CN101914455A - 一种盘长孢菌的生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种盘长孢菌的生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：(1)菌种的制备；(2)培养基的制备；(3)将步骤(1)中制备的菌种与步骤(2)中制备的培养基进行混合，并搅拌均匀；(4)分装到曲盘进行发酵、培养；(5)晾干或者风干；(6)粉碎；(7)活菌数检测；(8)包装储藏。本发明的优点为：用本方法生产的盘长孢菌剂对菟丝子具有杀灭专一性强、杀灭彻底、时效长的特点，对人体和作物无害，不破坏环境，是一种无毒、高效、环境友好的生物除草剂。
Description
技术领域
本发明为一种盘长孢菌的生产工艺，适用于生产杀灭寄生性杂草菟丝子的真菌孢子。
背景技术
菟丝子是一种恶性寄生杂草，是国际植物病害检疫对象。世界上共发现200余种菟丝子，在我国发现的有10多种，分布在新疆、宁夏、四川、陕西、内蒙古、山西、河北、山东、江苏、浙江、广东、广西、东北三省、台湾等地区。菟丝子可在棉花、大豆、辣椒、甜菜、西红柿、桂圆、冬青、扶芳藤、榛子、连翘等多种农作物、园艺植物和药用植物上寄生。被寄生的植物轻则减产20-30％，严重的甚至颗粒无收。目前在我国登记的可以杀灭菟丝子的农药只有一种。但是使用农药来杀灭菟丝子，实际使用效果较差，杀灭率低，专一性差，对生产作物有不良影响；而且有农药残留问题，给人体健康和环境带来危害。
发明内容
为克服现有技术的弊端，本发明提供一种对菟丝子具有杀灭专一性强、杀灭彻底、时效长而且对人体和作物无害，不破坏环境的盘长孢菌的生产工艺。本发明的技术方案是：一种盘长孢菌的生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：
(1)菌种的制备；制备一级斜面菌种：
土豆培养基制作：用新鲜土豆去皮后称取200克，切成约半厘米见方的小块，加入到1000毫升水中，煮沸后保持沸腾半小时，然后用两层纱布过滤，滤液补足水分到1000毫升，加入葡萄糖20克，搅拌将葡萄糖溶解。然后加入20克琼脂粉，加热将琼脂粉溶解，然后分装到试管中，121℃下高压灭菌20分钟，灭菌后趁热摆成斜面，凝固后即成土豆斜面培养基。
或者采用菟丝子种子培养基：将20克菟丝子种子在800毫升水中煮沸，保持沸腾半小时，然后用两层纱布过滤，其余操作同土豆培养基斜面制作。
斜面长度以占试管的1/3-1/2为宜。在无菌条件下将盘长孢菌接种到斜面上，在25-27℃下避光培养3天。
制备二级液体菌种
菟丝子种子液体培养基配方：粉碎后的菟丝子种子1％，淀粉2％，玉米浆4％，葡萄糖1％，蛋白胨0.1％，硫酸铵1％，碳酸钙0.4％，硫酸镁0.04％，磷酸氢二钾0.1％。加水溶解后分装至三角瓶中，装量为三角瓶容量的1/3到1/5。
将上述培养基在121℃下高压灭菌30分钟，待温度降低到30℃时即可接种。在无菌条件下，将一级斜面菌种用无菌水洗下后倒入三角瓶中，每个斜面菌种可接种3-5个1000毫升的三角瓶。然后在摇床上，以28℃、250转/分钟，避光培养48小时。即为二级液体菌种。制备三级生产用菌种
在发酵罐中制备生产用菌种，发酵罐液体培养基配方：淀粉2％，葡萄糖1％，玉米浆3％，硫酸铵0.3％，蛋白胨0.1％，碳酸钙0.4％，氯化钠0.3％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸镁0.03％，豆油0.3％。培养基在121℃高压灭菌30分钟，待培养基温度降低至30℃时，将二级液体菌种以无菌操作接入。接种比例为2％，即每2升二级液体菌种可接种100升生产用液体培养基。发酵罐培养控制参数为：温度28℃，罐压0.5公斤/厘米2，通气量1∶0.5(即1吨的发酵液，通气量为每分钟500升无菌空气)，连续通气培养48小时。
(2)培养基的制备；
(3)将步骤(1)中制备的菌种与步骤(2)中制备的培养基进行混合，并搅拌均匀；
(4)分装到曲盘进行发酵、培养；
(2)至(4)的具体过程如下：将麸皮60％，豆饼面20％，玉米面20％，另加水80％。先将固体原料混合均匀，然后加水混合均匀，分装在透气的棉布袋中，每袋装量不超过5公斤，然后在121℃高压灭菌1小时。待培养基温度降低至30℃时，将三级生产用菌种按10％的比例接种入固体培养基，搅拌均匀，分装在曲盘中，曲盘上先用4层灭过菌的纱布铺底，每盘中所装培养基高度不超过3厘米，上面再盖4层灭过菌的纱布。将曲盘放在发酵间在25-27℃避光培养3天，然后在30℃下避光培养1天。接种后12小时内采用间歇通风，半小时一次，每次10-15分钟。风压控制在10-15毫米水银柱。室内相对湿度95％，料温27℃。接种后12小时到24小时，通风时间逐渐延长，风压控制在40-80毫米水银柱。24小时后，风压控制在120-160毫米水银柱，相对湿度为95％。接种后60-72小时，降低湿度，提高风压，加大风量，促进孢子成熟，料温30℃，相对湿度60-70％。
(5)晾干或者风干：将菌剂在荫凉无阳光直射处晾干，至水分含量在12％以下；或者用鼓风机将菌剂吹干至水分降低到8％以下。
(6)粉碎：使用转速不超过3000转/分钟的粉碎机将晾干的菌剂粉碎。
(7)活菌数检测：检测活菌数使用血球计数板。方法如下：随机从粉碎后的菌剂中抽取10次，每次抽取大约10克左右，混匀。从中称取20克，用两层纱布包起。用洁净的水将纱布包浸泡20分钟，期间要不停的揉搓纱布包并用水冲洗。将洗液搅匀，在血球计数板上盖好盖玻片，用吸管吸取洗出的孢子液，使其沿着血球计数板的缝隙滴入计数室。在400-600倍视野下，计数血球计数板上的四角和中间的共5个中格，将计数结果乘以104即为每克含菌数。如果遇到菌在双线上，则只需计数相邻两边的菌数即可。
(8)包装储藏：按市场需要分装成合适重量，用不透光的塑料袋或者布袋盛装。附上说明书，注明生产日期、成品含菌数、使用时的兑水量。在荫凉干燥处储藏，避免阳光直射。
本发明的优点为：用本方法生产的盘长孢菌剂对菟丝子具有杀灭专一性强、杀灭彻底、时效长的特点，对人体和作物无害，不破坏环境，是一种无毒、高效、环境友好的生物除草剂。
附图说明
图1是本发明的生产工艺流程图。
具体实施方式
一种盘长孢菌的生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：
(1)菌种的制备；制备一级斜面菌种：
土豆培养基制作：用新鲜土豆去皮后称取200克，切成约半厘米见方的小块，加入到1000毫升水中，煮沸后保持沸腾半小时，然后用两层纱布过滤，滤液补足水分到1000毫升，加入葡萄糖20克，搅拌将葡萄糖溶解。然后加入20克琼脂粉，加热将琼脂粉溶解，然后分装到试管中，121℃下高压灭菌20分钟，灭菌后趁热摆成斜面，凝固后即成土豆斜面培养基。
或者采用菟丝子种子培养基：将20克菟丝子种子在800毫升水中煮沸，保持沸腾半小时，然后用两层纱布过滤，其余操作同土豆培养基斜面制作。
斜面长度以占试管的1/3-1/2为宜。在无菌条件下将盘长孢菌接种到斜面上，在25-27℃下避光培养3天。
制备二级液体菌种
菟丝子种子液体培养基配方：粉碎后的菟丝子种子1％，淀粉2％，玉米浆4％，葡萄糖1％，蛋白胨0.1％，硫酸铵1％，碳酸钙0.4％，硫酸镁0.04％，磷酸氢二钾0.1％。加水溶解后分装至三角瓶中，装量为三角瓶容量的1/3到1/5。
将上述培养基在121℃下高压灭菌30分钟，待温度降低到30℃时即可按种。在无菌条件下，将一级斜面菌种用无菌水洗下后倒入三角瓶中，每个斜面菌种可接种3-5个1000毫升的三角瓶。然后在摇床上，以28℃、250转/分钟，避光培养48小时。即为二级液体菌种。
制备三级生产用菌种
在发酵罐中制备生产用菌种，发酵罐液体培养基配方：淀粉2％，葡萄糖1％，玉米浆3％，硫酸铵0.3％，蛋白胨0.1％，碳酸钙0.4％，氯化钠0.3％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸镁0.03％，豆油0.3％。培养基在121℃高压灭菌30分钟，待培养基温度降低至30℃时，将二级液体菌种以无菌操作接入。接种比例为2％，即每2升二级液体菌种可接种100升生产用液体培养基。发酵罐培养控制参数为：温度28℃，罐压0.5公斤/厘米2，通气量1∶0.5(即1吨的发酵液，通气量为每分钟500升无菌空气)，连续通气培养48小时。
(2)培养基的制备；
(3)将步骤(1)中制备的菌种与步骤(2)中制备的培养基进行混合，并搅拌均匀；
(4)分装到曲盘进行发酵、培养；
(2)至(4)的具体过程如下：将麸皮60％，豆饼面20％，玉米面20％，另加水80％。先将固体原料混合均匀，然后加水混合均匀，分装在透气的棉布袋中，每袋装量不超过5公斤，然后在121℃高压灭菌1小时。待培养基温度降低至30℃时，将三级生产用菌种按10％的比例接种入固体培养基，搅拌均匀，分装在曲盘中，曲盘上先用4层灭过菌的纱布铺底，每盘中所装培养基高度不超过3厘米，上面再盖4层灭过菌的纱布。将曲盘放在发酵间在25-27℃避光培养3天，然后在30℃下避光培养1天。接种后12小时内采用间歇通风，半小时一次，每次10-15分钟。风压控制在10-15毫米水银柱。室内相对湿度95％，料温27℃。接种后12小时到24小时，通风时间逐渐延长，风压控制在40-80毫米水银柱。24小时后，风压控制在120-160毫米水银柱，相对湿度为95％。接种后60-72小时，降低湿度，提高风压，加大风量，促进孢子成熟，料温30℃，相对湿度60-70％。
(5)晾干或者风干：将菌剂在荫凉无阳光直射处晾干，至水分含量在12％以下；或者用鼓风机将菌剂吹干至水分降低到8％以下。
(6)粉碎：使用转速不超过3000转/分钟的粉碎机将晾干的菌剂粉碎。
(7)活菌数检测：检测活菌数使用血球计数板。方法如下：随机从粉碎后的菌剂中抽取10次，每次抽取大约10克左右，混匀。从中称取20克，用两层纱布包起。用洁净的水将纱布包浸泡20分钟，期间要不停的揉搓纱布包并用水冲洗。将洗液搅匀，在血球计数板上盖好盖玻片，用吸管吸取洗出的孢子液，使其沿着血球计数板的缝隙滴入计数室。在400-600倍视野下，计数血球计数板上的四角和中间的共5个中格，将计数结果乘以104即为每克含菌数。如果遇到菌在双线上，则只需计数相邻两边的菌数即可。
(8)包装储藏：按市场需要分装成合适重量，用不透光的塑料袋或者布袋盛装。附上说明书，注明生产日期、成品含菌数、使用时的兑水量。在荫凉干燥处储藏，避免阳光直射。
本发明生产菌剂的使用方法
1.使用方法：将菌剂成品用纱布包好，在洁净水中浸泡半小时，期间用手轻轻揉搓纱布包，并反复用水冲洗几次，尽量把菌剂洗脱下来。将滤液兑水后即可装喷雾器使用。按照菌剂含量，每克含菌数1亿/克的菌剂每公斤可兑水5公斤，含菌数不同的菌剂依此比例计算兑水量。喷雾器要清洗干净，不能有农药残留。菌剂要现配现用。
2.喷打方法和时间：在菟丝子刚缠绕植株时即可喷药。喷药时先用喷雾器喷头挑断菟丝子茎，造成伤口后再喷药效果更好。喷药时间要在早晨或者傍晚，避免在阳光直射下喷药。小雨天也可喷药，但是下大雨时不可喷药。
3.药效：喷药后3天左右，菟丝子开始萎蔫，出现水浸状。菌剂感染处凹陷，出现褐色斑点。5天左右菟丝子上的病灶蔓延相连，7-10天菟丝子有明显枯死。20天后受菟丝子寄生植株恢复生长，菟丝子枯死脱落。
4.实施例1：
我们在河北省唐山市乐亭县被菟丝子寄生的冬青上使用本方法生产的菌剂，效果明显。打药后5天，菟丝子枯萎死亡，冬青未受影响。10天后，冬青恢复生长。
实施例2：
在广西兴业县农业局下属的桂圆种植园使用本方法生产的菌剂，效果明显。打药3天后，菟丝子大部分已死亡，经手工将枯死的菟丝子从桂圆上取下后，经过5天后，桂圆恢复正常生长。
Claims (10)
1.一种盘长孢菌的生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：
(1)菌种的制备；
(2)培养基的制备；
(3)将步骤(1)中制备的菌种与步骤(2)中制备的培养基进行混合，并搅拌均匀；
(4)分装到曲盘进行发酵、培养；
(5)晾干或者风干；
(6)粉碎；
(7)活菌数检测；
(8)包装储藏。
2.根据权利要求1所述的一种盘长孢菌的生产工艺，其特征在于，所述步骤(1)中包括以下步骤：
a.一级斜面菌种的制备：以土豆斜面培养基或菟丝子种子斜面培养基在25-27℃避光培养3天，即得。
b.二级液体菌种的制备：将下述原料：粉碎后的菟丝子种子1％，淀粉2％，玉米浆4％，葡萄糖1％，蛋白胨0.1％，硫酸铵1％，碳酸钙0.4％，硫酸镁0.04％，磷酸氢二钾0.1％，加水溶解后分装至三角瓶中，每一三角瓶的原料容量的装量为三角瓶容量的1/3到1/5。将上述培养基在121℃下高压灭菌30分钟，待温度降低到30℃时即可接种，在无菌条件下，将一级斜面菌种用无菌水洗下后倒入三角瓶中，每个斜面菌种可接种3-5个1000毫升的三角瓶。然后在摇床上，以28℃、250转/分钟，避光培养48小时，即得二级液体菌种。
c.三级生产用菌种的制备：是在发酵罐中进行制备的，发酵罐液体培养基配方：淀粉2％，葡萄糖1％，玉米浆3％，硫酸铵0.3％，蛋白胨0.1％，碳酸钙0.4％，氯化钠0.3％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸镁0.03％，豆油0.3％。培养基在121℃高压灭菌30分钟，待培养基温度降低至30℃时，将二级液体菌种以无菌操作接入。接种比例为2％，即每2升二级液体菌种可接种100升生产用液体培养基。发酵罐培养控制参数为：温度28℃，罐压0.5公斤/厘米2，通气量1∶0.5，连续通气培养48小时，即得生产用菌种。
3.根据权利要求1所述的一种盘长孢菌的生产工艺，其特征在于，所述步骤(2)中包括以下步骤：将麸皮60％，豆饼面20％，玉米面20％进行混合均匀，然后另加水80％，成糊状，分装在透气的棉布袋中，上述固体原料每袋装量不超过5公斤，然后在121℃高压灭菌1小时。
4.根据权利要求1所述的一种盘长孢菌的生产工艺，其特征在于，所述步骤(3)和(4)中包括以下步骤：待步骤(2)的培养基温度降低至30℃时，将三级生产用菌种按10％的比例接种入固体培养基，搅拌均匀，然后分装在曲盘中，曲盘上先用4层灭过菌的纱布铺底，每盘中所装培养基高度不超过3厘米，上面再盖4层灭过菌的纱布。将曲盘放在发酵间在25-27℃避光培养3天，然后在30℃下避光培养1天；接种后12小时内采用间歇通风，半小时一次，每次10-15分钟，风压控制在10-15毫米水银柱，室内相对湿度95％，料温27℃；接种后12小时到24小时，通风时间逐渐延长，风压控制在40-80毫米水银柱；24小时后，风压控制在120-160毫米水银柱，相对湿度为95％；接种后60-72小时，降低湿度，提高风压，加大风量，促进孢子成熟，料温30℃，相对湿度60-70％。
5.根据权利要求1所述的一种盘长孢菌的生产工艺，其特征在于，所述的步骤(5)为将菌剂在荫凉无阳光直射处晾干，至水分含量在12％以下；或者用鼓风机将菌剂吹干至水分降低到8％以下。
6.根据权利要求1所述的一种盘长孢菌的生产工艺，其特征在于，所述的步骤(6)中使用转速不超过3000转/分钟的粉碎机将晾干的菌剂粉碎。
7.根据权利要求1所述的一种盘长孢菌的生产工艺，其特征在于，所述的步骤(7)为待固体发酵第4天后，检测活菌数，大于2亿/克即为合格产品。
8.根据权利要求2所述的一种盘长孢菌的生产工艺，其特征在于，所述的步骤a中采用土豆培养基制作：用新鲜土豆去皮后称取200克，切成约半厘米见方的小块，加入到1000毫升水中，煮沸后保持沸腾半小时，然后用两层纱布过滤，滤液补足水分到1000毫升，加入葡萄糖20克，搅拌将葡萄糖溶解。然后加入20克琼脂粉，加热将琼脂粉溶解，然后分装到试管中，121℃下高压灭菌20分钟，灭菌后趁热摆成斜面，凝固后即成土豆斜面培养基，作为一级斜面菌种。
9.根据权利要求2所述的一种盘长孢菌的生产工艺，其特征在于，所述的步骤a中菟丝子种子培养基：将20克菟丝子种子在800毫升水中煮沸，保持沸腾半小时，然后用两层纱布过滤滤液补足水分到1000毫升，加入葡萄糖20克，搅拌将葡萄糖溶解。然后加入20克琼脂粉，加热将琼脂粉溶解，然后分装到试管中，121℃下高压灭菌20分钟，灭菌后趁热摆成斜面，凝固后即成菟丝子斜面培养基，一级斜面菌种。
10.根据权利8或9所述的一种盘长孢菌的生产工艺，其特征在于，所述的斜面长度以占试管的1/3-1/2。
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|---|---|---|---|---|
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