CN107513501A - 盘长孢菌菌种培养和工艺过程 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了盘长孢菌菌种培养和工艺过程，通过从菌种的购买、培养基的制备、种子的制备、发酵生产终产品、无菌磨菌、菌种计数、无菌灌装一套流程，得到盘长孢菌液体；本发明通过将盘长孢菌制成液体，提高菌种的活力，做成液体状菌种活力可以保障、菌和培养基在一起，菌种在运输过程中还能生长，播撒之后感染容易，杀灭菟丝子的效果更好。
Description
技术领域
本发明涉及盘长孢菌菌种培养和工艺过程，适用于生产杀灭寄生性杂草菟丝子的真菌孢子。
背景技术
盘长孢菌，保藏单位：中国普通为生物菌种保藏中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所(CGMCC)；编号：CGMCC NO.3.1620；拉丁文名称：Gloeosporium sp.
盘长孢菌一种真菌，能侵染大豆菟丝子使其得病死亡，进而达到防治这一杂草的目的，是中国山东省农科院植保所首先发现并应用的。大豆菟丝子是危害大豆的一种恶性寄生杂草，广泛分布在中国主要大豆产区，一般危害可减产百分之10-20，严重的成片颗粒无收。以前用的鲁保一号都是粉剂，容易失效，菌种的数量不能达到需要的浓度，感染效率低，就不利于彻底杀灭菟丝子。
发明内容
针对背景技术中存在的问题，本发明提供了一种盘长孢菌菌种培养和工艺过程，旨在提高菌种的活力，做成液体状菌种活力可以保障、菌和培养基在一起，菌种在运输过程中还能生长，播撒之后感染容易，杀灭菟丝子的效果更好。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：盘长孢菌菌种培养和工艺过程，包括以下步骤，
S10：获得盘长孢菌。
S20：培养基的制备，包括PDA固体培养基的制备、YPD培养基的制备以及最终重悬菌种的培养基的制备其中：PDA固体培养基的制备的过程如下：称取去皮土豆，土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持20-30分钟，用两层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取。滤液补充水分至1000ml。把补充水分过后的滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，提前搞碎琼脂并添加15～20g，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，待琼脂完全溶解后，再补充水分，在121℃高压灭菌15min。分装至18mm×180mm的试管中，每个试管10ml，倾斜制成斜面。
YPD培养基的制备：配制方法：将10g酵母膏，20g蛋白胨，溶解于900ml水中，121℃高压灭菌，加入100ml 20％葡萄糖。
最终重悬菌种的培养基的制备过程为：20g土豆，使用搅拌器搅碎后加入500ml蒸馏水中，然后加入20g白糖、200g麸皮和200g研磨碎的活性炭，最终定容至1000ml，121度，灭菌15min
S30：种子的制备，包括一级种子的制备和二级种子的制备，其中一级种子的制备过程是分离菌种接种至PDA培养基斜面中，在28℃条件下培养3-5天，之后4-10℃条件下保存；
二级种子的制备过程是从PDA培养基中挑取一定量的菌接种至10ml的YPD培养基中，在28℃并且以每分钟转速为220的条件下进行摇菌两天，然后将10ml的菌液全部接种至1L的YPD培养基中，摇菌至饱和。
S40：发酵生产终产品：按照1％的接种量，将二级种子接种到100L的YPD培养基中，在28℃并且以每分钟转速为220rpm的条件下摇菌两天到三天，直至饱和。
S50：无菌磨菌：无菌磨菌是指无菌条件下，以每分钟2500rpm的转速旋转并离心10分钟，然后收集菌体，在灭菌的研钵中研磨菌球，打散菌体，在最终重悬菌种的培养基中重悬研磨碎的菌种。
S60：菌种计数：通过梯度稀释平板计数法，计算发酵终产品中的孢子菌种数量，最终保证100亿/ml。
S70：无菌灌装：将菌和培养基一起，按照每瓶500ml的量分装，成最终产品。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过将盘长孢菌制成液体，提高菌种的活力，做成液体状菌种活力可以保障、菌和培养基在一起，菌种在运输过程中还能生长，播撒之后感染容易，杀灭菟丝子的效果更好。
具体实施方式
下面结合本发明中的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
S10：获得盘长孢菌。
S20：培养基的制备，包括PDA固体培养基的制备、YPD培养基的制备以及最终重悬菌种的培养基的制备其中：PDA固体培养基的制备的过程如下：称取去皮土豆，土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持20-30分钟，用两层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取。滤液补充水分至1000ml。把补充水分过后的滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，提前搞碎琼脂并添加15～20g，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，待琼脂完全溶解后，再补充水分，在121℃高压灭菌15min。分装至18mm×180mm的试管中，每个试管10ml，倾斜制成斜面。
YPD培养基的制备：配制方法：将10g酵母膏，20g蛋白胨，溶解于900ml水中，121℃高压灭菌，加入100ml 20％葡萄糖。
最终重悬菌种的培养基的制备过程为：20g土豆，使用搅拌器搅碎后加入500ml蒸馏水中，然后加入20g白糖、200g麸皮和200g研磨碎的活性炭，最终定容至1000ml，121度，灭菌15min。此培养基优点：可为运输中的菌种提供营养，保证菌种活力。吸附有菌种的麸皮和活性炭泼洒后会吸附在菟丝子叶片和茎蔓上，不易脱落，使更多的菌种与菟丝子的接触，促进感染。
S30：种子的制备，包括一级种子的制备和二级种子的制备，其中一级种子的制备过程是分离菌种接种至PDA培养基斜面中，在28℃条件下培养3-5天，之后4-10℃条件下保存；
二级种子的制备过程是从PDA培养基中挑取一定量的菌接种至10ml的YPD培养基中，在28℃并且以每分钟转速为220的条件下进行摇菌两天，然后将10ml的菌液全部接种至1L的YPD培养基中，摇菌至饱和。
S40：发酵生产终产品：按照1％的接种量，将二级种子接种到100L的YPD培养基中，在28℃并且以每分钟转速为220rpm的条件下摇菌两天到三天，直至饱和。
S50：无菌磨菌：无菌磨菌是指无菌条件下，以每分钟2500rpm的转速旋转并离心10分钟，然后收集菌体，在灭菌的研钵中研磨菌球，打散菌体。在最终重悬菌种的培养基中重悬研磨碎的菌种。
S60：菌种计数：通过梯度稀释平板计数法，计算发酵终产品中的孢子菌种数量，最终保证100亿/ml。
S70：无菌灌装：将菌和培养基一起，按照每瓶500ml的量分装，成最终产品。
产品保质期模拟实验：
实验室25℃常温放置：实验结果如表1：
25℃室温放，产品在28天内活菌数逐渐增加，第56天活菌数有变少。说明室温的保质期为56天左右。
实验室30℃放置：实验结果如表2：
30℃放置，产品1周内活菌数有增加，随后逐渐减少，28天活菌数与最开始持平。说明30℃放置产品保质期较短，在2-3周之间。
实验室4℃条件放置：实验结果如表3：
4℃放置，产品活菌数在8周时间内基本保持不变。说明4℃放置产品保质期较长，因此产品比较适合4℃运输和4℃保存。
使用方法：
开口后直接倒入50斤水中，将里面白球碾碎，混匀后备用。先人工砍断菟丝子茎蔓，然后在傍晚或阴天直接洒在菟丝子上。一亩使用1瓶，可根据菟丝子酌情增加使用量。每周使用一次。
基于上述，本发明具有的优点在于：本发明通过将盘长孢菌制成液体，提高菌种的活力，做成液体状菌种活力可以保障、菌和培养基在一起，菌种在运输过程中还能生长，播撒之后感染容易，杀灭菟丝子的效果更好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.盘长孢菌菌种培养和工艺过程，其特征在于：由以下步骤组成，
S10：获得菌种；
S20：培养基的制备；
S30：种子的制备；
S40：发酵生产终产品；
S50：无菌磨菌；
S60：菌种计数：
S70：无菌灌装。
2.根据权利要求1所述盘长孢菌菌种培养和工艺过程，其特征在于：所述S20：培养基的制备，具体包括PDA固体培养基的制备、YPD培养基的制备以及最终重悬菌种的培养基的制备。
3.根据权利要求2所述盘长孢菌菌种培养和工艺过程，其特征在于：所述PDA固体培养基的制备过程具体为：称取去皮土豆，土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持20-30分钟，用两层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取。滤液补充水分至1000ml。把补充水分过后的滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，提前搞碎琼脂并添加15～20g，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，待琼脂完全溶解后，再补充水分，在121℃高压灭菌15min。分装至18mm×180mm的试管中，每个试管10ml，倾斜制成斜面。
4.根据权利要求2所述盘长孢菌菌种培养和工艺过程，其特征在于：所述YPD培养基的制备，具体配制方法：将10g酵母膏，20g蛋白胨，溶解于900ml水中，121℃高压灭菌，加入过滤灭菌的100ml 20％葡萄糖。
5.根据权利要求2所述盘长孢菌菌种培养和工艺过程，其特征在于：所述最终重悬菌种的培养基的制备过程为：20g土豆，使用搅拌器搅碎后加入500ml蒸馏水中，然后加入20g白糖、200g麸皮和200g研磨碎的活性炭，最终定容至1000ml，121度，灭菌15min。
6.根据权利要求1所述盘长孢菌菌种培养和工艺过程，其特征在于：所述S30种子的制备，包括一级种子的制备和二级种子的制备。
7.根据权利要求6所述盘长孢菌菌种培养和工艺过程，其特征在于：所述一级种子的制备过程是分离菌种接种至PDA培养基斜面中，在28℃条件下培养3-5天，之后在温度4-10℃条件下保存。
8.根据权利要求6所述盘长孢菌菌种培养和工艺过程，其特征在于：所述二级种子的制备过程是从PDA培养基中挑取一定量的菌接种至10ml的YPD培养基中，在28℃并且以每分钟转速为220rpm的条件下进行摇菌两天，然后将10ml的菌液全部接种至1L的YPD培养基中，摇菌至饱和。
9.根据权利要求1所述盘长孢菌菌种培养和工艺过程，其特征在于：所述S40：发酵生产终产品的具体过程是：按照1％的接种量，将二级种子接种到100L的YPD培养基中，在28℃并且以每分钟转速为220rpm的条件下摇菌两天到三天，直至饱和。
10.根据权利要求1所述盘长孢菌菌种培养和工艺过程，其特征在于：所述S50：无菌磨菌是指无菌条件下，以每分钟2500rpm的转速旋转并离心10分钟，然后收集菌体，在灭菌的研钵中研磨菌球，打散菌体，最后在在最终重悬菌种的培养基中重悬研磨碎的菌种。
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| CN112075424A (zh) * | 2020-09-24 | 2020-12-15 | 瑞楚生物科技(江苏)有限公司 | 可以促进盘长孢菌粘附和感染菟丝子叶片溶液配方 |
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| CN1651568A (zh) * | 2004-02-03 | 2005-08-10 | 李勇 | 一种食用菌液体菌种深层发酵工艺 |
| CN101914455A (zh) * | 2010-08-13 | 2010-12-15 | 易丛琴 | 一种盘长孢菌的生产工艺 |
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