CN103555615A - 一种解淀粉芽孢杆菌及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌及其用途，其形态特征：解淀粉芽孢杆菌X60(Bacillusamyloliquefaciens)在NA培养基上培养24小时后产生单菌落，菌落为乳白色，圆形，边缘有细齿，中间***，表面光滑，菌体为短直杆状，革兰氏阳性菌，可产生芽孢，可分泌蛋白酶、纤维素酶等。本发明对烟草灰霉病具有较好的防治效果，且有较长时间的预防作用，环境友好。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌及其用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体来说涉及一种解淀粉芽孢杆菌，同时还涉及该解淀粉芽孢杆菌在防治漂浮育苗苗期烟草灰霉病方面的用途。 

  

背景技术

由灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers. :Fr) 引起的烟草灰霉病是烟草上的重要病害之一，烟草整个生育期内均可发病，以苗期及现蕾期发生较重。苗期主要发生于近地面的叶片上，病斑近圆形，褐色，具有不清晰的淡色边缘；高湿环境下病斑迅速扩展，直径可达5厘米以上，病斑呈湿腐状，其上布满灰色霉层。在集约化漂浮育苗的情况下，病菌很快扩散，严重威胁着烟苗的生产，因此对苗期烟草灰霉病的防治迫在眉睫。 

长期以来，生产上主要靠化学防治药剂来防治烟草灰霉病，主要药剂有苯并咪唑类的多菌灵、甲基托布津，二甲酰亚胺类的腐霉利(速克灵)、扑海因，氨基甲酸酯类的乙霉威及其混剂，还有苯胺嘧啶类嘧霉胺等。由于灰霉病菌具有繁殖速率高、遗传变异大和适合度高的特性, 多年连续大量使用化学药剂使得该病原菌对一些杀菌剂产生抗性, 国内外已有它对多种杀菌剂产生抗性的报道。微生物菌剂可以与病原菌竞争营养、空间位点，诱导植物产生抗病性，其次生代谢产物对病原菌具有抑制作用、对植物具有促生作用，且绿色、环保、安全，在植物病害的防治中具有重要的应用价值。因此，寻找环境友好的、高效、安全的微生物菌剂，将其用于漂浮育苗苗期烟草灰霉病的防治具有广阔的发展空间，同时也是农业安全可持续发展的需要。 

  

发明内容

本发明的目的在于克服上述问题而提供的一种对烟草灰霉病具有较好的防治效果，且有较长时间的预防作用，环境友好的解淀粉芽孢杆菌。 

本发明的另一目的在于提供该解淀粉芽孢杆菌在防治漂浮育苗苗期烟草灰霉病方面的用途。 

一种解淀粉芽孢杆菌，其形态特征：在NA培养基上培养24 小时后产生单菌落，菌落为乳白色，圆形，边缘有细齿，中间***，表面光滑，菌体为短直杆状，革兰氏阳性菌，可产生芽孢，可分泌蛋白酶、纤维素酶等。 

 该菌种已于2013年8月13日保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：湖北省武汉市武昌珞珈山，武汉大学），保藏号：CCTCC NO: M 2013375，名称为：解淀粉芽孢杆菌X60 (Bacillus amyloliquefaciens)， 

（一）解淀粉芽孢杆菌X60 (Bacillus amyloliquefaciens)的分离步骤：

采用“稀释分离法”称取10g烟草根围土壤于洁净烧杯中，加于90ml无菌水，磁力搅拌使其充分混匀，静置20分钟后吸取0.5 ml上清液于15×150mm洁净试管中，添加4.5 ml无菌水充分混匀得10^-1浓度母液，再从稀释后的试管中吸取0.5 ml上清液，再加入4.5 ml无菌水充分混匀制得10^-2浓度溶液，依次稀释至10^-9不同浓度的土壤溶液待用。分别吸取上述不同浓度土壤溶液100μl，均匀涂布于培养细菌的NA平板上，28℃黑暗培养，待细菌长出后挑取单菌落纯化。

（二）培养基： 

牛肉膏蛋白胨固体培养基（NA）：牛肉膏3g，蛋白胨10g，琼脂粉16g，水1000ml，pH 6.8～7.2。

牛肉膏蛋白胨液体培养基（NB）：牛肉膏3g，蛋白胨10g，水1000ml，pH 6.8～7.2。 

（三）菌种的保种和传代： 

用18×180mm的试管，盛NA培养基9ml，做成斜面，接种细菌，28℃培养2-3天，置4℃保存，3个月转种一次。

将纯化后的细菌在NA培养基上划线培养，待细菌长出后挑出单菌落，用灭菌的牙签将细菌单菌落挑至装有5ml NB培养基的试管（15×150mm）里摇培24h，吸取700μl菌液至2ml菌株保存管中，再向保存管中添加700μl 30%灭菌甘油，置于-20℃冰柜中长期保存。 

（四）菌种的性态特征： 

该菌形成的菌落在NA平板上，30℃，培养2d，菌落直径5～15mm，菌落近圆形、白色、半透明、光滑湿润、稍***，菌体为短直杆状，为好氧细菌，革兰氏反应阳性。经细菌鉴定手册描述，结合Biolog鉴定结果及16S rDNA序列分析结果，将这一菌株记为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens X60)。

（五）菌种的培养特性 

培养温度20 ~ 50℃，最适温度范围30 ~ 37℃；培养初始pH4.0 ~ 9.0，最适6.0 ~7.0；培养盐浓度0.5 ~ 5%，最佳0.5%；可培养碳源有葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、纤维二塘、淀粉，其中葡萄糖最佳；可培养氮源有牛肉膏、蛋白胨、KNO₃、NH₄NO₃、(NH₄)₂SO₄和NaNO₂，其中牛肉膏和蛋白胨最佳。

本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：本发明经离体试验表明，解淀粉芽孢杆菌菌株X60对烟草灰霉病菌的生长具有很强的抑制作用。温室漂浮育苗防治实验表明：该菌剂能够显著降低由病原菌灰葡萄孢引起的烟草灰霉病的发生，并具有较长时间的预防作用。具有同化学杀菌剂多菌灵相当的防治效果。该菌剂用湿菌与菌种保藏液配制而成，菌体保藏液为0.01 mol/L磷酸盐缓冲液、及 0.001mol/L的Tween 40非离子型表面活性剂。该菌剂可以直接喷雾漂浮育苗苗床上的烟苗，也可以与育苗基质充分混合后育苗。本发明是专门针对漂浮育苗苗期烟草灰霉病开发的生防菌剂。由于是微生物菌剂，对环境友好，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，有利于无公害生产、有机生产。 

  

具体实施方式

从烤烟(Nicotiana tabacum L.)根际土壤中分离得到。解淀粉芽孢杆菌X60在NA培养基上培养24 小时后产生单菌落，菌落为乳白色，圆形，边缘有细齿，中间***，表面光滑，菌体为短直杆状，革兰氏阳性菌，可产生芽孢，可分泌蛋白酶、纤维素酶等。 

将上述防治烟草灰霉病的菌株X60在NB培养液30℃180rpm振荡培养36-48小时，然后6000rpm离心10分钟，取X60湿菌体与菌体保藏液，按质量体积比为1:50配成菌剂，菌剂成品活菌浓度为1×10¹⁰-1×10¹²CFU/ml，菌体保藏液为0.01 mol/L磷酸盐缓冲液，还含有浓度为0.001mol/L的Tween 40非离子型表面活性剂，所用NB培养液配制方法为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，加去离子水至1L，pH 6.8～7.2，经120℃灭菌20分钟后分装、待用。 

解淀粉芽孢杆菌X60对烟草灰霉病菌生长的抑制试验 

将融化好的PDA培养基与NA培养基按照1︰1比例混合均匀，倒制平板，待平板冷却后，每皿中央接种烟草灰霉病菌菌饼（直径5 mm，菌落边缘取菌饼），28 ℃黑暗条件下培养。2 d后采用无菌牙签在距菌碟2 cm左右处一条“十字线”上接种菌株X60，另一条线上接种无菌水为对照，置于28 ℃黑暗条件下培养，4 d后观察抑菌圈的大小。X60菌剂对漂浮育苗烟苗灰霉病的防效试验

病原菌孢子悬浮液的制备：将烟草灰霉病菌接种于PDA培养基平板，25℃黑暗条件下培养6d，然后将平板置于15℃黑暗条件下诱导分生孢子的形成，3d后用无菌纱布滤去菌丝得到分生孢子悬浮液。用血球计数板测定孢子悬浮液的浓度，并将孢子悬浮液浓度调至10⁵个孢子/ml，备用。

X60菌剂的制备：将上述防治烟草灰霉病的菌株X60在NB培养液30℃180rpm振荡培养36-48小时，然后6000rpm离心10分钟，取X60湿菌体与菌体保藏液，按质量体积比为1:50配成菌剂，菌剂成品活菌浓度为1×10¹⁰-1×10¹²CFU/ml，菌体保藏液为0.01 mol/L磷酸盐缓冲液，还含有浓度为0.001mol/L的Tween 40非离子型表面活性剂，所用NB培养液配制方法为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，加去离子水至1L，pH 6.8～7.2，经120℃灭菌20分钟后分装、待用。 

在烤烟漂浮育苗盘中育苗（品种：红花大金元），待烟苗长至5-6叶时备用。生防菌处理组Ⅰ，将上述生防菌液均匀喷雾至烟苗叶片表面，直至流失；对照组喷雾无菌水Ⅱ；多菌灵处理组Ⅲ，80%多菌灵可湿性粉剂1000倍稀释喷雾，直至流失；嘧霉胺处理组Ⅳ，40%嘧霉胺悬浮剂1500倍液喷雾，直至流失。处理24小时后，将上述烟草灰霉病菌孢子悬浮液均匀喷雾至叶片表面，每处理处理烟苗60株。接菌后将烟苗置于自然光照下，15-27℃，RH>80%培养。24天后观察记录叶片发病情况，并调查病情指数，计算防效。 

按照以下的病情统计分级，根据叶片发病面积进行病情统计： 

0级--全株无病；

1级--病斑面积占叶片面积的5%以下，或茎部病斑不超过茎围的1/3；

3级--病斑面积占叶片面积的6%～10%，或茎部病斑环绕茎围1/3～1/2；

5级--病斑面积占叶片面积的11%～20%，或茎部病斑超过茎围的1/2，但未全部环绕茎围；

7级--病斑面积占叶片面积的21%～40%，或茎部病斑全部环绕茎围；

9级--病斑面积占叶片面积的41%以上，或茎部病斑全部环绕茎围，植株凋萎甚至枯死；

室内平板对峙试验表明，菌株X60对烟草灰霉病菌的抑制率可以达到51.3%

漂浮育苗烟苗温室试验结果表明，X60菌剂处理组能够很好的预防烟草灰霉病的发生，其防治效果达到82.66%

   表1 X60菌剂施用24天后对漂浮育苗烟苗灰霉病的防效

处理	发病率（%）	病情指数	防效（%）
				对照	86.5	84.46	--
多菌灵	5.34	8.66	89.75
				嘧霉胺	3.26	7.48	91.14
X60菌剂	8.46	14.64	82.66

Claims (2)

1.一种解淀粉芽孢杆菌X60 (Bacillus amyloliquefaciens)，其特征在于所述菌种的保藏号为CCTCC NO: M 2013375。

2.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌X60在防治漂浮育苗苗期烟草灰霉病方面的用途。