CN106701867B - 一种提高尼可霉素产量的方法 - Google Patents
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Abstract
一种提高尼可霉素产量的方法。本发明涉及微生物领域，具体提供了一种圈卷产色链霉菌发酵培养基以及利用该培养基制备尼可霉素的方法。本发明通过向发酵培养基中添加适量吐温80，并进一步优化发酵培养基各具体组分的种类和用量，以及控制其他培养条件，提高尼可霉素的产量。本发明尼可霉素的产量可高达42600μg/mL，且方案简单、成本低廉，适用于工业化大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体提供了一种圈卷产色链霉菌发酵培养基以及利用该培养基制备尼可霉素的方法。
背景技术
尼可霉素是重要的肽基核苷类抗生素，其对农作物、果蔬及一些经济植物的真菌病害有良好的防治作用，并且对环境友好，适宜在农业生产中大规模推广使用。传统的制备方法汇总，通常采取诱变筛选优良菌株的方式来提高尼可霉素的产量，但是这种方式，具有不确定因素多，筛选工作大，育种缓慢，难以有效提高尼可霉素产量的缺点。
尼可霉素与几丁质合成酶的天然底物UDP-N-乙酰葡萄糖胺具有类似的结构，而竞争性地抑制几丁质合成酶，表现出抗真菌、杀昆虫和杀螨虫等多种生物活性。同时,尼可霉素对哺乳动物、蜜蜂、植物和细菌等毒性极低，且在自然界中易被降解，而被认为是一种理想的农用抗生素。最近的研究表明它对一些危及生命的几种致病真菌也有明显的抑制作用，可用于人体深部真菌感染疾病的治疗。
目前，现有技术制备尼可霉素的方法存在产量低、原料消耗较大的问题。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明旨在于提供一种圈卷产色链霉菌发酵培养基以及利用该培养基制备尼可霉素的方法。
本发明所使用的本发明所使用的圈卷产色链霉菌BJX005，已于2015年2月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.10523，分类命名为圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)。
圈卷产色链霉菌BJX005菌株，孢子丝钩状或圈卷很少成圈环。孢子球形、椭圆形。
本发明提供了一种利用圈卷产色链霉菌制备尼可霉素的方法，包含以下步骤:
步骤(1)：将保藏编号为CGMCC No.10523的圈卷产色链霉菌BJX005的种子液接种于含有质量浓度为0.01％～0.03％的吐温80的发酵培养基中进行发酵培养，得发酵液；
步骤(2)：从所述发酵液中提取尼可霉素。
本发明适量吐温80的加入，可以与发酵培养基的其他组分发生良好的协同作用，从而有效提高尼可霉素的产量。
本发明所述步骤(1)中发酵培养基包含以下组分：按质量百分比计，玉米淀粉2.5～3％、大豆饼粉2～3％、酵母粉0.2～0.3％、氯化钠0.4～0.6％、硫酸铵0.04～0.05％、碳酸钙0.45～0.5％，消泡剂0.02～0.025％，吐温800.01％～0.03％，余量为水；调节pH为6.0～7.5，优选6.8。
所述发酵培养器皿采用8～10层纱布封口后，放置于120～125℃温度下灭菌30～40min。
进一步地，本发明优选所述步骤(1)中发酵培养基包含以下组分：按质量百分比计，玉米淀粉3％、大豆饼粉3％、酵母粉0.2％、氯化钠0.6％、硫酸铵0.04％、碳酸钙0.5％，消泡剂0.02％，吐温800.02％，余量为蒸馏水，调节pH为6.8。本发明所述消泡剂优选为有机硅类消泡剂，更优选为聚硅氧烷类消泡剂。
本发明所述步骤(1)中圈卷产色链霉菌的种子液接种量为为4～10％(v/v)；
本发明所述步骤(1)中发酵培养为振荡培养，且振荡培养的转速为200～220r/min，发酵时间为60～80h，发酵温度25～28℃。
作为一个整体的技术方案，本发明提供了更有针对性的方案，具体如下：
本发明提供了一种通过圈卷产色链霉菌BJX005发酵生产尼可霉素的方法，包含以下步骤：
步骤(1)：将所述圈卷产色链霉菌的种子液以4～10％的接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养，得发酵液；所述发酵培养基包含以下组分：按质量百分比计，玉米淀粉3％、大豆饼粉3％、酵母粉0.2％、氯化钠0.6％、硫酸铵0.04％、碳酸钙0.5％，聚硅氧烷类消泡剂0.02％，吐温800.02％，余量为蒸馏水，调节pH为6.8；
步骤(2)：从所述发酵液中提取尼可霉素。
本发明提供了一种发酵培养基，按质量百分比计，所述发酵培养基包含以下组分：玉米淀粉2.5～3％、大豆饼粉2～3％、酵母粉0.2～0.3％、氯化钠0.4～0.6％、硫酸铵0.04～0.05％、碳酸钙0.45～0.5％，消泡剂0.02～0.025％，吐温800.01％～0.03％，余量为水。该发酵培养基可应用于尼可霉素生产中。
本发明所采用的圈卷产色链霉菌BJX005菌株遗传稳定性好，连续传代5次后其生产尼可霉素的能力仍保持原来水平。
本发明通过在发酵培养基中添加适量吐温80，优化消泡剂的选择；进一步优化发酵培养基其他组分的种类和用量，以及控制其他培养条件，使得吐温80、有机硅类消泡剂以及其他组分的协同作用，有效提高了尼可霉素的产量。本发明尼可霉素的产量可高达42600μg/mL，且方案简单、成本低廉、适用于工业化大规模生产。
本发明所述产品皆为市售，浓度皆为质量浓度，接种量为体积比。
具体实施方式
本发明所使用的保藏编号为CGMCC No.10523圈卷产色链霉菌(Streptomycesansochromogenes)BJX005，已于2015年2月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.10523，分类命名为圈卷产色链霉菌(Streptomycesansochromogenes)。
实施例中的产品均为市售产品，其中GP型聚醚类消泡剂环氧乙烷购自山东昌邑新兴助剂厂；聚硅氧烷消泡剂SXP-101-1，购自安徽宿州华润化工有限公司；GPE型聚醚类消泡剂，即泡敌，购自济南澳兴化工有限公司，检测手段采用烟草赤星病菌作为指示菌的生物检测方法。
实施例1
本发明提供了一种通过发酵圈卷产色链霉菌BJX005制取尼可霉素的方法，包含以下步骤：
步骤(1)：制备所述圈卷产色链霉菌的种子液，并将所述种子液以4％的接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养，得发酵液；所述培养基包含以下组分：玉米淀粉3g、大豆饼粉3g、酵母粉0.2g、氯化钠0.6g、硫酸铵0.04、碳酸钙0.5g、聚硅氧烷消泡剂SXP-101-10.02g、吐温800.02g，加水至100g。加热至80℃溶解，冷却后利用氢氧化钠调节pH值6.8；所述发酵培养为振荡培养，且振荡培养的转速为220r/min，发酵时间为70h，发酵温度为28℃；发酵器皿用8层纱布封口后，121℃灭菌30min；
步骤(2)：从所述发酵液中提取尼可霉素。
本实施例所制得尼可霉素经检测，产量为42600μg/mL。
实施例2
本发明提供了一种通过发酵圈卷产色链霉菌制取尼可霉素的方法，包含以下步骤：
步骤(1)：制备所述圈卷产色链霉菌的种子液，并将所述种子液以10％的接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养，得发酵液；所述培养基包含以下组分：玉米淀粉2.5g、大豆饼粉2g、酵母粉0.2g、氯化钠0.4g、硫酸铵0.05、碳酸钙0.45g、聚硅氧烷消泡剂DF-805(购自于广东东莞德丰消泡剂厂)0.025g、吐温800.01g，加水至100g。加热至80℃溶解，冷却后利用氢氧化钠调节pH值7.5；所述发酵培养为振荡培养，且振荡培养的转速为200r/min，发酵时间为80h，发酵温度为25℃；发酵器皿用10层纱布封口后，125℃灭菌40min；
步骤(2)：从所述发酵液中提取尼可霉素。
本实施例所制得尼可霉素经检测，产量为41000μg/mL。
实施例3
与实施例1相比，区别点仅在于，本实施例所使用消泡剂为GPE型聚醚类消泡剂即泡敌，其他条件均相同。
本实施例所制备得到的尼可霉素经检测，产量为40300μg/mL。
实施例4
一种发酵培养基，按质量百分比计，所述发酵培养基包含以下组分：玉米淀粉2.5％、大豆饼粉2％、酵母粉0.2％、氯化钠0.4％、硫酸铵0.04％、碳酸钙0.45％，消泡剂0.02％，吐温800.01％，余量为水。
实施例5
一种发酵培养基，按质量百分比计，所述发酵培养基包含以下组分：玉米淀粉3％、大豆饼粉3％、酵母粉0.3％、氯化钠0.6％、硫酸铵0.05％、碳酸钙0.5％，消泡剂0.025％，吐温800.03％，余量为水。
对比例1
与实施例1相比，区别点仅在于，本实施例发酵培养基中不含吐温80，其他条件均相同。
本实施例所制备得到的尼可霉素经检测，产量为36700μg/mL
实验表明：在培养基中添加吐温80能够提高尼可霉素的产量。
对比例2
与实施例1相比，区别点仅在于，本实施例发酵培养基中吐温80的质量含量为0.1％，其他条件均相同。
本实施例所制备得到的尼可霉素经检测，产量为40800μg/mL
实验表明：发酵培养基中，聚硅氧烷类消泡剂的适量添加，能够有效提高发酵产物的产量。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种利用圈卷产色链霉菌制备尼可霉素的方法，其特征在于，包含以下步骤：
步骤(1)：将保藏编号为CGMCC No.10523的圈卷产色链霉菌(Streptomycesansochromogenes)BJX005的种子液接种于含有质量浓度为0.01％～0.03％的吐温80的发酵培养基中进行发酵培养，得发酵液；
步骤(2)：从所述发酵液中提取尼可霉素；
所述步骤(1)中发酵培养基包含以下组分：按质量百分比计，玉米淀粉2.5～3％、大豆饼粉2～3％、酵母粉0.2～0.3％、氯化钠0.4～0.6％、硫酸铵0.04～0.05％、碳酸钙0.45～0.5％，聚硅氧烷类消泡剂0.02～0.025％，吐温80 0.01％～0.03％，余量为水；调节pH至6.0～7.5。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中发酵培养基的pH为6.8。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中发酵培养基包含以下组分：按质量百分比计，玉米淀粉3％、大豆饼粉3％、酵母粉0.2％、氯化钠0.6％、硫酸铵0.04％、碳酸钙0.5％，消泡剂0.02％，吐温80 0.02％，余量为蒸馏水，调节pH为6.8。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中圈卷产色链霉菌的种子液接种量为4～10％(v/v)。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中发酵培养为振荡培养，且振荡培养的转速为200～220r/min，发酵时间为60～80h，发酵温度为25～28℃。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中发酵培养为振荡培养，且振荡培养的转速为200～220r/min，发酵时间为60～80h，发酵温度为25～28℃。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包含以下步骤:
步骤(1)：将所述圈卷产色链霉菌的种子液以4～10％的接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养，得发酵液；所述发酵培养基包含以下组分：按质量百分比计，玉米淀粉3％、大豆饼粉3％、酵母粉0.2％、氯化钠0.6％、硫酸铵0.04％、碳酸钙0.5％，聚硅氧烷类消泡剂0.02％，吐温80 0.02％，余量为蒸馏水，调节pH为6.8；
步骤(2)：从所述发酵液中提取尼可霉素。
8.发酵培养基在保藏编号为CGMCC No.10523的圈卷产色链霉菌(Streptomycesansochromogenes)BJX005发酵生产尼可霉素中的应用，其特征在于，所述发酵培养基包含以下组分：玉米淀粉2.5～3％、大豆饼粉2～3％、酵母粉0.2～0.3％、氯化钠0.4～0.6％、硫酸铵0.04～0.05％、碳酸钙0.45～0.5％，消泡剂0.02～0.025％，吐温80 0.01％～0.03％，余量为水。
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| Characterization of the Polyoxin Biosynthetic Gene Cluster from Streptomyces cacaoi and Engineered Production of Polyoxin H;Wenqing Chen等;《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》;20090417;第10627页右栏第3段、第10628页左栏第2段、附图1 * |
| Wenqing Chen等.Characterization of the Polyoxin Biosynthetic Gene Cluster from Streptomyces cacaoi and Engineered Production of Polyoxin H.《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》.2009, * |
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