CN104025903A - 培养食用菌液体菌种的液体发酵培养基及液体菌种的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种食用菌液体菌种的液体发酵培养基，按照重量百分比包括：葡萄糖1.5％、玉米粉3％、蛋白胨0.2％、黄豆粉2％、MgSO₄·7H₂O0.1％、KH₂PO₄0.1％、VB₁0.01％、豆油0.03％，余量为水。并提供一种食用菌液体菌种的制备方法，包括斜面菌种的活化、一级液体菌种的培养和液体发酵三个步骤。本发明的食用菌液体菌种生产方法，通过液体培养基配方优化和发酵条件优化等方案，能够使液体菌种较固体菌种袋料栽培增产32.8％，污染率降低4％，节约制种时间，减少劳动力成本。

Description

培养食用菌液体菌种的液体发酵培养基及液体菌种的制备方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种培养食用菌液体菌种的液体发酵培养基及液体菌种的制备方法。

背景技术

随着国内外市场对食用菌产品需求的增加，中国的食用菌产业以年均17％的速度增涨。食用菌生产方式由传统的家庭作坊式操作、季节性生产的模式，逐渐向设施化、现代化、周年化、规模化生产发展。生产方式的变革带动了食用菌新技术、新工艺、新设备的开发。近年来，采用液体深层培养工艺制备食用菌液体菌种用于生产成为研发热点，涌现出了许多液体发酵设备生产厂家及诸多在香菇、黑木耳、金针菇、平菇、灰树花生产中采用液体菌种的报道。液体菌种在食用菌工厂化、周年化、规模化生产总推广应用，对于降低生产成本，提高产品质量具有显著效果。日本、韩国在食用菌工厂化生产中，已普遍采用液体菌种。

比如，灵寿县食用菌种植面积已达500万平方米，年产量10万吨，随着食用菌种植规模的不断发展，菌种的要求也将大大增加，每年需要固体原种40万瓶，栽培种2000万瓶，而需要如此大量的食用菌菌种，给农民生产造成了许多困难，增加了大量的成本。而液体菌种具有五大优势：1、降低成本：每个栽培袋的液体菌种费只有固体菌种的五分之一，接种工效比固体接种高4-5倍；2、提高纯度：液体菌种在完全无菌的密封环境中快速萌发，因而菌种纯度高，确保出菇健壮；3、减少污染：液体菌种萌发速度超过了杂菌滋长速度，杂菌几乎没有滋生的机会，因此克服了杂菌污染的技术难题，保证了产品质量；4、快速萌发液体菌种具有流动渗透性，接种后各点萌发，生产速度快，比固体菌种可缩短1/2时间；5、效益显著：液体菌种菌丝生长旺盛，菌龄短，出菇齐，质量与产量明显高于传统的生产方式，因而赢得市场获得效益。

鉴于此种情况，为了食用菌快速发展，研究开发适于食用菌生产的液体菌种，必将提高食用菌栽培的工业化水平，提高生产效率，增加农民收入，促进食用菌产业快速发展，经济社会效益明显。

但是，食用菌液体菌种在生产、接种和栽培中存在菌种活力低、污染率高、生产混乱等问题。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有技术的不足，提供一种菌种活力高、污染率低的食用菌液体菌种生产方法。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案如下：

一种食用菌液体菌种的液体发酵培养基，按照重量百分比包括：葡萄糖1.5％、玉米粉3％、蛋白胨0.2％、黄豆粉2％、MgSO₄·7H₂O0.1％、KH₂PO₄0.1％、VB₁0.01％、豆油0.03％，余量为水。

其中，优选地，所述食用菌为白灵菇或平菇-89。平菇-89即为平菇CCEF_(89)，是从国外品种中选育出的一个优良菌株,它抗杂性强,产量高,质优,该菌株已在河北、河南、山东、江苏、陕西、山西及北京、天津等十几个省市推广栽种。

一种食用菌液体菌种的制备方法，包括以下步骤：

1)斜面菌种的活化：将斜面菌种置PDA培养基上，于25℃恒温培养7天，作为一级菌种；

2)一级液体菌种的培养：将种子液体培养基置入300ml三角瓶中，每瓶的装量为70～90ml，将种子液体培养基灭菌后在无菌环境下接种步骤1得到的一级菌种，置于摇床中培养7天；

3)液体发酵：将权利要求1所述的发酵液体培养基置入发酵罐中，将液体培养基灭菌后在无菌环境下接种步骤2所得的液体菌种，接种量按重量百分比计为培养基的8～12％，搅拌培养3天，制成菌丝体。

其中，优选地，所述步骤2中采用的种子液培养基按重量百分比包括：玉米粉3％，麦麸2％，葡萄糖2％，蛋白陈0.5％，MgSO₄·7H₂O0.1％，KH₂PO₄0.1％，VB₁10mg/L，豆油0.03％。

其中，优选地，所述步骤2中的接种量按重量百比计，为培养基的8～12％。

其中，优选地，所述步骤2中起始pH值为5.5～6.5，摇床转速为200～220r/min。

其中，优选地，所述步骤3中液体发酵的条件为：温度为25℃，发酵罐压力0.05MPa，搅拌桨转速160～200rpm，通气量为0.6(V/V·min)。

其中，优选地，所述食用菌为白灵菇或平菇-89。

在液体发酵培养基中，碳源是构成菌体细胞的重要物质，也是食用菌生命活动所需的主要能量来源。白灵菇或平菇-89对碳源的利用相当广泛，既可以利用成分复杂的复合碳源，(玉米粉、淀粉等)，也可以利用单糖和双糖等小分子碳源，如(葡萄糖、蔗糖等)，甚至可以吸收利用醇类，如(山梨醇)。液体培养若用单一的碳源，从菌丝干重考虑，单糖是葡萄糖最佳，而复合碳源中，玉米粉是最好的。从应用生产实际出发，玉米粉的价格远远低于葡萄糖的价格，从而玉米粉的经济效益远远高于葡萄糖的经济效益。

在白灵菇或平菇-89液体培养中，不同的碳源对菌丝体的形态有重要影响。其中，复合碳源的培养基能够培养出大量的菌球，且菌球直径较均匀一致，其中菌球直径最小的是玉米粉培养基，菌球直径平均为2.1mm，其次可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖。相比之下，小分子碳源培养基培养出的以菌丝为多，菌球较少。究其原因，是因为复合碳源的成分较复杂，营养成分较丰富，且里面含有较多的固形物质，从而使培养基的黏度增加。由于在一定的范围内，黏度增大有利于菌球的形成，过高或过低的黏度都不利于菌球的生长和繁殖。而小分子碳源，由于其能直接被菌丝吸收利用，在短期内即使菌丝分枝、延伸，菌丝生长以***变大为特征，从而在后期出现营养不足，并引起菌丝内部缺氧，形成较大的菌丝片段以致影响了菌球的形成。但观察发现，用葡萄糖等小分子做碳源，在前期菌丝生长较旺盛，后期可能由于营养不足导致生物量有所下降。所以，将复合碳源与小分子碳源结合起来，效果最佳。

碳源是发酵培养基的基础，它既是细胞结构的重要组成成分，又是菌体产生各种代谢产物和细胞内贮藏物质的主要原料。在碳源选择上，还要考虑碳源对菌球数的影响。复合碳源的菌球数明显多于小分子碳源，最多的是玉米粉培养基的菌球数，最差的是山梨醇；产生此结果的原因，主要是复合碳源营养更丰富，不仅为白灵菇液体培养提供了碳源，其中还含有某些生长因子，从而更有利于白灵菇的生长。因为菌球数多，可以达到单位体积内有更多的发菌点，更有利于下一级的培养。

复合碳源中，玉米粉在生物量、菌球直径以及菌球数方面都是最佳的碳源，而小分子则以葡萄糖最佳。考虑到生产中的成本，本试验确定以玉米粉为复合碳源，小分子以葡萄糖为碳源。由于复合碳源是缓慢利用的营养物质，而小分子碳源有快速被菌丝体吸收的特点，为了相互弥补不足，通过在复合碳源中添加小分子碳源来达到最佳碳源的效果。

氮源是食用菌细胞合成蛋白质和核酸必不可少的主要原料，在深层发酵过程中起着非常重要的作用。从白灵菇和平菇-89在黄豆粉、蛋白胨、麦麸中均能很好的生长，而在尿素、硫酸铵、硝酸钾中生长不良，说明白灵菇对无机氮的利用不佳，其中以黄豆粉作为氮源时，菌丝生长量最高，蛋白胨次之。从经济方面考虑，黄豆粉作为农产品来源方便，成本低廉等特点，同时蛋白胨作为生长因了有利于菌丝的生长。

在一级液体菌种培养条件中，起始pH值在5.5-6.5之间菌丝都能较好的生长，其中在pH值6.5时菌妊生长量最高。接种量小于10％时，随着接种量的增加，生物量也增加，但超过10％时，由于菌丝体产量基本不受接种量的影响，因此确定10％的接种量为最佳。以80mL装液量所得的菌丝生物量为最高，高于80mL的装液量菌丝生物量有所下降，原因是装液量多，则通气量就少，培养基中溶解氧也少，无法满足菌体旺盛生长的需要，导致生物量下。摇床转速过低，使通气量不足，从而使生物量较低，转速为210r/min时生物量最大。

在液体发酵中，通气量为0.6(V/V·min)时，菌球大而多，色橙黄，泡沫情况较为适中。菌丝接种量为8～12％时，菌体初期生长繁殖迅速，发酵周期短，到过发酵终点时，产生的副产物较少。且观察到培养3d左右时，pH下降为最低3.5，观察菌丝体发现此时菌丝生长旺盛，粗壮，菌丝球数量较多。因此，pH值在3.5左右作为判断培养终点参考指标之一。

且在发酵初期溶解氧含量最大，随着发酵的进行菌丝逐渐适应环境开始大量生长后，溶解氧开始逐渐下降。

本发明的液体菌种在12h以内用完活力最高，保存温度10℃最佳，应在3天内用接种。

本发明的有益效果是：本发明的食用菌液体菌种生产方法，通过液体培养基配方优化和发酵条件优化等方案，能够使液体菌种较固体菌种袋料栽培增产32.8％，污染率降低4％，节约制种时间，减少劳动力成本。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

一种食用菌液体菌种的液体发酵培养基，按照重量百分比包括：葡萄糖1.5％、玉米粉3％、蛋白胨0.2％、黄豆粉2％、MgSO₄·7H₂O0.1％、KH₂PO₄0.1％、VB₁0.01％、豆油0.03％，余量为水。

一种食用菌液体菌种的制备方法，包括以下步骤：

1)斜面菌种的活化：将斜面菌种置PDA培养基上，于25℃恒温培养7天，作为一级菌种；

2)一级液体菌种的培养：将种子液体培养基置入300ml三角瓶中，每瓶的装量为70～90ml，将种子液体培养基灭菌后在无菌环境下接种步骤1得到的一级菌种，置于摇床中培养7天；

3)液体发酵：将权利要求1所述的发酵液体培养基置入发酵罐中，将液体培养基灭菌后在无菌环境下接种步骤2所得的液体菌种，接种量按重量百分比计为培养基的8～12％，搅拌培养3天，制成菌丝体。

液体菌种的制作及其栽培的工艺流程：斜面菌种—一级液体菌种的培养—液体菌种—接到栽培料中并进行培养—栽培管理—出菇。

供试栽培料配方：玉米芯40％、木屑40％、玉米面8％、稻糠8％、石膏1％、过磷酸钙1％，糖2％，磷酸二氢钾0.2％、含水率60％,pH值为6.5。

将栽培袋为17×33cm，厚度为0.045cm的聚内烯塑料袋，每袋装料为400g。把栽培料装到袋中，用食指把袋的两个角压入袋内，压紧培养料，然后继续装料并用乎压实，装满后，在袋中间用锥形木棒扎一孔，拔出木棒，目的是可以将液体菌种倒入培养基里面。然后将栽培袋高压灭菌，灭菌冷却后，在无菌环境下接液体菌种。

实施例1

一种白灵菇液体菌种的制备方法，包括以下步骤：

1)斜面菌种的活化：将斜面菌种置PDA培养基上，于25℃恒温培养7天，作为一级菌种；

2)一级液体菌种的培养：将种子液体培养基置入300ml三角瓶中，每瓶的装量为80ml，将种子液体培养基灭菌后在无菌环境下接种步骤1得到的一级菌种，接种量按重量百比计，为培养基的8～12％，置于摇床中培养7天；种子液体培养基为：玉米粉3％，麦麸2％，葡萄糖2％，蛋白陈0.5％，MgSO₄·7H₂O0.1％，KH₂PO₄0.1％，VB₁10mg/L，豆油0.03％。起始pH值为5.5，摇床转速为210r/min。

3)液体发酵：将液体发酵培养基置入发酵罐中，将液体培养基灭菌后在无菌环境下接种步骤2所得的液体菌种，接种量按重量百分比计为培养基的10％，搅拌培养3天，制成菌丝体。液体发酵的条件为：温度为25℃，发酵罐压力0.05MPa，搅拌桨转速180rpm，通气量为0.6(V/V·min)。

液体种子培养基：葡萄糖1.5％、玉米粉3％、蛋白胨0.2％、黄豆粉2％、MgSO₄·7H₂O0.1％、KH₂PO₄0.1％、VB₁0.01％、豆油0.03％，余量为水。

实施例2

一种白灵菇液体菌种的制备方法，包括以下步骤：

1)斜面菌种的活化：将斜面菌种置PDA培养基上，于25℃恒温培养7天，作为一级菌种；

2)一级液体菌种的培养：将种子液体培养基置入300ml三角瓶中，每瓶的装量为70ml，将种子液体培养基灭菌后在无菌环境下接种步骤1得到的一级菌种，接种量按重量百比计，为培养基的12％，置于摇床中培养7天；种子液体培养基为：玉米粉3％，麦麸2％，葡萄糖2％，蛋白陈0.5％，MgSO₄·7H₂O0.1％，KH₂PO₄0.1％，VB₁10mg/L，豆油0.03％。起始pH值为6.0，摇床转速为200r/min。

3)液体发酵：将液体发酵培养基置入发酵罐中，将液体培养基灭菌后在无菌环境下接种步骤2所得的液体菌种，接种量按重量百分比计为培养基的8％，搅拌培养3天，制成菌丝体。液体发酵的条件为：温度为25℃，发酵罐压力0.05MPa，搅拌桨转速160rpm，通气量为0.6(V/V·min)。

液体种子培养基：葡萄糖1.5％、玉米粉3％、蛋白胨0.2％、黄豆粉2％、MgSO₄·7H₂O0.1％、KH₂PO₄0.1％、VB₁0.01％、豆油0.03％，余量为水。

实施例3

一种白灵菇液体菌种的制备方法，包括以下步骤：

1)斜面菌种的活化：将斜面菌种置PDA培养基上，于25℃恒温培养7天，作为一级菌种；

2)一级液体菌种的培养：将种子液体培养基置入300ml三角瓶中，每瓶的装量为90ml，将种子液体培养基灭菌后在无菌环境下接种步骤1得到的一级菌种，接种量按重量百比计，为培养基的8％，置于摇床中培养7天；种子液体培养基为：玉米粉3％，麦麸2％，葡萄糖2％，蛋白陈0.5％，MgSO₄·7H₂O0.1％，KH₂PO₄0.1％，VB₁10mg/L，豆油0.03％。起始pH值为6.5，摇床转速为220r/min。

3)液体发酵：将液体发酵培养基置入发酵罐中，将液体培养基灭菌后在无菌环境下接种步骤2所得的液体菌种，接种量按重量百分比计为培养基的12％，搅拌培养3天，制成菌丝体。液体发酵的条件为：温度为25℃，发酵罐压力0.05MPa，搅拌桨转速200rpm，通气量为0.6(V/V·min)。

液体种子培养基：葡萄糖1.5％、玉米粉3％、蛋白胨0.2％、黄豆粉2％、MgSO₄·7H₂O0.1％、KH₂PO₄0.1％、VB₁0.01％、豆油0.03％，余量为水。

上述实施例制的白灵菇液体菌种质量技术指标如表1所示：

表1白灵菇液体菌种质量技术指标

实施例4白灵菇液体菌种与固体菌种袋栽对比试验，

液体菌种和固体菌种对产量比较

试验表明，接液体菌种的产量，都不低于固体菌种的产量。当接种量为10％时，袋平均产量达269.3g，生物学效率为67.3％，而固体菌种的产量为202.7g,生物学效率为50.7％。具体情况见表2。

表2液体菌种与固体菌种袋栽产量比较(单位：g)

从表2中不难发现，液体菌种的出菇日期要比固体菌种提前，最快的提前达40天，而且用液体菌种的产量比固体菌种的产量要高，其原因可能是液体菌种活性强，液体的流动性使的萌发点增多，菌丝日长速较快，从而所需时间缩短。其产量的增加是因为液体菌种的萌发整齐，同时因为液体菌种的培养基单含有很好的营养物质，增加了培养袋单的营养成分，所以液体菌种较固体菌种的产量高。

子实体质量的比较

白灵菇的商品质量是由产品的外观和众多的内在因素构成的综合性，主要包括感官品质、营养品质和安全要求等。目前白灵菇的销售渠道主要是外贸、出口，因此，对质量的要求逐渐提高，好的质量才有好的效益。从外观的特性，通过菌柄的长度和菌盖的直径来衡量判断，结果如表3。

表3液体菌种与固体菌种的子实体质量的比较

白灵菇液体菌种栽培的了实体品质与固体菌种相近。白灵菇色泽洁白，菇质脆嫩，菌盖幼小时呈半球形，边缘内卷，后逐渐长大平展。通过表3可看出，液体菌种的了实体的菌柄较长，菌盖大于固体菌种的。在相同的管理条件下，其差异的原因可能是液体菌种本身的营养稍好于固体菌种，所以长的较粗壮。

液体菌种栽培的效益分析

液体菌种作为一种新的技术，具有良好的经济效益，而经济效益是通过各种生产资料(劳动力、机械、肥料、农药、种子、能源等)的投入和使用价值的产出来计算的。这种生产中投入与产出之间的关系，实质是物质生产资源投入于一定的农业生产之后，在人的劳动和机械化动力的推动下，借助于各种自然力的作用所产生的一种物质交换关系。这种物质关系通过价值量的换算，反映为成本耗费与产品收益之间的经济关系。简单来讲，就是经济效益＝所得—所费。液体菌种的经济效益高在于用其生产食用菌，生产能够按照高产、优质、低消耗的要求进行。因此，根据前面的栽培研究和试验数据，进行了液体菌种与固体菌种的效益比较，结果如表4。

表4白灵菇每千袋液体菌种与固体菌种生产成本比较(单位：元)

项目	液体菌种生产	固体菌种生产
			原料费	350	350
人工费	460	630
			水电费	90	40
菌种费	15	170
			实施折旧费	120	50
其它费用	100	100
			合计费用	1135	1340
平均袋产量(g)	269.3	202.7
			市场价	15	15

通过表可以计算得出白灵菇液体菌种的每千袋的经济效益Y为:

Y＝15×269.3/1000×1000-1135＝2904.5(元)；

固体菌种的经济效益Y为：Y＝15X202.7/1000X1000-1340＝1700.5(元)，

这是同批次生产所得不同的差异，可以看出用液体菌种生产的白灵菇效益可以比固体菌种多出1204元。从而，可以得出液体菌种的生产具有良好的应用前景。

降低成本产生的效益：采用液体菌种，每个栽培袋菌种所占的成本为0.02元，而采用固体菌种为0.17元。采用固体菌种进行生产的污染率都在6％左右，而采用液体菌种污染为2％左右，成品率提高4个白分点，可以增加净收入116.2元/1000袋。所以，采用液体菌种，降低成本产生的效益可以达到5～8％。

缩短时间产生的效益：采用液体菌种栽培白灵菇，把传统的固体菌种的制种时间由3个多月缩短为30天，栽培袋发菌的时间仅为过去的一半。由于液体菌种生产周期的缩短，栽培户可以对原有设施进行改造，就可以进行全年候标准化生产，产品可提前上市，其效益当然是成倍增长。

提高产量产生的效益：经多次试验，采用液体菌种栽培白灵菇每袋产量提高32.8％左右。

减少用工产生的效益：固体菌种生产拌料、装瓶(袋)、灭菌、接种、养菌，操作复杂，劳动强度大。而采用液体菌种不但可以省去这些生产环节，而目在接种操作上也比固体效率提高2～3倍。综合以上各种因素，一个小型栽培户采用液体菌种可比采用固体菌种减少用工50多个，按一个工20元计，就可节省1000元。

以上分析结果充分证明，液体菌种具有显著的经济效益和社会效益。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种食用菌液体菌种的液体发酵培养基，其特征在于，按照重量百分比含有：葡萄糖1.5％、玉米粉3％、蛋白胨0.2％、黄豆粉2％、MgSO₄·7H₂O0.1％、KH₂PO₄0.1％、VB₁0.01％、豆油0.03％，余量为水。

2.根据权利要求1所述的一种食用菌液体菌种的液体发酵培养基，其特征在于：所述食用菌为白灵菇或平菇-89。

3.一种食用菌液体菌种的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)斜面菌种的活化：将斜面菌种置PDA培养基上，于25℃恒温培养7天，作为一级菌种；

2)一级液体菌种的培养：将种子液体培养基置入300ml三角瓶中，每瓶的装量为70～90ml，将种子液体培养基灭菌后在无菌环境下接种步骤1得到的一级菌种，置于摇床中培养7天；

3)液体发酵：将权利要求1所述的液体发酵培养基置入发酵罐中，将液体培养基灭菌后在无菌环境下接种步骤2所得的液体菌种，接种量按重量百分比计为培养基的8～12％，搅拌培养3～7天，制成菌丝体。

4.根据权利要求3所述的一种食用菌液体菌种的制备方法，其特征在于，所述步骤2中采用的种子液培养基按重量百分比含有：玉米粉3％，麦麸2％，葡萄糖2％，蛋白陈0.5％，MgSO₄·7H₂O0.1％，KH₂PO₄0.1％，VB₁10mg/L，豆油0.03％。

5.根据权利要求3所述的一种食用菌液体菌种的制备方法，其特征在于，所述步骤2中的接种量按重量百比计，为培养基的8～12％。

6.根据权利要求3所述的一种食用菌液体菌种的制备方法，其特征在于，所述步骤2中起始pH值为5.5～6.5，摇床转速为200～220r/min。

7.根据权利要求3所述的一种食用菌液体菌种的制备方法，其特征在于，所述步骤3中液体发酵的条件为：温度为25℃，发酵罐压力0.05MPa，搅拌桨转速160～200rpm，通气量为0.6(V/V·min)。

8.根据权利要求3～7所述的一种食用菌液体菌种的制备方法，其特征在于，所述食用菌为白灵菇或平菇-89。