DE10247014A1

DE10247014A1 - MHC-Multimere

Info

Publication number: DE10247014A1
Application number: DE2002147014
Authority: DE
Inventors: Volker Dr. Erfle; Dirk Busch; Horst Wolff
Original assignee: Erfle Volker Prof Priv-Doz Dr
Current assignee: Erfle Volker Prof Priv-Doz Dr
Priority date: 2002-10-09
Filing date: 2002-10-09
Publication date: 2004-04-22
Also published as: AU2003278063A1; WO2004033497A1

Abstract

Die Erfindung betrifft MHC-Multimer-Fusionsproteine, DNA, die für ein MHC-Fusionsprotein kodiert, sowie RNA, die nach Transkription ein MHC-Monomer-Fusionsprotein ergibt. Die Erfindung offenbart weiterhin die Verwendung eines DsRed-Proteins als Mittel zur Multimerisierung von MHC-Molekülen, Verfahren zur Herstellung von MHC und DsRed enthaltenden Fusionsproteinen und Verfahren zur Herstellung von MHC-Multimeren. Die Erfindung beschreibt weiterhin Verfahren zur Untersuchung einer Antigen-spezifischen zellulären Immunantwort, insbesondere zum Nachweis von T-Lymphozyten, die spezifische T-Zell-Rezeptoren auf ihrer Zelloberfläche tragen, Verwendungen der erfindungsgemäß hergestellten MHC-Monomere und -Multimere sowie Testsysteme, die die MHC-Monomere oder MHC-Multimere der Erfindung enthalten.

Description

Die Erfindung betrifft MHC-Multimer-Fusionsproteine, DNA, die für ein MHC-Fusionsprotein kodiert sowie RNA, die nach Transkription ein MHC-Monomer-Fusionsprotein ergibt. Die Erfindung offenbart weiterhin die Verwendung von Chromoproteinen als Mittel zur Multimerisierung von MHC-Molekülen, Verfahren zur Herstellung von MHC und Chromoprotein enthaltenden Fusionsproteinen und Verfahren zur Herstellung von MHC-Multimeren. Die Erfindung beschreibt weiterhin Verfahren zur Untersuchung einer Antigen-spezifischen zellulären Immunantwort, insbesondere zum Nachweis von T-Lymphozyten, die spezifische T-Zell-Rezeptoren auf ihrer Zelloberfläche tragen, Verwendungen der erfindungsgemäß hergestellten MHC-Monomere und -Multimere sowie Testsysteme, die die MHC-Monomere oder MHC-Multimere der Erfindung enthalten.

Das zelluläre Immunsystem erkennt Antigenstrukturen über Vermittlung durch Oberflächenmoleküle des "Major Histocompatibility Complex" (MHC). Antigen-präsentierende Zellen (APC) bereiten Antigene zu kurzen Peptiden auf, die nach Bindung in einer speziellen Pepid-Bindungsgrube des MHC-Moleküls präsentiert werden und so von T-Zellen erkannt werden können. Die spezifische Erkennung des Epitops (Peptidfragmentes) durch den 7-Zell-Rezeptor (TCR) erfordert dabei die gleichzeitige Interaktion mit dem MHC Molekül ("MHC-Restriktion").

Die Bindung von MHC/Peptid Komplexen am TCR ist durch eine sehr niedrige Affinität charakterisiert, insbesondere durch eine sehr schnelle Dissoziation (K^off) des MHC vom TCR. Von daher ist es nicht möglich, T-Zellen direkt über die Verwendung einer löslichen Form des natürlichen Liganden (z.B. als Fluoreszenz-markierten MHC/Peptid Komplex) in Abhängigkeit ihrer Epitop-Spezifität zu markieren. Durch die Multimerisierung von MHC/Peptid Komplexen zu z.B. MHC-Tetrameren ließ sich zeigen, daß die relative Avidität der Epitop-spezifischen Bindung an der 7-Zell-Oberfläche soweit erhöht werden kann, daß eine spezifische T-Zell-Markierung ermöglicht wird. Hierzu werden lösliche MHC-Moleküle in vitro generiert, spezifisch biotinyliert und über Fluoreszenz- markiertes Streptavidin zusammen mit beta- Mikroglobulin multimerisiert. Mit Hilfe solcher Reagentien kann die antigen-spezifische zelluläre Immunantwort im Tiermodell und direkt am Menschen sehr genau untersucht werden.

Die Herstellung von z.B. MHC-Tetramer-Reagenzien involviert eine Reihe komplexer biochemischer Reaktionen, wobei rekombinant exprimierte Proteine i.d.R. nach der Denaturierung korrekt in vitro gefaltet, biotinyliert und anschließend im richtigen molaren Verhältnis zur Multimerbildung gebracht werden müssen.

Gegenwärtig werden die meisten MHC-Tetramer-Reagenzien über ein sehr komplexes und aufwendiges Verfahren hergestellt. Zunächst werden MHC-Komponenten als rekombinante Proteine in E.coli exprimiert und aus inclusion bodies aufgereinigt. Nach Harnstoffdenaturierung werden die MHC-Anteile in der Gegenwart von beta-Mikroglobulin und von hohen Peptid/Epitop-Konzentrationen durch Verdünnung in einem Arginin-reichen Puffer mit Glutathion-Redoxsystem gefaltet und isoliert. In einem weiteren Schritt wird das rekombinante MHC biotinyliert und nach erneuter Aufreinigung über Streptavidin multimerisiert. Das für die Multimerisierung verwendete Streptavidin ist für den späteren optischen Nachweis mit Phycoerythrin markiert. Diese Fluoreszenz-gekoppelten MHC-Multimer Reagenzien können mit komplexen T-Zellgemischen inkubiert und so selektiv die MHC/Peptid-spezifischen Zellen innerhalb der Gesamtpopulation (z.B. per FACS-Analyse) bestimmt werden.

Die bestehende Technik der Herstellung von MHC-Multimer Reagenzien ist sehr aufwendig, empfindlich (z.B. die Effizienz der Biotinylierungsreaktion) und kosten-intensiv. Eine Vereinfachung des Herstellungsverfahrens z.B. über Expression einer DNS, die die notwendigen Komponenten wie MHC-Molekül, beta-Mikroglobulin, den Farbstoff sowie das Multimerisierungsmolekül zusammen enthält, würde den breiteren Einsatz dieser Methodik in der Grundlagenforschung wie auch im klinisch-diagnostischen Bereich wesentlich beschleunigen.

Es ist damit eine Aufgabe der Erfindung ein neues Mittel bereitzustellen, welches die Multimerisierung von MHC-Molekülen verbessert und die oben dargestellten Nachteile vermeidet.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das in Anspruch 1 näher beschriebene MHC-Multimerisierungsmittel gelöst. Bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen sowie den weiteren, unabhängigen Ansprüchen.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand einzelner Ausgestaltungen näher beschrieben. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese speziellen Ausführungsformen beschränkt, sondern der Umfang der Erfindung wird durch die Patentansprüche in Verbindung mit der Beschreibung definiert.

Erfindungsgemäß wird eine Multimerbildung, z.B. Tetramerbildung, von MHC-Molekülen unter Verwendung von Chromoproteinen durchgeführt, die zur Multimerisierung von MHC-Molekülen geeignet sind. Bei dem erfindungsgemäßen MHC Multimer handelt es sich um ein Multimer aus zwei oder mehreren, vorzugsweise vier MHC-Molekülen sowie einem Multimerisierungsmittel, wobei das Multimerisierungsmittel dadurch gekennzeichnet ist, daß es ein Chromoprotein ist, wobei DsRed1 oder DsRed als Multimerisierungsmittel ausgenommen sind.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Chromoprotein um ein Protein mit β-Barrel oder β-Can-artiger Struktur, die besonders gut zur Multimerisierung geeignet ist.

Besonders bevorzugt sind Chromoproteine, die aus Korallen gewonnen werden, wobei solche Chromoproteine beispielsweise aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus AmCyanl, ZsGreen1, ZsYellow1, DsRed2, DsRed-Express, AsRed2, HcRed1 besteht. Die Struktur der vorgenannten Proteine ist an sich bekannt, und sie können beispielsweise von CLONTECH^R in rekombinanter Form bezogen werden. Weitere Informationen sind in der veröffentlichten Broschüre „BC Living Colors RCFP Licensing Program von BD Biosciences – Clontech" zu finden.

Die vorgenannten fluoreszierenden Proteine wurden aus Riff-Korallen der Klasse Anthozoa gewonnen und wurden bereits als Reporter eingesetzt und weisen viele Vorteile auf. Beispielsweise sind sie physikochemisch ausgesprochen stabil, tolerieren beträchtliche Änderungen des pHs und können die Einwirkungen üblicher denaturierender Mittel ohne Verlust der Fluoreszenzeigenschaft überstehen. Sie sind extrem vielseitig, emittieren eine starke, sichtbare Fluoreszenz in einer Vielzahl von Zelltypen und Medien. Sie zeigen eine ausgezeichnete Fotostabilität, was es ermöglichst, die Fluoreszenz über lange Zeitspannen hinweg zu überwachen. Abhängig vom Protein bewegt sich die Fluoreszenz von 489 nm bis 618 nm (siehe Tabelle 1). Die oben erwähnten fluoreszierenden Proteine werden von Säugetierzellen gut toleriert und sogar nach 14 Tagen einer konstitutiven Expression bleibt bei einem hohen Prozentsatz von Zellen eine Fluoreszenz erhalten. Die oben genannten Protelne haben sich als zur Erzeugung von stabil transfizierten Zelllinien und transgenen Organismen brauchbar erwiesen.

Überraschend und unerwartet wurde von den Erfindern nunmehr festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Multimerisierungsmittel auch zur Multimerisierung von MHC-Molekülen und gleichzeitig für den späteren optischen Nachweis des Mittels herangezogen werden können. Weder die Bindung des Antigen-spezifischen Peptids an MHC-Moleküle noch die Bindung des MHC-Multimers an die T-Zell-Rezeptoren einer T-Zelle wird durch die erfindungsgemäße Multimerisierung gestört oder nachteilig beeinflußt. Insbesondere kann durch die Chromoprotein vermittelte Multimerisierung die Multimer-Herstellung wesentlich vereinfacht, beschleunigt und kostengünstig effizienter gestaltet werden, ohne die Funktionalität zu behindern. Der Nachweis der Chromoproteine, insbesondere der oben genannten fluoreszierenden Proteine, erfolgt durch fluoreszenzdetektierende Verfahren in an sich bekannter Weise, wie es im Stand der Technik beispielsweise in den von den CLONTECH^R Laboratories, Inc. veröffentlichten Protokollen dargestellt wird (CLONTECHniques XIV (4): 2 – 6). Dazu gehören neben FACS-analysen auch Fluoreszenzmikroskopie und fluoreszenzbasierende Scanningverfahren (z.B. Fluorimager von Molecular Dynamics).

Erfindungsgemäß können sowohl MHC-Klasse I als auch MHC-Klasse II -Moleküle multimerisiert werden. Der Begriff „Multimer", wie er hierin definiert ist, bedeutet vorzugsweise Di mere oder Tetramere, wobei die genaue Ausbildung des Multimers von der Auswahl des speziellen Multimerisierungsmittels abhängt.

Beispiele für einsetzbare Histokompatibilitätsantigene sind MHC-Klasse I-Antigene, beispielsweise HLA-A (zum Beispiel A1, A2, A3, A11, A24, A31, A33 und A38), HLA-B und HLA-C, MHC-Klasse II-Antigene, beispielsweise HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DX, HLA-DO, HLA-DZ und HLA-DP.

Z.B. sind MHC-Tetramere Komplexe aus vier MHC-Molekülen, die mit einem spezifischen Peptid assoziiert sein können und durch ihre Bindung an ein Fluorochrom nachweisbar sind. Diese Komplexe binden eine spezielle Gruppe von T-Zell-Rezeptoren auf CD8⁺-T-Zellen. Bei Vermischung der so erhaltenen Tetramere mit PBLs oder Gesamtblut und Nachweis zur Verwendung durchflusszytometrischer Verfahren kann die Menge aller T-Zellen, die für ein Peptid spezifisch sind und das damit verbundene Allel analysiert werden. Es ist also möglich, die zelluläre Immunantwort gegen ein spezifisches Peptid zu bestimmen.

MHC-Multimere gemäß der Erfindung können beispielsweise eingesetzt werden, um die zelluläre Immunantwort unter nachfolgenden Bedingungen zu studieren:

1. Bei allen Virusinfektionen, beispielsweise HIV, HBV, CMV, HPV, HBV, HCV, Influenza und Masern und viele anderen.
2. Bakterielle Infektionen
3. Parasiteninfektionen, beispielsweise Malaria.
4. Tumoren, einschließlich Brust-Prostata, Melanom-, Colon-, Lungen- und Cervixtumoren.
5. Autoimmunitätserkrankungen einschließlich Mutiplesklerose, Diabetes, Rheumatoide Arthritis usw.
6. Allergische Erkrankungen wie Asthma bronchiale, Neurodennitis usw.

Durch die Multimer-Technologie ist es möglich, individuelle T-Zellen auf Grundlage der Spezifität der Bindung an den MHC-Peptid-Komplex zu identifizieren. Aufgrund der Spezifität der Multimere bieten sich folgende Vorteile:

– Das Verfahren ist quantitativ;
– Es sind keine radioaktive Markierungen einzusetzen;
– Das Verfahren arbeitet schnell, so daß auch frische Blutproben oder Gewebekulturproben analysierbar sind, und große Probenmengen verarbeitet werden können;
– Durch die Verwendung eines Durchflusszytometers können die Zellen nicht nur mit dem Multimer-Fluorochromen der vorliegenden Erfindung, sondern auch mit anderen Zelloberflächenmarkern zur gleichen Zeit markiert werden;
– Es können einheitliche Subpopulationen durch die Durchflusszytometrie sortiert werden und im Wege weiterer Testsysteme auf ihre Funktionalität überprüft werden;
– Spezifische T-Zellen können aus Blutproben ohne vorherige in vitro-Kultur analysiert werden;
– Spezifische T-Zellen können aus Blutproben isoliert und dem Patienten zur Therapie zurückgegeben werden;
– Alle spezifischen T-Zellen sind nachweisbar, unabhängig von ihrem funktionellem Status, wie z.B. zytotoxische T-Zellen, T-Helferzellen usw.

Ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht in der Möglichkeit der gentechnischen Erzeugung von Multimeren in einem einzigen Schritt. Dadurch werden die im Stand der Technik bestehenden Nachteile, d.h. eine Mulimerisierung mit Hilfe der Komponenten Avidin und Streptavidin vermieden. Ein beispielhaftes Genkonstrukt zur Expression des erfindungsgemäßen Fusionsproteins, das zur Herstellung der Multimeren dient umfaßt beispielsweise ein wie in 2 dargestelltes Konstrukt, bestehend aus einem Promotor, dem das jeweilige Chromoprotein kodierenden DNA-Abschnitt, einem Linker, einem MHC kodierenden Bereich und ggf. weiteren über einen Linker angebundenen kodierenden Bereichen wie vorzugsweise einen für β-Mikroglobulin kodierenden Bereich etc.

Ausgangspunkt der Erfindung ist die Herstellung eines Fusionsproteins aus einem für ein MHC-Protein kodierenden Gen und aus einem für ein erfindungsgemäßes Chromoprotein kodierenden Gen. Hierzu werden bevorzugt beim MHC-Molekül die Transmembran-Anteile und die zytosolischen Anteile entfernt, um eine lösliche Form des MHC-Moleküls zu erhalten. Der MHC-Anteil und der Chromoprotein-Anteil werden bevorzugt durch ein Linkermolekül miteinander verknüpft. Das nach Entfernung der transmembranen und zytosolischen Anteile erhaltene trunkierte MHC-Molekül wird dann über das Linker-Molekül an den N-Terminus des Chromoproteins gekoppelt.

Es ist insbesondere darauf zu achten, daß durch das Einfügen des Linker-Moleküls die Multimerbildung über den Chromoproteinanteil nicht behindert wird. Besonders bevorzugt wird ein Aminosäurelinker verwendet. Ein Beispiel für einen flexiblen Aminosäurenlinker ist ein Derivat des lacZ-Alpha-Peptids [angegeben im „single letter code": MASSG GTGGS GGTGG SGGGG ASPSL VPSSD PLVTA ASVLE FALAG AQE] oder der synthetische flexible Linker Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Thr[Gly Gly Ser Gly Gly Thr]₃, der zwischen den beiden Proteinanteilen des Fusionsproteins MHC und dem Chromoprotein eingefügt wird und die Multimerisierung sterisch nicht behindert.

Selbstverständlich stehen dem Fachmann auch andere Aminosäurelinker zur Verfügung. Entsprechende Techniken sind bekannt. Es ist aber auch möglich, die Proteine selbst durch beispielsweise peptidchemische Bindungen über Crosslinker oder ähnliche Verfahren miteinander zu verbinden. Beispielsweise sei auf Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Gold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), 1989 und Ansubel F.M. et al., 1994, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, NY) und nachfolgende Auflagen hingewiesen.

In einer bevorzugten Ausgestaltungsform der Erfindung kann auch eine Variante des Aminosäurelinkers eingesetzt werden, die zumindest eine Erkennungssequenz für eine Protease enthält, beispielsweise den Faktor Xa. Hierdurch wird eine vereinfachte Abspaltung der MHC-Moleküle vom Chromoproteinmultimer ermöglicht.

Folgende weitere Varianten des Linkers zwischen MHC und dem Chromoprotein können im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendet werden:
lacZα-Linker:
E Q A G A L A F E L V S A A T V L P D S S P V L S

Standard-Serin-Glycin-Linker:
S G G S S G G G

Extrem langer Standard-Linker:
S S S G G G S S G G S S G G G

Die erfindungsgemäß hergestellten rekombinanten MHC-Chromoprotein-DNA-Moleküle können in an sich bekannter Weise in rekombinanter Form in Expressionsplasmiden kloniert und in prokaryonten Zellen, bevorzugt E.coli-Zellen, oder in eukaryonten Zellen, beispielsweise Hefezellen oder etablierten menschlichen Zellen, exprimiert werden. Geeignete Techniken stehen auf diesem Fachgebiet zur Verfügung, und es wird hier wiederum auf die oben genannten Laborhandbücher verwiesen. Die erhaltenen rekombinanten monomeren Chromoprotein-MHC-Proteinmoleküle werden durch an sich bekannte Verfahren aufgereinigt und können dann in vitro oder in vivo multimerisiert werden.

Zur Multimerisierung werden die löslichen Versionen der MHC-Chromoprotein-Moleküle, wahlweise, insbesondere bei MHC-I, in Kombination mit beta₂-Mikroglobulin, zur Multimerisierung gebracht. Die Multimerisierung findet bevorzugt in Gegenwart des Antigenspezifischen Peptids statt. Die Ausbildung von Multimeren ist eine den erfindungsgemäßen Chromo-Proteinen inne wohnende Eigenschaft und es bedarf nicht mehr der aus dem Stand der Technik bekannten komplizierten, zeitraubenden Methoden wie Biotinylierungen, Streptavidin-Bindungen sowie Fluorochrom-Kopplungsreaktionen, um die Multimerbildung und die Fluoreszenzentwicklung zu gewährleisten. Bei der Erfindung wirkt das eingesetzte Chromo-Protein sowohl als Multimerisierungsagens als auch als fluoreszierendes Mittel.

Die erfindungsgemäßen Chromo-Proteine können selbstverständlich durch an sich bekannte Methoden abgeändert werden, um beispielsweise die Multimerisierung, die Bindung an das MHC-Molekül und/oder die Fluoreszenz- bzw. Farbaktivität zu verbessern. Üblicherweise werden für derartige Mutagenisierungen zufallsgenerierte Mutanten auf ihre neuen Charakteristika ausgetestet, oder es wird in gezielter Weise nach Strukturuntersuchungen eine Mutagenisierung des Chromoproteins vorgenommen, um seine Aktivitäten zu verbessern.

Zusammenfassend ist der Begriff „Chromoprotein" oder „rekombinantes Chromoprotein" nicht auf ein spezielles Protein beschränkt, sondern umfasst alle Varianten und Derivate dieser Proteinsequenzen, die dessen Funktion im Rahmen der vorliegenden Erfindung erfüllen können, d.h. zur Multimerisierung von MHC-Molekülen sowie zum optischen Nachweis geeignet sind. Bevorzugte Beispiele sind oben angegeben, wobei diese selbstverständlich nicht isoliert betrachtet werden sollen, sondern jederzeit auch Kombinationen der einzelnen Veränderungen zur Erzielung eines vorteilhaften Chromoproteins vom Begriff „Chromoprotein" oder „rekombinantes Chromoprotein" mit umfasst sind.

Modifikationen der Sequenzen, wie beispielsweise Deletionen, Insertionen oder Substitutionen in der Sequenz, die im sich ergebenden Protein-Molekül sogenannte "stille" Veränderungen (silent changes) erzeugen, werden ebenfalls als innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung liegend betrachtet.

Vorzugsweise sind derartige Aminosäure-Substitutionen das Ergebnis der Ersetzung einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen strukturellen und/oder chemischen Eigenschaften, d.h. konservative Aminosäureersetzungen. Aminosäuresubstitutionen können auf Grundlage der Ähnlichkeit in der Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobie, Hydrophilie, und/oder der amphipatischen (amphiphilen) Natur der involvierten Reste vorgenommen werden. Beispiele für unpolare (hydrophobe) Aminosäuren sind Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Polare neutrale Aminosäuren schließen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Thyrosin, Asparagin und Glutamin ein. Positiv geladene (basische) Aminosäuren schließen Arginin, Lysin und Histidin ein. Und negativ geladene (saure) Aminosäuren schließen Asparaginsäure und Glutaminsäure ein.

"Insertionen" oder "Deletionen" bewegen sich typischerweise im Bereich von ein bis fünf Aminosäuren. Der erlaubte Variationsgrad kann experimentell durch systematisch vorgenommene Insertionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäuren in einem Polypeptidmolekül unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken und durch Untersuchen der sich ergebenden rekombinanten Varianten bezüglich ihrer biologischen Aktivität ermittelt werden.

Daraus ergibt sich, daß, wo der Begriff "Chromoprotein" entweder in der Beschreibung oder in den Ansprüchen verwendet wird, er alle derartigen Modifikationen und Varianten umfaßt, die ein biologisch äquivalentes Chromoprotein zur Folge haben. So kann eine erfindungsgemäßes Chromoprotein auch lediglich aus einer Multimerisierungsdomäne und einer Farbstoffdomäne bestehen.

Die erfindungsgemäß ausgebildeten Multimere, z.B. Tetramere, werden mit der zu analysierenden Zellpopulation gemischt. Unter Zellpopulation versteht man insbesondere PBMC-Populationen (periphere Blut mononukleäre Zellen) oder T-Lymphozyten (T-Zellen). Nur T-Zellen mit T-Zell-Rezeptoren, die zur Bindung an die spezielle MHC-Peptid-Kombination, die im Tetramer vorliegt, befähigt sind, können an das Tetramer bilden. Derartige Zellen werden durch das Chromoprotein markiert. Selbstverständlich können auch weitere Fluoreszenzmarkierungen zusätzlich zum Chromoprotein eingesetzt werden. Beispielsweise kann ein für einen T-Zell-Marker spezifischer monoklonaler Antikörper in Kombination mit einem unterschiedlichen Fluorochrom, beispielsweise FITC, eingesetzt werden. Die Zellen können dann unter Verwendung eines Durchflusszytometrieverfahrens analysiert werden. Der Anteil der CD8⁺ T-Zell-Population, die mit Hilfe des Tetramers positiv gefärbt wurde, wird bestimmt. Mit Hilfe von Fluoreszenznachweisverfahren, beispielsweise der Durchflusszytometrie, können die MHC-Tetramer-T-Zell-Komplexe auch sortiert werden und Beispielsweise die so erkannten T-Zellen in einen Patienten appliziert werden.

In einer weiteren Ausgestaltungsform der Erfindung liegen die MHC-Monomere oder -Multimere, z.B. Tetramere, in einem Testsystem vor, das in Form eines Kits angeboten werden kann.

Der Lösungsansatz der Erfindung reduziert die zur Herstellung von MHC-Multimer-Reagenzien benötigten Komponenten (2 MHC-Ketten [z.B. MHC-I: schwere Kette und beta-2-Mikroglobulin, MHC-II: alpha und beta Kette], d-Biotin, Peptid, Streptavidin-PE) auf 4 (MHC-linker-Chromoprotein-Fusionsprotein, 2: MHC-Kette und das jeweilige MHC-bindende Peptid/Epitop). Außerdem wird die hohe Anzahl der benötigten Reaktionsabläufe (Extraktion von rekombinanten MHC Anteilen, in vitro Faltung in Gegenwart des Peptides, Biotinylierung, chromatographische Aufreinigung, Multimerisierung unter Zugabe von Streptavidin-PE, weitere Reinigung über Molekularsiebchromatographie) auf z. B. 3 (Extraktion von rekombinantem HLA-linker-Chromoprotein, Refolding in Anwesenheit des Peptids und anschließende Aufreinigung) reduziert. Alleine die Reduktion der Anzahl der notwendigen Aufreinigungsschritte, welche immer mit starken Verlusten verbunden sind, steigert die Gesamtausbeute an Reagenz deutlich. Außerdem ist der generierte MHC-Multimer Komplex relativ klein und sehr viel stabiler, wodurch Vorteile gegenüber bisher verwendeten Reagenzien entstehen. Außerdem sind diese Fusionsproteine gegenüber den klassischen MHC-Tetrameren bei Lagerung in gefrorenem Zustand stabiler und können als ein Protein (eine Komponente) gelagert werden, im Gegensatz zu den klassischen MHC-Multimeren, die als zwei Komponenten getrennt gefroren gelagert werden müssen.

Aus den vorgenannten Gründen ergeben sich folgende Möglichkeiten für in vivo Applikationen von Chromoprotein-MHC Multimeren:

Konventionelle MHC-Multimer Reagenzien werden – wie oben dargestellt – i.d.R. mit Hilfe von Avidin oder Streptavidin hergestellt. Avidin bzw. Streptavidin hat allerdings nach intravenöser Applikation eine sehr kurze in vivo Halbwertszeit, was insbesondere durch eine schnelle Aufnahme in der Leber bedingt ist. Entsprechend ist auch die in vivo Halbwertszeit konventioneller MHC-Multimer-Reagenzien nur sehr kurz. Für die erfindungsgemäßen Chromoprotein-MHC-Multimere wird eine deutlich längere in vivo Halbwertszeit erwartet; dazu ist der Farbstoff selber sehr resistent gegenüber schädigenden bzw. degradierenden in vivo Einflüssen. In vivo Anwendungen mit MHC-Multimeren sind von Bedeutung für grundlagenwissenschaftliche Fragestellungen (z.B. in vivo Färbung antigen-spezifischer T-Zellen und nachfolgende Detektion im Gewebeschnitt, antigen-spezifische Immunsierung bzw. Toleranz-Induktion) als auch klinische Anwendungen (antigen-spezifische Immunsierung bzw. Toleranz-Induktion, Konjugation der Reagenzien mit immunmodulatorischen Substanzen bzw. Tracern).

Die vorliegende Erfindung wird nunmehr anhand von Beispielen und den beigefügten Abbildungen verdeutlicht, die Folgendes zeigen:

1.: Schematische Darstellung einer MHC-HcRed1 Expressions-Kassette im Vektor pet3a.

Dieses Konstrukt ist beispielhaft für verschiedene weitere Varianten. Die einzelnen Bestandteile sind in verschiedenen Farben markiert. Blau: Promotor bzw. Terminator für die überexpression in E.coli. Rot: Leserahmen für eine Mutante des HcRed1-Proteins. Grau: Leserahmen für die schwere Kette des MHC-Proteins. Grün: Fusionsprotein aus MHC und HcRed1. Cyan: Linkerregion, in diesem Fall repräsentiert durch ein Peptid dass zugleich ein Epitop-Tag darstellt. Zu beachten ist, dass der Leserahmen für HcRed1 kein internes Startcodon enthält und somit praktisch nur Fusionsprotein der vollen Länge exprimiert werden kann.

2.: Schematische Darstellung der wesentlichen Bestandteile einer weiteren MHC-HcRed1 Expressions-Kassette.

Diese besitzt im Gegensatz zum Konstrukt aus 1 kein Epitop-Tag als Linkerpeptid sondern einen Linker der sich aus mehreren Serinen und Glycinen zusammensetzt. Die Flexibilität des Linkers und die Beweglichkeit der miteinander verbundenen Proteine ist in diesem Fall wahrscheinlich deutlich höher.

3.: MHC-Protein (Schwerekette und β₂-Mikroglobulin).

Links ist die Darstellung gemäss der Sekundärstruktur des Proteins zu sehen, wie sie später auch in den 5 und 6 der Fusionsproteine verwendet wird (Helikale Strukturen in rot, β-Faltblätter in blau, unstrukturierte Regionen und Turns in weiss). Rechts zur Verdeutlichung die gesonderte Darstellung von schwerer Kette (in grün) und β₂-Mikroglobulin (in purpur).

4.: Räumliche Darstellung eines MHC-Chromoprotein-Tetramers.

Die einzelnen Ketten des Homo-Tetramers sind in den Farben Orange, Rot, Grün und Cyan dargestellt. Rechts ist eine Seitenansicht, links eine Aufsicht auf das Tetramer zu sehen. Deutlich zu erkennen ist die symmetrische und kompakte Anordnung des Tetramers, die es zur beabsichtigten Anwendung befähigt. Diese Abbildung ist für die erfindungsgemäßen Multimere, insbesondere Tetramere, beispielhaft.

5.: MHC- Chromoprotein Tetramer

Der MHC-Tetramer-Verband wurde gemäss den Erläuterungen von 4 dargestellt. Der C-Terminus jeweils eines MHC-Proteins wurde computerunterstützt an den N-Terminus einer Untereinheit des Chromoprotein-Tetramers angefügt. Die Darstellung zeigt nur eine mögliche Anordnung der MHC-Moleküle im Raum, die durch den flexiblen Peptidlinker einen Bewegunsspielraum erhalten. Diese Ansicht zeigt das Chromoprotein-Tetramer von der Seite

6.: MHC- Chromoprotein Tetramer

Erläuterungen wie bei 5. Diese Ansicht zeigt das Chromoprotein-Tetramer von oben.

7.: MHC-DsRed-Fusionsprotein exprimierende Bakterien-Kolonien.

BL21 (DE3) Bakterien wurden mit pET3a/H2-K^d-DsRed transformiert und auf Ampicillinhaltiger Agarose kultiviert. Zu erkennen sind einzelne Bakterien-Kolonien mit tiefroter Farbe. Die rote Farbe kommt durch den DsRed-Anteil des rekombinant exprimierten Fusionsproteins.

8.: Rekombinante Expression von MHC-DsRed-Fusionsprotein

BL21 (DE3) Bakterien wurden mit pET3a/H2-K^d-DsRed transformiert. Nach Wachstum in Flüssigkultur (LB, 100μg/m1 auf Carbenicillin) wurde bei OD₆₀₀ von ca. 0.8 ein Aliquot entnommen („Nullwert"), der Rest wurde für 3 weitere Stunden in Gegenwart von IPTG (0.4 mM) inkubiert. Proben von „Nullwert" und „3 h" wurden anschließen gewaschen, in dH₂O lysiert, in Proteingel-Probenpuffer aufgekocht, und nachfolgend über SDS-PAGE aufgetrennt. Die Abbildung zeigt ein Proteingel nach Coomassie-Färbung von zwei verschiedenen Kulturen (links MHC-Fusionsprotein mit „Wildtyp" DsRed bzw. rechts mit einer DsRed-Mutante zur Optimierung der Faltungseigenschaften). Man beachte die deutliche zusätzliche Bande nach 3 h IPTG Induktion bei ca. 65 kD, die dem rekombinanten Fusionsprotein entspricht.

9: Anregungs- und Emissionsspektren von AmCyan, ZsGreen, ZsYellow, DsRed2, AsRed2, und HcRed.

Beispiele:

Aufgrund der hervorragenden Fluoreszenz-und Tetramerisierungseigenschaften in verschiedenen Versuchen wurden Experimente durchgeführt, um die Ausbildung von MHC-Multimeren durch die Fusion an die erfindungsgemäßen Chromoproteine zu erreichen.

Klonierung der Expressionskonstrukte:

Alle Expressionskonstrukte wurden durch Standard-Klonierungsmethoden erzeugt, ausgehend von den von Clontech erhältlichen Vektoren, die für AmCyan1, ZsGreen1, ZsYellow1, DsRed2, DsRed-Express, AsRed2, HcRed1 kodieren und die als PCR-Template fur alle weiteren Varianten dieser Proteine dienten. Die Erfindung wird im Folgenden anhand des Chromoproteins HcRed1 veranschaulicht.

Als Expressionsvektor des vollständigen Konstrukts und als Quelle des MHC-Proteins wurde der Vektor pET3a/H2-K^d verwendet. Mittels verschiedener Klonierungsstrategien, die die bereits vorhandene Restriktionsschnittstellen im Zielvektor pET3a/H2-K^d nutzten, wurden die für diverse Varianten der oben genannten Chromoproteine kodierende DNA eingefügt. Auf diese Weise wurden Vektoren erzeugt (wie z.B. pET3a/H2-K^d-HcRed1), die unter der Kontrolle des T7-Promotors ein Fusionsprotein aus MHC und einer HcRed1-Variante enthielten, die über unterschiedliche Linkerpeptide miteinander verknüpft waren (siehe 1 und 2).

Als Translationsstart war dabei nur das Start-ATG des MHC-Proteins vorhanden, aber kein internes Start-Codon am Linker oder am HcRed1. Die Expression verkürzter Proteine kann dadurch weitgehend ausgeschlossen werden.

Folgende Sequenz aus dem Vektor pET3a/H2-K^d-SSGGlinkHcRed1 zeigt beispielhaft die Abfolge der Aminosäuren der letzten 12 AS des MHC-Moleküls und der ersten 12 AS einer HcRed1-Variante (in kursiv). Dazwischen befindet sich ein verwendetes Linkerpeptid (in fett gedruckt).
KLPPSTVSNTAS G G S S G G G VSGLLKESMRIK

Die nächste Sequenz, die aus dem Vektor pET3a/H2-K^d-directHcRed1 stammt, zeigt wieder die Abfolge der Aminosäuren der letzten 12 AS des MHC-Moleküls und der ersten 12 AS einer HcRed-Variante (in kursiv). Dazwischen befindet sich ein Epitop-Tag, der als Linker fungieren kann und der ausserdem über seine Fähigkeit, spezifische Antikörper zu binden, nachgewiesen werden kann (in fett gedruckt).
KLPPSTVSNTAS Q P E L A P E D P E D G G H D SSYSGLLKESMR

Für eine detaillierte Darstellung der MHC-HcRed1-Expressionskassette wird auf l und 2 verwiesen. HcRed1-MHC-Fusionsproteine wurden in pET3a (Novagen) Vektoren kloniert und anschließend in die Expressionsbakterien BL21(DE3) transformiert. Auch ohne gezielte Expressionsinduktion kann in diesem System eine geringe Generierung des rekombinanten Proteins beobachtet werden. Die Herstellung großer Mengen an rekombinanten MHC-HcRed1 Fusionproteinen konnte sowohl unter Verwendung der Originalsequenz von HcRed1, als auch unter Verwendung von HcRed1-Mutanten erreicht werden. Rekombinante MHC Klasse-I Moleküle werden i.d.R. durch in vitro Rückfaltung der in „inclusion bodies" exprimierten und aufgereinigten Teilkomponenten (Schwerekette und β₂-Mikroglobulin) in Gegenwart hoher Konzentrationen des jeweiligen MHC-bindenen Peptids (Epitop) hergestellt. Exprimiert man HcRed1 in gleicher weise in „inclusion bodies" und führt eine identische Aufreinigung und Rückfaltung in vitro durch, so erhält man ein farbgebendes Protein, daß alle Charakteristika von korrekt gefaltetem HcRed1-Fluoreszenzprotein hat.

Zusammengefaßt zeigen diese Daten, daß zwei wesentliche Grundvoraussetzungen für den erfolgreiche Einsatz von HcRed1-MHC Multimeren gegeben sind:

(1) Große Mengen an MHC-HcRed1-Fusionsprotein können im bakteriellen Expressionssystem hergestellt werden; dabei zeigt sich bereits bei in vivo Expression die „Funktionalität" des HcRed1-Anteils im Fusionsprotein durch die typische farbgebende Charakteristik.
(2) HcRed1-Fluoreszenzprotein kann unter den für die Herstellung von löslichen MHC-Molekülen optimierten Bedingungen aus „inclusion bodies" generiert werden.

Tabelle 1:

SEQUENCE LISTING

Claims

MHC-Multimer, enthaltend zwei oder mehrere MHC-Moleküle sowie ein Multimerisierungsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß das Multimerisierungsmittel ein Chromoprotein ist, wobei DsRedl als Multimerisierungsmittel ausgenommen ist.
MHC-Multimer nach Anspruch 1, wobei das Chromoprotein eine β-Barrel- oder β-Canartige Struktur aufweist.
MHC-Multimer nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Chromoprotein aus Korallen gewonnen wird.
MHC-Multimer nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-3, wobei das Chromoprotein aus AmCyanl, ZsGreen1, ZsYellow1, DsRed2, DsRed-Express, AsRed2, HcRed1 ausgewählt ist.
MHC-Multimer nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-4, wobei das Multimerisierungsmittel ein rekombinantes Chromoprotein ist.
MHC-Multimer nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Chromoprotein über ein Linkermolekül an das MHC-Protein gekoppelt ist.
MHC-Multimer nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Linkermolekül aus mehreren Aminosäuren besteht.
MHC-Multimer nach Anspruch 7, wobei der Linker aus einer Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1-8 ausgewählt ist.
MHC-Multimer nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Linkermolekül so ausgestaltet ist, daß eine Abspaltung der MHC-Moleküle vom Chromoprotein ermöglicht wird.
MHC-Multimer nach Anspruch 7-9, dadurch gekennzeichnet, daß das Linkermolekül eine Erkennungssequenz für eine Protease enthält.
MHC-Multimer nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das MHC-Molekül trunkiert ist.
MHC-Multimer nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das MHC-Molekül durch Deletion des Transmembran- und/oder des Cytosolanteils trunkiert ist.
MHC-Multimer nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es in Form eines Epitop-spezifischen Chromoprotein-MHC-Peptid-Komplexes, wahlweise in Verbindung mit einem T-Zell-Rezeptor, vorliegt.
MHC-Multimer nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das MHC-Molekül ein Säuger, bevorzugt Maus- oder Human-MHC -Molekül ist.
MHC-Multimer nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich ein oder mehrere β-Mikroglobulin-Moleküle enthält.
MHC-Monomer-Fusionsprotein, dadurch gekennzeichnet, daß es in Verbindung mit einem zur Multimerisierung geeigneten Chromoprotein, wahlweise verbunden über ein Linkermolekül, vorliegt, wobei DsRed1 als Multimerisierungsmittel ausgenommen ist.
Fusionsprotein nach Anspruch 16, wobei das Chromoprotein eine β-Barrel- oder β-Canartige Struktur aufweist.
Fusionsprotein nach Anspruch 16 oder 17, wobei das Chromoprotein aus Korallen gewonnen wird.
Fusionsprotein nach einem oder mehreren der Ansprüche 16-18, wobei das Chromoprotein aus AmCyanl, ZsGreen1, ZsYellow1, DsRed2, DsRed-Express, AsRed2, HcRed1 ausgewählt ist.
Fusionsprotein nach einem oder mehreren der Ansprüche 16-19, wobei das MHC-Molekül trunkiert ist.
Fusionsprotein nach Anspruch 20, wobei das MHC-Molekül durch Deletion des Transmembran und/oder des Zytosolanteils trunkiert ist.
Fusionsprotein nach einem oder mehreren der Ansprüche 16-21, das zusätzlich ein oder mehrere β-Mikroglobulin-Moleküle enthält.
DNA, die für ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüch 16-22 kodiert.
RNA, die nach Transkription ein Fusionsprotein nach Anspruch 16-23 ergibt.
Prokaryontenzelle oder Eukaryontenzelle, enthaltend eine DNA oder RNA nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche.
Verwendung eines Chromoproteins als Mittel zur Multimerisierung von MHC-Molekülen, wobei die Verwendung von DsRedl ausgenommen ist.
Verwendung nach Anspruch 26, wobei das Chromoprotein eine β-Barrel- oder β-Can-artige Struktur aufweist.
Verwendung nach Anspruch 26 oder 27, wobei das Chromoprotein aus Korallen gewonnen wird.
Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 26-28, wobei das Chromoprotein aus AmCyanl, ZsGreen1, ZsYellow1, DsRed2, DsRed-Express, AsRed2, HcRed1 ausgewählt ist.
Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins nach Anspruch 16-22, dadurch gekennzeichnet, daß a) eine für ein MHC-Protein kodierende DNA, wahlweise über einen Linker, mit einer für ein Chromoprotein kodierenden DNA zu einer für ein Fusionsprotein kodierenden DNA verbunden und das Fusionsprotein exprimiert wird; oder ein MHC-Protein, wahlweise über einen Linker, mit einem Chromoprotein zu einem Fusionsprotein verbunden wird; b) das Fusionsprotein wahlweise aufgereinigt wird.
Verfahren zur Herstellung eines MHC-Multimeren, dadurch gekennzeichnet, daß a) eine für ein MHC-Protein kodierende DNA, wahlweise über einen Linker, mit einer für ein Chromoprotein kodierenden DNA zu einer für ein Fusionsprotein kodierenden DNA verbunden und das Fusionsprotein exprimiert wird; oder ein MHC-Protein, wahlweise über einen Linker, mit einem Chromoprotein zu einem Fusionsprotein verbunden wird; b) das Fusionsprotein wahlweise aufgereinigt wird; c) das MHC-Fusionsprotein, wahlweise in Anwesenheit der Antigen-spezifischen Peptide, multimerisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß die Multimerisierung in Anwesenheit von beta-2-Mikroglobulin erfolgt.
Verfahren zur Untersuchung einer Antigen-spezifischen zellulären Immunantwort, dadurch gekennzeichnet, daß a) ein MHC-Multimer oder seine monomere Form nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche mit T-Zellen, bevorzugt mit CD8+-T-Zellen, in Gegenwart eines Peptids in Kontakt gebracht werden, um T-Antigen-MHC-Multimere zu erhalten; b) die erhaltenen Multimere nachgewiesen werden, bevorzugt durch ein Durchflußzytometrie-Verfahren oder andere zur Detektion von Fluoreszenzemissionen geeigneten Detektionsverfahren, wie Fluoreszenzmikroskopie oder Fluoreszenzscanning-Verfahren.
Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß a) die T-Zellen in Gesamtblut oder PBLs vorliegend eingesetzt werden, oder b) die T-Zellen aus Lymphknoten bzw. extralymphoiden Geweben eingesetzt werden.
Testsystem, enthaltend MHC-Monomere oder MHC-Multimere nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche.
Verwendung von MHC-Multimeren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche zur Untersuchung einer Antigenspezifischen Immunantwort, zum Nachweis oder zur Sortierung von T-Zellen, die spezifisch T-Zell-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche tragen, und zur weiteren Verwendung so gewonnener T-Zellen zur Rückführung in einen Patienten.