CN107151632B - 蝙蝠蛾被毛孢菌丝体及其发酵技术 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蝙蝠蛾被毛孢菌丝体及其发酵技术，该发明蝙蝠蛾被毛孢菌丝体及其发酵技术，是目前西藏唯一的虫草菌丝体发酵技术，在海拔3600米的情况下，跟野生虫草的生长坏境最接近，从而使产品的各种功效更加接近野生虫草。与野生虫草相比发酵虫草菌丝体在有效成分、重金属含量等各方面都十分明显的优势，产生了巨大的社会效益和经济效益。所述发酵技术包括以下步骤：(1)接种；(2)一级种子罐培养；(3)二级种子罐培养；(4)发酵罐培养；(5)离心；(6)烘干，粉碎。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体地说，涉及一种蝙蝠蛾被毛孢菌丝体及其发酵技术。
背景技术
冬虫夏草(Cordyceps(Berk)Sacco.)为冬虫夏草菌的子座以及它的寄主虫草蝙蝠蛾(HepialusarmoricanusOberthur)等幼虫尸体壳的复合体，冬虫夏草的菌子座是麦角菌科(Clavicipiraceae)虫草属(Cordyceps)。冬虫夏草主要产于我国的青海、西藏、云南、贵州、四川等海拔3500-5000m山中的草甸土中，为中国特产的名贵中药材。虫草由我国传到西方己有270年历史。1878年意大利学者Saccardo将虫草学名定为Cordyceps sinensis(Berkeley)Sacc，意为中国虫草。其味甘性平，以全草入药。主要功效可保肺肾、补精髓、化痰止劳咳。用于肺肾两虚症，治疗肺结核、老人畏寒、咳嗽、衰弱、产妇及老人贫血、慢性肾炎等。常食冬虫草夏还可促进消化，调节免疫功能，增强人体对多种疾病的抵抗力。
国内外有一些人认为冬虫夏草就是由虫草属真菌寄生而且能够产生子座的菌物的结合体的通称。然而我国传统的中医药学以及绝大多数的学者所指明的冬虫夏草是分布在我国云贵高原、青藏高原以及边缘地区的高寒草甸，由中国被毛孢真菌寄生在虫草蝙蝠蛾昆虫幼体以后所形成的复合体，而其他种类的虫菌复合体只能叫“虫草”。
现代医学认为，冬虫夏草因含有多种生理和药理的活性物质，在临床应用研究中具有多方面功效。幸运的是人工液体发酵培养得到的虫草菌丝，经过药理、毒理、植化研究，证明其药理作用与化学组成和天然虫草基本相同，多年的临床应用证明冬虫夏草的替代品可以为冬虫夏草菌丝体，2000年版的中华人民共和国药典对此有明确的规定。
发明内容
解决的技术问题：
本发明的目的是提供一种蝙蝠蛾被毛孢菌丝体及其发酵技术，在西藏海拔3600米的情况下，跟野生虫草的生长坏境最接近，从而使产品的各种功效更加接近野生虫草，与野生虫草相比发酵虫草菌丝体在有效成分、重金属含量等各方面都十分明显的优势。
技术方案：
一种蝙蝠蛾被毛孢菌丝体的发酵技术，包括以下步骤：
(1)接种；
(2)一级种子罐培养；
(4)二级种子罐培养；
(4)发酵罐培养；
(5)离心；
(6)烘干，粉碎。
一种蝙蝠蛾被毛孢菌丝体的发酵技术，包括以下步骤：
(1)接种：在三角瓶中装入种子培养基，灭菌，冷却至室温，调节pH值到5.5-6.5，再将蝙蝠蛾被毛孢菌种接种在装有种子培养基的三角瓶中，然后放入温度为12-20℃的恒温摇床上以130-170转/分培养至菌丝浓度为20-30wt％，得到三角瓶发酵液；
(2)一级种子罐培养：在搅拌式发酵罐中装入一级种子罐培养基，灭菌，冷却至室温，调节pH值到5.5-6.5，再将三角瓶发酵液加入搅拌式发酵罐中，在温度为12-20℃，搅拌速度为130-170转/分，通气量为30-50L/min，保持罐压为0.03-0.1MPa，培养时间为10-15天，得到一级种子罐发酵液；
(5)二级种子罐培养：在搅拌式发酵罐中装入二级种子罐培养基，灭菌，冷却至室温，调节pH值到5.5-6.5，再将一级种子罐发酵液加入搅拌式发酵罐中，在温度为12-20℃，搅拌速度为130-170转/分，通气量为30-50L/min，保持罐压为0.03-0.1MPa，培养时间为10-15天，得到二级种子罐发酵液；
(4)发酵罐培养：将液体培养基装入发酵罐中，灭菌，冷却至室温，调节pH值到5.5-6.5，再将二级种子罐发酵液加入发酵罐中，在温度为12-20℃，搅拌速度为130-170转/分，通气量为30-50L/min，保持罐压为0.03-0.1MPa，培养时间为10-15天，得到发酵罐发酵液；
(5)离心：将发酵罐发酵液进行离心，弃上清液，得到沉淀物；
(6)将沉淀物烘干，粉碎即得。
一种蝙蝠蛾被毛孢菌丝体的发酵技术，包括以下步骤：
(1)接种：在容量为1000mL三角瓶中装入400-600mL种子培养基，在温度为120-125℃下灭菌25-35min，冷却至室温，调节pH值到5.5-6.5，再将蝙蝠蛾被毛孢菌种接种在装有400-600mL种子培养基的容量为1000mL三角瓶中，然后放入温度为12-20℃的恒温摇床上以130-170转/分培养至菌丝浓度为20-30wt％，得到三角瓶发酵液；
(2)一级种子罐培养：在容量为20L的搅拌式发酵罐中装入8-12L一级种子罐培养基，在温度为120-125℃下灭菌25-35min，冷却至室温，调节pH值到5.5-6.5，再将三角瓶发酵液加入容量为20L的搅拌式发酵罐中，在温度为12-20℃，搅拌速度为130-170转/分，通气量为30-50L/min，保持罐压为0.03-0.1MPa，培养时间为10-15天，得到一级种子罐发酵液；
(6)二级种子罐培养：在容量为200L的搅拌式发酵罐中装入80-120L二级种子罐培养基，在温度为120-125℃下灭菌25-35min，冷却至室温，调节pH值到5.5-6.5，再将一级种子罐发酵液加入容量为200L的搅拌式发酵罐中，在温度为12-20℃，搅拌速度为130-170转/分，通气量为30-50L/min，保持罐压为0.03-0.1MPa，培养时间为10-15天，得到二级种子罐发酵液；
(4)发酵罐培养：将1000-1500L液体培养基装入2000L发酵罐中，在温度为120-125℃下灭菌25-35min，冷却至室温，调节pH值到5.5-6.5，再将二级种子罐发酵液加入容量为2000L发酵罐中，在温度为12-20℃，搅拌速度为130-170转/分，通气量为30-50L/min，保持罐压为0.03-0.1MPa，培养时间为10-15天，得到发酵罐发酵液；
(5)离心：将发酵罐发酵液进行离心，弃上清液，得到沉淀物；
(6)将沉淀物烘干，粉碎即得。
所述烘干为在温度为70-90℃、真空度为110-150Pa下烘干24-72小时。
所述种子培养基、一级种子罐培养基、二级种子罐培养基、液体培养基均由下述重量份原料制备而成：葡萄糖、蛋白胨、玉米粉、磷酸二氢钾、硫酸镁、酵母膏、消泡剂、豆油、水。
所述种子培养基、一级种子罐培养基、二级种子罐培养基、液体培养基均由下述重量份原料制备而成：葡萄糖1-4份、蛋白胨1-4份、玉米粉1-4份、磷酸二氢钾0.1-1.0份、硫酸镁0.01-0.1份、酵母膏0.5-2.5份、消泡剂0.1-0.5份、豆油0.5-2.5份、水950-1050份。
进一步地，所述种子培养基、一级种子罐培养基、二级种子罐培养基、液体培养基均由下述重量份原料制备而成：葡萄糖1-4份、桑叶提取物0.2-2份、蛋白胨1-4份、玉米粉1-4份、磷酸二氢钾0.1-1.0份、硫酸镁0.01-0.1份、酵母膏0.5-2.5份、消泡剂0.1-0.5份、豆油0.5-2.5份、0.2-0.6份多糖、水950-1050份。
所述桑叶提取物的制备方法为：将桑叶粉碎，过10-20目筛，得到桑叶粉末；将桑叶粉末与质量分数为40-60％的乙醇水溶液以固液质量比1：(18-22)混合均匀后加入到三颈烧瓶中，在55-65℃水浴中回流浸提1.5-2.5小时，回流浸提的同时以转速为50-70转/分进行搅拌，离心，取上层清夜在真空度0.05-0.1MPa、温度为65-75℃下进行减压浓缩，浓缩至密度为1.02-1.12g/mL(25℃)，得到桑叶提取物。
进一步地，所述桑叶提取物的制备方法为：将桑叶粉碎，过10-20目筛，得到桑叶粉末；将桑叶粉末与水以固液质量比1：(18-22)混合均匀；在超声功率100-200W、超声频率35-45kHz的条件下于55-65℃超声提取1.5-2.5小时，离心，得到上层清夜A和下层沉淀；将下层沉淀与桑叶粉末重量18-22倍的质量分数为40-60％的乙醇水溶液混合均匀后加入到三颈烧瓶中，在55-65℃水浴中回流浸提1.5-2.5小时，回流浸提的同时以转速为50-70转/分进行搅拌，离心，得到上层清夜B；将上层清夜A和上层清夜B混合均匀在真空度0.05-0.1MPa、温度为65-75℃下进行减压浓缩，浓缩至密度为1.02-1.12g/mL(25℃)，得到桑叶提取物。
所述多糖为黑木耳多糖、香菇多糖中的一种或其混合物。在本发明一个实施例中，所述多糖由65-75wt％黑木耳多糖和25-35wt％香菇多糖组成。
本发明还提供了一种蝙蝠蛾被毛孢菌丝体，采用上述方法制作而成。
技术效果：
本发明蝙蝠蛾被毛孢菌丝体及其发酵技术，是目前西藏唯一的虫草菌丝体发酵技术，在海拔3600米的情况下，跟野生虫草的生长坏境最接近，从而使产品的各种功效更加接近野生虫草。与野生虫草相比发酵虫草菌丝体在有效成分、重金属含量等各方面都十分明显的优势，产生了巨大的社会效益和经济效益。
具体实施方式
虫草素和腺苷含量测定：参照郭涛、张龙、王兵、申鸿《不同培养基培育蛹虫草中的虫草素和腺苷含量测定》进行测试。
虫草多糖含量测定：参照许峰、吴玲芳、林善、王鸿艳等《发酵冬虫夏草菌丝体中虫草多糖含量的检测及结构鉴定》进行测试。
实施例中葡萄糖为山东淄博玉丰源制糖有限公司提供的葡萄糖粉。
实施例中蛋白胨为福建仙游三和生物科技有限公司提供医药级蛋白胨。
实施例中硫酸镁为江苏连云港口缘镁业有限公司提供的七水硫酸镁。
实施例中磷酸二氢钾由成都蓝剑化工有限公司提供。
实施例中消泡剂为宿州市华润化工有限责任公司提供SXP-106有机硅消泡剂。
实施例中豆油为浙江益海嘉里食品工业有限公司提供的金龙鱼大豆油。
实施例中酵母膏为浙江东成药业有限公司提供的酵母粉(发酵培养基专用)。
实施例中玉米粉为滨州金汇玉米开发有限公司提供的玉米淀粉。
实施例中桑叶为亳州百川药业有限公司提供的霜桑叶。
实施例中黑木耳多糖为杭州众芝康菇生物技术有限公司提供的含量为30wt％的黑木耳多糖。
实施例中香菇多糖为陕西藤迈生物科技有限责任公司提供的含量为30wt％的香菇多糖。
蝙蝠蛾被毛孢，Hirsutella hepiali Chen et Shen。该菌种系国家食品药品监督管理局2005.5.20颁布的真菌类保健食品申报与审评规定(试行)中，可用于保健食品的真菌菌种名单之一。也是目前全国唯一得到中国菌物学术界专家院士们公认的真正的冬虫夏草真菌菌种。本发明实施例中蝙蝠蛾被毛孢是从中国科学院微生物菌种保藏管理中心引种。
实施例1
蝙蝠蛾被毛孢菌丝体的发酵技术，包括以下步骤：
(1)接种：在容量为1000mL三角瓶中装入500mL种子培养基，在温度为121℃下灭菌30min，冷却至室温，调节pH值到6.0，再将蝙蝠蛾被毛孢菌种接种在装有500mL种子培养基的容量为1000mL三角瓶中，然后放入温度为18℃的恒温摇床上以150转/分培养至菌丝浓度为25wt％，得到三角瓶发酵液；
(2)一级种子罐培养：在容量为20L的搅拌式发酵罐中装入10L一级种子罐培养基，在温度为121℃下灭菌30min，冷却至室温，调节pH值到6.0，再将三角瓶发酵液加入容量为20L的搅拌式发酵罐中，在温度为18℃，搅拌速度为150转/分，无菌空气的通气量为40L/min，保持罐压为0.08MPa，培养时间为11天，得到一级种子罐发酵液；
(7)二级种子罐培养：在容量为200L的搅拌式发酵罐中装入100L二级种子罐培养基，在温度为121℃下灭菌30min，冷却至室温，调节pH值到6.0，再将一级种子罐发酵液加入容量为200L的搅拌式发酵罐中，在温度为18℃，搅拌速度为150转/分，无菌空气的通气量为40L/min，保持罐压为0.06MPa，培养时间为13天，得到二级种子罐发酵液；
(4)发酵罐培养：将1200L液体培养基装入2000L发酵罐中，在温度为121℃下灭菌30min，冷却至室温，调节pH值到6.0，再将二级种子罐发酵液加入容量为2000L发酵罐中，在温度为18℃，搅拌速度为150转/分，无菌空气的通气量为40L/min，保持罐压为0.08MPa，培养时间为12天，得到发酵罐发酵液；
(5)离心：将发酵罐发酵液以转速为5000转/分进行离心20min，弃上清液，得到沉淀物；
(6)将沉淀物在温度为80℃、真空度为120Pa下烘干48小时，粉碎至16目即得蝙蝠蛾被毛孢菌丝体。
所述种子培养基、一级种子罐培养基、二级种子罐培养基、液体培养基均由下述重量份原料制备而成：葡萄糖3份、蛋白胨2.5份、玉米粉3份、磷酸二氢钾0.6份、硫酸镁0.04份、酵母膏1.5份、消泡剂0.2份、豆油1.5份、蒸馏水1000份。将各原料加入水中混合均匀即得。
实施例2
蝙蝠蛾被毛孢菌丝体的发酵技术，包括以下步骤：
(1)接种：在容量为1000mL三角瓶中装入500mL种子培养基，在温度为121℃下灭菌30min，冷却至室温，调节pH值到6.0，再将蝙蝠蛾被毛孢菌种接种在装有500mL种子培养基的容量为1000mL三角瓶中，然后放入温度为18℃的恒温摇床上以150转/分培养至菌丝浓度为25wt％，得到三角瓶发酵液；
(2)一级种子罐培养：在容量为20L的搅拌式发酵罐中装入10L一级种子罐培养基，在温度为121℃下灭菌30min，冷却至室温，调节pH值到6.0，再将三角瓶发酵液加入容量为20L的搅拌式发酵罐中，在温度为18℃，搅拌速度为150转/分，无菌空气的通气量为40L/min，保持罐压为0.08MPa，培养时间为11天，得到一级种子罐发酵液；
(8)二级种子罐培养：在容量为200L的搅拌式发酵罐中装入100L二级种子罐培养基，在温度为121℃下灭菌30min，冷却至室温，调节pH值到6.0，再将一级种子罐发酵液加入容量为200L的搅拌式发酵罐中，在温度为18℃，搅拌速度为150转/分，无菌空气的通气量为40L/min，保持罐压为0.06MPa，培养时间为13天，得到二级种子罐发酵液；
(4)发酵罐培养：将1200L液体培养基装入2000L发酵罐中，在温度为121℃下灭菌30min，冷却至室温，调节pH值到6.0，再将二级种子罐发酵液加入容量为2000L发酵罐中，在温度为18℃，搅拌速度为150转/分，无菌空气的通气量为40L/min，保持罐压为0.08MPa，培养时间为12天，得到发酵罐发酵液；
(5)离心：将发酵罐发酵液以转速为5000转/分进行离心20min，弃上清液，得到沉淀物；
(6)将沉淀物在温度为80℃、真空度为120Pa下烘干48小时，粉碎至16目即得蝙蝠蛾被毛孢菌丝体。
所述种子培养基、一级种子罐培养基、二级种子罐培养基、液体培养基均由下述重量份原料制备而成：葡萄糖3份、桑叶提取物1份、蛋白胨2.5份、玉米粉3份、磷酸二氢钾0.6份、硫酸镁0.04份、酵母膏1.5份、消泡剂0.2份、豆油1.5份、黑木耳多糖0.4份、蒸馏水1000份。将各原料加入水中混合均匀即得。
所述桑叶提取物的制备方法为：将桑叶粉碎，过16目筛，得到桑叶粉末；将桑叶粉末与质量分数为50％的乙醇水溶液以固液质量比1：20混合均匀后加入到三颈烧瓶中，在60℃水浴中回流浸提2小时，回流浸提的同时以转速为60转/分进行搅拌，以转速为5000转/分进行离心20min，取上层清夜在真空度0.06MPa、温度为70℃下进行减压浓缩，浓缩至密度为1.08g/mL(25℃)，得到桑叶提取物。
实施例3
蝙蝠蛾被毛孢菌丝体的发酵技术，包括以下步骤：
(1)接种：在容量为1000mL三角瓶中装入500mL种子培养基，在温度为121℃下灭菌30min，冷却至室温，调节pH值到6.0，再将蝙蝠蛾被毛孢菌种接种在装有500mL种子培养基的容量为1000mL三角瓶中，然后放入温度为18℃的恒温摇床上以150转/分培养至菌丝浓度为25wt％，得到三角瓶发酵液；
(2)一级种子罐培养：在容量为20L的搅拌式发酵罐中装入10L一级种子罐培养基，在温度为121℃下灭菌30min，冷却至室温，调节pH值到6.0，再将三角瓶发酵液加入容量为20L的搅拌式发酵罐中，在温度为18℃，搅拌速度为150转/分，无菌空气的通气量为40L/min，保持罐压为0.08MPa，培养时间为11天，得到一级种子罐发酵液；
(9)二级种子罐培养：在容量为200L的搅拌式发酵罐中装入100L二级种子罐培养基，在温度为121℃下灭菌30min，冷却至室温，调节pH值到6.0，再将一级种子罐发酵液加入容量为200L的搅拌式发酵罐中，在温度为18℃，搅拌速度为150转/分，无菌空气的通气量为40L/min，保持罐压为0.06MPa，培养时间为13天，得到二级种子罐发酵液；
(4)发酵罐培养：将1200L液体培养基装入2000L发酵罐中，在温度为121℃下灭菌30min，冷却至室温，调节pH值到6.0，再将二级种子罐发酵液加入容量为2000L发酵罐中，在温度为18℃，搅拌速度为150转/分，无菌空气的通气量为40L/min，保持罐压为0.08MPa，培养时间为12天，得到发酵罐发酵液；
(5)离心：将发酵罐发酵液以转速为5000转/分进行离心20min，弃上清液，得到沉淀物；
(6)将沉淀物在温度为80℃、真空度为120Pa下烘干48小时，粉碎至16目即得蝙蝠蛾被毛孢菌丝体。
所述种子培养基、一级种子罐培养基、二级种子罐培养基、液体培养基均由下述重量份原料制备而成：葡萄糖3份、桑叶提取物1份、蛋白胨2.5份、玉米粉3份、磷酸二氢钾0.6份、硫酸镁0.04份、酵母膏1.5份、消泡剂0.2份、豆油1.5份、黑木耳多糖0.4份、蒸馏水1000份。将各原料加入水中混合均匀即得。
所述桑叶提取物的制备方法为：将桑叶粉碎，过16目筛，得到桑叶粉末；将桑叶粉末与水以固液质量比1：20混合均匀；在超声功率150W、超声频率40kHz的条件下于60℃超声提取2小时，以转速为5000转/分进行离心20min，取上层清夜在真空度0.06MPa、温度为70℃下进行减压浓缩，浓缩至密度为1.08g/mL(25℃)，得到桑叶提取物。
实施例4
蝙蝠蛾被毛孢菌丝体的发酵技术，包括以下步骤：
(1)接种：在容量为1000mL三角瓶中装入500mL种子培养基，在温度为121℃下灭菌30min，冷却至室温，调节pH值到6.0，再将蝙蝠蛾被毛孢菌种接种在装有500mL种子培养基的容量为1000mL三角瓶中，然后放入温度为18℃的恒温摇床上以150转/分培养至菌丝浓度为25wt％，得到三角瓶发酵液；
(2)一级种子罐培养：在容量为20L的搅拌式发酵罐中装入10L一级种子罐培养基，在温度为121℃下灭菌30min，冷却至室温，调节pH值到6.0，再将三角瓶发酵液加入容量为20L的搅拌式发酵罐中，在温度为18℃，搅拌速度为150转/分，无菌空气的通气量为40L/min，保持罐压为0.08MPa，培养时间为11天，得到一级种子罐发酵液；
(10)二级种子罐培养：在容量为200L的搅拌式发酵罐中装入100L二级种子罐培养基，在温度为121℃下灭菌30min，冷却至室温，调节pH值到6.0，再将一级种子罐发酵液加入容量为200L的搅拌式发酵罐中，在温度为18℃，搅拌速度为150转/分，无菌空气的通气量为40L/min，保持罐压为0.06MPa，培养时间为13天，得到二级种子罐发酵液；
(4)发酵罐培养：将1200L液体培养基装入2000L发酵罐中，在温度为121℃下灭菌30min，冷却至室温，调节pH值到6.0，再将二级种子罐发酵液加入容量为2000L发酵罐中，在温度为18℃，搅拌速度为150转/分，无菌空气的通气量为40L/min，保持罐压为0.08MPa，培养时间为12天，得到发酵罐发酵液；
(5)离心：将发酵罐发酵液以转速为5000转/分进行离心20min，弃上清液，得到沉淀物；
(6)将沉淀物在温度为80℃、真空度为120Pa下烘干48小时，粉碎至16目即得蝙蝠蛾被毛孢菌丝体。
所述种子培养基、一级种子罐培养基、二级种子罐培养基、液体培养基均由下述重量份原料制备而成：葡萄糖3份、桑叶提取物1份、蛋白胨2.5份、玉米粉3份、磷酸二氢钾0.6份、硫酸镁0.04份、酵母膏1.5份、消泡剂0.2份、豆油1.5份、黑木耳多糖0.4份、蒸馏水1000份。将各原料加入水中混合均匀即得。
所述桑叶提取物的制备方法为：将桑叶粉碎，过16目筛，得到桑叶粉末；将桑叶粉末与水以固液质量比1：20混合均匀；在超声功率150W、超声频率40kHz的条件下于60℃超声提取2小时，以转速为5000转/分进行离心20min，得到上层清夜A和下层沉淀；将下层沉淀与桑叶粉末重量20倍的质量分数为50％的乙醇水溶液混合均匀后加入到三颈烧瓶中，在60℃水浴中回流浸提2小时，回流浸提的同时以转速为60转/分进行搅拌，以转速为5000转/分进行离心20min，得到上层清夜B；将上层清夜A和上层清夜B混合均匀在真空度0.06MPa、温度为70℃下进行减压浓缩，浓缩至密度为1.08g/mL(25℃)，得到桑叶提取物。
实施例5
蝙蝠蛾被毛孢菌丝体的发酵技术，包括以下步骤：
(1)接种：在容量为1000mL三角瓶中装入500mL种子培养基，在温度为121℃下灭菌30min，冷却至室温，调节pH值到6.0，再将蝙蝠蛾被毛孢菌种接种在装有500mL种子培养基的容量为1000mL三角瓶中，然后放入温度为18℃的恒温摇床上以150转/分培养至菌丝浓度为25wt％，得到三角瓶发酵液；
(2)一级种子罐培养：在容量为20L的搅拌式发酵罐中装入10L一级种子罐培养基，在温度为121℃下灭菌30min，冷却至室温，调节pH值到6.0，再将三角瓶发酵液加入容量为20L的搅拌式发酵罐中，在温度为18℃，搅拌速度为150转/分，无菌空气的通气量为40L/min，保持罐压为0.08MPa，培养时间为11天，得到一级种子罐发酵液；
(11)二级种子罐培养：在容量为200L的搅拌式发酵罐中装入100L二级种子罐培养基，在温度为121℃下灭菌30min，冷却至室温，调节pH值到6.0，再将一级种子罐发酵液加入容量为200L的搅拌式发酵罐中，在温度为18℃，搅拌速度为150转/分，无菌空气的通气量为40L/min，保持罐压为0.06MPa，培养时间为13天，得到二级种子罐发酵液；
(4)发酵罐培养：将1200L液体培养基装入2000L发酵罐中，在温度为121℃下灭菌30min，冷却至室温，调节pH值到6.0，再将二级种子罐发酵液加入容量为2000L发酵罐中，在温度为18℃，搅拌速度为150转/分，无菌空气的通气量为40L/min，保持罐压为0.08MPa，培养时间为12天，得到发酵罐发酵液；
(5)离心：将发酵罐发酵液以转速为5000转/分进行离心20min，弃上清液，得到沉淀物；
(6)将沉淀物在温度为80℃、真空度为120Pa下烘干48小时，粉碎至16目即得蝙蝠蛾被毛孢菌丝体。
所述种子培养基、一级种子罐培养基、二级种子罐培养基、液体培养基均由下述重量份原料制备而成：葡萄糖3份、桑叶提取物1份、蛋白胨2.5份、玉米粉3份、磷酸二氢钾0.6份、硫酸镁0.04份、酵母膏1.5份、消泡剂0.2份、豆油1.5份、香菇多糖0.4份、蒸馏水1000份。将各原料加入水中混合均匀即得。
所述桑叶提取物的制备方法为：将桑叶粉碎，过16目筛，得到桑叶粉末；将桑叶粉末与水以固液质量比1：20混合均匀；在超声功率150W、超声频率40kHz的条件下于60℃超声提取2小时，以转速为5000转/分进行离心20min，得到上层清夜A和下层沉淀；将下层沉淀与桑叶粉末重量20倍的质量分数为50％的乙醇水溶液混合均匀后加入到三颈烧瓶中，在60℃水浴中回流浸提2小时，回流浸提的同时以转速为60转/分进行搅拌，以转速为5000转/分进行离心20min，得到上层清夜B；将上层清夜A和上层清夜B混合均匀在真空度0.06MPa、温度为70℃下进行减压浓缩，浓缩至密度为1.08g/mL(25℃)，得到桑叶提取物。
实施例6
蝙蝠蛾被毛孢菌丝体的发酵技术，包括以下步骤：
(1)接种：在容量为1000mL三角瓶中装入500mL种子培养基，在温度为121℃下灭菌30min，冷却至室温，调节pH值到6.0，再将蝙蝠蛾被毛孢菌种接种在装有500mL种子培养基的容量为1000mL三角瓶中，然后放入温度为18℃的恒温摇床上以150转/分培养至菌丝浓度为25wt％，得到三角瓶发酵液；
(2)一级种子罐培养：在容量为20L的搅拌式发酵罐中装入10L一级种子罐培养基，在温度为121℃下灭菌30min，冷却至室温，调节pH值到6.0，再将三角瓶发酵液加入容量为20L的搅拌式发酵罐中，在温度为18℃，搅拌速度为150转/分，无菌空气的通气量为40L/min，保持罐压为0.08MPa，培养时间为11天，得到一级种子罐发酵液；
(12)二级种子罐培养：在容量为200L的搅拌式发酵罐中装入100L二级种子罐培养基，在温度为121℃下灭菌30min，冷却至室温，调节pH值到6.0，再将一级种子罐发酵液加入容量为200L的搅拌式发酵罐中，在温度为18℃，搅拌速度为150转/分，无菌空气的通气量为40L/min，保持罐压为0.06MPa，培养时间为13天，得到二级种子罐发酵液；
(4)发酵罐培养：将1200L液体培养基装入2000L发酵罐中，在温度为121℃下灭菌30min，冷却至室温，调节pH值到6.0，再将二级种子罐发酵液加入容量为2000L发酵罐中，在温度为18℃，搅拌速度为150转/分，无菌空气的通气量为40L/min，保持罐压为0.08MPa，培养时间为12天，得到发酵罐发酵液；
(5)离心：将发酵罐发酵液以转速为5000转/分进行离心20min，弃上清液，得到沉淀物；
(6)将沉淀物在温度为80℃、真空度为120Pa下烘干48小时，粉碎至16目即得蝙蝠蛾被毛孢菌丝体。蝙蝠蛾被毛孢菌丝体测试结果：虫草素含量为0.75％，虫草多糖含量为27.9％，虫草酸含量为16.3％，氨基酸含量为181mg/g，腺苷含量0.78％。
所述种子培养基、一级种子罐培养基、二级种子罐培养基、液体培养基均由下述重量份原料制备而成：葡萄糖3份、桑叶提取物1份、蛋白胨2.5份、玉米粉3份、磷酸二氢钾0.6份、硫酸镁0.04份、酵母膏1.5份、消泡剂0.2份、豆油1.5份、黑木耳多糖0.28份、香菇多糖0.12份、蒸馏水1000份。将各原料加入水中混合均匀即得。
所述桑叶提取物的制备方法为：将桑叶粉碎，过16目筛，得到桑叶粉末；将桑叶粉末与水以固液质量比1：20混合均匀；在超声功率150W、超声频率40kHz的条件下于60℃超声提取2小时，以转速为5000转/分进行离心20min，得到上层清夜A和下层沉淀；将下层沉淀与桑叶粉末重量20倍的质量分数为50％的乙醇水溶液混合均匀后加入到三颈烧瓶中，在60℃水浴中回流浸提2小时，回流浸提的同时以转速为60转/分进行搅拌，以转速为5000转/分进行离心20min，得到上层清夜B；将上层清夜A和上层清夜B混合均匀在真空度0.06MPa、温度为70℃下进行减压浓缩，浓缩至密度为1.08g/mL(25℃)，得到桑叶提取物。
测试例1
对实施例1-5制备的蝙蝠蛾被毛孢菌丝体进行测试，具体测试结果见表1。
表1：测试结果表
本发明是目前西藏唯一的虫草菌丝体发酵技术，在海拔3600米的情况下，跟野生虫草的生长坏境最接近，从而使产品的各种功效更加接近野生虫草。与野生虫草相比发酵虫草菌丝体在有效成分、重金属含量等各方面都十分明显的优势，产生了巨大的社会效益和经济效益。通过大量试验，考察筛选出蝙蝠蛾被毛孢的最适生长条件，在确定最佳生长条件后，创造性的选用植物源提取物，考察植物源提取物的种类、添加量和菌体收获时间对蝙蝠蛾被毛孢生长的影响，并利用这三种因素中的最优水平进行正交试验，来实现蝙蝠蛾被毛孢的培养。
Claims (2)
1.一种蝙蝠蛾被毛孢菌丝体的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)接种：在容量为1000mL三角瓶中装入400-600mL种子培养基，在温度为120-125℃下灭菌25-35min，冷却至室温，调节pH值到5.5-6.5，再将蝙蝠蛾被毛孢菌种接种在装有400-600mL种子培养基的容量为1000mL三角瓶中，然后放入温度为12-20℃的恒温摇床上以130-170转/分培养至菌丝浓度为20-30wt％，得到三角瓶发酵液；
(2)一级种子罐培养：在容量为20L的搅拌式发酵罐中装入8-12L一级种子罐培养基，在温度为120-125℃下灭菌25-35min，冷却至室温，调节pH值到5.5-6.5，再将三角瓶发酵液加入容量为20L的搅拌式发酵罐中，在温度为12-20℃，搅拌速度为130-170转/分，通气量为30-50L/min，保持罐压为0.03-0.1MPa，培养时间为10-15天，得到一级种子罐发酵液；
(3)二级种子罐培养：在容量为200L的搅拌式发酵罐中装入80-120L二级种子罐培养基，在温度为120-125℃下灭菌25-35min，冷却至室温，调节pH值到5.5-6.5，再将一级种子罐发酵液加入容量为200L的搅拌式发酵罐中，在温度为12-20℃，搅拌速度为130-170转/分，通气量为30-50L/min，保持罐压为0.03-0.1MPa，培养时间为10-15天，得到二级种子罐发酵液；
(4)发酵罐培养：将1000-1500L液体培养基装入2000L发酵罐中，在温度为120-125℃下灭菌25-35min，冷却至室温，调节pH值到5.5-6.5，再将二级种子罐发酵液加入容量为2000L发酵罐中，在温度为12-20℃，搅拌速度为130-170转/分，通气量为30-50L/min，保持罐压为0.03-0.1MPa，培养时间为10-15天，得到发酵罐发酵液；
(5)离心：将发酵罐发酵液进行离心，弃上清液，得到沉淀物；
(6)将沉淀物烘干，粉碎即得；
所述种子培养基、一级种子罐培养基、二级种子罐培养基、液体培养基均由下述重量份原料制备而成：葡萄糖1-4份、桑叶提取物0.2-2份、蛋白胨1-4份、玉米粉1-4份、磷酸二氢钾0.1-1.0份、硫酸镁0.01-0.1份、酵母膏0.5-2.5份、消泡剂0.1-0.5份、豆油0.5-2.5份、0.2-0.6份多糖、水950-1050份；
所述桑叶提取物的制备方法为：将桑叶粉碎，过10-20目筛，得到桑叶粉末；将桑叶粉末与水以固液质量比1：(18-22)混合均匀；在超声功率100-200W、超声频率35-45kHz的条件下于55-65℃超声提取1.5-2.5小时，离心，得到上层清夜A和下层沉淀；将下层沉淀与桑叶粉末重量18-22倍的质量分数为40-60％的乙醇水溶液混合均匀后加入到三颈烧瓶中，在55-65℃水浴中回流浸提1.5-2.5小时，回流浸提的同时以转速为50-70转/分进行搅拌，离心，得到上层清夜B；将上层清夜A和上层清夜B混合均匀在真空度0.05-0.1MPa、温度为65-75℃下进行减压浓缩，浓缩至在25℃时的密度为1.02-1.12g/mL，得到桑叶提取物；
所述多糖为黑木耳多糖、香菇多糖中的一种或其混合物。
2.如权利要求1所述蝙蝠蛾被毛孢菌丝体的发酵方法，其特征在于：所述烘干为在温度为70-90℃、真空度为110-150Pa下烘干24-72小时。
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