CN102550293B - 一种双孢蘑菇菌种的液体发酵培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双孢蘑菇菌种的液体发酵培养方法，包括：（1）取活化的0.5cm2斜面母种接种到装有60～120mL液体培养基的250mL培养瓶中，控温21～27℃，90～180rpm振荡培养5～7d得一级摇瓶菌种，按接种量为5～10%转接一级种子到二级培养液进行培养，再将培养好的二级摇瓶液体菌种转接到三级液体培养液进行培养，相同方法依次进行各级培养得种子液；（2）将种子液按5%的接种量接种至装有6L发酵培养基的10L发酵罐进行发酵培养，25℃培养5～6d即可。该方法生产周期短、菌龄一致、生产成本低、接种简便，一支试管种通过五级种培养就可以放大200000倍，液体二级菌种生长速度明显优于固体传统栽培种，速度提高了33%，同时，液体种各级之间的生长速度并没有太大差异，平均满瓶时间是27.5d，完全可以在工厂生产中实际应用。
Description
技术领域
本发明属于食用菌培植技术领域，具体涉及一种双孢蘑菇菌种的液体发酵培养方法。
背景技术
双孢蘑菇(Agaricus bisporus)是一种广泛栽培的食用菌，在现有的技术中，双孢蘑菇的生产一般采用固体菌种，但固体菌种具有明显的缺陷，主要表现在生长周期长、菌龄不一致、发菌速度慢、栽培种需用量大、生产成本高等方面，显然不能满足大规模的双孢蘑菇栽培需求。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种双孢蘑菇菌种的液体发酵培养方法，以满足高效培育双孢蘑菇的使用需求。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种双孢蘑菇菌种的液体发酵培养方法，包括以下步骤：
(1)取活化的0.5cm2斜面母种接种到装有60～120mL液体培养基的250mL培养瓶中，控温21～27℃，90～180rpm振荡培养5～7d得一级摇瓶菌种，按接种量为5～10％转接一级种子到二级培养液进行培养，再将培养好的二级摇瓶液体菌种转接到三级液体培养液进行培养，相同方法依次进行各级培养得种子液；其中，各级摇瓶培养条件相同，液体培养基配方为：碳源，氮源10～20g，KH2PO4 1～3g，MgSO4 0.5～1.5g，VB1 10mg，水1000mL，pH5～7；碳源为20～30g的麸皮、玉米粉、葡萄糖、果糖、甘露糖或蔗糖，或20～30mL麦芽汁；氮源为蛋白胨、酵母粉、玉米粉、硫酸铵或硝酸钾；
(2)将步骤(1)所得的种子液按5％的接种量接种至装有6L发酵培养基的10L发酵罐进行发酵培养，25℃培养5～6d，即可；其中，发酵培养基配方为：麦麸30g，玉米粉10g，蛋白胨1g，磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁1g、VB1 10mg/L，水1000mL，pH6.5。
步骤(1)中，碳氮比(g/g或mL/g)优选为3∶1或2.5∶1.5；
步骤(1)中，碳源优选为麸皮、玉米粉或麦芽汁；一级培养最优选使用麦芽汁，二级培养最优选使用玉米粉。
步骤(1)中，氮源优选为蛋白胨、酵母粉或玉米粉，最优选为玉米粉。
步骤(1)中，一级培养时，液体培养基的优选配方为：麦芽汁30mL，玉米粉10g，KH2PO4 1g，MgSO4 0.5g，VB1 10mg，水1000mL，pH6.5。
步骤(1)中，二级培养时，液体培养基的优选配方为：玉米粉10g，蛋白胨20g，KH2PO4 1g，MgSO4 0.5g，VB1 10mg，水1000mL，pH6.5。
步骤(1)中，培养条件优选为：装液量为90mL，控温25℃，150rpm振荡培养5～6d，接种量为5％。
有益效果：与现有的固体培养双孢蘑菇菌种方法相比，本发明的双孢蘑菇菌种的液体发酵培养方法具有的明显优势包括：生产周期短、菌龄一致、生产成本低、接种简便，一支试管种通过五级种培养就可以放大200000倍，液体二级菌种生长速度明显优于固体传统栽培种，速度提高了33％，同时，液体种各级之间的生长速度并没有太大差异，平均满瓶时间是27.5d，完全可以在工厂生产中实际应用，具有很好的实用性，能够产生很好的经济效益和社会效应。
附图说明
图1是碳源对菌丝球生长量结果图；
图2是碳源对菌丝球数量影响结果图；
图3是碳源对菌丝球直径影响结果图；
图4是氮源对菌丝球生长量结果图；
图5是不同碳氮比对菌丝球生长量结果图；
图6是pH值对生物量的影响结果图；
图7是培养过程中pH值变化曲线图；
图8是接种液体菌种与固体菌种生长速度比较图；
图9是不同浓度的无机盐培养结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
以下实施例所使用的材料和方法为：
试验材料：菌种为双孢蘑菇。
按照有机肥料中国人民共和国农业行业标准NY525-2002测定各种原料含碳量和含氮量。
菌丝体生物量测定：将生长良好、无污染的摇瓶培养发酵液，经4层纱布过滤，菌丝球生物量湿重为沥干后取固体物在电子天平上称重，菌丝球生物量干重则是直接过滤烘干称重。
菌球直径测定：取1mL发酵液用水稀释10倍，随机取20个菌球在培养皿中沿固定的直线排成一行，用卡尺测定总长度，重复3次，求其平均值。
菌球密度测定：取1mL均匀的发酵液用水稀释10倍，于培养皿下垫置黑色方格纸计数。
pH值测定：采用酸度计测定pH值。
还原糖测定：取发酵液上清液按3，5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖。
菌丝生长速度：固体栽培种或是液体菌种相同接种量接种后，观察菌丝在菌种瓶中萌发，向下生长，直至生长至瓶底的时间，即满瓶时间。
发酵罐参数测定：10L全自动气升式搅拌玻璃发酵罐装液量为6L，以摇瓶试验得出的最佳液体培养基配方配置液体发酵培养基，在发酵罐中经过空消和发酵罐自身蒸汽121℃下灭菌20min，待罐内培养基温度下降至25℃左右，按照5％接种量接种已经活化好的液体菌种种子液，通入无菌空气开始控制培养发酵。按12h为间隔定时无菌取样，其菌丝球生物量、菌丝球密度、菌丝球直径，溶氧浓度和pH值以电极测量。
实施例1
取活化的斜面母种约0.5cm2的小块接种到液体培养基中，于25℃恒温振荡培养得一级摇瓶菌种，再将培养好的一级摇瓶液体菌种转接到各处理的二级液体菌种摇瓶中，依次进行各级培养，若无特殊说明，各级摇瓶培养条件均为：250mL三角瓶装液量100mL，接种量5％(V/V)，摇床转速150r/min，25℃振荡培养5～7d，同样，其余各级液体菌种也是相同的培养方式。双孢蘑菇液体菌种的液体培养基配方为：氮源，碳源，KH2PO4 3g，MgSO4 1.5g，VB1 10mg，水1000mL，pH自然，121℃灭菌30min。用作双孢蘑菇斜面培养的PDA通用培养基配方：马铃薯200g，蔗糖20g，水1000mL，pH自然，121℃灭菌20min，。
(1)在液体培养基中，氮源为20g蛋白胨，碳源选择麦芽汁、麸皮、玉米淀粉、果糖、葡萄糖、甘露糖和蔗糖分别进行培养，其中，麦芽汁为30mL，麸皮、玉米淀粉、果糖、葡萄糖、甘露糖和蔗糖均为30g。对双孢蘑菇液体菌种菌丝球生物量进行分析，结果如图1所示，在所测碳源中，双孢蘑菇对麦芽汁的利用效果较好，双孢蘑菇菌丝球生物量达15.25g/100mL，其次是麸皮、玉米淀粉，而对果糖的利用效果最差，生物量为3.96g/100mL，利用率仅为麦芽汁的1/4。显然，无论是从理论基础还是生产实际出发，麦芽汁来源广泛，成本远远低于化学试剂糖类价格，从而用复合碳源麦芽汁的经济成本远远低于糖类。不同碳源培养基对菌丝球数量、菌球直径有重要影响，如图2和图3所示，菌球直径最小的是麦芽汁培养基，菌球直径平均为1.7mm，单位体积发酵液中含有菌球数目465个/mL，其次是麸皮菌球直径2.1mm、365个/mL，玉米淀粉菌球直径2.2mm、345个/mL。复合碳源的培养基能够培养出大量的菌丝球，且菌球直径较为均一，因此，在生产中复合碳源麦芽汁效果最佳。
复合碳源营养成分丰富，里面含有较多的固形物质，从而在菌丝利用时产生多种物质使得黏度增大，在一定是黏度范围内，黏度增大有利于菌丝的形成，有利于新的菌丝片段成长为新的菌丝球萌发点，过高或过低的黏度都对菌球的生长和繁殖无益。而低分子碳源，由于其能直接被菌丝吸收利用，在菌丝生长过程中提供充足的营养，使菌丝分枝、延伸，菌丝生长以***变大为特征，从而在后期出现营养不足，并引起菌丝内部缺氧，形成较大的菌丝片段，以致影响了菌球的形成，致使菌球数目急剧降低，菌丝片段多，菌丝球较少，并且直径不统一。
(2)在液体培养基中，碳源为30mL麦芽汁，氮源选择蛋白胨、酵母粉、玉米粉、牛肉膏、尿素、硫酸铵和硝酸钾分别进行培养，其中，氮源各为20g。
分别接种双孢蘑菇，在25℃下摇瓶培养，测定双孢蘑菇液体菌丝球生物量，结果如图4所示，有机氮与无机氮相比，双孢蘑菇对大多数有机氮的利用效率较高，生物量都较高，玉米粉和蛋白胨都是不错的氮源。对部分无机氮尿素等的利用效率最差，生物量为零。在以上氮源中，玉米粉与其他氮源相比，产生的泡沫最少，泡沫增多会影响溶氧系数，严重时造成大量逃液，增加污染几率，所以最佳氮源是玉米粉或蛋白胨，由于玉米粉在增加粘性以及成本上的优势，选择玉米粉为氮源。
(3)在液体培养基中，碳源为30mL麦芽汁，氮源为20g蛋白胨，并添加玉米粉进行培养，观察玉米粉对双孢蘑菇液体菌种菌丝生长的影响，结果如表1所示，当不添加玉米粉的时候，双孢蘑菇菌丝生物量最小，菌球直径大、数量少；随着玉米粉添加量的增大，菌丝生物量也随之增大，当添加量达到2％(质量比，下同)时，菌球生物量反而变小，可能液体黏性过大，液体摇动振荡速率降低，影响液体中溶氧性，菌丝大量生长时由于没有得到充分的氧气而在后期生长缓慢。而玉米粉添加量在1％、1.5％时，液体黏性较为合适，氧气供应充足，并且碳氮比均比较适合双孢蘑菇菌丝生长，菌丝适应强，很快诱导菌丝萌发生长，得到大量直径均一的菌丝球，并且生物量也处于最高点，因此，玉米粉添加量优选为1％。玉米粉不仅可以作为氮源，也作为增黏剂，同时玉米粉还能提供一定的有机质营养，这样玉米粉可以同时满足几个生长因素，但这是相对最经济实惠的，玉米粉在其中被彻底利用，是对资源的充分利用。
表1玉米粉含量对双孢蘑菇菌丝生物量影响
| 添加量(％) | 0 | 0.5 | 1.0 | 1.5 | 2.0 |
| 生物量(g/100mL) | 3.12 | 9.95 | 15.12 | 13.96 | 9.16 |
| 菌球直径(mm) | 2.9 | 1.6 | 1.2 | 1.1 | 1.9 |
| 菌球数量(个/mL) | 53 | 268 | 569 | 514 | 351 |
(4)在液体培养基中，碳源为麦芽汁，氮源为玉米粉，进行七个不同的配比方案培养，观察其对双孢蘑菇液体培养的影响。分别比较了不同配比下，对菌丝生物量的影响，从而初步确认最佳碳氮比，结果如图5所示，在碳源充足的情况下，随着氮源的增加，生物量也随之逐渐增加，当碳源比为3∶1时(麦芽汁30mL，玉米粉10g)，生物量达到最大值；而当氮源充足，碳源逐渐减少的时候，生物量随着碳源的降低而减少。同时对培养液的pH值研究发现，氮源过多时，灭菌后pH值会偏高；碳源丰富时，pH值会出现偏低，过高或者过低的pH值都不利于双胞蘑菇菌丝的生长。因此，碳源、氮源并非越多越好，而是要有一个适当的比例才是最适合双孢蘑菇液体菌种菌丝生长，优选比例为3∶1或2.5∶2.5。
(5)在液体培养基中，碳源为30mL麦芽汁，氮源为10g玉米粉，分别对硫酸镁和磷酸二氢钾做了十个不同浓度的培养。结果如图9所示，添加不同含量的硫酸镁和磷酸二氢钾对菌丝生长有一定的促进作用，当硫酸镁添加量小于0.05％时，随着其含量的增加，双孢蘑菇生物量也成正比例增加，当含量为0.05时，达到最大值；然后，生物量随着硫酸镁含量的增加成下降趋势。当磷酸二氢钾含量在0.10％之前，生物量随着含量的增加而增大，当含量为0.10％时，生物量达到最大值，这说明低浓度的无机盐对双孢蘑菇有促进作用，而高浓度反而不利于其生长。所以，在双孢蘑菇液体培养基中应添加硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.10％。
(6)在液体培养基中，碳源为30mL麦芽汁，氮源为10g玉米粉，硫酸镁为0.5g，磷酸二氢钾为1g，改变培养基初始pH值以确定其液体培养最合适的初始pH值，实验结果由图6和7所示，pH值对液体菌种生物量的影响呈现钟罩型的曲线，起始pH值不同导致培养结束时双孢蘑菇菌丝生物量的不同，并观察到双孢蘑菇生长pH值的上下临界点，当pH值小于4或者大于8.5的时候，双孢蘑菇菌丝不能生长，在pH值在6.5之前，随着pH值的上升，菌丝生物量也随之增大；当pH值达到6.5时，菌丝生物量达到最大值；随着pH值的逐步增大，菌丝生物量也逐步降低。在pH6-7之间，pH值变化情况对菌丝生物量的影响尤为显著，因为初始pH值给微生物提供了一个适宜生长的环境，生物酶处于最适状态，菌丝不需经过长期的适应过程就直接开始新陈代谢作用。初始pH值6.5培养的液体培养基，培养过程中，pH值有一定逐渐变小的趋势，初始阶段变化不太明显，至培养3d后，pH值开始明显下降；培养末期，pH值大约比初始pH值6.5降低1左右，pH值的降低，培养液酸性增强，会对代谢过程产生一些反馈抑制，降低生物各种酶的活性，影响菌丝生长；同时使液体培养基更容易被其他细菌污染，影响整个发酵过程，所以应该适当缩短液体培养时间，降低污染率，因此选择pH值6.5作为液体培养基的初始pH值。
至此，得出双孢蘑菇液体菌种的优选培养基配方为：麦芽汁30mL，玉米粉10g，KH2PO43g MgSO41.5g，VB110mg，水1000mL，pH6.5。
(7)在双孢蘑菇液体菌种的优选培养基(麦芽汁30mL，玉米粉10g，KH2PO43g MgSO41.5g，VB110mg，水1000mL，pH6.5)中，选择不同的培养温度培养双孢蘑菇液体菌种，实验结果如表3所示，从表中数据可以看出，25℃时，除了菌球直径并非最佳结果外，其余标准均处于最佳水平菌丝球生物量9.26g/100mL，菌丝球密度421个/mL，同时还可以发现，在25℃上下波动范围之内，对菌丝生物量并没有直接显著的影响，因此，选择25℃作为最适培养温度。
表2培养温度对双孢蘑菇菌丝生物量的影响
(8)在双孢蘑菇液体菌种的优选培养基(麦芽汁30mL，玉米粉10g，KH2PO43g MgSO41.5g，VB110mg，水1000mL，pH6.5)中接种培养双孢蘑菇，通过改变摇瓶的装液量和摇床转速，考察溶氧水平对双孢蘑菇菌丝球生物量、菌丝球密度、菌丝球直径等参数的影响，结果如表3所示，摇床转速为150r/min时，菌丝生物量处于最大值，而装液量分别在90mL、120mL、250mL时，差别并不是特别明显，考虑到装液量过多会造成溢液从而容易导致培养液的污染，因此，最佳装液量为90mL/250mL，摇床转速为150r/min。
表3装液量和摇床转速对双孢蘑菇生物量的影响
实施例2
试管种转接到液体培养液中，需要及时从培养液中获取丰富的营养，才能迅速适应液体而非先前生长的固体斜面培养基环境，因此，需要一级液体培养液中能够提供充分的营养，缩短菌丝生长适应过程，得到比较符合标准的液体菌种。当以一级液体种作为种子继续扩大培养时，需要考虑其生长环境的改变，此时不同的碳源对其生长的影响最为明显。按一定的接种量将实施例1最佳培养条件下培养至对数生长期的液体种接种到二级液体培养液中，在二级液体培养液中和选择不同碳源进行培养，其结果如表4所示，一级液体种中最合适的碳源麦芽汁对二级种的作用并不十分显著，相反倒是麸皮与葡萄糖对菌丝生物量影响明显。在以上各种不同碳源培养时，菌球生长的形态都有各自的特点，其中蔗糖、甘露醇、麦芽汁作为碳源时，菌丝球大小不均，而麸皮和葡萄糖中的菌丝球大小一致，直径大约是1mm左右，呈典型的圆形菌球。经过比较分析可知，以麸皮作为碳源培养的菌丝球无论是生物量还是菌丝球密度、菌丝球直径各个方面都适合液体菌种生产的要求，所以选择麸皮作为二级液体种的碳源。二级液体培养其余的营养成分及培养条件均与一级液体菌种各个条件一致，即玉米粉作为氮源(添加量为1％)、磷酸二氢钾0.05％、硫酸镁0.10％、VB1少量。培养条件：培养温度25℃、初始pH值6.5、装液量90mL/250mL、摇床转速150r/min。
表4不同碳源对双孢蘑菇二级液体菌种的影响
| 碳源 | 生物量(g/100mL) | 菌丝球密度(个/mL) | 菌丝球直径(mm) |
| 葡萄糖 | 11.23 | 395 | 1.00 |
| 麦芽汁 | 3.43 | 294 | 0.83 |
| 甘露醇 | 7.11 | 256 | 0.72 |
| 麸皮 | 10.09 | 403 | 1.10 |
| 可溶性淀粉 | 7.95 | 361 | 0.73 |
| 蔗糖 | 5.48 | 375 | 0.68 |
| 乳糖 | 5.21 | 363 | 0.82 |
按上述最佳培养基配方(麦麸30g，磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁1g、VB110mg/L，水1000mL，pH值6.5)进行最适接种量试验，分别在一定的液体培养基中以不同接种量(v/v)接种2.5、5、7.5、10、12.5％的一级液体菌种，在培养温度25℃、装液量90mL/250mL、摇床转速150r/min等最佳条件下培养，分别测量菌丝球生物量、菌丝球密度、菌丝球直径，实验结果如表5所示：在接种量为5％时菌丝生物量与接种量2.5％时有明显的提高，但是超过5％以后的各个接种量并没有太大的区别，生物量和菌球直径、数量都处于一个相对稳定的水平，而且接种量过大给操作上带来了一定的难度，也因此带来一些污染隐患。因此，考虑经济成本和实际工作中的困难选择5％作为最适接种量。
表5不同接种量对二级液体种生物量的影响
| 接种量(％) | 2.5 | 5 | 7.5 | 10 | 12.5 |
| 生物量(g/100mL) | 6.46 | 10.89 | 11.02 | 10.93 | 10.76 |
| 菌球直径(mm) | 1.6 | 1.8 | 1.8 | 1.7 | 1.8 |
| 菌球数量(个/mL) | 393 | 431 | 427 | 412 | 422 |
目前，对于发酵终点的判断常用有六种方法，它们是计算单位体积的菌球数，计算单位体积的菌丝干重，观察菌球性状，采样回试管培养法，测定还原糖和总糖以及显微镜观察法。本发明以测定还原糖来判断发酵终点，由于食用菌是大型真菌，属于真核微生物，通过测定液体培养基中还原糖，得出双孢蘑菇液体培养过程中的对数期以及稳定期，此时作为发酵终点，可以得到最佳的培养效果。试验从培养后24h开始，每隔24h采一次样，测定其还原糖的含量同时测定其生物量，试验结果为：通过还原糖含量的比较分析得知，双孢蘑菇一到五级液体菌种发酵的终点都在发酵的第6d，此时无论是菌球数量或者菌球直径都处于作为菌种的最佳时期，因此，培养的第6d即可作为发酵终点，且能达到最好的效果，并得到最高的经济效益。
在培养2d内，还原糖是随培养时间的增加而增大的，这可能是因为培养基中的玉米粉及麸皮中所含淀粉类物质，双孢蘑菇菌丝体产生的淀粉酶降解其中的营养物质，从而增加了培养基中还原糖的含量。这一阶段可以认为是培养的延缓期，在这期间，是菌种在新鲜的培养基中的适应过程，用来调整以适应新环境；并且菌体细胞表现为自身体积增大，少数菌体***。这一阶段的表现为胞外水解酶的合成和分泌、有效矿物质及微量元素的调整等。一般来讲，此阶段的长短与菌种的遗传特征、菌龄及接种前后的环境有密切关系，为了缩短时间，采取转接对数期的菌种或采用尽量吻合的培养基。
在培养6～7d后，菌体处于比较稳定的阶段，可以称为稳定期，由于前期菌体的旺盛生长，培养环境发生了很大的变化，某些营养物质的缺乏，代谢产物的积累以及培养过程中产生的有机酸导致pH值的变化，限制了菌体的快速生长和***，菌丝由顶端开始生长分化成一些特性繁殖器官，从而停止了细胞的继续延伸，甚至菌丝球内部分菌丝死亡，使得老细胞死亡数与新细胞的增长数接***衡状态，生物量也减少。此时是发酵终点的最后期限，否则将会导致进入下个阶段——衰亡期，此阶段环境条件更不适合菌体的生长和***，细胞的死亡率更高，细胞的活性大大降低，这是因为营养物质的耗尽及一些代谢产物的释放，从而改变了菌丝体的正常生长条件。菌丝体内液泡增大，开始自溶，菌丝球形态改变，由于自溶导致此阶段的还原糖处于一个暂时的稳定时期。
实施例3
采用10L全自动气升搅拌发酵罐，装液量为6L，按5％接种量，25℃培养条件下在液体培养最适培养基中(麦麸30g，玉米粉10g，磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁1g、VB110mg/L，水1000mL pH值6.5)进行液体发酵培养，通过取样分析和记录发酵罐***监测数据，双孢蘑菇液体菌丝在气升式发酵罐中各个生长指标变化结果为：在发酵罐条件下，双孢蘑菇保持了较好的生长速率，菌丝球生物量增长非常明显。发酵前期，菌丝密度迅速上升，并维持在一个稳定值，菌丝球直径随着发酵过程的推进，也有一定的增长，但是菌丝球直径增长仍在合理范围之内。当发酵至第5d时菌丝求生物量达到最大值的90％，随后菌丝球生物量逐渐稳定并开始下降，从生物量角度考虑，此时已经达到菌丝发酵终点。通过还原糖含量分析，双孢蘑菇起初还原糖含量并没有一个迅速变化的过程，可能是由于双孢蘑菇开始生长较慢，并没有迅速利用培养基中的大量糖类物质，而pH值变化则比较明显，随着发酵时间的延伸，pH值呈现出逐渐下降的趋势，pH影响细胞凋亡自溶等一系列生理反应的调控机制，通过pH值与菌丝球生物量、菌丝球密度以及直径等参数的关系分析，可以选择根据pH值的变化来确定双孢蘑菇液体发酵罐发酵终点，发酵罐发酵的第6d是发酵终点，而作为生产应用中，往往应选择发酵第5-6d作为实际生产中的发酵终点，此时的菌丝球活性高，尚未到达微生物生长的衰亡期。
实施例4
本试验中选择不同接种量接种麦粒原种培养基，分别按1％、2％、3％、4％不同的接种量接种，比较各个不同接种量在麦粒培养基(麦粒90％、棉籽壳8.5％、石膏1％、石灰0.5％，质量百分比)上菌丝生长速度以及菌种的污染情况，比较各个接种量对菌丝生长的影响，结果如表6所示，菌种瓶在不同接种量的时候，菌丝生长明显受到其中水分的影响，在麦粒培养基相同的条件下，由于接种量的不同，导致菌种瓶中水分含量不同，双孢蘑菇菌丝生长培养基的含水量在60-64％左右，麦粒培养料含水量一定的情况下，不同液体菌种接种量给与培养基的水分均保存在菌种瓶中，因此，其主要的影响因素在于水分。由上表可以看出，当接种量为4％时，由于菌种瓶中的水分含量过大，使得菌丝不能从上至下生长至底部，而当接种量为1％时，水分较少，菌丝球均匀分布在麦粒培养料的上方，从不同点一起萌发，并以较快的速度齐头并进向下生长，在最短的时间内到达菌种瓶底部，且菌丝洁白，呈明显放射状向下生长。与CK(即固体栽培种)比较，菌丝生长时间明显缩短，菌丝生长迅速，大概能够提快35％以上。因此，在1％与2％接种量无明显区别的时候，选择1％(7.5mL/瓶)接种量作为最佳接种量即可。
表6接种量对菌丝生长的影响
| 接种量％ | 1 | 2 | 3 | 4 | CK |
| 满瓶时间d | 26 | 26 | 41 | / | 40 |
| 直观描述 | 菌丝生长快 | 底部积水 | 底部积水多 | 水分过大 | / |
实施例5
液体菌种生产方便，菌龄一致，便于接种，其生长速度是体现其优势的一大标准，比较固体斜面试管菌种和液体菌种在相同培养基上的生长时间，可以较为直观的看出液体菌种对于固体原种生长的优势。按1％的接种量对麦粒培养基接种，同时按传统方法制备固体麦粒原种，分别观察其菌丝满瓶时间，结果如图8所示，在相同的麦粒培养基上，各级液体菌种与传统试管斜面菌种比较，生长速度有明显的提高，平均在27d左右，少于栽培种的36d，更少于试管母种所需的42d时间，而且萌发时间短，在接种后菌丝球均匀分布在麦粒培养基的上部，菌丝同时萌发，不存在各个不同部位的差别。另外，由于菌丝球具有流动性，一部分直径很小的菌丝球随着液体流到菌种瓶的不同部位，使得其停留在菌种瓶的各个位置，在适应环境后，开始萌发生长。因此，萌发点多是其生长速度快的一个重要原因。而试管斜面接种时从琼脂培养基转接到麦粒培养基上，固体环境发生改变，菌丝需要一定的适应时间。据观察，一般情况下，试管种和固体栽培种在接种后需要一周左右的时间才能明显观察到菌丝萌发出白色菌丝并向下扩散，液体菌种在接种后3～4d内可以观察到向下生长的现象；其次因为试管斜面菌种和栽培种只是分布在麦粒培养基的最上端，其生长的总体方向就是一个从上至下的推进过程，生长时间过长就会引起上下菌龄不一致，影响菌种的整体质量。在制种过程中，一支试管可以转接6瓶原种，每瓶原种可以转接40瓶左右栽培种，因此，栽培种是被放大扩殖了240倍；同样一支试管可以转接20瓶液体培养一级种，而一级液体种按10％接种量传代培养每次放大10倍，故二级种相当于放大200倍，三级种放大2000倍，四级种放大20000倍，而五级种放大200000倍；比较二级种与栽培种基本处于相近的放大水平，液体二级菌种生长速度明显优于固体传统栽培种，速度提高了33％，这是非常显著的变化。同时，液体种各级之间的生长速度并没有太大差异，平均满瓶时间是27.5d，除5级种之外，基本都处在一个上下5％波动区间之内，从而看出液体菌种一到四级种之间传代是很稳定的，并且放大系数达到20000倍，完全可以在工厂生产中实际应用。
实施例6
按简单工艺生产液体菌种(实施例1和2)，转接生产双孢蘑菇栽培种，在生长速度上，液体菌种转接的栽培种明显快于用麦粒原种扩大的栽培种，为了进一步比较两种不同方式的栽培种在生产上的优劣，选择以传统的牛粪稻草培养料栽培双孢蘑菇，液体菌种栽培单独一层15.5m2，统一管理，观察其“吃料”生长情况，以最终出菇产量为比较两者优劣的标准，试验结果为：通过整个栽培过程中的观察，双孢蘑菇液体转接的栽培种菌丝浓度比传统麦粒种要大，菌丝活力强，在栽培料床架上吃料比较快，菌丝延展性较强，附着力强。两种栽培种在整个吃料过程中，并没有太大的时间差距。但出菇后明显观察到两种栽培种所生产出的双孢蘑菇在个体上有一定的差异，液体菌种转接的栽培料所在床架上单位面积现蕾多，体大小比较均匀，一级菇比例大，而传统栽培种所在床架上，出菇时间并不一致，不易控制菇型大小，在秋菇生产期间，液体菌种制备的栽培种在菇棚栽培中平均单位面积产量为5.98KG/m2，而传统固体菌种制备栽培种在栽培种平均单位面积产量为5.72KG/m2，发现两种之间的产量差异并不明显，基本上处于一个同等水平，由此说明，使用液体菌种制备栽培种再用于双孢蘑菇的大规模栽培在目前尚未能直接使用液体菌种栽培双孢蘑菇阶段，这是完全可行的。
上述的双孢蘑菇栽培料培养方法为：固体栽培料装袋后在121℃下灭菌120min，冷却至28℃时接种，接种标准为固体菌种基本覆盖菌种袋上方，液体菌种则是将菌丝球均匀覆盖上培养料上方。接种后将栽培袋集中在经过消毒处理过的培养室中25℃恒温培养，定期进行翻动培养即可。
Claims (1)
1.一种双孢蘑菇菌种的液体发酵培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取活化的0.5cm2斜面母种接种到装有60～120mL液体培养基的250mL培养瓶中，控温21～27℃，90～180rpm振荡培养5～7d得一级摇瓶菌种，按接种量为5～10%转接一级种子到二级培养液进行培养，再将培养好的二级摇瓶液体菌种转接到三级液体培养液进行培养，相同方法依次进行各级培养得种子液；其中，各级摇瓶培养条件相同：装液量为90mL，控温25℃，150rpm振荡培养5～6d，接种量为5%；液体培养基配方为：碳源，氮源10～20g，KH2PO41～3g，MgSO40.5～1.5g，VB110mg，水1000mL，pH5～7；碳源为20～30mL麦芽汁；氮源为玉米粉；碳氮比为3:1或2.5:1.5；
其中，一级培养时，液体培养基配方为：麦芽汁30mL，玉米粉10g，KH2PO41g，MgSO40.5g，VB110mg，水1000mL，pH6.5；
二级培养时，液体培养基配方为：玉米粉10g，蛋白胨20g，KH2PO41g，MgSO40.5g，VB110mg，水1000mL，pH6.5；
（2）将步骤（1）所得的种子液按5%的接种量接种至装有6L发酵培养基的10L发酵罐进行发酵培养，25℃培养5～6d，即可；其中，发酵培养基配方为：麦麸30g，玉米粉10g，蛋白胨1g，磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁1g、VB110mg/L，水1000mL，pH6.5。
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