KR102245908B1 - 물체 및 티슈의 라벨링을 위한 희토류 공간/스펙트럼 미세 입자 바코드 - Google Patents

물체 및 티슈의 라벨링을 위한 희토류 공간/스펙트럼 미세 입자 바코드 Download PDF

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Abstract

물품 및 티슈의 라벨링을 위해 상향 변환 나노결정들(UCN)을 사용하여 공간 및 스펙트럼 인코딩되는 중합체 미세 입자들이 기재된다. 스펙트럼으로 식별 가능한 방출 스펙트럼을 갖는 UCN이 각각의 미세 입자의 인코딩 영역의 상이한 구획들 내에 배치된다.

Description

물체 및 티슈의 라벨링을 위한 희토류 공간/스펙트럼 미세 입자 바코드{RARE EARTH SPATIAL/SPECTRAL MICROPARTICLE BARCODES FOR LABELING OF OBJECTS AND TISSUES}
정부 이익에 관한 진술
본 발명은 미국 공군에 의해 수여된 계약 번호 FA8721-05-C-0002 하에 정부 지원을 받아 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
관련 출원
본 출원은 2013년 3월 15일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/801,351호 및 2013년 3월 15일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/800,995호의 이익 및 이에 대한 우선권을 주장하고, 상기 출원문헌들 각각은 그 전체 내용이 인용에 의해 본원에 포함된다.
많은 산업(예를 들어, 제약 분야, 은행 분야, 미술품 분야)이 "모방(spoofing)" 또는 위조에 저항성인 라벨을 사용해 물체를 라벨링하는 데에 관심을 갖고 있다. 코드, 예를 들어 1차원 바코드(예를 들어, UPC 바코드), 2차원 코드(예를 들어, QR 코드) 및 라디오 주파수 식별(RFID) 태그를 사용해 물체를 라벨링하기 위한 많은 다양한 기술들이 현재 존재한다. 그러나, "모방" 또는 위조에 저항성인 더 작고 더 비간섭적인(unobtrusive) 라벨링에 대한 필요성이 존재한다.
도 1은 일 양태에 따른 예시적인 미세 입자를 도식적으로 나타낸다.
도 2는 일 양태에 따른 예시적인 상향 변환 나노결정(UCN: upconversion nanocrystal)("UCN1"로 표시됨)의 방출 스펙트럼의 그래프이다.
도 3은, 일 양태에 따른, "UCN2"로 표시되는 예시적인 UCN의 방출 스펙트럼의 그래프이다.
도 4는, 일 양태에 따른, "UCN3"으로 표시되는 예시적인 UCN의 방출 스펙트럼의 그래프이다.
도 5는, 일 양태에 따른, "UCN4"로 표시되는 예시적인 UCN의 방출 스펙트럼의 그래프이다.
도 6은, 일 양태에 따른, "UCN5"로 표시되는 예시적인 UCN의 방출 스펙트럼의 그래프이다.
도 7은, 일 양태에 따른, "UCN6"으로 표시되는 예시적인 UCN의 방출 스펙트럼의 그래프이다.
도 8은, 일 양태에 따른, "UCN7"로 표시되는 예시적인 UCN의 방출 스펙트럼의 그래프이다.
도 9는, 일 양태에 따른, "UCN8"로 표시되는 예시적인 UCN의 방출 스펙트럼의 그래프이다.
도 10은, 일 양태에 따른, "UCN9"로 표시되는 예시적인 UCN의 방출 스펙트럼의 그래프이다.
도 11은, 일 양태에 따른, "UCN10"으로 표시되는 예시적인 UCN의 방출 스펙트럼의 그래프이다.
도 12는, 일 양태에 따른, CCD 이미지 센서의 RGB 채널들의 스펙트럼 반응도의 그래프로서, UCN 방출 밴드들이 중첩되어 있다.
도 13은, 일 양태에 따른, UCN6의 방출 스펙트럼을 CCD 이미지 센서의 RGB 채널들의 스펙트럼 반응도와 중첩시킨 그래프이다.
도 14는, 일 양태에 따른, 도펀트 농도 변화에 의해 생성되는 독특한 상향 변환 방출 스펙트럼을 나타내는 그래프이다.
도 15는, 일 양태에 따른, NIR 조명하의 상이한 유형의 UCN들의 이미지이다.
도 16은, 일 양태에 따른, 상이한 유형의 UCN들의 투과 전자 현미경 사진이다.
도 17은, 일부 양태들에 따른, 상이한 뱃치(batch)의 UCN들에 대한 방출 스펙트럼의 그래프들을 포함한다.
도 18은, 일부 양태들에 따른, 외부 자기장 인가 시 그리고 외부 자기장 비인가 시 액체 중의 UCN들의 발광 이미지들을 포함한다.
도 19는, 일 양태에 따른, UCN4에 대한 자화 대 인가된 자기장의 그래프이다.
도 20은, 일 양태에 따른, 이음매가 없는(contiguous) 미세 입자의 형성 방법을 도식적으로 나타내는 블럭도이다.
도 21은, 일 양태에 따른, 이음매가 없는 미세 입자를 형성하는 스톱 플로우 리소그래피(stop flow lithography) 방법을 도식적으로 나타낸다.
도 22는, 일부 양태들에 따른, 상이한 수의 인코딩 영역들을 갖는 미세 입자들의 발광 이미지이다.
도 23은, 일부 양태들에 따른, 각각이 상이한 유형의 UCN들을 포함하는 미세 입자들에 대한 적분 강도 값들의 그래프들을 포함한다.
도 24는, 일부 양태들에 따른, 상이한 유형의 나노결정들을 포함하는 미세 입자들에 대한 적분 강도 데이터의 산포 플롯이다.
도 25는, 일 양태에 따른, 적색 채널 대 녹색 채널에 대한 평균 측정 적분 강도 데이터 및 예상 적분 강도 데이터의 플롯으로서, 5-시그마 신뢰 폐곡선(confidence contour)들을 나타낸다.
도 26은, 일부 양태들에 따른, 상이한 뱃치의 미세 입자들에 대한 적분 강도 데이터를 나타낸다.
도 27은, 일부 양태들에 따른, UCN들의 표면 화학 개질에서 각각의 단계 후의 UCN 4의 방출 스펙트럼의 그래프이다.
도 28은, 일부 양태들에 따른, 강한 지속적인 NIR 조사 동안의 미세 입자 방출 강도를 시간의 함수로서 나타낸다.
도 29는, 일부 양태들에 따른, 카복실-말단 UCN을 갖는 미세 입자들에 대한, 그리고 아실화된 UCN을 갖는 미세 입자들에 대한, 강도 대 미세 입자 에이지(age)의 그래프들을 나타낸다.
도 30은, 일 양태에 따른, 미세 입자들의 상이한 색상 채널들에 대한 적분 강도의 그래프이다.
도 31은, 일부 양태들에 따른, 블리스터 팩을 라벨링(labeling)하는 미세 입자들의 발광 이미지이다.
도 32는, 일부 양태들에 따른, 블리스터 팩을 라벨링하는 미세 입자들의 발광 이미지의 근접도이다.
도 33은, 일 양태에 따른, 블리스터 팩 상의 인코딩된 미세 입자들의 구획들 또는 스트라이프들에 대한 적분 강도 데이터의 그래프이다.
도 34는, 일부 양태들에 따른, 인코딩된 PUA 미세 입자들 및 인코딩된 PEG 미세 입자들의 구획들 또는 스트라이프들에 대한 적색 및 녹색 채널들에서의 적분 강도 데이터의 그래프이다.
도 35는, 일 양태에 따른, 시뮬레이트된 PET 가공 후의 인코딩된 미세 입자들의 발광 이미지이다.
도 36은, 일 양태에 따른, 시뮬레이트된 PET 가공 전의 그리고 시뮬레이트된 PET 가공 후의 인코딩된 미세 입자들에 대한 적분 강도의 그래프들을 포함한다.
도 37은, 일 양태에 따른, 쓰레드(thread)를 라벨링하는 미세 입자들의 발광 이미지들을 나타낸다.
도 38은, 일 양태에 따른, 화폐를 라벨링하는 미세 입자들의 이미지들을 나타낸다.
도 39는, 일 양태에 따른, PVA 열쇠의 벌크(bulk) 내에 매립된 인코딩된 미세 입자들의 이미지이다.
도 40은, 일 양태에 따른, ABS 열쇠의 벌크 내에 매립된 인코딩된 미세 입자들의 이미지이다.
도 41은, 일 양태에 따른, 블리스터 팩, 화폐, 신용 카드, 3D 세라믹, 미술품 및 고온 주조(cast) 물체의 라벨링에 사용된 미세 입자들의 이미지들을 포함한다.
도 42는, 일부 양태들에 따른, 미세 입자의 발광 이미지로부터 스펙트럼 코드들을 판독하는 프로세스의 이미지들을 포함한다.
도 43은, 일 양태에 따른, 2가지 상이한 코드의 미세 입자들을 식별하는 데 사용되는 이미지들을 포함한다.
도 44는, 일부 양태들에 따른, 입자 합성을 위한 플로우 리소그래피 및 디코딩 시스템을 도식적으로 나타낸다.
도 45는 도 44의 입자 합성을 위한 시스템의 이미지이다.
기재된 방법들, 시스템들 및 매체의 추가의 특징들, 기능들 및 장점들이 아래의 설명으로부터 명백할 것이며, 특히 첨부된 도면들과 함께 읽을 때 그러할 것이다.
상세한 설명
위조 또는 모방에 저항성인 라벨을 사용해 물체를 라벨링하기 위한 많은 시도들이 존재한다. 예를 들어, 약제 패키징과 같은 정보-집약적 프로세스에 있어서 단일 유닛(unit)들의 독특한 인코딩은 105 내지 1012의 인코딩 용량 및 고속-대량(high-throughput) 입자 합성을 수반할 수 있다. 또다른 예로서, 일부 분야들을 위한 혹독한 환경에의 노출은 열 불감성, 생체적합성(biocompatibility) 및/또는 내약품성을 필요로 한다. 일부 라벨링 기술의 경우, 판독 시스템의 복잡성 및 비용이 실행을 제한할 수 있다. 일부 라벨링 분야들은 혼동 인자들(예를 들어, 복잡한 배경, 엄폐요소(obscurant), 잡음)의 존재하에 낮은 오차의 판독을 필요로 하며, 이는 어려운 기술적 과제이다.
양태들은 물품(article) 및/또는 티슈의 라벨링을 위한 중합체 미세 입자들, 상기 미세 입자들의 제조 방법, 및 상기 미세 입자들을 사용하는 라벨링 방법을 포함한다. 각각의 하이드로겔 미세 입자는 인코딩 영역을 포함한다. 인코딩 영역은 복수의 구획들을 포함하고, 상기 구획들 중 하나 이상은 특징적인 스펙트럼 시그너쳐(spectral signature)를 갖는 관련된 다수의 상향 변환 나노결정(UCN)들을 포함한다. 인코딩 영역의 복수의 구획들이 미세 입자의 공간 인코딩을 가능하게 한다. 각각의 영역에 대한 관련된 다수의 UCN들은 스펙트럼으로 식별 가능한 UCN 세트로부터 선택되며, 이는 각각의 구획의 미세 입자에 대한 스펙트럼 인코딩을 가능하게 한다. 공간 인코딩과 스펙트럼 인코딩의 조합에 의해, 미세 입자들은 대규모의 다중화 능력 및 뛰어난 확장 능력(scaling capability)을 함께 갖는다.
코딩은 비대칭 입자들에 대해서는 CS로서 그리고 대칭 입자들에 대해서는 CS/2로서 지수적으로 크기가 조절되며, 여기서 C는 식별 가능한 스펙트럼 시그너쳐(UCN '색상')의 갯수이고, S는 공간적 피쳐(예를 들어, 미세 입자 '스트라이프')의 갯수이다. 예를 들어, S개의 인코딩 구획 및 C개의 상이한 스펙트럼 식별 가능 나노결정 세트를 갖는 대칭 미세 입자의 경우, 하기 수학식은 획득될 수 있는 코드 또는 고유 식별자의 갯수를 열거한다:
Figure 112015099955063-pct00001
예를 들어, 대칭 미세 입자들의 인코딩 영역이 6개의 구획을 갖고, 각각의 구획이 5개의 상이한 유형의 스펙트럼 식별성 나노결정 세트로부터 선택되는 다수의 UCN을 포함하는 시스템의 경우, 약 20,000개의 고유 식별자/코드가 생성될 수 있다. 또다른 예로서, 대칭 미세 입자들의 인코딩 영역이 6개의 구획을 갖고, 각각의 구획이 9개의 상이한 유형의 스펙트럼 식별성 나노결정 세트로부터 선택되는 다수의 UCN을 포함하는 시스템의 경우, 약 500,000개의 고유 식별자/코드가 생성될 수 있다. 따라서, 적정한 수의 색상을 유사하게 적정한 수의 스트라이프와 연계지어 상당한 인코딩 용량(encoding capacity)을 수득할 수 있으며, 상기 인코딩 용량은 둘 중 어느 하나의 양에 대한 점진적인 변화에 의해 빠르게 확장된다. 라벨링 용량을 증가시키기 위해, 비대칭 미세 입자들을 사용할 수 있을 것이다. 예를 들어, 6개의 구획을 갖고, 각각의 구획이 9개의 상이한 유형 중 하나의 유형의 스펙트럼 식별성 나노결정들을 포함하는 비대칭 미세 입자는 백만개를 초과하는 고유 식별자/코드를 생성할 것이다. 라벨링 용량을 증가시키기 위해, 복수의 미세 입자들의 조합을 사용하여 물체를 라벨링할 수 있을 것이다.
일부 양태들은, 공간적인 패턴화를, 희토류 상향 변환 나노결정들(UCN), 단파장 근적외선 여기, 및 휴대용 전하-결합 디바이스(CCD)-기반 디코딩과 조합하여, 플로우 리소그래피에 의해 합성된 입자들을 식별한다. 일부 양태들은, 큰, 지수적으로 확장될 수 있는 인코딩 용량(>106), 초저 디코딩 오류-경보율(<10-9), 자기장 인가에 의한 입자들의 조작 능력, 그리고 입자 화학 조성(chemistry) 및 혹독한 가공 조건 둘 다에 대한 극적인 불감성을 나타낸다. 본 발명자들에 의해 수행된 실험들은, 약제 패키징의 은폐된 다중입자 바코딩(굴절-지수 매칭), 다중화된 마이크로RNA 검출(생체적합성) 및 고온 주조 물체의 매립식 라벨링(온도 저항성)을 포함하여, 직교 요건(orthogonal requirement)들을 갖는 소정 범위의 실시 분야들에 대해, 관찰된 디코딩과 예상된 디코딩 사이의 정량적인 일치를 나타낸다.
일부 양태들은 고속-대량 입자 합성 및 휴대용 CCD-기반 디코딩과의 양립성을 위한 로버스트 인코딩 방법(robust encoding method)을 사용한다. 일부 양태들에서, 수득되는 입자들 및 디코딩 시스템은 입자 화학 조성에 대한 극적인 불감성 - 이는 인코딩 용량 및 디코딩 오차율을 입자 물질 특성과 관계 없이 조율하는 것을 가능하게 한다 - 뿐만 아니라 간단한 마그네틱 조작 능력을 나타낸다. 아래에 기재된 실시예에서, 본 발명자들은 도발적인 현실의 환경에서 온도-저항성 입자들 및 생체적합성 입자들 둘 모두의 정량적으로 예측가능한 디코딩을 설명한다. 백만 초과의 단일-입자 인코딩 용량 및 1ppb(10억분율) 미만의 오차율에 의해, 일부 양태들은 법의학적 제품 라벨링 및 다중화된 생체 검정과 같은 분야들을 위해 실제 접근가능한 코드 갯수를 몇 자릿수만큼 확장시킨다. 본원에 기재된 방법을 사용하여, 인코딩된 입자들의 용도를 선행 기술에서는 밝혀지지 않은 넓고 확대된 범위의 산업적 분야들로 확장시킬 수 있다. 양태들을 사용하여, 독특하게 인코딩된 입자들의 작은 세트들로부터 대규모의 인코딩 용량을 갖는 은폐된 이중 위조-방지 라벨을 생성할 수 있다.
도 1은, 일 양태에 따른, 물품 또는 티슈의 라벨링에 사용될 수 있는 예시적인 미세 입자(10)를 도식적으로 나타낸다. 미세 입자(10)는 중합체를 포함하는 바디(body)(12)를 갖는다. 바디(12)는 복수의 상이한 구획들(예를 들어, 구획들(31, 32, 33, 34, 34, 35, 36))을 포함하는 인코딩 영역(30)을 갖고, 각각의 구획(31 내지 36)은 스펙트럼으로 식별 가능한 UCN 세트로부터 선택되는 관련된 다수의 상향 변환 나노결정들(UCN)(예를 들어, UCN(41))을 갖는다(하기 도 2 내지 도 11에 수반되는 논의 참조). 일부 양태들에서, 하나 이상의 구획들은 나노결정들을 전혀 포함하지 않을 수 있고, 이들은 인코딩을 위한 무효 구획 또는 "블랭크(blank)"로서 작용할 수 있다.
예를 들어, 일부 양태들에서, 제1의 스펙트럼 시그너쳐를 갖는 제1의 다수의 UCN들이 인코딩 영역의 제1 구획(31) 내에 배치된다. 인코딩 영역의 제2 구획(32)은 제1의 스펙트럼 시그너쳐와는 상이한 제2의 스펙트럼 시그너쳐를 갖는 제2의 다수의 UCN들을 포함한다. 일부 양태들에서, 미세 입자의 인코딩 영역은 또한 제3의 다수의 UCN들을 갖는 제3 구획(33)을 포함한다. 일부 양태들에서, 미세 입자의 인코딩 영역은 또한 제4의 다수의 UCN들을 갖는 제4 구획(34)을 포함한다. 일부 양태들에서, 미세 입자의 인코딩 영역은 또한 제5의 다수의 UCN들을 갖는 제5 구획(35)을 포함한다. 인코딩 영역의 각각의 구획(31 내지 36) 내의 다수의 미세 입자들은 스펙트럼으로 식별 가능한 UCN 세트로부터 선택된다.
당해 기술분야의 통상의 숙련가는, 본 발명의 기재 내용에 비추어, 각각의 미세 입자가 6개 미만의 구획들 및 관련된 다수의 UCN들(예를 들어, 5개의 구획들, 4개의 구획들, 3개의 구획들, 2개의 구획들) 또는 6개를 초과하는 구획들 및 관련된 다수의 UCN들(예를 들어, 구획들, 7개의 구획들, 8개의 구획들, 9개의 구획들, 10개의 구획들 등)을 갖는 인코딩 영역을 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
인코딩 영역의 구획 내에 배치된 다수의 UCN들과 관련된 스펙트럼 시그너쳐를 본원에서는 인코딩 영역의 구획의 스펙트럼 시그너쳐라고도 지칭한다. 일부 양태들에서, 인코딩 영역의 2개 이상의 구획들이 동일한 스펙트럼 시그너쳐를 가질 수 있다. 일부 양태들에서, 동일한 스펙트럼 시그너쳐를 갖는 인코딩 영역의 2개 이상의 구획들이 서로 인접할 수 있다. 일부 양태들에서, 동일한 스펙트럼 시그너쳐를 갖는 인코딩 영역의 모든 구획들은, 상이한 스펙트럼 시그너쳐(들)를 갖는 인코딩 영역의 하나 이상의 구획들에 의해 서로 분리되어야 한다. 일부 양태들에서, 인코딩 영역의 각각의 구획은 인코딩 영역의 모든 다른 구획들의 스펙트럼 시그너쳐와는 상이한 스펙트럼 시그너쳐를 가져야 한다. 일부 양태들에서, 인코딩 영역의 하나 이상의 구획들이 나노결정들을 포함하지 않아 상기 구획 또는 구획들은 스펙트럼 시그너쳐를 갖지 않는 "블랭크"이다. UCN의 스펙트럼 시그너쳐는 UCN의 방출(emission) 스펙트럼과 관련된 정보를 포함하며, 상기 정보가 UCN을 또다른 유형의 나노결정으로부터 식별한다. 일부 양태들에서, UCN의 또는 다수의 유사한 UCN들의 스펙트럼 시그너쳐는 하나의 스펙트럼 밴드의 방출(또는 하나의 스펙트럼 범위 내의 방출)과 또다른 스펙트럼 밴드의 방출(또는 또다른 스펙트럼 범위 내의 방출)의 적분 강도를 포함할 수 있다. 스펙트럼 시그너쳐 또는 스펙트럼 시그너쳐에 관한 정보를 본원에서는 스펙트럼 코드라 지칭할 수 있다.
도 2 내지 10은 각각 UCN1 내지 UCN9로 표시되는 9개의 스펙트럼 식별 가능 유형 UCN들의 예시 세트에 대한 방출 스펙트럼을 나타내며, 이는 근적외선(NIR) 광(예를 들어, NIR 다이오드 레이저로부터의 980㎚ 광)에 의해 여기될 때의 것이다. UCN들의 예시 세트는 더 낮은 주파수(예를 들어, 근적외선(NIR))의 광에 노출 시 가시선 범위에서 복수의 협폭 밴드들(예를 들어, 절반 최대치의 전체 폭(FWHM: full width half maximum)으로서 70㎚ 미만의 폭의 밴드들)을 발광한다. 구체적으로, 스펙트럼 식별 가능 UCN들의 예시 세트(예를 들어, UCN1 내지 UCN10)는 470㎚ 부근(예를 들어, 445 내지 500㎚)에 집중된, 550㎚ 부근(예를 들어, 520 내지 560㎚)에 집중된, 그리고 650㎚ 부근(예를 들어, 640 내지 670㎚)에 집중된, 2개 이상의 밴드들을 방출한다. 단순화를 위해, 445 내지 500㎚ 밴드를 본원에서는 청색 밴드라 지칭하고, 520 내지 560㎚ 밴드를 본원에서는 녹색 밴드라 지칭하며, 640 내지 670㎚ 밴드를 본원에서는 적색 밴드라 지칭한다.
당해 기술분야의 통상의 숙련가는, 본 발명의 기재 내용에 비추어, UCN들의 세트가 9개 미만(예를 들어, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개) 또는 9개 초과(예를 들어, 10개, 11개, 12개 등)의 상이한 유형의 스펙트럼 식별 가능 UCN들을 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 또한, 당해 기술분야의 숙련가는, 본 발명의 기재 내용에 비추어, 도시된 스펙트럼과는 상이한 스펙트럼을 갖는 UCN들, 그리고 도시된 밴드와는 상이한 밴드들에서 방출하는 UCN들도 양태들의 범위 내에 속한다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 도 11은 UCN1 내지 UCN9 중 어느 것에 대한 대체물로서 또는 UCN1 내지 UCN9에 더하여 세트에 사용될 수 있는 UCN10으로 표지된 UCN에 대한 방출 스펙트럼을 나타낸다. 인코딩 용량을 증대시키기 위해, Yb-Er-Tm 비를 조절함으로써 스펙트럼 식별성 UCN들의 팰릿(palette)을 추가로 확장시킬 수 있으며, 이는 디코딩 오차율에 대해 무시해도 될 정도의 영향을 미친다.
다수의 UCN들의 스펙트럼 시그너쳐는 다양한 밴드들 내에서 방출되는 적분 강도들의 비 또는 비들(예를 들어, 녹색 밴드에 대한 적색 밴드 비 또는 이의 역, 청색 밴드에 대한 적색 밴드 비 또는 이의 역, 녹색 밴드에 대한 청색 밴드 또는 이의 역, 또는 상기 언급된 것들의 임의의 조합)과 관련된 정보를 포함할 수 있다. 이들 비들은 UCN들의 방출 스펙트럼과 관련하여 정의될 수 있다. 그러나, 일부 양태들에서, 다수의 UCN들의 스펙트럼 시그너쳐는 다양한 밴드들에서 방출된 광의 강도와 관련된 정보 및 사용될 검출기 또는 이미지 센서의 반응도와 관련된 정보 둘 모두를 포함할 수 있다. 임의의 검출기, 이미지 센서 또는 이미징 디바이스가 사용될 수 있다. 예를 들어, 검출기 또는 이미징 디바이스는 전하-결합 디바이스(CCD), 광전 증폭관-기반 디바이스(PMT), 상보성 금속-산화물-반도체(CMOS) 이미징 센서, 애벌런시 포토다이오드 어레이(APD: avalanche photodiode array) 이미징 디바이스 등일 수 있다. 일부 양태들에서, 2개 이상의 색상 채널을 갖는 이미징 센서가 사용될 수 있다.
도 12는 일부 양태들에서 검출기로서 사용될 수 있는 전형적인 RGB CCD 디바이스에 대한 적색 채널(61), 녹색 채널(62) 및 청색 채널(63)의 스펙트럼 반응도를 나타낸다. 도시된 바와 같이, UCN들의 예시 세트의 적색 방출 밴드(71), 녹색 방출 밴드(72) 및 청색 방출 밴드(73)는 각각 적색 채널(61), 녹색 채널(62) 및 청색 채널(63)의 스펙트럼 반응도의 반응도 곡선들에 중첩된다. 예를 들어, 도 13은 UCN6의 방출 스펙트럼이 전형적인 RGB 디바이스의 채널들의 스펙트럼 반응도에 중첩되는 것을 보여준다. 각각의 이미지 센서 채널에 대한 예상 스펙트럼 반응도와 방출 스펙트럼의 중첩 적분(convolution)은 각각의 유형의 UCN에 대한 CCD 이미지 센서의 각각의 채널의 예상 스펙트럼 반응에 상응하는 곡선을 제공한다. UCN 유형에 대한 스펙트럼 시그너쳐는 특정 UCN 방출 스펙트럼에 대한 이미지 센서의 예상 스펙트럼 반응, 예를 들어, 2개의 색상 채널들에 대해 검출되는 예상 적분 강도의 비에 관한 정보를 포함할 수 있다.
예를 들어, 하기 표 1은 UCN3 내지 UCN7 및 UCN10 유형의 UCN들의 방출 스펙트럼에 대한 CCD 디바이스의 예상 스펙트럼 반응을 나타낸다(방출 스펙트럼에 대해서는 상기 도 4 내지 도 8 및 도 11 참조). 예상 스펙트럼 반응은 도 12에 도시된 이미지 센서 채널 스펙트럼 반응도와 UCN 유형에 대한 방출 스펙트럼의 중첩 적분이다. 구체적으로는, 표 1은 UCN들의 방출로 인한 각각의 색상 채널에 대한 예상 총 적분 강도를 나타낸다. 표 1은 또한, 적색 채널에 대한 녹색 채널에서의, 적색 채널에 대한 청색 채널에서의, 그리고 녹색 채널에 대한 청색 채널에서의 예상 총 강도의 비들을 포함한다. 적분 강도는, 임의의 특정한 색상 채널 또는 방출 밴드에 대한 절대 강도를 결정하기 위해 보정할 필요성을 감소시키거나 제거하는 상이한 색상 채널들에 대한 비들로서 표현된다.
Figure 112015099955063-pct00002
최근의 기술들은 미세 입자들을 포함하는 형광 코딩을 생화학적 또는 화학적 검정에 사용하고 있다. 본 발명자들은 미세 입자의 상이한 인코딩 영역들의 식별에 UCN들을 사용하는 것이 미세 입자들을 인코딩하는데 현재 사용되는 다른 기술들과 비교할 때 많은 이점을 갖는다는 것을 발견하였다. 예를 들어, 일부 다른 기술들은 미세 입자의 형광 표지된 코딩 영역에서의 1차원적 또는 2차원적 두께 변화 또는 홀(hole)들을 식별에 이용한다.
복수의 협폭 방출 밴드들을 갖는 UCN들과는 달리, 흔히 사용되는 형광 표지 분자(예를 들어, 형광단)들 각각은 단일 광폭 밴드에서 방출하는 경향이 있다(예를 들어, DAPI 형광 염료는 약 100㎚ 폭 FWHM인 단일 방출 밴드를 갖는다). 형광단을 인코딩에 사용하는 미세 입자들에서, 형광단의 광폭 방출 밴드는 방출 밴드들 사이의 유의한 중첩 및 그로 인한 식별에서의 모호함 없이 사용될 수 있는 상이한 형광단들의 수를 제한한다. 또한, 단일 형광단에 대한 복수의 방출 밴드들의 부재는 외부적인 보정 표준의 사용을 필요로 할 수 있다. 이에 반해, UCN들은 (예를 들어, 수십 내지 수백 ㎚ 분리된) 가시 스펙트럼의 상이한 구간들에서 복수의 협폭 방출 밴드들을 갖는다. 여러 밴드들에서의 방출 강도의 비는 상이한 나노결정들을 식별하는 데 이용될 수 있으며, 또한 내부적인 보정 표준으로서 작용하여 외부 보정에 대한 필요성이 제거된다.
UCN들을 인코딩에 사용하는 미세 입자들은 형광단들을 인코딩에 사용하는 미세 입자들보다 자체발광으로 인한 신호 대 잡음 비의 감소를 더 적게 경험할 수 있다. 발광성 UCN들은 하나의 파장 범위에서 광을 흡수하고 이보다 더 짧은 파장 범위에서 광을 발광한다(예를 들어, NIR 범위에서 광을 흡수하고 가시선 범위에서 발광한다). 이에 반해, 흔히 사용되는 형광단들 및 양자 점들은 보통 소정의 파장 범위에서 광을 흡수하고 이보다 더 긴 파장 범위에서 광을 발광한다(예를 들어, 자외선 범위에서 광을 흡수하고 가시선 범위에서 발광한다). 예를 들어, 흔히 사용되는 형광단 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)은 370㎚ 부근(UV)에서 최대 흡광도를 갖고 450㎚ 부근(청색)에서 최대 발광도를 갖는다. 식별을 위한 형광단들의 조명 (예를 들어, UV 광을 사용하는)은 가시선 파장에서 물질 및 용매의 의도하지 않은 자체형광을 초래하여 신호 대 잡음 비가 감소될 수 있으며, 이는 생체 시료를 사용하는 경우 중대한 문제점이 될 수 있다. 본원에 기재된 나노결정들은 상향 변환성이기 때문에, 나노결정들의 여기에 사용되는 NIR 광이 일반적으로 이보다 더 짧은 가시선 범위의 파장에서 자체발광을 일으키지 않는다. 따라서, UCN의 사용은 인코딩 영역에 대한 신호 대 잡음 비를 개선시킬 수 있다.
상이한 유형의 UCN들을 인코딩에 사용하는 미세 입자들은 단지 단일 협폭 밴드 여기원(excitation source)을 필요로 할 수 있는 반면, 상이한 유형의 형광단들을 사용하는 미세 입자들은 상이한 파장 밴드들에서 여기를 제공하기 위해 복수의 광원들을 필요로 할 수 있다. 예를 들어, 10W/㎠ 미만의 전력 밀도를 갖는 980㎚ 광원(예를 들어, 근적외선(NIR) 레이저 다이오드)을 복수의 상이한 타입의 UCN들을 위한 단일 여기원으로서 사용할 수 있다. 이에 반해, 가시광 스펙트럼 구간들에 대한 통상의 형광단들, 예를 들어, 각각 350㎚, 503㎚ 및 632㎚에서 최대 흡광도를 갖는 DAPI(청색), 오레곤 그린(Oregon green) 500(녹색) 및 ALEXA FLUOR 633(적색)을 사용하는 미세 입자들은 복수의 상이한 여기원들, 예를 들어, UV 레이저, 아르곤-이온 레이저 및 적색 헬륨-네온 레이저를 필요로 할 수 있다.
일부 양태들에서, UCN들은 조율가능한 스펙트럼 특성들을 갖는 밝은 반-스톡스(anti-Stokes) 방출체인 희토류 나노결정들이다. 개별 UCN들은 단일 파장의 연속파(CW) NIR 광을 흡수하고 가시선 스펙트럼의 복수의 협폭 밴드들에서 발광한다. 커다란 반-스톡스 이동이 샘플 자체형광으로부터의 스펙트럼 간섭을 감소시키고 신호-대-잡음 비의 향상으로 이어진다. M-잉크(나노구조화된 자성 물질들이 상이한 파장의 광을 반사시키는 광학 활성 염료) 또는 양자 점들과는 달리, 이들 장점들은 엄폐 요소들 또는 복잡한 반사 배경의 존재하에서도 지속된다. 란탄족 도펀트들의 상대적인 화학량론 특성들을 조정함으로써 복수의 밴드들에서의 방출 강도를 조율하는 것은, 2개 이상의 밴드들에서의 적분 강도 비가 절대 강도가 아닌 코드로서의 역할을 하는 비율계량(ratiometric)적으로 독특한 스펙트럼 인코딩을 가능하게 한다. 일부 양태들에서, (예를 들어, 다공성 규소 결정들에 의해 요구되는 바와 같은) 외부 스펙트럼 표준, (예를 들어, 양자 점들 및 루미넥스(luminex)와 함께 사용되는 바와 같은) 정밀한 염료 로딩, (예를 들어, M-잉크에 의해 요구되는 바와 같은) 민감한 기기 장치, 및 광범위한 보정이 판독에 있어서 불필요할 수 있으며, 이는 디코딩을 위한 표준 CCD 이미지화의 사용을 가능하게 한다.
UCN의 합성 실시예
란탄족-도핑된 NaYF4 UCN들을, NaYF4 UCN 합성을 위한 수많은 공지된 프로토콜 중 단지 하나인 가변 뱃치 열수 합성(scalable batch hydrothermal synthesis)을 통해 제조하였다.
수성 희토류 클로라이드 염, 수산화나트륨, 불화암모늄, 에탄올 및 올레산을 테플론(TEFLON)-코팅된 스테인레스강 압력 용기 내에서 가열하였다. 구체적으로는, 2㎖의 ReCl3(0.4M, RE= Y, Yb, Er, Gd, Tm) 및 2㎖의 NH4F(2M)를 3㎖의 NaOH(0.6M), 10㎖의 에탄올 및 10㎖의 올레산의 혼합물에 첨가하였다. 상기 용액을 50㎖ 테플론-라이닝된 오토클레이브로 옮기고 200℃에서 2시간 동안 가열하였다. 상기 수득된 생성물을 원심분리하여 나노결정들을 수득한 다음, 상기 나노결정들을 에탄올과 탈이온수로 반복해서 세척한 후 사이클로헥산 중에 다시 분산시켰다.
합성 동안, 본 발명자들은 나노결정들의 발광 강도(luminescence intensity)를 개선시키고 나노결정들의 상향 변환 스펙트럼을 변경시키기 위해 다양한 란탄족 도펀트 농도 및 반응 시간 및 온도를 사용하였다.
상기에 기재된 합성 절차는 상이한 결정 구조들을 갖는 2가지 상이한 상(phase)의 NaYF4 UCN들을 생성할 수 있다: 정육면체 결정 구조를 갖는 α-상 및 육각형 결정 구조를 갖는 β-상. 일반적으로 말하면, 발광 강도는 β-상 내의 표면 결함 대 결정 부피의 비가 더 낮음으로 인해 α-상 결정들에서보다 β-상 결정들에서 유의하게 더 높다. 높은 수준의 가돌리늄 도핑의 부재하에서는 나노결정들 내에서 α→β 상 전이를 유도하기 위해 상대적으로 높은 온도를 상대적으로 긴 시간 동안 유지시켜야 한다(예를 들어, 24시간 동안 350℃). 이에 반해, 본 발명자들은 30mol% 가돌리늄(Gd)을 도핑하여 더 낮은 온도(200℃)를 더 짧은 시간(2시간) 동안 유지시켜서 α→β 상 전이를 유도하였다. Gd은 다른 도펀트들의 존재로 인해 발생하는 상향 변환 발광 스펙트럼 형상에 대한 영향을 거의 갖지 않는다.
반응 시간의 증가 및 반응 온도의 증가는 나노결정 크기의 증가로 인해 UCN들의 발광 강도를 증가시키는 경향이 있었다. 나노결정 크기의 증가는 나노결정들에 대한 표면적 대 부피 비를 감소시키고, 이에 의해 표면 결함 대 결정 부피의 비를 감소시킨다. 또한, 더 큰 나노결정들에 대한 발광은, 더 작은 나노결정들에서 발생할 수 있는 고주파수 방출의 우선적인 소광으로 인한 적색-이동의 가능성이 더 적었다.
Gd 외의 도펀트들의 농도를 이용하여 상향 변환 방출 스펙트럼을 변화시켰다. 구체적으로는, UCN 반응 예비혼합물 중의 란탄족 이온들 Yb3+, Er3+ 및 Tm3+의 상대적인 화학량론 특성을 조절함으로써 별개의 UCN을 제조하였다. 란탄족 도펀트의 화학량론 특성은 UCN 나노구조 및 표면 화학 조성에 미치는 영향이 상대적으로 적어, 입자 화학 조성 및 그 결과로 생긴 물질 특성으로부터 방출 스펙트럼의 제어가 탈연계(decoupling)된다. 이테르븀(Yb3 +)은 밝은 다색 발광에 중요한 도펀트인데, 그 이유는 이테르븀이 방출을 상향 변환시키기 위한 고-NIR 횡단면 흡수 및 에너지 전달제로서 작용하기 때문이다. 에르븀(Er3+) 공동-도핑된 결정들에서 Yb 비율을 증가시키는 것은 상향 변환 스펙트럼을 '적색-이동'시키는 경향이 있고, 이는 적색 밴드(640 내지 670㎚)에서의 방출 강도 대 녹색 밴드(520 내지 560㎚)에서의 방출 강도의 비를 증가시킨다. 도 14는 Yb 농도 증가가 어떻게 방출 스펙트럼을 이동시키고 전체 방출 색상을 녹색에서 주황색으로 이동시키는지를 보여준다. 낮은 수준(2% 이하)의 Er3 + 도핑은 550㎚ 및 650㎚에 집중된 협폭 피크들을 초래한다. Yb3+ 및 Er3+으로 도핑된 물질들에 대한 전체 방출 색상은 Yb 농도에 따라 녹색에서 적색까지의 범위일 수 있다. 매우 낮은 수준(약 0.2%)의 툴륨(Tm3+) 도핑은 청색 밴드(445 내지 500㎚)에서의 방출 및 800㎚에서의 더 강한 피크를 초래한다.
UCN1 내지 UCN10으로 표시되는 10개의 상이한 유형의 스펙트럼 식별 가능한 란탄족-도핑된 NaYF4 UCN들을 제조하였다. 상이한 유형의 란탄족-도핑된 NaYF4 UCN들의 스펙트럼이 도 2 내지 도 11에 나타난다. NIR 레이저 다이오드로 조사 시 UCN1 내지 UCN9 유형들의 전체 색상들이 도 15에 도시되며, 이는 사이클로헥산 중 UCN1 내지 UCN9의 현탁액의 980㎚ 근적외선(NIR) 여기 시의 발광 이미지를 포함한다. 도 15에 나타낸 바와 같이, UCN들의 색상들은 육안으로 쉽게 식별될 수 있다. 각각의 유형의 나노결정들에 사용된 도펀트의 조성이 하기 표 2에 열거된다. 각각의 도펀트 농도의 잔량을 구성하는 Y 농도는 이것이 활성 도펀트가 아니기 때문에 꺾쇠 괄호로 묶여 있다.
Figure 112015099955063-pct00003
도 16은 상기에 기재된 공정에 의해 생성된 UCN1 내지 UCN9 유형 UCN들의 투과 전자 현미경(TEM) 이미지들 뿐만 아니라 UCN6 나노결정들의 확대 이미지를 보여준다. 도 16에서, 축척 막대는 100㎚이다. TEM 샘플들은 사이클로헥산 중의 UCN 1적을 구리 격자판의 표면 위에 올려 놓음으로써 제조되었다. 전체적으로, 생성된 나노결정들은 길이 250 내지 450㎚ 및 너비 40 내지 60㎚의 평균 크기를 갖는 봉 형상이었다.
본 발명자들은 방출 스펙트럼이 뱃치마다 일관된다는 것을 확인하기 위해 동일 유형 나노결정들의 여러 상이한 뱃치들을 제조하였다. UCN들의 상향 변환 발광 스펙트럼은 폴리(우레탄아크릴레이트)(PUA) 예비중합체 용액(9/1 PUA/PI (v/v)) 중에서 1W CW 다이오드 레이저(980㎚)를 여기원으로서 사용하는 형광 분광계를 사용해 측정되었다. 도 17은 3개의 상이한 뱃치들의 UCN7 유형 나노결정들에 대한 정규화된 방출 스펙트럼을 도시한다. 도시된 바와 같이, 3개의 상이한 뱃치들에 대한 방출 스펙트럼은 합쳐진 그래프 상에서 사실상 구분이 되지 않는다.
UCN1 내지 UCN10의 높은 Gd 함량은 UCN들이 상자성이 되도록 하고 외부 자기장을 통한 물리적 조작에 종속되도록 한다. 본 발명자들은 바이알 내에서 현탁된 나노결정들을 외부 강자성 자석을 사용하여 조작함으로써 이를 확인하였다. 도 18은 바이알 내의 액체 중 UCN들의 발광 이미지들로서, (a) 자기장이 인가되지 않을 때 바이알 바닥에 가라앉아 있는, 그리고 (b) 강자성 자석으로부터 자기장이 인가될 때 바이알의 왼쪽으로 끌어당겨진 UCN들의 발광 이미지들이다. 도 19는 UCN4에 대한 자화 데이터를 인가된 자기장의 함수로서 나타낸 그래프로서, 이는 초전도 양자 간섭 장치(SQUID)를 사용하여 수득되었다.
UCN의 표면 개질 실시예
상기에 기재된 합성 공정은 17개-탄소 탄화수소 꼬리를 갖는 지방산인 올레산으로 봉쇄(capped)된 나노결정들을 생성하였다. 올레산 봉쇄의 결과로서, 수득된 나노결정들은 수성 매질 중에서 불용성이었고, 이는 나노결정들을 수성 또는 친수성 공급원 물질 중에 분산시키는 것에 관해 문제를 일으켰다. 또한, 올레산 꼬리를 갖는 나노결정들은 소수성 매질 중에서만 밝게 발광하였다. 올레산 봉쇄된 UCN들이 물에 노출되면 현저한 응집이 야기되고 표면 결함-매개 소광으로 인해 높은 정도의 가역적 발광 감쇠가 야기되었다.
본 발명자들은 UCN들 상의 올레산 꼬리를 개질시켜 이들의 수용해도를 개선시키고 이들의 친수성 매질 중 발광을 증가시키는 방법을 사용하였다. 올레산 이중 결합을 산화시켜 알코올을 형성한 후 이를 개열시켰으며, 이에 의해 올레산 쇄의 바깥쪽을 향한 소수성 부분이 표출되고 카복실산 그룹이 형성되었다.
UCN들의 올레산 꼬리를 개질시키는 데 사용된 특정 절차는 0.1g의 UCN들을 사이클로헥산(100㎖), 3급-부탄올(70㎖), 물(10㎖) 및 5중량% K2CO3 용액(5㎖)의 혼합물에 첨가하고 실온에서 약 20분 동안 교반하는 단계를 수반하였다. 이어서, 20㎖의 르미유-본 루들로프(Lemieux-von Rudloff) 시약(5.7mM KMnO4 및 0.1M NaIO4 수용액)을 상기 용액에 적가하였다. 상기 수득된 혼합물을 48시간 동안 교반하였다. 상기 생성물을 원심분리하고, 탈이온수, 아세톤 및 에탄올로 세척하였다. 후속적으로, UCN들을 pH 4의 염산(50㎖) 중에 분산시키고, 1시간 동안 교반하여 카복실-말단 나노결정들을 형성하였고, 이를 탈이온수로 5회 세척하고 원심분리에 의해 수집하였다. 상기 수득된 카복실-말단 나노결정들은 수성 매질 중에 응집 없이 분산되었고, 친수성 매질 내에서 강하게 발광하였다. 표면 개질은 미세 입자 바디에 친수성 물질이 사용될 경우 유용하지만; PUA와 같은 소수성 물질에 대해서는 필요하지 않을 수 있다.
본 발명자들은 미세 입자의 중합체 물질과 가교결합될 수 있는 아크릴레이트-말단 UCN들을 형성하도록 카복실-말단 UCN들을 개질시키는 방법을 개발하였다. 상기 방법은 200㎕의 EDC(20㎎/㎖) 및 200㎕의 설포-N-하이드록시석신이미드(설포-NHS)(20㎎/㎖)를 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES) 완충액(0.1M, pH 6.0, 40㎎/㎖) 중에서 200㎕의 카복시-말단 UCN들과 혼합하고 실온에서 2시간 동안 교반하여 표면을 카복실산 그룹으로서 활성화시키는 단계를 포함하였다. NHS-활성화된 UCN들을 원심분리하고 물로 세척하였다. 상기 침전물을 2-하이드록시에틸아크릴레이트(20㎎/㎖)를 함유하는 200㎕의 PBS 완충액(0.1M, 5㎖, pH 7.2) 중에 다시 분산시켰다. 이어서 상기 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 상기 수득된 아크릴화된 UCN들을 반복적인 원심분리(3000rpm, 5분, 5회)에 의해 정제하고 탈이온수 중에 다시 현탁시켰다.
도 20은 물체 또는 티슈의 라벨링을 위한 중합체 미세 입자의 제조 방법의 순서도(110)이다. 제1의 인코딩 영역 공급원 물질이 제공된다(112). 제1의 인코딩 영역 공급원 물질은 중합체 및 제1의 다수의 UCN들을 포함하고, 상기 UCN들은 제1의 스펙트럼 시그너쳐를 갖는다. 예를 들어, 제1의 다수의 UCN들은 상기에 기재되고 UCN3으로 표시된 나노결정들일 수 있다. 제1의 다수의 UCN들(유형 UCN3)의 스펙트럼 시그너쳐는 도 4에 도시된 스펙트럼으로서 설명될 수 있거나, 또는 하나의 검출 채널 내 적분 강도와 또다른 검출 채널 내 적분 강도의 비(예를 들어, 표 1에 나타낸 바와 같은, 녹색 검출 채널 적분 강도와 적색 검출 채널 적분 강도의 비)에 의해, 또는 복수의 상이한 적분 강도 비들(예를 들어, 녹색 대 적색, 청색 대 적색, 적색 대 녹색)에 의해 설명될 수 있다. 제2의 인코딩 영역 공급원 물질이 또한 제공된다(114). 제2의 인코딩 영역 공급원 물질은 제1의 스펙트럼 시그너쳐와는 상이한 제2의 스펙트럼 시그너쳐를 갖는 제2의 다수의 UCN들을 포함한다. 제2의 다수의 UCN들은 상기에 기재되고 UCN4로서 표지된 UCN들일 수 있다. 제2의 다수의 UCN들(유형 UCN4)의 스펙트럼 시그너쳐는 도 5에 도시된 스펙트럼으로서 설명될 수 있거나, 또는 하나의 검출 채널 내 적분 강도와 또다른 검출 채널 내 적분 강도의 비(예를 들어, 표 1에 나타낸 바와 같은, 녹색 검출 채널 적분 강도와 적색 검출 채널 적분 강도의 비)에 의해, 또는 복수의 상이한 적분 강도 비들(예를 들어, 녹색 대 적색, 청색 대 적색, 적색 대 녹색)에 의해 설명될 수 있다. 순서도에는 제1의 인코딩 영역 공급원 물질과 제2의 인코딩 영역 공급원 물질만이 명시되어 있지만, 필요한 인코딩 영역 공급원 물질의 수는 수득되는 미세 입자 내에 요망되는 인코딩 영역의 구획의 수에 상응한다.
제1의 인코딩 영역 공급원 물질과 제2의 인코딩 영역 공급원 물질을 가교결합하여 인코딩 영역의 제1 구획(31) 및 인코딩 영역의 제2 구획(32)을 형성한다. 인코딩 영역이 3개 이상의 구획들을 갖는 양태들에서는, 각각의 구획을 인코딩 영역의 하나 이상의 다른 구획들과 가교결합하여 이음매가 없는 미세 입자를 형성한다.
일부 양태들에서, 인코딩 영역의 구획들 중 적어도 일부를 위한 UCN들은 친수성 표면을 갖는다. 일부 양태들에서, 인코딩 영역의 구획들 중 적어도 일부를 위한 UCN들은 친수성 리간드를 갖는다. 일부 양태들에서, 제1의 인코딩 영역 공급원 물질을 제공하는 단계 및 제2의 인코딩 영역 공급원 물질을 제공하는 단계는 제1의 다수의 나노결정들 및 제2의 다수의 나노결정들을 친수성 표면 및/또는 친수성 리간드를 갖도록 개질시키는 단계를 포함할 수 있다. 친수성 표면 및/또는 친수성 리간드를 갖는 것은 UCN들을 수성 또는 친수성 공급원 물질 내에 분산시키는 데 도움이 될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 티슈 라벨링 분야에서는 하이드로겔 물질을 바디에 사용할 수 있다.
일부 양태들에서, 인코딩 영역의 구획들 중 적어도 일부를 위한 UCN들은 하이드로겔 매트릭스 중합체와의 가교결합을 위해 아크릴화된 리간드를 갖는다. 일부 양태들에서, 제1의 인코딩 영역 공급원 물질을 제공하는 단계 및 제2의 인코딩 영역 공급원 물질을 제공하는 단계는 제1의 다수의 나노결정들 및 제2의 다수의 나노결정들을 아크릴화된 리간드를 포함하도록 개질시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 양태들에서, 다수의 UCN들은 입자 합성 시에 아크릴레이트 그룹을 통해 중합체 물질에 결합된다.
다른 양태들에서는, UCN들과 중합체 매트릭스 사이에 또다른 유형의 공유 결합을 생성할 수 있을 것이다. UCN들은 임의의 수의 공유결합 부착 메커니즘(예를 들어, 아미드 결합, 다이설파이드, 에스테르, 에테르, 알데하이드/케톤, 사이클 첨가(cycloaddition), 클릭 화학(click chemistry), 아지드 및 카바메이트)을 이용하여 중합체 매트릭스에 결합될 수 있다.
일부 양태들에서, 바디는 소수성 중합체 물질, 예를 들어 PUA를 포함한다. 이들 양태에서, 사용되는 나노결정들은 소수성 표면 또는 소수성 리간드를 가질 수 있다. 올레산-봉쇄된 나노결정들은 PUA와 같은 소수성 물질 중에 분산되도록 개질시킬 필요가 없다.
일부 양태들에서, UCN들 중 적어도 일부는 희토류 금속으로 도핑된다. 일부 양태들에서, UCN들 중 적어도 일부는 적어도 30mol% Gd을 포함하는 조성물로 도핑된다. 일부 양태들에서, UCN들 중 적어도 일부는 상자성이다.
일부 양태들에서, 인코딩 영역의 각각의 구획을 위한 물질은 동일한 물질이다. 일부 양태들에서, 인코딩 영역의 일부 구획들을 위한 물질은 상기 인코딩 영역의 다른 구획들을 위한 물질과는 상이하다.
상기에 언급된 바와 같이, 일부 양태들에서, UCN들은 친수성 표면을 갖는다. 일부 양태들에서, UCN들은 친수성 리간드를 갖는다. 친수성 표면 및/또는 친수성 리간드를 갖는 것은 UCN들을 공급원 물질 내에 분산시키는 데 도움이 될 수 있다.
일부 양태들에서, 당해 방법은 각각의 인코딩 영역을 위한 공급원 물질을 가교결합을 위한 영역으로 공동-유동(co-flowing)시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 스톱-플로우 리소그래피(SFL) 기술을 미세 입자들 형성에 사용할 수 있다. SFL에서는 점성의 UV-민감성 예비-중합체 용액(상기 용액을 본원에서는 공급원 물질이라 지칭할 수 있다)들이 소형 미세유체 장치 내로의 층상(laminar) 공동-유동을 겪고, 상기 장치는 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 제조될 수 있다. 유기 합성의 경우, 미세유체 장치는 퍼플루오로폴리에테르(PFPE)로부터 제조될 수 있다. 예비-중합체 용액들의 유동이 잠시 동안 중단되고, 그 동안에 장치 내의 예비-중합체 용액들이 포토마스크-패턴화된 자외선 광에 노광된다. UV 광은 포토마스크에 의해 그려진 구역 내에서 몇 밀리초 내에 가교결합, 중합 또는 이들 둘 다를 일으켜 마이크로-크기의 중합체성 입자들을 형성한다. 각각의 입자 형상은 포토마스크에 의해 규정된다. 입자의 각각의 스트라이프 부분의 조성은 층상 공동-유동 스트림들(예를 들어, 공급원 물질들)의 조성에 의해 결정된다. SFL 기술은 전체 미세 입자의 입자 형상 및 미세 입자의 상이한 스트라이프 부분의 조성 둘 모두를 제어하는 능력으로 인해, 나노결정들을 사용하는 미세 입자들의 공간 및 스펙트럼 인코딩에 특히 매우 적합하다.
도 21은 SFL을 사용하여 하이드로겔 미세 입자를 제조하는 것을 도식적으로 나타내며, 상기 미세 입자는 식별 가능한 스펙트럼 시그너쳐들을 갖는 UCN들을 갖는 상이한 구획들을 포함하는 인코딩 영역을 갖는다. 상기 도면에서, 인코딩 영역 공급원 물질(ERSM)들은 ERSM1 내지 ERSM6으로 표시된다. 각각의 인코딩 영역 공급원 물질들은 예비-중합체(142) 및 다수의 UCN들을 포함하며, 상기 UCN들은 일부 양태들에서 아크릴화된 UCN들(144)일 수 있다. 본원에서 사용된 용어 예비-중합체는 가교결합될 수 있는 중합체 쇄들 및 단량체들을 포함한다. 본원에서 사용된 용어 가교결합은 광범위하게는, 중합체 쇄들 사이에 결합을 형성하는 것, 중합체와 나노입자 사이에 결합을 형성하는 것, 그리고 단량체들을 중합하는 것을 의미한다. 하나 이상의 인코딩 영역 공급원 물질들 ERSM1 내지 ERSM6은 미세유체 장치 내의 영역(150)으로 유동한다. 공동-유동들이 잠시 중단될 때, 광원(160)(예를 들어, 350㎚ UV 광원), 포토마스크(162) 및 집광 광학 장치(예를 들어, 대물렌즈(164))가 예비-중합체(142)의 가교결합/중합을 위해 영역(150)에서 패턴화되고 집광된 광을 제공한다. 예비-중합체 공급원 물질의 가교결합(146)은 중합체 네트워크(network)를 생성함으로써 이음매가 없는 미세 입자(170)를 형성한다. 도시된 바와 같이, UCN들(144)는 아크릴화된 리간드들을 포함할 수 있고, 이는 UCN들(144)가 중합체 네트워크(148)과 가교결합(146)할 수 있도록 한다. 각각의 인코딩 영역 공급원 물질 ERSM1 내지 ERSM6은 미세 입자(170)의 인코딩 영역의 상응하는 구획(171 내지 176)을 형성한다. 일부 양태들에서는, UCN들이 중합체 네트워크와 가교결합되지 않지만, 대신에 중합체 네트워크(148)의 매트릭스 공극 크기에 의해 물리적으로 포집동반(entrained)된다.
포토마스크(162)가 4개의 미세 입자들을 동시에 형성하는 패턴을 갖는 것으로 도시되어 있긴 하지만, 일부 양태들에서는, 포토마스크가 4개를 초과하는 미세 입자들을 동시에 형성하기 위한 패턴을 가질 수 있다. 일부 양태들에서는, 한번에 단 하나의 미세 입자가 형성될 수 있다. 일부 양태들에서, 포토마스크는 상이한 형상을 갖는 미세 입자들을 동시에 생성하는 패턴을 가질 수 있다. 일부 양태들에서, 포토마스크는 비대칭 입자들 및/또는 직사각형이 아닌 형상을 갖는 입자들을 생성할 수 있다.
미세 입자(170)가 6개의 인코딩 영역을 갖는 것으로 도시되어 있긴 하지만, 다른 양태들에서는 6개보다 더 많거나 또는 더 적은 인코딩 영역들이 존재할 수 있다. 예를 들어, 도 22는 각각이 2개 내지 6개의 인코딩 영역들을 갖는 다양한 미세 입자들의 발광 이미지들을 보여준다. 추가의 인코딩 영역(예를 들어, 6개 대신 7개의 스트라이프들)을 갖는 미세 입자들은 단일 입자 인코딩 용량을 천만 초과까지 상승시킬 것이며, 그럼에도 불구하고 미세유체 합성 장치 상에 추가의 유입 포트 외에는 더 필요로 하는 것이 없다.
이음매가 없는 중합체 미세 입자들의 형성을 위한 SFL 기술에 관한 추가의 상세 사항들에 대해서는 2012년 12월 13일자로 발행된 미국 특허 출원 공보 US 제2012/0316082 A1호 및 2012년 1월 5일자로 발행된 미국 특허 출원 공보 US 제2012/0003755 A1호를 참조하기 바라며, 상기 출원문헌들은 그 전체 내용이 인용에 의해 본원에 포함된다. 예시적인 플로우 래소그래피 시스템이 아래에서 도 44 및 도 45와 관련하여 설명된다.
UCN들을 갖는 PEG-DA 하이드로겔 미세 입자들의 제조 실시예
본 발명자들은 스톱 플로우 리소그래피에 의해 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트(PEG-DA) 중합체 미세 입자들을 제조하였다. 우선, 본 발명자들은 나노결정들의 미세 입자들 내로의 혼입이 나노결정들의 방출 스펙트럼을 변화시키는지를 결정하기 위해, 각각의 세트가 단지 하나의 유형의 나노결정을 포함하는 미세 입자들의 세트들을 제조하였다. 각각의 나노결정 유형들 UCN1 내지 UCN10에 대해, 50개의 PEG-DA 하이드로겔 미세 입자들을 제조하였다. CCD 디바이스를 사용하여, NIR 광 조사 동안 각각의 미세 입자의 3개 색상 이미지(적색 채널, 녹색 채널 및 청색 채널)를 수득하여 적색 채널 이미지, 녹색 채널 이미지 및 청색 채널 이미지를 생성하였다. 각각의 채널 이미지에 대해, 각각의 미세 입자의 경계선들 내의 강도(픽셀 값)를 적분하여 각각의 미세 입자에 대한 각각의 채널의 "픽셀 값"을 수득하였다. 도 23은 UCN1 내지 UCN9 유형들에 대한 50개의 미세 입자들로부터의 적색, 녹색 및 청색 채널들에 대한 적분 "픽셀 값들"의 히스토그램들을 포함한다. 일부 유형들에 대한 히스토그램들은 또한 대표적인 NIR-조사된 미세 입자의 삽입 이미지를 포함한다. 삽입 이미지들에 의해 나타난 바와 같이, 스톱 플로우 리소그래피 공정은 상이한 미세 입자 형상들을 제조하는 데 사용될 수 있다.
이어서 각각의 유형의 UCN들에 대한 50개의 미세 입자들로부터의 평균 측정 적분 강도 값들을 UCN 방출 데이터와 이미지 센서 반응 곡선들의 중첩 적분으로부터 수득되는 예상 적분 강도 데이터와 비교하였다. 하기 표 3은 미세 입자들 내의 UCN들에 대한 측정 평균 적분 강도 데이터, 표준 편차 및 변동 계수를 포함한다. 용액 중 UCN들로부터의 방출 스펙트럼에 기초하는 예상 적분 강도 데이터가 또한 비교를 위해 포함된다. 표 3에서 나타난 바와 같이, 평균 적분 강도 값과 예상 적분 강도 값은 일관된다. 모든 입자들 및 UCN 색상들에 걸친 평균 변동 계수는 2%였다. 이는 개별 합성된 입자들의 개별 획득된 이미지들에 대해 (255의 척도로) 2.1 RGB 유닛의 평균 표준 편차에 상응하며, 이는 뛰어난 입자간 재현력(particle-to-particle reproducibility)을 시사한다. 또한, 오차(error) 타원들은 6 시그마보다 더 우수한 정도까지 비-중첩성이며, 이는 1ppb 미만의 디코딩 오차율이 예상될 수 있음을 시사한다. 따라서, 소정 유형의 나노결정들의 방출 스펙트럼이 공지되면, 색상 채널에서의 검출을 위한 적분 강도를 신뢰성 있게 예측할 수 있다.
Figure 112015099955063-pct00004
도 24는 UCN1 내지 UCN9 유형 나노결정들이 혼합된 각각의 미세 입자들에 대한 적색 채널, 녹색 채널 및 청색 채널 적분 강도 값들을 나타내는 산포 플롯이다. 모든 UCN1 내지 UCN9 유형의 나노결정들은 적색 채널 및 녹색 채널 방출 강도를 갖는다. UCN1, UCN2, UCN6, UCN7, UCN8 및 UCN9 유형의 나노결정들은 적색 채널 및 녹색 채널 뿐만 아니라 청색 채널에서도 방출 강도를 갖는다. 데이터 점들의 각각의 집락 주위의 타원들은 가우시안 혼합 모델(Gaussian mixture model)을 데이터에 피팅시켜 얻은 3-시그마, 4-시그마 및 5-시그마 폐곡선들이다. 빈틈없는 집락들 사이의 분리에 의해 나타나는 바와 같이, 미세 입자에 대한 적색 채널, 녹색 채널 및 청색 채널 적분 강도들을 사용하여 각각의 미세 입자에 대한 UCN 유형을 명확하게 구별할 수 있다. 도 25는 UCN1 내지 UCN9 유형의 나노결정들이 통합된 입자들에 대한 녹색 채널 대 적색 채널에서의 평균 적분 강도 값(측정값 사각형) 및 예상 적분 강도 값(중첩 적분 값 동그라미)의 비교를 나타낸다. 타원들은 5-시그마 신뢰 폐곡선들을 나타낸다.
따라서, 본 발명자들은, NIR 다이오드 레이저를 사용하여 조사되고 표준 CCD 카메라를 사용하여 이미지화된 중합체 입자들 내에 통합된 6개의 상이한 유형의 UCN들의, 잡음에 강건한 스펙트럼 식별을 입증하였다. 또한, 녹색 채널 대 적색 채널 플롯에 의해 나타난 바와 같이, 적색 채널 적분 강도 및 녹색 채널 적분 강도는 6개의 상이한 유형의 나노결정들을 식별하기에 충분하다. 도 24 및 25의 산포 플롯들은 집락 중첩이 평균으로부터 단지 6 표준 편차 지나서 발생한다는 것을 나타내며, 이는 1ppb(10억분율) 미만의 예상 오차율을 시사한다.
본 발명자들은 또한, 상이한 뱃치들로부터의 미세 입자들의 적분 강도의 신뢰성 및 예측 가능성을 결정하기 위해 상이한 시간에 생성된 상이한 뱃치들의 미세 입자들을 비교하였다. 50개의 미세 입자들로 된 5개의 개별 뱃치들을 제조하였으며, 각각의 뱃치는 동일한 UCN4 유형 나노결정들을 포함하였다. 미세 입자들을 NIR 광원으로 조사하고, CCD 카메라를 사용하여 색상 이미지들을 수득하였다. 모든 5개의 뱃치들 내의 미세 입자들에 대해 적분 강도 데이터를 생성하고, 각각의 뱃치에 대한 평균 적분 강도 값들을 비교하였다. 도 26은 50개의 미세 입자들의 각각의 뱃치에 대해 녹색 채널에 대한 평균 적분 강도와 적색 채널에 대한 평균 적분 강도를 비교하는 그래프이다. 적색 채널에서의 적분 강도와 녹색 채널에서의 적분 강도는 5개의 뱃치에 걸쳐 일관되었다. 예상되는 바와 같이, 청색 채널에는 검출 신호가 존재하지 않았다. 하기 표 4는 각각의 뱃치에 대한 적색 및 녹색 채널 측정 적분 강도 값들을 열거하며, 이는 상이한 뱃치들의 미세 입자들에 대한 스펙트럼 시그너쳐의 일관성 및 재현력을 입증한다.
Figure 112015099955063-pct00005
본 발명자들은 산화 및 아크릴화 공정이 UCN들의 방출 스펙트럼을 변화시키지 않는다는 것을 확인하였다. 도 27은 UCN들의 표면 화학 개질에서 각각의 단계 후의 UCN4 유형 나노결정들의 방출 스펙트럼의 그래프이다(예를 들어, 처리 전 사이클로헥산 중에서, 산화 후, 아크릴화 후, 그리고 PUA 예비중합체 용액 중에서). 스펙트럼들은 서로 중첩되는데, 이는 미세 입자들 내로의 혼입 전에 UCN들의 표면 화학 개질이 그 결과로 생기는 입자들의 방출 스펙트럼에 유의하게 영향을 미치지 않는다는 것을 확증한다.
본 발명자들은 또한, 하이드로겔 미세 입자들 내로 통합된 나노결정들에 대해 장시간의 강한 NIR 조사 시 광퇴색으로 인한 발광 반응의 감쇠가 존재하지 않는다는 것을 확인하였다. 도 28은 UCN7 유형 나노결정들을 포함하는 하이드로겔 미세 입자들에 대해 1W 레이저로부터 980㎚ NIR 광에 연속 노광 시 강도를 시간 함수로서 나타내는 그래프이다. 이는 광퇴색으로 인해 감쇠를 나타내는 다수의 흔히 사용되는 형광단들과는 대조적인 것이다.
본 발명자들은 또한, 나노결정들이 하이드로겔 매트릭스 내의 공극들 내에 포획되어 있는 카복실-말단 UCN들로 제조된 하이드로겔 미세 입자들의 안정성과, 나노결정들이 아크릴레이트를 통해 하이드로겔 매트릭스에 결합되어 있는 아크릴화된 UCN들로 제조된 하이드로겔 입자들의 안정성을 비교하였다. 도 29는, 아크릴화된 UCN7 유형 나노결정들을 포함하는 미세 입자들의 강도와, 아크릴화 없이 카복실-말단 UCN7 유형 나노결정들을 포함하는 미세 입자들의 강도를 미세 입자들의 나이의 함수로서 비교하는 그래프들을 포함한다. 도시된 바와 같이, 아크릴화 없이 카복실-말단 UCN들을 포함하는 미세 입자들의 방출 강도에서 30일에 걸쳐 감소가 존재하며, 이는 아마도 미세 입자들로부터의 UCN들의 확산에 기인한다. 이에 반해, 아크릴화된 UCN들을 갖는 미세 입자들은 30일의 에이징(aging)에 걸쳐 감쇠를 나타내지 않았다. 따라서, UCN들의 아크릴화 및 후속의 하이드로겔 매트릭스에의 결합은 미세 입자들의 발광 안정성(예를 들어, 반감기)을 개선시킨다.
스펙트럼 및 공간 인코딩을 갖는 이음매가 없는 미세 입자들의 형성 실시예
UCN들을 형성하는 방법의 예측 가능성 및 재현력, 그리고 각각이 단지 하나의 유형의 UCN들을 포함하는 하이드로겔 입자들로부터의 스펙트럼의 예측 가능성 및 재현력을 확증한 후, 본 발명자들은 스펙트럼 인코딩과 공간 인코딩 둘 모두를 갖는 PEG-DA 하이드로겔 미세 입자들 및 폴리우레탄 아크릴레이트(PUA) 미세 입자들을 제조하였다. PUA 미세 입자들은 내열성 및 내약품성이다. PEG-DA 미세 입자들은 생체적합성이고 메조다공성(mesoporous)이어서, 커다란 생체 거대분자들의 확산을 가능하게 한다. 더욱 치밀하게 가교결합된 PUA 입자들의 경우, 소수성 UCN 표면 화학 조성 및 커다란 봉 모양의 UCN 나노구조가 미세 입자 내의 UCN들의 균일하고 비가역적인 물리적 포집동반을 가능하게 하였다. 반면, UCN들의 미세 입자들 내로의 안정한 통합은 강한 공유 결합에 의한 도입을 위해 UCN 상에 UV-활성 관능 그룹을 갖는 친수성 표면 화학 조성의 사용을 수반하였으며, 이는 상기에 기재된 바와 같다.
구체적으로는, 각각이 복수의 구획들(예를 들어, 복수의 스트라이프들)로 나누어진 인코딩 영역을 포함하는 가늘고 긴 중합체 미세 입자들을 제조하였고, 상기 각각의 구획은 식별 가능한 스펙트럼 시그너쳐를 갖는 다수의 나노결정들을 포함하였다. 제조된 미세 입자들이 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 구획들의 인코딩 영역을 포함하긴 했지만, 일부 양태들에서, 각각의 미세 입자는 6개를 초과하는 구획들을 갖는 인코딩 영역을 가질 수 있다. 일부 양태들에서, 일부 입자들은 다른 미세 입자들과는 상이한 수의 구획을 가질 수 있다. 제조된 하이드로겔 미세 입자들이 직사각형이고 가늘고 길긴 했지만, 일부 양태들에서, 하이드로겔 미세 입자들은 상이한 종횡비 및/또는 상이한 형상을 가질 수 있다. 또한, 제조되는 미세 입자들은 대칭 또는 비대칭일 수 있다.
미세 입자들은 인코딩 영역 공급원 물질들을 사용하여 SFL에 의해 제조되었다. PEG-DA 하이드로겔 미세 입자 공급원 물질의 경우, 아크릴화된 UCN들을 PEG-DA 예비혼합물 용액 중에 분산시켜, 45vol% PEG-DA(Mn=700), 40vol% UCN(0.5㎎/㎕), 10vol% 폴리(스티렌설포네이트) PSS 및 5vol% DAROCUR 1173 광개시제(PI)의 혼합물을 수득하였다. PUA 미세 입자 공급원 물질의 경우, 150㎎의 UCN들을 300㎕의 9:1 용적 비 PUA/PI 용액 중에 분산시켰다. 상기 공급원 물질들을 사용하여, 도 21과 관련해 상기에 기재된 바와 같이 SFL을 사용하여 이음매가 없는 미세 입자들을 형성하였다.
SFL 시스템을 위해 폴리-디메틸실록산(PDMS)으로부터 미세유체 장치를 제작하였다. PDMS를 경화제와 10:1 비로 혼합하고, 진공하에 30분 동안 탈기시켰다. 탈기된 PDMS를 SU-8 마스터 금형 위에 붓고 65℃에서 밤새 경화시켰다. 이어서 상기 금형으로부터 채널들을 잘라 내고, 부분-경화된 PDMS로 코팅된 유리 슬라이드에 접합시켜 산소 투과성을 보장하였다. 조립된 장치를 65℃에서 밤새 완전히 경화시켰다. SFL 시스템의 미세유체 장치 내 미세유체 채널은 300㎛ 너비 및 36㎛ 높이였다.
SFL을 위한 포토마스크를 컴퓨터 지원 제도(computer added drafting) 프로그램을 사용하여 설계하고, 고해상도 프린터로 인쇄하였다. 합성 전에 마스크를 현미경의 시야 조리개 내에 위치시켰다. SFL 시스템을 위해 폴리-디메틸실록산(PDMS)으로부터 미세유체 장치를 제작하였다. PDMS를 경화제와 10:1 비로 혼합하고, 진공하에 30분 동안 탈기시켰다. 탈기된 PDMS를 SU-8 마스터 금형 위에 부었다.
SFL 시스템의 미세유체 채널에 복합 단량체 용액을 로딩하고, 현미경 스테이지 상에 정렬시키고, 압력-추진 유동에 적용시켰다. 모든 합성 사이클에서, 단량체 유동을 중단시키고(350밀리초), 2색성 필터 세트를 통해 필터링된 UV 광을 사용하여 장치 내에서 입자들을 광중합시켰다(365㎚ 파장 광, 100나노초의 노광 시간 동안). 이어서 상기 중합된 입자들을 500밀리초 동안 수집 관 내로 대류시켰다. 합성은 초당 약 5개 입자의 속도로 발생되었다. 합성 후 입자들을 세정하였다. PUA 입자들은 에탄올:PEG200(1/1(v/v))으로 8회 세정되고 에탄올 중에 저장되었다. PEG 입자들은 1X TET(0.05%(v/v) Tween 20를 함유하는 1xTE)로 3회 세정하였다.
본원에 기재된 실시예에서는 PEG-DA 및 PUA가 미세 입자들에 사용되긴 하였지만, 스톱-플로우 리소그래피에서 사용되고 있는 모든 디-아크릴화 단량체가 인코딩 영역에 사용될 수 있다. 또한, UCN들(개질된 표면 또는 리간드를 갖는 나노결정들 또는 개질되지 않은 표면 또는 리간드를 갖는 나노결정들)이 잘 분산될 수 있는 모든 디-아크릴화 단량체들도 사용될 수 있다.
시험에 사용된 인코딩된 하이드로겔 미세 입자들의 최초 뱃치에서, 인코딩 영역의 각각의 구획은 UCN3, UCN4, UCN5 및 UCN7 유형의 세트로부터 선택된 다수의 나노결정들을 포함하였고, 상기 나노결정들의 특성은 상기에 기재되어 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 인코딩된 미세 입자들은, 각각이 인코딩 영역의 하나 이상의 구획들을 갖고 각각이 하나 이상의 유형의 스펙트럼 식별 가능한 UCN들을 갖는 미세 입자들을 의미한다. 8개의 인코딩된 미세 입자들을 NIR 다이오드 레이저로 조사하고, 표준 CCD 이미지 센서를 사용하여 이미지화하였다. 상기 이미지 센서의 적색 채널 및 녹색 채널에 대해 적분 강도를 산출하였다. 도 30은 8개의 미세 입자들에서 인코딩 영역의 각각의 구획에 대한 녹색 채널 적분 강도 대 적색 채널 적분 강도의 플롯이다. 도시된 바와 같이, 인코딩 영역의 구획들에 대한 적분 강도들은 UCN3, UCN4, UCN5 및 UCN7 유형의 나노결정들에 상응하는 그룹들로 무리 지어져 있다. 타원들은 단지 하나의 유형의 나노결정들을 갖는 입자들로부터의 데이터에 대한 5-시그마 가우시안 피트(five-sigma Gaussian fit)들이고, 이는 "훈련 데이터(training data)"로서 간주될 수 있다. 인코딩된 입자들에 대한 모든 데이터 점들이 훈련 데이터에 대해 5-시그마 가우시안 피트의 범위 내에 속하였다.
인코딩된 미세 입자들은 많은 상이한 유형의 라벨링 분야에 사용될 수 있다. 일부 양태들에서는, 대표 집단의 입자들이 패키징 표면의 대부분을 덮는다. 일부 양태들에서는, 복수의 입자들의 시퀀스 또는 집단화(grouping)로 이루어진 개별 코드가 잘 정의된 위치에 놓인다. 표면 상의 입자들의 시퀀스 또는 집단화를 사용하여 비대칭 입자들의 경우 (CS)N 그리고 대칭 입자들의 경우 (CS/2)N의 인코딩 용량으로 물체를 독특하게 식별할 수 있으며, 여기서 N은 배치된 입자들의 수이다. 단지 1000개의 독특한 비대칭 입자들의 세트로부터 10개의 입자들을 무작위적으로 매립하는 것은 지구 상의 모든 제품을 독특하게 바코드화하기에 충분한 약 (1000)10 또는 1030의 인코딩 용량을 제공한다.
본 발명자들은 폴리비닐 클로라이드(PVC) 블리스터 팩 물질을 라벨링하기 위하여 2개의 구획(2개의 스트라이프), 3개의 구획(3개의 스트라이프) 및 4개의 구획(4개의 스트라이프)의 인코딩된 미세 입자들을 사용하였고, 이때 각각의 스트라이프는 UCN1 내지 UCN9 유형의 나노입자들 중 하나를 포함하였으며, 이는 도 31에 도시된 바와 같다. 인코딩된 입자들을 라미네이팅(laminating) 용액, 구체적으로는 부피 기준으로 9:1의 PUA 용액/광개시제 중에 분산시켰다. 2㎕의 예비중합체 용액을 블리스터 팩 위에 적하시켰다. 10분 후, PUA를 365㎚ UV 광을 사용해 30초 동안 가교결합시켰다.
도 31은 1W 980㎚ NIR 레이저로 조사된 블리스터 팩을 나타낸다. PUA 입자들 및 그 주변의 라이네이트는 동일한 굴절 지수를 갖는데, 이는 이들이 적절한 NIR 공급원으로 조사되지 않는 한에는 보이지 않도록 한다. 도 31의 상세도는 980㎚ 레이저 조사하에 현미경을 사용하여 이미지화된 미세 입자들을 나타낸다. 당해 이미지에서, 각각의 구획의 전체 색상이 쉽게 식별 가능하다. 도 32는 약제학적 블리스터 팩 상에 라미네이트된 인코딩된 PUA 입자들의 또다른 발광 이미지이다. 도 32에서, 각각의 미세 입자들은 2 내지 6개의 코딩 구획들을 갖는다.
추가로, 도 33은 적색 채널 및 녹색 채널에 대한 각각의 미세 입자의 각각의 구획의 적분 강도의 그래프를 포함한다. 촘촘한 군집화는 각각의 구획 또는 스트라이프의 스펙트럼 시그너쳐들이 쉽게 식별 가능하다는 것을 확증한다. 추가로, 모든 데이터가 단색 하이드로겔 미세 입자들의 훈련 세트로부터 결정되는 5 시그마 불확실성 한계 범위 내에 속한다. 블리스터 팩 표면의 복잡한 배경에도 불구하고, 모든 디코딩된 스펙트럼들이 훈련 중심점(centroid)들의 5 시그마 범위 내에 속하였다. 놀랍게도, PUA-기반 RGB 훈련 데이터는 필요하지 않으며, 이는 UCN 3 내지 5 및 7에 대한 PEGDA-기반 훈련 데이터의 성공적인 사용에 의해 입증되는 바와 같다(도 33).
도 34는 생체 검정에 사용된 PEG-DA 미세 입자들과 블리스터 팩의 라벨링에 사용된 PUA 미세 입자들 둘 모두에 대한 적색 채널 및 녹색 채널에 대한 각각의 미세 입자의 각각의 구획의 적분 강도의 그래프이다. 도시된 바와 같이, 데이터가 둘 모두의 미세 입자들 유형에 대해 5-시그마 폐곡선 내에 피트되며, 이는 상이한 미세 입자 물질들에 걸쳐서 식별의 신뢰성이 적용된다는 것을 확증한다.
PUA 미세 입자들은, 영구적인 매립식 바코드가 유용한 디코딩, 잠금해제 분야에 영향을 미치지 않으면서, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트)(PET)와 같이 보편적인 용융된 플라스틱 중에서 최대 260℃의 고온 주조에의 노출을 견딘다. 본 발명자들은 PUA 미세 입자들이 통상적인 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 가공을 견딜 수 있다는 것을 실험적으로 확증하였다. PET 가공을 시뮬레이트하기 위해, PUA 인코딩된 미세 입자들을 PET 과립들을 함유하는 바이알 내에 로딩하였다. PUA 미세 입자들과 PET 칩들의 혼합물을 함유하는 바이알을 PET 과립들이 완전히 용융될 때까지 260℃로 가열하였다. 용융된 미세 입자 및 PET 용액을 저부 유리 슬라이드 위에 적하한 다음 상부 유리 슬라이드로 샌드위치화시켰다. 샌드위치화시킨 유리 슬라이드들을 삽입된 용액이 분산되어 균등한 PET 필름이 생성될 때까지 다시 가열하였다. 용융 공정 전에 그리고 용융 공정 후에 발광 이미지들을 수득하였다. 도 35는 시뮬레이트된 PET 가공 후 NIR 광으로 조사된 2개의 PUA 인코딩된 미세 입자들의 발광 이미지이다. 도 36은 PET 가공 후 10개의 미세 입자들에서의 다양한 색상 코드들에 대한 적분 강도의 그래프들을 포함한다. 도 36에서 그래프들에 의해 나타난 바와 같이, 코딩된 미세 입자들의 방출은 시뮬레이트된 PET 가공에 의해 영향을 받지 않은 것으로 보였고, 이는 PUA 미세 입자들이 PET 가공을 겪는 PET 공급원 물질에 사용될 수 있다는 것을 의미한다.
PUA 미세 입자들은 또한 반복적인 조사 및 주변 광에 불감성이며, 이는 암실에 저장되어야 하는 형광 표지된 입자들과 비교해 뚜렷한 장점이다.
남아 있는 기술적 위험들에 대한 조사는 치밀한 입자 패킹 및 이에 수반되는 잠재적 입자 중첩으로 인한 정확도 균형에 대한 필요성에 의문을 제기할지도 모른다. 그러나, 작은 수의 입자들이 요구된다는 것이 이러한 문제점을 제거한다. 예를 들어, 약 250×70마이크론의 치수를 갖는 10개의 입자들의 배치 및 대략 10㎜의 시야의 경우, 시야 가장자리에서 편안한 버퍼를 제공하기 위해 최대 300 내지 500마이크론의 입자간 간격이 필요할 것이다. 대조적으로, 소비자 수요가 낮은 잉크젯 프린터는 잉크의 개별 도트들을 인치당 300개의 도트 또는 80마이크론마다 하나의 도트로 신뢰성 있게 간격을 두어 정확한 입자 배치를 가능하게 할 수 있다.
PUA 미세 입자들은 많은 다양한 유형의 물품들의 표면 라벨링에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명자들은 폴리에스테르 쓰레드를 미세 입자들로 코팅하였다. 입자들을 9:1의 PUA 대 PI 용액으로 혼합하고, 이를 사용하여 쓰레드를 코팅하였다. 이어서 상기 용액을 365㎚ UV 램프를 사용하여 광중합하였다. 도 37은 쓰레드 상에 코팅된 미세 입자들의 이미지들을 포함하며, 상단의 이미지는 정상 조명하의 이미지이고 하단의 이미지는 NIR 조명하의 이미지이다. 정상 조명하의 이미지들은 미세 입자들이 비간섭적이라는 것을 보여준다. 미세 입자들을 또한 화폐에 적용하였으며, 이는 도 38에 도시된 바와 같다.
미세 입자들은 위조 방지 목적을 위한 라벨링에 특히 적합할 수 있는데, 그 이유는, 미세 입자들은 비교적 이미지화하기가 쉽고 이미지로부터 정량적인 스펙트럼 정보를 획득하는 것이 비교적 용이하지만, 위조자들이 미세 입자들을 동일 특성들을 갖는 미세 입자들의 배열 및 공간/스펙트럼 시그너쳐를 이용해 "모방"하기는 어려울 것이기 때문이다.
본 발명자들은 또한 미세 입자들을 물체들의 벌크의 라벨링에 사용하였다. 예를 들어, 도 39는 3D 인쇄로 형성된 폴리비닐 알코올(PVA) 열쇠를 나타낸다. PVA 열쇠의 벌크는 약 12개의 미세 입자들을 포함한다. 왼쪽의 확대도에 나타낸 바와 같이, 미세 입자들은 정상 조명하에서는 보이지 않는다. 그러나, NIR 조명하에서는 미세 입자들이 뚜렷하게 식별될 수 있다.
도 40은 3D 인쇄로 형성된 아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌(ABS) 열쇠를 나타내며, 상기 열쇠의 벌크 내에 약 12개의 미세 입자들이 포함된다. 왼쪽의 상세도에 나타낸 바와 같이, 정상 조명하에서는 미세 입자들이 보이지 않는다. 그러나, NIR 조명하에서는 미세 입자가 뚜렷하게 식별될 수 있다. 본 발명자들은 또한 미세 입자들을 폴리락트산(PLA) 열쇠의 벌크 내에 매립하였다.
PVA, ABS 및 PLA 열쇠에서, 미세 입자들은 이들을 플라스틱 필라멘트 상에 코팅하고 이를 3D 프린터의 압출 부재를 통해 통과시킴으로써 열쇠의 벌크 내로 매립되었다. 그러나, 다른 양태들에서는, 미세 입자들을 상기 물질의 벌크에 첨가한 후 상기 물질을 (예를 들어, 사출 성형 또는 취입 성형을 통해) 형성 또는 성형할 수 있다.
예를 들어, 폴리스티렌 열쇠를 상기 물질의 벌크 내의 미세 입자들을 사용해 고온에서 주조하였다(도 41 참조). 실리콘 성형 물질을 열쇠 위에 붓고 24시간 동안 경화시켜 금형을 생성하였다. 9:1(v/v) 비의 PUA/PI 용액 중의 UCN-통합된 PUA 입자들을 상기 금형 내에 적하하고, 365㎚ 휴대용 UV 램프를 사용하여 30초 동안 경화시켰다. 열쇠 모양의 금형에 폴리스티렌(MW= 280,000) 과립을 충전시키고, 260℃에서 90분 동안 가열하였다. 실리콘 금형을 실온으로 냉각시키고, 주조 물체를 상기 금형으로부터 떼어냈다. 이어서 맞춤형 휴대용 디코더를 사용하여 1W 980㎚ NIR 레이저로부터의 여기하에 발광 이미지들을 취득하였다.
가시광에 의한 일상적인 조명하에서는 미세 입자들이 보이지 않는 것이 중요한 분야들에 있어서, 미세 입자를 위한 중합체 물질은 미세 입자가 부착될 그 물질의 굴절 지수와 조화를 이루도록 선택될 수 있다. 표면 라벨링 분야들의 경우, 미세 입자의 중합체 물질은 미세 입자들을 기저의 물체에 부착시키는 데 사용되는 코팅 물질의 굴절 지수와 조화를 이루도록 선택될 수 있다. 물체의 바디 내 라벨링의 경우, 미세 입자의 중합체 물질은 물체의 바디의 굴절 지수와 조화를 이루도록 선택될 수 있다.
일부 양태들에서, 다양한 유형의 미세 입자들이 티슈를 위한 매립식 라벨로서 사용될 수 있다.
도 41의 이미지에 의해 예시된 바와 같이, 미세 입자들은 다양한 유형의 물체들의 표면 및/또는 벌크의 라벨링에 사용될 수 있다. 미세 입자들은 정상 조명하에서는 비간섭적이거나 "은폐되어(covert)" 있지만, NIR 조명하에서는 뚜렷하게 보인다. 특히, 디코딩은 현미경-기반 기기 장치에 제한되지 않는다. 도 41은 대물렌즈가 장착된 휴대폰 카메라로 구성된 휴대용 장치를 사용하는 휴대용 디코더에 대한 이미지 획득을 예시한다. 구체적으로는, 휴대용 현미경 디코더를 다음의 구성요소들을 사용하여 조립하였다: 카메라가 내장된 휴대폰, 10배 접안렌즈 튜브 조립체에 대한 DIN 대물렌즈, 20배 대물렌즈(긴 작업 거리(LWD) 확대율 20배/개구수(0.30)), 및 현미경 접안렌즈에 대한 휴대폰 어댑터. 도 41은 약제 블리스터 팩, 화폐, 신용 카드, 3D 세라믹 물체, 미술품 및 고온 주조 폴리스티렌 열쇠의 라벨링에 사용된 미세 입자들의 이미지들을 포함한다.
도 42는 본 발명의 일부 양태들에 따른 미세 입자의 스펙트럼 코드들을 판독하는 방법을 예시한다. 우선, x 또는 y 축을 따라서 최대값 또는 최소값을 확인한다(단계 1). 입자의 중심 지점과 말단 지점을 확인한다(단계 2). 입자 배향을 결정하고, 비대칭 입자의 경우 입자의 방향을 결정하고, 각각의 스트라이프의 중심을 확인한다(단계 3). 각각의 스트라이프 둘레의 샘플링된 면적 내에서 평균 RGB 값을 산출한다(단계 4).
구체적으로는, 6개의 스트라이프를 갖는 입자들의 이미지들을 CCD 디코더를 통해 취득하고, 이미지 처리 및 분석 소프트웨어(예를 들어, 미국 매사추세츠주 나티크 소재의 매스웍스(Mathworks)에 의한 MATLAB) 내로 로딩하였다. 그레이스케일 강도-기반 엣지 검출 알고리즘(grayscale intensity-based edge detection algorithm)을 이용하여 입자 경계선들을 규정하였다. 경계선 픽셀 x 및 y 값들을 평균 내어 입자 중심점을 결정하였다. 최소 및 최대 x 및 y 값들(총 4개의 점들)을 갖는 경계선 픽셀들을 표시하고, 인접하는 점들 사이의 거리들을 사용하여, 입자 말단 점, 또는 입자 경계선의 두 번째로 짧은 모서리 및 이의 종축 상에 놓이는 픽셀을 결정하였다. 이어서 말단 픽셀 및 중심점 픽셀을 사용하여 코드 배향 및 입자의 종축에 대한 디렉터(director) 둘 모두를 결정하였다. 입자를 이의 종방향 디렉터를 따라서 6개의 영역(스트라이프의 갯수는 선험적으로 알려진 것으로 간주되었다)으로 분절함으로써 입자들의 각각의 스프라이프 영역의 중심점을 결정하였다. 다른 양태들에서는, k-평균 이미지 분절화 알고리즘(k-means image segmentation algorithms)을 사용하여, 입자 스트라이프의 갯수에 대한 선험적 지식 없이 색상을 기준으로 입자의 영역들을 규정할 수 있다. 피시험 입자들의 6개의 스트라이프 영역들 각각의 픽셀들을 평균 냄으로써 RGB 값들을 측정하고, 이를 입자 훈련 세트로부터 결정된 바와 같은 훈련 RGB 값 및 표준 편차와 비교하였다. RGB 값의 평균 세트가 훈련 RGB 값의 3.5 표준 편차 이내에 들어가는 경우, 상기 값은 매치되는 것으로 결정되었다. 이러한 방식으로, '아날로그' RGB 시퀀스들을 스펙트럼 시그너쳐들의 '디지털' 시퀀스들로 번역하였다.
식별을 시험하기 위해, "정확한 코드"를 갖는 복수의 미세 입자들 및 상이한 "잘못된 코드"를 갖는 몇몇 미세 입자들을 생성하였으며, 이는 도 43에 도시된 바와 같다. 도 42와 관련하여 상기에 기재된 프로세스를 사용하는 자동화된 디코딩 시스템은, 발광 이미지들을 사용하여, 제공된 "인증 코드"와 매치되는 "정확한 코드"의 미세 입자들을, 제공된 인증 코드와 매치되지 않는 "잘못된 코드"의 미세 입자들로부터 정확하게 구별하였다. 도 43에서, 식별된 "잘못된 코드"의 이미지들은 이미지 둘레에 상자가 그려져 표시되어 있다.
예시적인 입자 합성 시스템과 관련하여 추가의 상세 사항들이 아래에 제공된다. 도 44는 입자 합성을 위한 플로우 리소그래피 및 디코딩 시스템을 도식적으로 나타내며, 상기 시스템은 플로우 리소그래피 현미경 구성, 디코딩 현미경 구성 및 분광계 구성을 포함한다. 도 45는 입자 합성을 위한 플로우 리소그래피 및 디코딩 시스템의 이미지이다. 플로우 리소그래피 현미경 구성은 UV LED 광원, 10배 대물렌즈(에드문드 옵틱스(Edmund optics)), CMOS 카메라, 2색성 케이지 큐브(cage cube), 2색성 미러, 케이지 큐브가 실장된 회전 프리즘 미러, XYZ 샘플 스테이지, 마스크 홀더, Ø1" 렌즈 튜브, XY 변환기, Ø1" 광학기용 고정밀 줌 하우징(zoom housing), 30㎜ 케이지, 포스트(post), LED 및 밸브 제어 계전기(이는 기기 제어 하드웨어 및 소프트웨어에 의해 제어됨), 카메라 어댑터 및 CCD 카메라를 포함한다. 디코딩 현미경 구성(setup)은 1W 980㎚ 레이저, 950㎚ 컷-온(cut-on) 필터, 시준기, CCD 카메라 어댑터 및 CCD 카메라를 포함한다. 분광계 구성은 분광계, 레이저 변환 스테이지, X,Y 변환 렌즈 마운트, NIR 무색성 이중 쌍(achromatic doublet pairs), 시준기, 950㎚ 컷-온 필터, 30㎜ 케이지 및 포스트를 포함한다.
본원에 기재된 다목적 고성능 스톱-플로우 리소그래피(SFL) 시스템 및 기술은 입자 합성을 위한 고속 대량 프로세스이다. 반연속 프로세스에서, 복수의 공동 유동하는 층상 스트림들 - 각각이 단일 광학 활성 UCN 모이어티 또는 프로브 분자를 함유한다 - 이 (예를 들어, 폴리(디메틸실록산)(PDMS)으로부터 또는 유기 용매와 함께 사용하기 위한 비-팽윤성 티올렌계 수지로부터 형성되는) 마이크로채널 내로 대류하고, 정지되고, 적소에서 마스크-패턴화 자외선 광(365㎚)을 통해 광중합되어 바코드 입자들이 시간당 18,000개 입자의 속도로 형성되고, 이어서 유동이 재개될 때 상기 입자들이 배출된다. 이러한 시간당 약 104개 입자의 속도는 결코 제한적이지 않으며; 수력학적 유동 집속을 이용하여 유사한 입자들에 대한 합성 속도를 시간당 105개 초과의 입자로 증가시켜 왔다. 합성 플랫폼은 또한 상업용 부품 및 자립식 광학기를 사용하여 구성될 수 있다. 산업 현장에서의 병행화는 추가의 최적화 없이 시설-규모의 합성 처리량을 몇몇 자릿수(orders of magnitude)만큼 용이하게 증가시켜 산업적 요구를 만족시킬 수 있을 것이다.
예시적인 양태들을 설명함에 있어서, 명확성을 위해 특정한 용어가 사용된다. 설명의 목적을 위해, 각각의 특정 용어는 유사한 목적을 달성하기 위해 유사한 방식으로 작용하는 모든 기술적 및 기능적 등가물들을 적어도 포함하는 것으로 의도된다. 추가로, 특정한 예시적 양태가 다수의 시스템 구성요소들, 장치 부품들 또는 방법 단계들을 포함하는 일부 경우, 이들 구성요소들, 부품들 또는 단계들은 단일 구성요소, 부품 또는 단계로 대체될 수 있다. 마찬가지로, 단일 구성요소, 부품 또는 단계는 동일 목적을 제공하는 다수의 구성요소들, 부품들 또는 단계들로 대체될 수 있다. 또한, 예시적인 양태들을 이들의 특정한 양태들과 관련하여 나타내고 설명하긴 하였지만, 당해 기술분야의 통상의 숙련가들은 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않으면서 형태 및 상세 사항에서 다양한 치환 및 변경이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 추가로, 다른 양상들, 기능들 및 장점들도 본 발명의 범위 내에 있다. 예시적인 순서도들이 설명의 목적으로 본원에 제공되며, 이들은 방법들의 비제한적인 예들이다. 당해 기술분야의 통상의 숙련가는, 예시적 방법들은 예시적인 순서도들에 나타난 것들보다 더 많거나 또는 더 적은 단계들을 포함할 수 있다는 것과, 예시적인 순서도들에서의 단계들은 예시된 순서도들에 나타난 순서와 상이한 순서로 수행될 수 있다는 것을 인지할 것이다.

Claims (31)

  1. 라벨링(labeling)을 위한 미세 입자로서,
    상기 미세 입자는
    중합체 물질을 포함하고 인코딩 영역을 포함하는 바디(body);
    상기 인코딩 영역의 제1 구획 내에 배치된 제1의 다수의 상향 변환(upconversion) 나노결정들(상기 제1의 다수의 상향 변환 나노결정들은 제1의 스펙트럼 시그너쳐(spectral signature)를 갖는다); 및
    상기 인코딩 영역의 상기 제1 구획으로부터 공간적으로 분리된 상기 인코딩 영역의 제2 구획 내에 배치된 제2의 다수의 상향 변환 나노결정들(상기 제2의 다수의 상향 변환 나노결정들은 제2의 스펙트럼 시그너쳐를 갖는다)
    을 포함하는,
    라벨링을 위한 미세 입자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제2의 스펙트럼 시그너쳐가 상기 제1의 스펙트럼 시그너쳐와는 상이한, 미세 입자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1의 다수의 상향 변환 나노결정들은 하나 이상의 희토류 원소들로 도핑된 제1의 물질을 포함하고, 상기 제2의 다수의 상향 변환 나노결정들은 하나 이상의 희토류 원소들로 도핑된 제2의 물질을 포함하는, 미세 입자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제1의 다수의 상향 변환 나노결정들은 상기 중합체 물질에 공유 결합되는, 미세 입자.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제1의 다수의 상향 변환 나노결정들은 입자 합성 시에 아크릴레이트 그룹을 통해 상기 중합체 물질에 결합되는, 미세 입자.
  6. 제1항에 있어서, 상기 제1의 다수의 상향 변환 나노결정들은 상기 제1 구획의 벌크(bulk) 전체에 걸쳐서 분포되는, 미세 입자.
  7. 제1항에 있어서, 상기 인코딩 영역의 각각의 구획에 대해, 상기 상향 변환 나노결정들이 응집 없이 분산되는, 미세 입자.
  8. 제1항에 있어서, 상기 인코딩 영역의 상기 제1 구획으로부터 공간적으로 분리되고 상기 인코딩 영역의 제2 구획으로부터 공간적으로 분리된 상기 인코딩 영역의 제3 구획 내에 배치된 제3의 다수의 상향 변환 나노결정들을 추가로 포함하고, 상기 제3의 다수의 상향 변환 나노결정들은 제3의 스펙트럼 시그너쳐를 갖는, 미세 입자.
  9. 제8항에 있어서, 상기 인코딩 영역의 상기 제1 구획으로부터 공간적으로 분리되고 상기 인코딩 영역의 제2 구획으로부터 공간적으로 분리되며 상기 인코딩 영역의 제3 구획으로부터 공간적으로 분리된 상기 인코딩 영역의 제4 구획 내에 배치된 제4의 다수의 상향 변환 나노결정들을 추가로 포함하고, 상기 제4의 다수의 상향 변환 나노결정들은 제4의 스펙트럼 시그너쳐를 갖는, 미세 입자.
  10. 제9항에 있어서, 상기 인코딩 영역이 적어도 6개의 상이한 구획들을 포함하는, 미세 입자.
  11. 제1항에 있어서, 상기 인코딩 영역의 적어도 하나의 구획은 나노결정들을 포함하지 않는, 미세 입자.
  12. 제1항에 있어서, 각각의 상기 스펙트럼 시그너쳐는 400 내지 800㎚ 범위 내의 복수의 별개 밴드들에서의 발광을 포함하는, 미세 입자.
  13. 제1항에 있어서, 상기 중합체 물질이 폴리우레탄 아크릴레이트(PUA)를 포함하는, 미세 입자.
  14. 제1항에 있어서, 상기 중합체 물질이 생체적합성(biocompatible)인, 미세 입자.
  15. 제1항에 있어서, 상기 중합체 물질이 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트(PEG-DA)를 포함하는, 미세 입자.
  16. 제1항에 있어서, 상기 상향 변환 나노결정들이 상자성인, 미세 입자.
  17. 제1항에 있어서, 상기 상향 변환 나노결정들 중 적어도 일부가 가돌리늄을 포함하는, 미세 입자.
  18. 라벨링을 위한 미세 입자의 제조 방법으로서,
    상기 방법은
    중합체 및 제1의 스펙트럼 시그너쳐를 갖는 제1의 다수의 상향 변환 나노결정들을 포함하는 제1의 인코딩 영역 공급원 물질을 제공하는 단계;
    중합체 및 상기 제1의 스펙트럼 시그너쳐와는 상이한 제2의 스펙트럼 시그너쳐를 갖는 제2의 다수의 상향 변환 나노결정들을 포함하는 제2의 인코딩 영역 공급원 물질을 제공하는 단계; 및
    상기 제1의 인코딩 영역 공급원 물질과의 가교결합으로 상기 미세 입자의 인코딩 영역의 제1 구획을 형성하고, 상기 제2의 인코딩 영역 공급원 물질과의 가교결합으로 상기 인코딩 영역의 제2 구획을 형성함으로써 이음매가 없는(contiguous) 미세 입자를 형성하는 단계
    를 포함하는,
    라벨링을 위한 미세 입자의 제조 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 제1의 인코딩 영역 공급원 물질과 상기 제2의 인코딩 영역 공급원 물질을 가교결합을 위한 소정의 영역으로 공동-유동(co-flowing)시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  20. 제18항에 있어서, 각각의 상기 제1의 다수의 상향 변환 나노결정들 및 각각의 상기 제2의 다수의 상향 변환 나노결정들이 친수성 표면을 갖는, 방법.
  21. 제18항에 있어서, 각각의 상기 제1의 다수의 상향 변환 나노결정들 및 각각의 상기 제2의 다수의 상향 변환 나노결정들이 친수성 리간드를 갖는, 방법.
  22. 제18항에 있어서, 각각의 상기 제1의 다수의 상향 변환 나노결정들 및 각각의 상기 제2의 다수의 상향 변환 나노결정들이 소수성 표면을 갖는, 방법.
  23. 제18항에 있어서, 각각의 상기 제1의 다수의 상향 변환 나노결정들 및 각각의 상기 제2의 다수의 상향 변환 나노결정들이 소수성 리간드를 갖는, 방법.
  24. 제18항에 있어서, 상기 제1의 다수의 상향 변환 나노결정들이 상기 미세 입자의 상기 인코딩 영역의 상기 제1 구획의 벌크 전체에 걸쳐서 분포되고, 상기 제2의 다수의 상향 변환 나노결정들이 상기 미세 입자의 상기 인코딩 영역의 상기 제2 구획의 벌크 전체에 걸쳐서 분포되는, 방법.
  25. 제18항에 있어서, 상기 방법이, 하이드로겔 및 상기 제1의 스펙트럼 시그너쳐와는 상이한 제3의 스펙트럼 시그너쳐를 갖는 제3의 다수의 상향 변환 나노결정들을 포함하는 제3의 인코딩 영역 공급원 물질을 제공하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 제3의 인코딩 영역 공급원 물질은 상기 미세 입자의 상기 인코딩 영역의 제3 구획을 형성하는, 방법.
  26. 제18항에 있어서, 상기 방법이, 하이드로겔 및 상기 제1의 스펙트럼 시그너쳐와는 상이한 제4의 스펙트럼 시그너쳐를 갖는 제4의 다수의 상향 변환 나노결정들을 포함하는 제4의 인코딩 영역 공급원 물질을 제공하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 제4의 인코딩 영역 공급원 물질은 상기 미세 입자의 상기 인코딩 영역의 제4 구획을 형성하는, 방법.
  27. 제18항에 있어서, 상기 제1의 다수의 상향 변환 나노결정들 및 상기 제2의 다수의 상향 변환 나노결정들을, 예상되는 제1의 스펙트럼 반응 시그너쳐를 예상되는 제2의 스펙트럼 반응 시그너쳐와 비교함으로써 선택하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 예상되는 제1의 스펙트럼 반응 시그너쳐는 상기 제1의 스펙트럼 시그너쳐와 이미지 센서의 스펙트럼 반응의 중첩 적분(convolution)이고, 상기 예상되는 제2의 스펙트럼 반응 시그너쳐는 상기 제2의 스펙트럼 시그너쳐와 상기 이미지 센서의 스펙트럼 반응의 중첩 적분인, 방법.
  28. 제18항에 있어서, 상기 제1의 인코딩 영역 공급원 물질을 제공하는 단계가 상기 제1의 다수의 상향 변환 나노결정들을 형성하는 단계를 포함하는, 방법.
  29. 제18항에 있어서, 상기 제1의 인코딩 영역 공급원 물질을 제공하는 단계가 각각의 상기 제1의 다수의 상향 변환 나노결정들의 표면을 개질시키는 단계를 포함하는, 방법.
  30. 제18항에 있어서, 상기 상향 변환 나노결정들이 상자성인, 방법.
  31. 삭제
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