CN104099251B

CN104099251B - 一种黑曲霉菌株及其在多种真菌毒素降解中的应用

Info

Publication number: CN104099251B
Application number: CN201410146585.8A
Authority: CN
Inventors: 孙秀兰; 张晓雪; 李耘; 张银志; 钱和
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: SHANGHAI XIONGTU BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.; Jiangnan University
Priority date: 2014-04-11
Filing date: 2014-04-11
Publication date: 2016-11-23
Anticipated expiration: 2034-04-11
Also published as: CN104099251A

Abstract

本发明公开了一种黑曲霉(Aspergillus niger)菌株FS‑UV1，保藏编号CCTCC NO:M 2013553。该菌株对黄曲霉毒素B1具有良好的降解效果，降解率达到95.3％；较原菌株提高了37.8％；对玉米赤霉烯酮的降解效率达到93％，较原菌株提高了7％，对呕吐毒素的降解率达到52.6％，较原菌株提高了9.5％。大鼠实验证明该菌株是一种无毒副作用的安全有效的降解方法。

Description

一种黑曲霉菌株及其在多种真菌毒素降解中的应用

技术领域

本发明涉及一种黑曲霉，特别是一种诱变获得的，对黄曲霉毒素B1具有良好降解效果的菌株。

背景技术

真菌毒素对食品尤其是对粮食的危害极大，真菌可在粮食作物田间生长及收获后储藏过程中毒素的生物合成及代谢。据***粮农组织估计,全世界谷物供应25％受真菌毒素污染而不能食用，对真菌毒素的防治成为保证食品安全刻不容缓的头等大事。而微生物防治具有安全、高效、经济、应用性强、环境友好型等优势，成为近年来备受推崇的防治方法。而真菌毒素中危害较大当属黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮以及呕吐毒素。

自从1960年英国爆发了火鸡的黄曲霉毒素中毒事件以来，国内外对黄曲霉毒素开展了大量深入而广泛的研究。由于真菌的繁殖速度快、孢子的数量大、散布远，因此粮食等农作物在种植、收获、贮藏和加工过程中极易受到产毒真菌和黄曲霉毒素的污染。在已发现的18种黄曲霉毒素中，以AFB₁的致畸性、致突变性和致癌性最强。早在1993年，AFB₁已被国际癌症研究机构定为人类I类致癌物。

研究表明多种细菌对黄曲霉毒素具有生物防治作用。如杆菌、伯克霍尔德菌、链霉菌、链球菌和乳酸菌等均可抑制产毒霉菌的生长，产毒作用。畅晓渊发现从埃及传统奶酪中分离出的扩展短杆菌对黄曲霉生长有较强的抑制作用；从泰国发酵豆酱中分离出的地衣芽胞杆菌和短小杆菌不仅能抑制黄曲霉生长，而且还能降解74～85％的AFB₁；Cho从韩国酱油中分离出一株短小芽孢杆菌，发现该菌分泌的伊枯草素能抑制产毒黄曲霉和寄生曲霉的生长；高雅从豆瓣中分离出一株能抑制黄曲霉生长的枯草芽孢杆菌；章挺也从枯草芽孢杆菌中分离出抑制黄曲霉孢子萌发的表面活性肽和杆菌霉素D。因此分离出一种对黄曲霉毒素具有良好防治及降解效果的菌株具有十分重要的意义。

紫外诱变是应用最广泛的一种物理诱变方法，郭继平采用紫外诱变对米曲霉K61菌株进行改造,最终筛选出一株蛋白酶活力高且遗传性能稳定的突变株Y29；潘涛在紫外诱变过程中筛选到一株稳定高产菌株10min^-5,柠檬酸产量增加了5.33％；赵琼等以木醋杆菌(Acetobacterxylinum)C5为出发菌株,对其进行紫外诱变,将照射时间3min作为紫外诱变剂量,经过初筛和复筛,获得1株细菌纤维素高产菌株A.xylinumC544,该突变株的产量是原始菌株的1.5倍；可见菌株经过诱变后往往可以表现出比原菌株更加优良的特性。因而，对菌株进行诱变筛选选育出对黄曲霉毒素降解效果较好的菌株具有良好的应用前景。

发明内容

本发明提供了一种新型黑曲霉(Aspergillus niger)，已于2013年11月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M 2013553；以其18SrDNA全序列为基础的***发育树如说明书附图1所示。

本发明提供了一种诱变黑曲霉，该菌株对黄曲霉毒素B1具有良好的降解效果，降解率达到95.3％；较原菌株提高了37.8％；对玉米赤霉烯酮的降解效率达到93％，较原菌株提高了7％，对呕吐毒素的降解率达到52.6％，较原菌株提高了9.5％。

所述黑曲霉保藏条件如下：从生长良好的固态平板培养基PDA上接取3环诱变黑曲霉到发酵培养基中，28℃摇床(200rpm)培养36h，取0.65mL移入含有0.3mL无菌甘油的甘油管中，放入-70℃超低温冰箱保存。

所述固态平板培养基PDA为(w/v)：马铃薯300g、葡萄糖20g、琼脂20g、氯霉素0.1g、蒸馏水1L、自然pH、121℃高压灭菌15min。

所述液体发酵培养基PDB为(w/v)：马铃薯300g、葡萄糖20g、蒸馏水1L，自然pH，121℃高压灭菌15min。

所述诱变黑曲霉的培养条件为：将已保藏甘油管的诱变黑曲霉接入液体培养基，28℃，130rpm，摇床培养36h。

所述黑曲霉的获得方法为：将从酱醅中筛选出来的黑曲霉亲代接种到PDA固体培养基中，28℃130rpm，培养36h，取50ml生理盐水洗下孢子，振荡均匀，形成单孢子悬浮液,制成10⁸CFU/ml的菌悬液。取上述孢子悬液5ml,经200w紫外照射5min，微波处在高档时加热80s。将诱变后的菌株接种于PDB培养基，从菌落中挑取适当孢子按上述方式制成10⁸CFU/ml菌悬液，接种到30ml培养基中，28℃130rpm，摇床培养36h。吸取10ul发酵液于酪蛋白平板上进行复筛。将上述复筛后菌株及原菌株接种到30ml培养基中，28℃130rpm，摇床培养36h。向发酵液中加入0.05ppm AFB1、0.5ppm玉米赤霉烯酮及0.5ppm呕吐毒素，比较原菌株及新型诱变菌株对AFB1、玉米赤霉烯酮及呕吐毒素的降解效果。

本发明是从酱醅中分离得到的经紫外微波复合诱变的对AFB1具有良好降解效果的新型菌株，对黄曲霉毒素B1的降解率达到95.3％，较原菌株对AFB1提高了37.8％；对玉米赤霉烯酮的降解效率达到93％，较原菌株提高了7％；对呕吐毒素的降解率达到52.6％，较原菌株提高了9.5％。诱变后的菌株可应用食品，农产品，粮食以及饲料等领域中多种真菌毒素的降解中，达到降低真菌毒素尤其是黄曲霉毒素B1含量的目的。

附图说明

图1：新型黑曲霉FS-UV1的***发育树

图2：新型黑曲霉FS-UV1对AFB1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的降解效果

图3：新型黑曲霉FS-UV1的酶活性

图4：新型黑曲霉FS-UV1降解玉米浆中毒素大鼠实验切片图

A：饲料组；B：标准品组；C：花生粕组；D：实验组。

具体实施方式

实施例1：酱醅中黑曲霉的筛选方法

从发酵4d后的酱中用含β-环糊精的PDA培养基定性地分离出酱醅中的非产毒丝状真菌，然后用ELISA方法对所分离菌株的产毒能力进行定量分析，最后筛选出非产毒的霉菌。

对能抑制黄曲霉产毒菌进行复筛，筛选出能降解AFB₁的菌株，降解率为58％。筛选出AFB₁的防治菌株。

通过菌落特征观察和个体形态观察，并将菌株的18S rDNA与GenBank数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中已知序列对比，发现其与黑曲霉(Aspergillus niger)同源性达100％。结合菌株的形态特征和分子生物学鉴定，可确定菌株为黑曲霉。本菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2013703。

实施例2：紫外微波复合诱变黑曲霉制备方法

取上述孢子悬液5ml,经200w紫外照射5min，微波处在高档时加热80s。将诱变后的菌株接种于PDB培养基，从菌落中挑取适当孢子按上述方式制成10⁸CFU/ml菌悬液，接种到30ml培养基中，28℃130rpm，摇床培养36h。吸取10ul发酵液于酪蛋白平板上进行复筛。通过菌落特征观察，个体形态观察，并将菌株的18S rDNA与GenBank数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中已知序列对比，发现其与黑曲霉(Aspergillus niger)同源性达100％。结合菌株的形态特征和分子生物学鉴定，可确定菌株为黑曲霉。新型黑曲霉FS-UV1的进化树如图1。本菌株已于2013年11月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M 2013553，保藏地址为中国武汉武汉大学。

实施例3：新型黑曲霉对多种真菌毒素的降解

将上述菌株FS-UV1及原菌株接种到30mlPDB培养基中，28℃130rpm，摇床培养36h。向发酵液中加入0.05ppmAFB1、0.5ppm玉米赤霉烯酮及0.5ppm呕吐毒素，比较原菌株及新型诱变菌株对AFB1、玉米赤霉烯酮以及呕吐毒素的降解效果。

1)新型黑曲霉FS-UV1对AFB1的降解

将复合诱变菌株FS-UV1及原菌株接种到30mlPDB培养基中，28℃130rpm，摇床培养36h。向发酵液中加入0.05ppm黄曲霉毒素B1，从中吸取1ml并加入3ml三氯甲烷，萃取两次，氮气吹干，加入三氟乙酸100ul，正己烷200ul，衍生化30min，应用高效液相色谱法进行检测。色谱条件为C18柱6mm×150mm×5um；流动相乙腈：水＝20:80检测温度：30℃；流速：1ml/min；检测波长：激发波长：360nm；发射波长：440nm。

2)新型黑曲霉FS-UV1对玉米赤霉烯酮的降解

将复合诱变菌株FS-UV1及原菌株接种到30mlPDB培养基中，28℃130rpm，摇床培养36h。向发酵液中加入0.5ppm玉米赤霉烯酮标准品，再从中吸取1ml并加入3ml三氯甲烷，萃取两次，氮气吹干，高效液相色谱法进行含量检测。色谱条件为色谱柱：C18柱6mm×150mm×5um；流动相：乙腈：水＝50:50；检测温度：25℃；流速：1ml/min；检测波长：激发波长：240nm；发射波长：440nm

3)新型黑曲霉FS-UV1对呕吐毒素的降解

将上述诱变后菌株及原菌株接种到30mlPDB培养基中，28℃培养36h。向发酵液中加入0.5ppm呕吐毒素标准品，吸取10ml，再从中吸取1ml加入3ml三氯甲烷进行萃取两次，氮气吹干，高效液相色谱法进行含量检测。色谱条件：色谱条件为色谱柱：C18柱6mm×150mm×5um；流动相：甲醇：水＝20:80；检测温度：30℃；流速：0.8ml/min；检测波长：218nm。

结果如图2所示，新型黑曲霉FS-UV1(CCTCC NO:M 2013553)对黄曲霉毒素B1的降解率达到95.3％，较原菌株对AFB1提高了37.8％；对玉米赤霉烯酮的降解效率达到93％，较原菌株提高了7％；对呕吐毒素的降解率达到52.6％，较原菌株提高了9.5％。

实施例4：新型黑曲霉FS-UV1对毒素污染的花生粕、棉籽粕中黄曲霉毒素B1的防治

取适量复合诱变黑曲霉FS-UV1(CCTCC NO:M 2013553)孢子接种于黄曲霉毒素污染的棉籽粕或花生粕中(黄曲霉毒素B1含量68μg/mL)，28℃发酵培养7d，取40g棉籽粕或花生粕粉碎试样溶于100ml乙腈-水(9:1)溶液中，高速均质器搅拌提取2min，定性滤纸过滤，移取10ml滤液加入40ml水稀释混匀，玻璃滤纸过滤1～2次至滤液澄清。取适量滤液与氯仿按1:2混合萃取两次。氮气吹干，溶于1.0ml流动相，待测。经高效液相色谱法测定，发现棉籽粕或花生粕中黄曲霉毒素B1残留量低于2μg/mL，降解率达到98％。

实施例5：降解产物大鼠动物试验验证

大鼠饲喂前禁食12h，自由饮水，称体质量并记录，做好标记，随机分成4组，即：饲喂普通饲料组A(简称：空白组)；灌胃黄曲霉毒素B1标准品组B(简称：对照组)；饲喂被黄曲霉毒素污染的花生粕组C(简称：花生粕组)；饲喂污染花生粕和黑曲霉发酵液共培养48h实验组D(简称：降解组)，每组各8只。各组小鼠每日同一时间饲喂处理，自由采食饮水，持续30天，最后脱颈处死。取出大鼠的肝脏和肾脏，经过石蜡包埋，切片，HE染色，在100×和400×的光学显微镜下观察其组织切片图4(左为肝脏，右为肾脏)。结果发现，花生粕组由于毒素含量高，导致大鼠的肝肾明显损坏；而降解组的大鼠肝肾未发现明显的组织损坏，这说明黑曲霉发酵液能够降解花生粕中的黄曲霉毒素，并使其毒性消失。因此，该黑曲霉对毒素降解是安全无毒副产物的菌株，为动物饲料提供了一种高效安全的脱毒方法。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims

1.一种黑曲霉(Aspergillus niger)FS-UV1，于2013年11月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2013553，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

2.根据权利要求1所述的黑曲霉应用于降解毒素污染的花生粕、棉籽粕中黄曲霉毒素B1。

3.根据权利要求1所述的黑曲霉应用于降解毒素污染的花生粕、棉籽粕中玉米赤霉烯酮。

4.根据权利要求1所述的黑曲霉应用于降解毒素污染的花生粕、棉籽粕中呕吐毒素。

5.根据权利要求1所述的黑曲霉在食品、饲料领域的应用。