization)반응을 통하여 박막이 형성될 수 있다.

예시적으로, 상기 전기화학적 중합반응은 표면처리된 전극 표면에 타이오닌 모노머를 전해질 용액에 녹인 다음 전류-전압 주사법(potential cycling), 일정전위 인가법(potential step) 또는 일정전류법(Galvanostatic method) 등과 같은 전기화학적 중합법을 사용하여 박막을 형성시킬 수 있으며, 바람직하게는 전류-전압 주사법을 사용할 수 있다.

구체적으로, 상기 전도성 고분자 전극은 상기 싸이오닌 모노머를 전해질 용액으로서 pH 6.0 ~ 7.0의 인산염 완충액(phosphate buffer solution)에 용해하여 전극에 1.5 ~ 2.0 V의 등전위(constant potential)를 300 ~ 500초 동안 인가한 다음, 100㎷/초로 일정 전극 전압 구간에서 반복하여 전기화학적 중합하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 타이오닌이 함유된 pH 6.5의 인산염 완충액에서 전극에 1.8 V의 등전위를 400초 동안 인가하는 전처리 과정을 거친 다음, 전극 전압 -0.4 ~ 2 V 구간에서 반복하여 순환적으로 전위변화를 일으켜 전극 표면에 전도성 고분자로 전기화학적 중합하여 박막을 형성시키는 것이 좋다. 이때 생성되는 박막의 두께는 전기화학적 중합법의 반복 회수로 조절이 가능하므로 이에 의해 제한되지 않으며, 상기 전극 전압 구간은 센서의 전체적인 민감도를 고려하여 실험조건에 따라 변화될 수 있다.

본 발명에서 상기 폴리 싸이오닌에 프로브 DNA를 연결시키는 단계는 폴리 싸이오닌 코팅된 금 나노입자가 형성된 전극을 프로브 DNA 전구체를 포함하는 수용액에 침지하는 단계를 포함할 수 있다.

이 경우에 상기 프로브 DNA는 측정하고자 하는 특정한 표적 DNA에 상보적으로 상응하는 단일가닥 DNA로서, 검출하고자 하는 표적 DNA의 단일가닥 DNA와 하이브리드화(hybridization)하여 이중가닥 DNA로 결합가능하다.

예컨대, 본 발명에서 사용가능한 프로브 DNA는 상기 표적 DNA의 단일가닥 DNA와 완전히 상보적으로 일치하는 단일가닥 DNA일 수 있고, 또한 부분적으로만 일치하는 단일가닥 DNA일 수 있다.

즉, 표적 DNA의 단일가닥 DNA와 완전히 상보적인 서열을 가질 수도 있고, 제조공정상 또는 필요에 의해 선택적으로 상기 표적 DNA와 염기서열상 약간의 차이를 둔 형태로 상보적인 서열을 가지도록 프로브 DNA를 설계할 수 있다.

본 발명에서 상기 폴리 싸이오닌 코팅된 금 나노입자가 형성된 전극을 프로브 DNA 전구체를 포함하는 수용액에 침지하게 되면, 상기 폴리싸이오닌내 아민기내 질소원자가 프로브 DNA의 인산기(PO4-)의 인 원자와 공유결합을 통해 프로브 DNA가 폴리싸이오닌에 고정화 될 수 있다.

최종적으로 얻어지는, 프로브 DNA를 포함하는 바이오센서용 전극에서 미반응된 프로브 DNA를 제거하기 위해 인산염 완충용액 등으로 세척을 할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 제조방법에 의해 얻어지는 바이오센서용 전극을 제공할 수 있다.

본 발명은 또한, 전극 표면에 금 나노입자가 형성되어 분산된 전도성 투명전극을 포함하며, 상기 금 나노입자는 폴리 싸이오닌이 코팅되어 있고, 상기 폴리 싸이오닌은 단일가닥(single strand) 프로브 DNA와 공유결합으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 바이오센서용 전극을 제공한다.

여기서 상기 전도성 투명전극은 ITO이고, 상기 폴리 싸이오닌은 앞서 기재된 바와 같이 전기화학적 중합방법에 의해 형성될 수 있다.

본 발명에서, 상기 바이오 센서용 전극을 통해 임상적으로 의미가 있는 특정 유전자의 존재 유무를 종래의 PCR 기법에 비해 보다 간편하고 빠르게 확인할 수 있는 전기화학 기반의 바이오 센서용 전극을 제공할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 기재된 바이오센서용 전극을 포함하는 DNA 감지용 장치를 제공하며, 또한 상기 DNA 감지용 장치를 이용하여 전기화학적 방법을 통해 상기 단일가닥(single strand) 프로브 DNA와 상보적으로 상응하는 DNA를 분석하는 방법을 제공한다.

이를 보다 상세히 설명하면, 본 발명에서의 DNA 감지 장치는 측정하고자 하는 특정한 DNA가 포함된 용액을 저장하는 용액 저장조, 상기 바이오센서용 전극을 포함하는 작동 전극, 상기 작동전극에 대응하는 상대(counter) 전극, 및 기준전극을 포함하여 이루어진다. 또한 상기 감지 장치는 상기 작동 전극과 상대전극에 전압 또는 전류를 공급하는 전압공급원 또는 전류 공급원과 상기 작동전극으로부터 송신되는 전압값 또는 전류값을 측정하는 전압측정기 또는 전류 측정기를 추가로 포함할 수 있다.

이 경우에 상기 전압공급원 또는 전류 공급원과 상기 전압측정기 또는 전류 측정기로서 순환 전압-전류측정장치(CV, cyclic voltammeter)가 사용될 수 있다.

여기서 상기 작동전극은 금 나노입자에 폴리 싸이오닌이 코팅되고 상기 폴리싸이오닌에 프로브 DNA가 연결된 전극이며, 상기 작동전극에 대응하는 상대전극은 백금판 또는 백금선 전극을 사용되고, 기준 전극은 통상적으로 사용이 가능한 Ag/AgCl 전극이 사용될 수 있다.

또한 본 발명에서 상기 용액 저장조내 저장되는 용액은 선택적으로, 전자전달매개체를 포함함으로써, 상기 전자전달매개체의 산화환원에 따라 최종적으로 작동전극내 전기신호가 정량화될 수 있다.

상기 프로브 DNA를 포함하는 DNA 감지용 장치내 표적 DNA의 존재 유무 또는 함량의 변화에 따라 변화된 전기적 신호를 측정하게 되면 전기화학적 방법으로 표적 DNA를 검출 및 분석할 수 있다.

이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

(실시예)

하기 실시예에서 사용된 인산수소이나트륨(Na₂HPO₄)과 아인산 이수소나트륨(NaH₂PO₄), N-에틸-N’-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염화수소(EDC), 염화금산(HAuCl₄) 그리고 싸이오닌 아세테이트(thionine acetate, C₁₂H₉N₃S·C₂H₄O₂)는 시그마알드리치로부터 구매하였다.

인산염 완충용액(PBS)은 0.1 M Na₂HPO₄와 0.1 MNaH₂PO₄의 혼합에 의해 제조되었다.

DNA 샘플은 아래의 염기서열을 갖는 종류로서 Cosmo Genetech 사의 것을 사용하였다.

pDNA: 5′-PO4-AGT TAA AAG CAG CCC TGG TGA CCA GGC GCC CAA TAC GAC C-3′ ;

cDNA: 5′-GGT CGT ATT GGG CGC CTG GTC ACC AGG GCT GCT TTT AAC T-3′ ;

1-base mismatch DNA (1bmDNA): 5′-GGT CGT ATT GGG CGC CTG GCC ACC AGG GCT GCT TTT AAC T-3′ ;

3-base mismatch DNA (3bmDNA): 5′-GGT CGT ATT GGG CGC CTG ACT ACC AGG GCT GCT TTT AAC T-3′ ;

noncomplementary DNA (ncDNA): 5′-AGT TAA AAG CAG CCC TGG TGA CCA GGC GCC CAA TAC GAC C-3′;전기화학적 실험을 위한 장치로서 CHI430A electrochemical workstation(CH instruments, Inc. USA)가 사용되었고, 본 발명의 센서를 포함하는 3전극 시스템을 구성하기 위해 작동전극으로 O-링을 사용하여 0.32 cm²의 면적을 갖도록 설정한 산화인듐주석(ITO) 전극을 사용하고 백금선을 상대전극(counter)으로, 기준전극(reference electrode)으로 Ag/AgCl 전극(aq. saturated KCl)을 사용하였다.

디퍼런셜 펄스 볼타모그램(DPVs)는 -0.3 ~ +0.3 V 의 범위로 펄스 진폭은 100 mV·s^- ¹로 펄스폭은 2ms 로 하였고 펄스 주기는 100ms로 실험하였다.

전기화학적 임피던스 측정기(ESI: Electrochemical impedance spectroscopy, IM6ex, Zahner-Elektrik GmbH & Co. KG)에 의해 5 mM K3[Fe(CN)6] 의 농도하에서 10⁵- 0.1 Hz의 주파수 범위 및 5mV의 진폭 교류에서 +0.30 V(즉, the formal potential (E0) of [Fe(CN)6]3-) 조건하에 측정되었다.

실시예 1. 폴리 싸이오닌으로 코팅된 금 나노입자를 포함하는 산화인듐주석(ITO) 전극의 형성

1단계: 산화인듐주석 전극에 금 나노입자 증착

인산염 완충용액(PBS)에 금 이온을 포함하는 염화금산(HAuCl4) 전구체를 녹여서 0.1mM의 금 이온이 함유된 수용액을 제조한다.

크기가 20mm×30mm인 산화인듐주석(ITO) 기판을 에탄올과 Triton X-100 용액을 혼합한 용액에 소니케이션(sonication)하여 세척을 한 후, 질소기체를 이용하여 건조한다.

전기화학적으로 금 나노입자를 형성하기 위하여 기준전극은 Ag/AgCl전극을 사용하고, 상대전극은 백금선 전극을, 작업전극은 상기 세척된 산화인듐주석(ITO) 전극을 사용한다.

상기 전극을 금 이온이 함유된 수용액을 포함하는 테프론셀에 침지하고 전위는 0.2V에서 1.3V 사이에 15회 이상의 사이클을 주어서 산화인듐주석(ITO) 전극에 금 나노입자를 형성하여 증착하였다.

도 2의 (A)는 금 이온이 함유된 수용액을 이용하여 전기화학적 방법에 의해 산화인듐주석(ITO) 박막에 금 나노입자가 증착된 전극의 순환전압전류(CV)곡선을 도시한 그림이다. 총 15회의 사이클 중 1회, 2회, 5회, 10회, 15회의 결과를 도시하였다.

상기 1회차의 결과를 보면 핵 형성에 따른 금속 증착의 전형적 전류 루프(loop)를 나타내며, 이는 금 입자의 ITO상의 증착에는 오버포텐셜이 필요한 것을 알 수 있다.

2회부터 15회까지의 사이클에 따르면 횟수가 증가함에 따라 -0.93V에서 1.0V로 환원전류가 증가하는 것을 볼 수 있고, 이는 연속적으로 금 나노입자가 전극상에 형성됨을 알 수 있다.

한편, 그림의 안쪽에 있는 그림은 0.1M의 황산수용액(H₂SO₄)의 산화인듐주석(ITO) 전극만 측정한 경우와 금 나노입자가 증착된 순환전압전류곡선(CV)을 도시하였다. 이를 비교하면 상기 금 나노입자가 증착된 전극은 1.0 V에서 산화금의 형성되는 것을 알 수 있고, 금 나노입자의 전체 표면적은 상기 산화금 단일층의 환원을 위한 전체 전하량(~ 400 mCcm^-2)으로부터 계산하였을 때 0.21 cm2 정도로 나타나며, 이는 전체 ITO면적의 65.6% 정도로 나타났다.

도 2의 (B)는 금 나노입자가 증착된 산화인듐주석(ITO) 전극 표면의 주사전자현미경(SEM)의 그림으로서, 이를 통해서 증착된 금 나노입자가 균일하게 분포되어 있으며, 이들의 크기는 약 50nm에서 120nm사이의 크기를 갖는 것을 알 수 있다.

2단계: 금 나노입자에 폴리 싸이오닌으로 코팅된 산화인듐주석 전극 제조

0.1 mM의 싸이오닌을 함유한 인산염 완충용액(pH 7)에 상기 금 나노입자가 증착된 산화인듐주석(ITO) 전극을 침지한다. 전위가 0.6V에서 +1.2V사이에 15회 이상의 사이클로 전기중합(electropolymerization)을 통해 상기 금 나노입자를 포함하는 산화인듐주석 전극에 싸이오닌이 중합되어 상기 금나노입자에 폴리 싸이오닌이 코팅되도록 한다.

도 2의 (C)는 금 나노입자에 폴리 싸이오닌이 전기중합에 의해 코팅된 산화인듐주석 전극의 순환전압전류곡선(CV)을 도시화하였다. 상기 폴리싸이오닌에서의 0.1V(I) 및 0.2V(I’) 에서의 싸이오닌 양이온-라디칼 산화환원 피크와 1.0 V(II)에서의 1차 아민(-NH2)기의 수소원자의 탈리에 의한 피크를 볼 수 있다. 상기 폴리 싸이오닌은 금 나노입자의 표면과 Au-N 원자간의 결합을 형성할 수 있어, 금 나노입자와 폴리싸이오닌의 결합력이 향상될 수 있다.

또한 금 나노입자 표면에 폴리 싸이오닌 필름의 연속적 형성은 +0.17 (III) 및 -0.05 V (III′) 에서의 산화환원 피크로부터도 알 수 있다.

도 2의 (D)는 금 나노입자에 폴리 싸이오닌이 코팅된 산화인듐주석 전극의 주사전자현미경 사진을 나타낸 그림이며, 이를 통해 폴리싸이오닌 코팅된 금 나노입자의 크기는 150-280nm사이로 상기 금 나노입자만 증착된 경우보다 큰 것을 알 수 있다.

도 3의 (A)는 5mM의 Fe(CN)₆ ^3-/4-가 함유된 수용액에 ITO 전극, ITO 전극에 금 나노입자가 증착된 전극, 폴리 싸이오닌으로 코팅된 금 나노 입자가 증착된 ITO 전극의 순환전압전류(CV) 곡선을 도시한 것이고, 도 3의 (B)는 5mM의 Fe(CN)₆ ^3-/4-가 함유된 수용액에 ITO 전극, ITO 전극에 금 나노입자가 증착된 전극, 폴리 싸이오닌으로 코팅된 금 나노 입자가 증착된 ITO 전극의 EIS(electrochemical Impedance Spectroscopy) 스펙트럼을 도시화한 그림이다.

상기 도 3에 따른 결과로서 ΔE_p(V), R_ct(kΩ), k_app(cms^-1)^a　를 아래 표 1에 도시하였다. 이를 보다 상세히 살펴보면, 금나노입자가 형성된 전극의 경우 ITO만으로이루어진 전극보다 피크-피크 분리(ΔE_p(V)가 줄어들어 전극표면에서의 전자전달 반응의 용이함을 알 수 있고, 폴리싸이오닌이 코팅된 금나노 입자를 포함하는 경우에 전하이동 저항이 가장 작아 최적의 산화환원 조건을 갖는 것을 알 수 있다.

R_ct :change transfer resistance

k_app : the apparent standard heterogeneous rate constant

실시예 2: 프로브 DNA의 고정 및 표적 DNA의 검출

상기 폴리 싸이오닌이 코팅된 금나노입자를 포함하는 전극을 프로브 DNA 수용액에 담근다. 상기 프로브 DNA는 단일 가닥 DNA로서 측정하고자 하는 특정 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 DNA이며, 이의 종류는 앞서 기재한 바와 같다. 상기 프로브 DNA(1 uM)를 함유하고 있는 인산염 완충용액(PBS) 1 ml에 활성화제로서 10mM의 EDC를 혼합하고 50℃에서 6시간동안 스터링하여 폴리 싸이오닌으로 코팅된 금 나노입자가 형성된 ITO 전극의 폴리싸이오닌과 프로브 DNA를 고정화하여 공유결합을 생성한다.

상기 폴리 싸이오닌 표면에 프로브 DNA가 고정화가 된 전극(pDNA/PTH/GNPs/ITO 전극)은 상기 폴리싸이오닌의 질소 원자가 프로브 DNA의 인 원자와 공유결합을 통해 고정화 될 수 있다.

이후 공정으로서 상기의 pDNA/PTH/GNPs/ITO 전극의 미결합된 pDNA를 제거하기 위하여 인산염 완충용액으로 세척을 한다.

한편, 단일가닥 표적 DNA의 검출을 위해 상기 제조된 pDNA/PTH/GNPs/ITO 전극을 상기 프로브 DNA에 상보적으로 결합가능한 단일가닥 표적 DNA 또는 상기 mismatched된 DNA등의 샘플(cDNA, 1bmDNA, 3bmDNA and ncDNA)이 함유된 1 mL 인산염 완충용액에 pDNA/PTH/GNPs/ITO 전극을 50℃에서 2시간동안 침지한다. 그리고 난 후 미결합된 DNA를 제거하기 위하여 세척을 한다.

도 4의 (A)는 폴리 싸이오닌으로 코팅된 금 나노 입자가 증착된 ITO 전극, 이에 프루브 DNA가 결합된 전극, 및 상기 프루브 DNA에 상보적 DNA가 결합되어 하이브리드된 형태의 전극의 전압에 따른 DPV(differential pulse voltammograms)에 의한 전류 밀도를 도식화하였다. 그래프에 따르면 폴리싸이오닌이 코팅된 전극(PTH/GNPs/ITO 전극)에서 20.5uA/cm² 였던 것이 프로브 DNA가 공유결합에 의해 고정화됨에 따라서 전류밀도가 10.8uA/cm²로 감소하는 것을 알 수 있다. 또한 상기 프로브 DNA에 상보적 DNA가 결합되어 하이브리드 되는 경우에는 이보다 더 낮은 전류밀도값을 가지는 것으로 나타나 상기 타겟 DNA의 검출이 가능함을 알 수 있다.

도 4의 (B)는 프로브 DNA와 표적 DNA의 혼성화에 따른 전류밀도의 감소경향을 나타낸 그래프로서, 표적 DNA의 종류에 따라 혼성화가 상이하게 이루어짐으로써 발생되는 전류밀도의 변화량을 나타낸 그래프이다.

상기 표적 DNA가 cDNA인 경우 프로브 DNA와 혼성화한 전류밀도의 변화량은 약 3.5 uA/cm² 이며, 표적 DNA가 1bmDNA의 경우 약 1.25 uA/cm² , 3bmDNA는 약 1.1 uA/cm² , ncDNA는 약 0.36 uA/cm²를 가짐으로써 표적 DNA와의 상보적으로 결합되는 염기서열이 차이가 날수록 전류밀도값이 낮은 값을 갖는다는 것을 확인할 수 있다.

상기의 결과로부터, 본 발명에 따른 바이오 센서용 전극은 특정한 서열의 검출하고자 하는 표적 DNA를 선택적으로 검출할 수 있음을 알 수 있다.

도 4의 (C)는 표적 DNA로서 단일 가닥 DNA의 검출 범위를 나타낸 그래프로 cDNA의 농도를 1uM부터 1fM 사이에서의 전류밀도의 변화량을 나타내었다. 이를 살펴보면, 상기 전류 밀도의 변화량은 폴리싸이오닌의 산화 피크 전류밀도와 선형관계를 가지는 것을 볼 수 있으며, 상기 센서의 검출한계는 0.93 fM 정도인 것으로 나타남으로써, 하기 표2에 따른 종래 기술에 의한 검출 수단보다 우수한 것으로 보여지고 있어, 저농도의 cDNA의 검출이 가능하며, 검출 한계성이 우수하여서 DNA 검출을 위한 바이오센서로서 적합하다.

aPANI-NF = polyaniline nanofiber, bPICA = poly(indole-5-carboxylic acid), cMWCNTs = multiwall carbon nanotubes, dGG1PAMAM = first generation G1 dendrimer on graphene sheet, eGO = graphene oxide

따라서 본 발명에 의해 제조된 금 나노입자에 폴리 싸이오닌이 코팅되고, 이에 프로브 DNA가 연결된 바이오 센서용 전극은 높은 감지성과 낮은 검출 한계를 갖고 있다. 또한, 안정성과 재현성이 높다는 장점을 갖고 있기에 단일 가닥의 DNA를 검출하기 위한 바이오센서로서 충분한 역할을 한다.

한편, 본 발명에 의해 제조된, DNA 검출을 위한 바이오 센서용 전극의 안정성을 평가하기 위해 상기 전극을 80 °C 의 온수에 10분동안 담근 후 다시 얼음 배스에 상기 센서를 냉각하는 과정을 거친 후의 센서의 전류밀도를 측정하여 이를 초기의 전류밀도와 비교하였다. 이 경우에 초기 값보다 18% 감소된 정도의 전류밀도를 나타내었고, 상기 감소값은 프로브 DNA의 탈리로 인한 것으로 추정된다. 한편, 상기 센서를 4 °C에서 2주간 보관하는 경우 초기 값 대비 91% 의 신호를 보여줌으로써, 열 안정성 및 장기 보관 안정성이 우수함을 나타내었다.

이상, 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시 형태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 맹백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

a) 전도성 투명 전극에 금 나노입자가 형성되어 분산되도록 하는 단계;
b) 상기 금 나노입자가 형성된 투명 전극 표면에 싸이오닌의 중합을 통해 폴리 싸이오닌이 코팅된 금 나노입자가 형성되도록 하는 단계; 및
c) 상기 폴리 싸이오닌에 프로브 DNA를 연결시키는 단계;를 포함하는 바이오센서용 전극의 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 전도성 투명 전극은 ITO, IZO, ATO, FTO, (SnO2), (ZnO) 에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 바이오센서용 전극의 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 금 나노입자는 금 전구체를 전기화학적으로 환원시키거나, 또는 폴리올법, 또는 환원제의 존재 하에서 환원시킴으로써, 형성되는 것을 특징으로 하는 바이오센서용 전극의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 폴리 싸이오닌은 싸이오닌이 포함된 수용액에서 전기화학적 중합반응을 통하여 형성되는 것을 특징으로 하는 바이오센서용 전극의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 c) 단계는 b) 단계에서 얻어지는, 폴리 싸이오닌 코팅된 금 나노입자가 형성된 전극을 프로브 DNA 전구체를 포함하는 수용액에 침지하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서용 전극의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 c) 단계에서의 프로브 DNA는 측정하고자 하는 특정 DNA에 상보적으로 상응하는 단일가닥 DNA인 것을 특징으로 하는 바이오센서용 전극의 제조방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 제조방법에 의해 제조되는 바이오센서용 전극.
측정하고자 하는 특정한 DNA가 포함된 용액을 저장하는 용액 저장조, 제7항에 기재된 바이오센서용 전극을 포함하는 작동 전극, 상기 작동전극에 대응하는 상대(counter) 전극, 및 기준전극을 포함하는 DNA 감지 장치.
전극 표면에 금 나노입자가 형성되어 분산된 전도성 투명전극을 포함하며, 상기 금 나노입자는 폴리 싸이오닌이 코팅되어 있고, 상기 폴리 싸이오닌은 단일가닥(single strand) 프로브 DNA와 공유결합으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 바이오센서용 전극.
제9항에 있어서,
상기 전도성 투명전극은 ITO이고, 상기 폴리 싸이오닌은 전기화학적 중합방법에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 바이오센서용 전극.
제9항 또는 제10항에 기재된 바이오센서용 전극을 포함하는 DNA 감지용 장치.
제11항에 기재된 DNA 감지용 장치를 이용하여 전기화학적 방법을 통해 상기 단일가닥(single strand) 프로브 DNA와 상보적으로 상응하는 DNA를 분석하는 방법.