CN105274020B - 一种生姜茎基腐病菌拮抗细菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生姜茎基腐病菌拮抗细菌，命名为洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia)C3，已于2014年10月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.9791。生姜茎基腐病菌拮抗细菌C3对生姜茎基腐病防效达41.18％，与对照相比有显著提高，处理后发病率、病情指数与CK2相比均有所降低，说明C3防病效果理想。

Description

一种生姜茎基腐病菌拮抗细菌及应用

技术领域

本发明涉及一种生姜茎基腐病菌拮抗细菌及应用。

背景技术

生姜茎基腐病又称生姜软腐病、生姜茎腐病等，由腐霉菌侵染引起，1907年首次报道在印度苏拉特发现，现普遍发生于印度、澳大利亚、日本、尼日利亚、夏威夷、斐济、斯里兰卡、韩国及我国台湾等地区，该病危害严重。据报道，部分重病种植区每年因生姜茎基腐病导致的减产高达80％～90％，甚至绝产。在尼泊尔因该病导致的大田损失25％，储藏期损失24％。在印度重病田块损失高达90％以上。生姜茎基腐病病原菌为卵菌门腐霉菌属，在真菌界分类上生姜茎基腐病病原菌隶属于卵菌纲，腐霉科，腐霉属。该病原菌是一种低等真菌，以腐生的方式在土壤中长期存活，寄生于高等植物，为害根部和茎基部引起腐烂，表现为猝倒、根腐和茎腐。

针对生姜茎基腐病病原研究、发病规律、侵染循环规律及影响发病的因素等方面，目前生产上的防治措施主要有农业防治、化学药剂防治及生物防治。化学药剂的诸多优点使其在农业生产中被广泛应用，但是随着人类健康和环保意识的逐渐增强，农药的长期大量不规范使用，伴随的诸多问题也逐渐显现出来。比较突出的如环境污染、农药残留、抗药性的产生和对非靶标生物的直接毒害等。而生物防治在一定程度上弥补了化学农药的缺陷，在未来农业可持续发展中将发挥重大作用。但是目前生物防治仅局限于室内盆栽实验，将生物防治应用到田间仍然需要很长的时间。然而从环境安全和人类健康角度出发，最终要找出安全有效的生物防治方法和途径，来逐步取代现有的化学防治。

生防菌剂因其环境友好性、发挥持续性、防效针对性等优点已经被广泛研究和应用，潜力巨大。国内外已报道有大量的生防制剂研制并成功应用。如常见的苏云金杆菌、白僵菌等已被商品化生产应用，并取得了良好的防效。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种生姜茎基腐病菌拮抗细菌及应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供的生姜茎基腐病菌拮抗细菌，该菌株命名为洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia)C3，已于2014年10月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.9791。

上述菌株的主要生物学特征为：洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacenocepacia)，革兰氏阴性菌，菌落黄白色，表面光滑无褶皱，单菌落圆形，在PDA培养基上菌落生长速度快。

生姜茎基腐病菌拮抗细菌C3用于制备生防菌剂的方法为：用优化培养基培养生姜茎基腐病菌拮抗细菌，600nm OD值为1时，将细菌悬浮液6000rpm离心10min，菌体用等体积无菌水或磷酸缓冲液重新悬浮，稀释至细菌浓度为5×10⁸cfu/ml，分装后4℃放置备用。

本发明的有益效果，

1.室内防病效果测定表明，生姜茎基腐病菌拮抗细菌C3对生姜茎基腐病防效达41.18％，与对照相比有显著提高，处理后发病率、病情指数与CK2相比均有所降低，说明C3防病效果理想；

2.对生姜茎基腐病菌拮抗细菌C3发酵条件进行优化，对基础培养基、培养基组分单因素试验进行研究，结果表明甘油和酵母粉分别作为培养基碳氮源时效果最好，培养基组分的正交试验表明甘油2％、酵母粉1％、K₂HPO₄0.2％、MgSO₄0.1％的配比为最优配比，通过培养时间、接种量、培养基瓶装量以及pH等对菌体生长量的影响研究表明，以接种量3％、150ml/250ml瓶装量、培养时间48h、pH为8-9时，该菌株菌体浓度最大；

3.对发酵液抗菌活性物质进行温度、蛋白酶和紫外线三个方面的稳定性实验。发酵液经胰蛋白酶和胃蛋白酶处理后对病原菌的抑制变化不明显；经不同温度处理30min后与对照相比较，病原菌菌落直径无明显变化；经紫外线连续照射12h后的抑菌效果与对照相比无明显差异。因此该菌活性物质对热、蛋白酶和紫外线有着较强的稳定性。

附图说明

图1为生姜茎基腐病菌拮抗细菌C3菌落形态；

图2为拮抗细菌C3对生姜茎基腐病菌的抑制作用；

图3为光学显微镜下拮抗细菌C3对生姜茎基腐病菌菌丝体的作用，其中A为对照，B为用C3处理2天后病原菌丝体的形态；

图4为拮抗细菌C3对生姜茎基腐病菌及其它病原菌的抑菌圈大小；

图5为拮抗细菌C3对生姜茎基腐病菌及其它病原菌的抑菌作用图；

图6为不同培养基对菌体发酵浓度的影响；

图7为不同碳源对菌体发酵浓度的影响；

图8为不同氮源对菌体发酵浓度的影响；

图9为不同装瓶量对菌体发酵浓度的影响；

图10为不同接种量对菌体发酵浓度的影响；

图11为不同发酵时间对菌体发酵浓度的影响；

图12为不同pH对菌体发酵浓度的影响；

图13为不同温度处理对发酵液中抗菌物质活性的影响；

图14为紫外线处理对发酵液中抗菌物质活性的影响；

图15为蛋白酶处理对发酵液中抗菌物质活性的影响。

具体实施方式

结合实施实例，对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

本发明中未详尽描述的试剂、方法均为所属领域的常规试剂、方法。

实施例1：生姜茎基腐病菌拮抗细菌C3的获得和鉴定

从大葱根围筛选拮抗细菌，采用形态学和分子生物学方法对筛选得到的拮抗细菌进行鉴定。

(一)形态学鉴定：

细菌形态在适宜情况下相对稳定，将筛选出的拮抗细菌划线于NA培养基，培养24h后观察单菌落特征，包括菌落形态、大小、颜色的均一性、菌体气味、培养基有无变色等进行初步鉴定，结果如图1所示；

(二)分子生物学鉴定：

通过16S rDNA测序和RecA基因测序，将测序结果序列与GenBank中已提交序列进行比对，将菌株C3鉴定为洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia)。

通过以上鉴定，确认菌株C3为洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.9791，保藏时间为2014年10月17日。

实施例2：抑菌效果

(一)生姜茎基腐病菌拮抗细菌C3对病原菌的抑制效果

C3对姜茎基腐病菌的抑制作用，如图2所示，培养皿中间为C3，周围为姜茎基腐病菌，因此，C3明显对姜茎基腐病菌有抑制作用。如图3所示，其中，A图为对照，菌丝体表现为表面平滑，粗细均匀，呈管状；B图为C3与姜茎基腐病菌对峙培养2天后的菌丝体，表现为菌丝体局部膨大、异常分支等畸形生长。

(二)生姜茎基腐病菌拮抗细菌C3对指示病原菌的抑制效果

如图4、5所示，C3对茎基腐病菌、烟草青枯病菌和立枯丝核菌都表现明显的抑制作用；白地霉为筛选指示菌。

实施例3：生姜茎基腐病菌拮抗细菌C3对茎基腐病的室内防效

(一)生防菌剂及病原接种体的制备

细菌悬浮液准备：用优化培养基培养生姜茎基腐病菌拮抗细菌C3，600nm OD值为1时，将细菌悬浮液6000rpm离心10min，菌体用等体积无菌水或磷酸缓冲液重新悬浮，稀释至细菌浓度为5×10⁸cfu/ml，分装后4℃放置备用。

辅助载体：按照麦芽糊精60％、酵母粉10％、麦麸30％的配比三种物质混匀。

病原菌接种体：将茎基腐病原菌接种于灭菌的小麦粒中，28℃培养7d，备用，实验设计具体见表1。

表1实验设计及不同处理

首先将土壤与基质3:1混匀后160℃灭菌2h，分装到花盆里。栽种前两天，将辅助载体以每盆10g与上层1/3土壤混匀。根据上述不同处理，将配制好的生姜茎基腐病菌拮抗细菌C3菌悬液按每盆10ml与1000ml水混匀，灌入土壤。两天后，栽种无病种姜，每盆5棵，每处理3盆。生长两天后，接入茎基腐病菌接种体，每个姜芽附近接种一粒带菌麦粒。

接种后5d，用相同浓度生防菌悬液灌根，12d后观察并测定各处理发病级别，按照病害分级标准计算病情指数与防病效果，以清水处理为对照。

发病级别参照李长松等苗期病害分级标准：

0级：无病

1级：茎基部或根部稍显病斑或稍变色

2级：1/3～1/2茎基部或根部出现病斑,变色或腐烂

3级：病斑绕整个茎基部或根部，变色腐烂

4级：枯萎死亡

(二)室内防效结果

结果如表2所示，生姜茎基腐病菌拮抗细菌C3对生姜茎基腐病防效达41.18％，与对照相比有显著提高，处理后发病率、病情指数与CK2相比均有所降低，说明防病效果理想。

表2不同处理对生姜茎基腐病的防治效果

实施例4：生姜茎基腐病菌拮抗细菌C3培养发酵条件优化

(一)基础发酵培养基的筛选

以KB1、KB2、NYBD、YPG、LB、Ppm培养基为备选基础培养基，培养基组分及配比如表3，将种子液以4％接种量接种到装有50mL培养基的100mL三角瓶中，28℃、180rpm培养72h得菌悬液，将菌悬液4℃、10000rpm冷冻离心20min，沉淀即为细菌菌体，稀释后用紫外分光光度计测定600nm下OD值，以无菌水调0，测定不同培养基类型对菌体发酵浓度的影响，结果如图6所示，由图可以看出，以KB1培养基菌体发酵浓度最大，所以选取KB1培养基为基础培养基。

表3基础培养基成分及配比

(二)培养基组分单因素实验

对基础培养基KB1进行碳源和氮源的筛选。按照相同的配比将甘油、蔗糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉分别作为基础培养基中的碳源，其他成分及配比不变，测定不同成分碳源对菌体浓度的影响。按照相同配比将牛肉膏、酵母粉、胰蛋白胨、(NH₄)₂SO₄、NH₄Cl、蛋白胨分别作为基础培养基中氮源。由图7-8可以看出，甘油作为培养基碳源，酵母粉作为培养基氮源时，OD值最大，说明生姜茎基腐病菌拮抗细菌C3菌体浓度最大，因此将甘油和酵母粉作为培养基组分优化的碳源和氮源。

确定基础培养基后，在单因素试验的基础上以筛选出的碳源和氮源及基础培养基中无机盐为不变因素，根据原基础培养基配比选择上中下三个水平，对培养基成分配比进行4因素3水平的L₉(3⁴)正交试验，正交表的设计根据DPS自动生成表4。将菌悬液4℃、10000rpm冷冻离心20min，沉淀即为细菌菌体，稀释后用紫外分光光度计测定600nm下OD值，以无菌水调0，测定不同组分配比对菌体发酵浓度的影响。

表4优化培养基配比正交试验因素与水平

按正交表设计，各因素水平、实验结果与极差分析见表5，四种组分对菌体发酵浓度的影响依次为甘油＞MgSO₄＞K₂HPO₄＞酵母粉，即发酵液中酵母粉的含量百分比对菌体发酵影响最大，最优组合为A₁B₂C₃D₁，即甘油2％、酵母粉1％、K₂HPO₄0.2％、MgSO₄0.1％。

表5发酵培养基正交实验结果与分析

(三)发酵条件优化

以优化好的培养基配比为基础，分别测定培养基不同接种量、装瓶量、发酵时间和培养基pH对菌体发酵浓度的影响。

(1)装瓶量对菌体发酵浓度的影响

以优化配比培养基为基础，4％种子液接种量、pH自然条件下在250ml三角瓶中调节培养基瓶装量为50ml、10ml、150ml、200ml，28℃180rpm培养72h后，用紫外分光光度计测定600nm下OD值，以无菌水调0，确定最大菌体浓度时的瓶装量。图9中可以看出菌体浓度随瓶装量增大而增大，150ml/200ml瓶装量时达到最高值，随后浓度下降，原因可能是因为随瓶装量的增加，瓶内可供细菌利用的氧气减少，代谢降低。所以确定瓶装量为150ml/250ml，即250mL三角瓶中装有150mL培养基。

(2)接种量对菌体发酵浓度的影响

以优化培养基组分及配比，150ml/250ml瓶装量、pH自然条件下调节种子液接种量为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％，对菌体发酵浓度影响如图10所示，3％接种量时菌体浓度最大，因此确定接种量为3％。

(3)发酵时间对菌体发酵浓度的影响

以优化培养基组分及配比，150ml/250ml瓶装量、pH自然、3％接种量条件下，设置不同培养时间12h、24h、36h、48h、60h、72h、96h、108h，紫外分光光度计测定600nm下OD值，以无菌水调0，分析不同培养时间段菌体浓度，结果如图11所示，从图中可以看出菌体浓度随发酵时间增加而增大，48h时菌体浓度最大，随后呈稳定状态，故确定发酵时间为48h。

(4)pH对菌体发酵浓度的影响

以优化培养基组分及配比，150ml(250ml)装瓶量、3％接种量条件下设置不同pH的培养基，pH分别为4、5、6、7、8、9、10摇菌48h，将菌悬液4℃、10000rpm冷冻离心20min，沉淀即为细菌菌体，稀释后用紫外分光光度计测定600nm下OD值，以无菌水调0，测定不同pH对菌体发酵浓度的影响。结果见图12，从图中可以看出pH8-9菌体浓度最大，表明此条件下菌体生长最快。

实施例5：发酵液理化性质测定

以优化好的培养基和发酵条件培养细菌，发酵液经离心、获得无菌滤液，采用混合倒平板法对发酵液的温度、紫外线和蛋白酶稳定性进行测定。

(一)温度稳定性：

将发酵液用10mL离心管分装，分别于50℃、60℃、70℃、80℃、100℃处理30min，以4℃放置滤液为对照，采用混合到平板法以滤液：培养基＝1:5的比例倒板，每个处理重复3次，测定发酵液抑菌活性差异。

结果如图13，菌落直径与对照相比无明显差异，100℃处理30min抑菌效果与对照相同，说明抑菌活性成分对高温不敏感。

(二)紫外线稳定性：

取适量发酵液置于无菌培养皿中，密封后于30W紫外灯下距离30cm连续照射12h，以4℃放置滤液为对照，参照上述方法测定抑菌活性。

如图14所示，发酵液经紫外线近距离连续照射12h后抑菌效果与对照无明显差异，说明发酵液中活性成分对紫外照射有良好稳定性。

(三)蛋白酶稳定性：

取适量发酵液，分别加入适量胰蛋白酶和胃蛋白酶溶液，使酶的终浓度为0.5g/L，37℃水浴3h使酶充分反映。以4℃放置滤液为对照，参照上述方法测定抑菌活性。

如图15，发酵液经胰蛋白酶和胃蛋白酶处理3h后抑菌效果无明显变化，说明发酵液中抑菌活性成分对蛋白酶不敏感。

综上，发酵液经不同温度处理30min后与对照相比病原菌菌落直径无明显变化；发酵液经紫外线连续照射12h后与对照相比病原菌菌落直径无明显变化；发酵液经胰蛋白酶和胃蛋白酶处理3h后与对照相比病原菌菌落直径无明显变化；因此该菌产生的抗菌物质对热、蛋白酶和紫外线有着较强的稳定性。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (5)

1.生姜茎基腐病菌拮抗细菌，其特征在于，命名为新洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacenocepacia)C3，已于2014年10月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.9791。

2.一种C3菌剂，其特征在于，它的活性成分为权利要求1所述的生姜茎基腐病菌拮抗细菌。

3.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂的产品包装剂型为液体菌剂。

4.权利要求2或3所述菌剂的制备方法，其特征在于，采用如下步骤：用优化培养基培养生姜茎基腐病菌拮抗细菌，600nm OD值为1时，将细菌悬浮液6000rpm离心10min，菌体用等体积无菌水或磷酸缓冲液重新悬浮，稀释至细菌浓度为5×10⁸cfu/ml，分装后4℃放置备用。

5.权利要求1所述菌株或权利要求2所述菌剂在治疗生姜茎基腐病的应用。