CN103875446B - 一种液体培养生产茶树菇菌种的方法及其保藏方法 - Google Patents

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本发明提供了一种液体培养生产茶树菇菌种的方法及其保藏方法，其工艺步骤和工艺参数为：筛选液体培养高效菌株:优选液体培养菌球数量多、大小均匀、表面毛刺多的菌株，培养的菌球数量200-260个/ml、菌球直径1.0-1.5mm；摇瓶培养基配方:葡萄糖1-3%、玉米粉2-4%、酵母粉0.2-0.4%、麸皮1.0-3.0%、KH2PO40.5-1.5%、MgSO40.5-1.0%、PH值自然；提出了茶树菇液体菌种发酵罐培养培养基配方；建立了茶树菇液体菌种发酵罐培养工艺条件。本发明把发酵工程技术与茶树菇生物学特性有机地结合起来，不仅获得高质量的茶树菇液体菌种，并能有效地降低茶树菇生产成本。液体培养生产茶树菇菌种技术解决了茶树菇生产菌种上的关键技术问题，本发明工艺生产周期短、生产成本低、接种后出菇整齐，便于管理。

Description

一种液体培养生产茶树菇菌种的方法及其保藏方法
技术领域
本发明涉及一种液体培养生产茶树菇菌种的方法及其保藏方法。
背景技术
菌种的生产是茶树菇生产中的关键环节。食用菌菌种生产方法主要有固体培养和液体培养两种。目前，茶树菇菌种的培养方式主要是固体培养。固体培养方式存在培养周期长、菌龄不一致、生产成本高、生产效率低、不便于机械化和标准化生产等缺点。液体培养生产食用菌菌种是一项多因素的生产技术，它涉及到菌株、用料及配方、深层发酵工艺等，工艺路线和工艺参数显著影响到食用菌生产产量、质量和效益。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种采用液体培养生产茶树菇菌种的方法，将工业化生物液体发酵技术运用到茶树菇菌种生产领域，在相对可控的环境和设施条件下，高效率地组织起茶树菇菌种生产，实现一条新型的茶树菇菌种生产工艺。
本发明涉及液体培养生产茶树菇菌种的方法，其工艺步骤和工艺参数为：
1、液体培养高效菌株的筛选
优选液体培养菌球数量多、大小均匀、表面毛刺多的菌株，培养的菌球数量200-260个/ml、菌球直径1.0-1.5ml。
2、摇瓶培养基配方
葡萄糖1-3%、玉米粉2-4%、酵母粉0.2-0.4%、麸皮1.0-3.0%、KH2PO40.5-1.5%、MgSO40.5-1.0%、PH值自然。
3、摇瓶培养工艺参数：摇瓶装料系数为20-30%、24-26℃下静止培养时间为2-3天，摇瓶培养温度为23-25℃、摇瓶培养转速为180-200r/min、摇瓶培养时间为3-4天，摇瓶培养发酵终点判断标准：菌球表面多毛刺、菌球数量为900-1200个/ml、菌球直径为0.5-1毫米，培养液澄清度90%以上。
4、发酵罐培养基配方
马铃薯15-25%、麦麸2-4%、蛋白胨2-4%、KH2PO40.1-0.15%、MgSO4·7H2O0.05-0.1%、酵母粉0.2-0.4%、消泡剂1%。
5、发酵罐培养参数
发酵罐装料系数为50-60%、接种量为10-15%、培养温度为24-26℃、搅拌机转速为150-200r/min，通气量为1：0.5-0.6V/V/min，培养时间3-4天，发酵终点判断标准：菌丝体含量不再增加，菌球表面多毛刺、菌球数量为200-260个/ml、菌球直径为1.0-1.5ml、培养液澄清度90%以上、pH值为3.0-4.0。
6、茶树菇液体菌种保藏
茶树菇液体菌种保藏方法为：低温、密闭条件下保藏。保藏有效期和保藏温度对应如下：保藏温度为0-5℃时保藏有效期10-12天；保藏温度为6-10℃时保藏有效期8-10天；保藏温度为11-16℃时保藏有效期5-8天；保藏温度为17-19℃时保藏有效期3-5天；保藏温度为20-22℃时保藏有效期2-3天。
本发明以菌球数量、大小、表面毛刺多少、菌体得率为指标筛选液体培养茶树菇高效菌株；依据茶树菇的生物学特性，以菌种生物量和菌种活性（接种后萌发时间、菌丝长速）为检验指标，确定茶树菇液体菌种摇瓶和发酵罐培养的培养基配方；以茶树菇液体菌种性状（密度、直径）和菌种活性（萌发时间、菌丝长速）为指标，确定茶树菇液体菌种摇瓶培养装料系数、培养温度、摇瓶转速和接种量的条件组合；按照茶树菇摇瓶培养菌体生物量、摇瓶质量变化随培养时间的变化规律和菌种活性来判定茶树菇菌种液体培养终点；依据发酵罐工作原理，以菌球直径、菌球密度、菌丝体生物量为指标和培养液pH变化规律来确定发酵罐液体培养装料系数、搅拌转速、通气量、接种量、发酵时间；以菌种活性（接种后萌发时间、菌丝长速）为指标确定茶树菇液体菌种保藏方法。
本发明把发酵工程技术与茶树菇生物学特性有机地结合起来，不仅获得高质量的茶树菇液体菌种，并能有效地降低茶树菇生产成本。液体培养生产茶树菇菌种技术解决了茶树菇生产菌种上的关键技术问题，改变了目前茶树菇菌种“试管—瓶子—小袋—大袋”的生产方式，为实现茶树菇生产的规模化、集约化、标准化生产提供配套技术。
本发明工艺具有以下特点：
1、生产周期短。采用传统的茶树菇斜面母种→固体原种→固体栽培种的茶树菇菌种生产方式，需要70天左右，而采用茶树菇斜面母种→摇瓶菌种→发酵罐液体菌种的生产方式，生产周期只要20天左右。
2、生产成本低。相比固体菌种生产，不仅所需原料便宜，而且由于不使用传统的菌种瓶或菌种袋，可省去装瓶、挖瓶、接种等很多繁杂工艺，同时由于采取配套的高效率接种机和接种枪等接种工具接种，可节省大量的劳动力、电耗和空间等，所以可降低生产成本。
3、接种后出菇整齐，便于管理。由于液体菌种菌龄一致、流动性好、活性强、萌发点多，接种后菌丝萌发快，生长速度一致，现蕾和出菇的时间一致性好，便于采收、管理和加工，可提高栽培效益。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行详细说明：
实施例1
本发明提供一种液体培养生产茶树菇菌种的方法，其工艺步骤和工艺参数为：
1．液体培养高效菌株筛选
优选液体培养菌球数量多、大小均匀、表面毛刺多的菌株，其菌球数量200-260个/ml、菌球直径1.0-1.5ml；
2．摇瓶培养
①摇瓶培养基配方：葡萄糖1-3%、玉米粉2-4%、酵母粉0.2-0.4%、麸皮1.0-3.0%、KH2PO40.5-1.5%、MgSO40.5-1.0%、PH值自然。
②摇瓶培养基配制：先清洗摇瓶，然后进行空灭，灭菌方法同常规。按照摇瓶培养基配方称取原料，土豆切片煮沸后维持10-15min，过滤后取滤液，麦麸煮沸后维持10-15min，过滤后取滤液，其余原料加热溶解后与过滤液一起装瓶，摇瓶装料系数为20-30%，在温度121℃、压力0.15Mpa下灭菌30-40min。
③摇瓶培养：摇瓶培养基灭菌后冷却到28℃以下，按照无菌操作要求，在摇瓶培养基液面上接入3-4块黄豆大小的斜面种子，菌种面朝上，24-26℃下恒温静止培养2-3天后，在温度23-25℃、转速180-200r/min条件下摇床培养，培养3-4天。发酵终点判断：菌球表面多毛刺、菌球数量900-1200个/ml、菌球直径0.5-1毫米、培养液澄清度90%以上。
3、发酵罐培养
①发酵罐培养基配方：马铃薯15-25%、麦麸2-4%、蛋白胨2-4%、KH2PO40.1-0.15%、MgSO4·7H2O0.05-0.1%、酵母粉0.2-0.4%、豆油1%。
②发酵罐培养基配制：按照发酵罐培养基配方称取原料，培养液的配制及过滤同摇瓶培养基配制方法。
③发酵罐清洗和空灭：将发酵罐清洗后在温度121-126℃、压力0.12-0.15Mpa下灭菌30-50min。
④上料：发酵罐空灭后从投料口加入配制好的培养液和豆油，发酵罐装料系数为50-60%，打开气泵搅拌2-3min，在温度121℃、压力0.12-0.15Mpa下灭菌40-45min。
⑤灭菌：料液装罐后在温度123℃、压力0.12Mpa条件下灭菌30-40min。
⑥接种：培养基灭菌后冷却至25-28℃，按照无菌操作要求，将摇瓶菌种按无菌操作要求从进料口接入发酵罐，接种量10-15%。
⑦发酵罐培养：启动设备控制柜进入培养状态，培养温度24-26℃、搅拌机转速为150-200r/min，通气量1：0.5V/V/min，培养时间3-4天。
⑧发酵终点判定：接种24小时后，每隔12小时，在火焰控制下从接种口取样观察菌种萌发和生长情况。发酵终点判断标准：菌球表面多毛刺、菌球数量200-260个/ml、菌球直径1.0-1.5ml，培养液澄清度90%以上，pH值3.0-4.0。
本发明技术指标：相比固体菌种生产成本节省60%，污染率1.5%以下，菌种培养时间缩短18-21天，出菇时间缩短8-10天，茶树菇产量提高16%。
实施例2：
1．液体培养高效菌株筛选
优选液体培养菌球数量多、大小均匀、表面毛刺多的菌株，其菌球数量200-260个/ml、菌球直径1.0-1.5mm；
2．摇瓶培养
①摇瓶培养基配方：葡萄糖1%、玉米粉4%、酵母粉0.3%、麸皮2.0%、KH2PO40.5%、MgSO40.8%、PH值自然。
②摇瓶培养基配制：先清洗摇瓶，然后进行空灭，灭菌方法同常规。按照摇瓶培养基配方称取原料，土豆切片煮沸后维持15min，过滤后取滤液，麦麸煮沸后维持15min，过滤后取滤液，其余原料加热溶解后与过滤液一起装瓶，摇瓶装料系数25%，在温度121℃、压力0.15Mpa下灭菌35min。
③摇瓶培养：摇瓶培养基灭菌后冷却到26℃，按照无菌操作要求，在摇瓶培养基液面上接入3块黄豆大小的斜面种子，菌种面朝上，24-26℃下恒温静止培养3天后，在温度23-25℃、转速180r/min条件下摇床培养，培养4天。发酵终点判断标准：菌球表面多毛刺、菌球数量900-1200个/ml、菌球直径0.5-1mm和培养液澄清度90%。
3．发酵罐培养
①发酵罐培养基配方：马铃薯25%、麦麸2%、蛋白胨2%、KH2PO40.15%、MgSO4·7H2O0.06%、酵母粉0.2%、豆油1%。
②发酵罐培养基配制：按照发酵罐培养基配方称取原料，培养液的熬制、过滤同摇瓶培养基配制方法。
③发酵罐清洗和空灭：将发酵罐清洗后在温度121℃、压力0.12Mpa下空灭30min。
④上料：发酵罐空灭后从投料口加入配制好的培养液和1%豆油，发酵罐装料系数为60%，打开气泵搅拌3min。
⑤灭菌：将料液在温度121℃、压力0.12下灭菌45min。
⑥接种：培养基灭菌后冷却至25℃，按照无菌操作要求，将摇瓶菌种按无菌操作要求从进料口接入发酵罐，接种量15%。
⑦发酵罐培养：启动设备控制柜进入培养状态，培养温度26℃、搅拌机转速为180r/min，通气量1：0.5V/V/min，培养时间4天。
⑧发酵终点判定：接种24小时后，每隔12小时，在火焰控制下从接种口取样观察菌种萌发和生长情况。发酵终点判断标准：菌丝体含量不再增加，菌球表面多毛刺、菌球数量200-260个/ml、菌球直径1.0-1.5mm，培养液澄清度90%以上，pH值3.0-4.0。
本发明技术指标：相比固体菌种生产成本节省60%，污染率1.5%以下，菌种培养时间缩短18-21天，出菇时间缩短8-10天，茶树菇产量提高16%。
实施例3：
1．液体培养高效菌株筛选
优选液体培养菌球数量多、大小均匀、表面毛刺多的菌株，其菌球数量200-260个/ml、菌球直径1.0-1.5mm。
2．摇瓶培养
①摇瓶培养基配方：葡萄糖3%、玉米粉2%、酵母粉0.2%、麸皮1.0%、KH2PO41.5%、MgSO41.0%、PH值自然。
②摇瓶培养基配制：先清洗摇瓶，然后进行空灭，灭菌方法同常规。按照摇瓶培养基配方称取原料，土豆切片煮沸后维持10min，过滤后取滤液，麦麸煮沸后维持10min，过滤取滤液，其余原料加热溶解后与过滤液一起装瓶，摇瓶装料系数20%，在温度121℃、压力0.15Mpa下灭菌35min。
③摇瓶培养：摇瓶培养基灭菌后冷却到28℃，按照无菌操作要求，在摇瓶培养基液面上接入3块黄豆大小的斜面种子，菌种面朝上，24-26℃下恒温静止培养3天后，在温度23-25℃、转速200r/min条件下摇床培养，培养3天。发酵终点判断：菌球表面多毛刺、菌球数量900-1200个/ml、菌球直径0.5-1mm和培养液澄清度92%。
3．发酵罐培养
①发酵罐培养基配方：马铃薯15%、麦麸4%、蛋白胨4%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O0.08%、酵母粉0.4%、菜油1%。
②发酵罐培养基配制：按照发酵罐培养基配方称取原料，培养液的熬制、过滤同摇瓶培养基配制方法。
③发酵罐清洗和空灭：发酵罐清洗后在温度121℃、压力0.12Mpa下空灭30min。
④上料：发酵罐空灭后从投料口加入配好的培养液和菜油1%，发酵罐装料系数为50%，打开气泵搅拌2min。
⑤灭菌：将料液在温度121℃、压力0.12下灭菌45min。
⑥接种：培养基灭菌后冷却至25℃，按照无菌操作要求，将摇瓶菌种从进料口接入发酵罐，接种量为10%。
⑦发酵罐培养：启动设备控制柜进入培养状态，培养温度24℃、搅拌机转速为180r/min，通气量1：0.6V/V/min，培养时间3天。
⑧发酵终点判定：接种24小时后，每隔12小时，在火焰控制下从接种口取样观察菌种萌发和生长情况。发酵终点判断标准：菌丝体含量不再增加，菌球表面多毛刺、菌球数量200-260个/ml、菌球直径1.0-1.5ml，培养液澄清度90%，pH值3.0-4.0。
实施例4：
1．液体培养高效菌株筛选
优选液体培养菌球数量多、大小均匀、表面毛刺多的菌株，其菌球数量200-260个/ml、菌球直径1.0-1.5mm；
2．摇瓶培养
①摇瓶培养基配方：葡萄糖2%、玉米粉3%、酵母粉0.3%、麸皮3.0%、KH2PO41.0%、MgSO40.5%、PH值自然。
②摇瓶培养基配制：先清洗摇瓶，然后进行空灭，灭菌方法同常规。按照摇瓶培养基配方称取原料，土豆切片煮沸后维持12min，过滤后取滤液，麦麸煮沸后维持12min，过滤后取滤液，其余原料加热溶解后与过滤液一起装瓶，摇瓶装料系数为24%，在温度121℃、压力0.15Mpa下灭菌35min。
③摇瓶培养：摇瓶培养基灭菌后冷却到26℃，按照无菌操作要求，在摇瓶培养基液面上接入3块黄豆大小的斜面种子，菌种面朝上，24-26℃下恒温静止培养3天后，在温度23-25℃、转速180r/min条件下摇床培养，培养4天。发酵终点判断：菌球表面多毛刺、菌球数量900-1200个/ml、菌球直径0.5-1mm和培养液澄清度93%。
3．发酵罐培养
①发酵罐培养基配方：马铃薯20%、麦麸2%、蛋白胨3%、KH2PO40.12%、MgSO4·7H2O0.1%、酵母粉0.4%、豆油1%。
②发酵罐培养基配制：按照发酵罐培养基配方称取原料，培养液的熬制、过滤同摇瓶培养基配制方法。
③发酵罐清洗和空灭：将发酵罐清洗后在温度121℃、压力0.12Mpa下空灭30min。
④上料：发酵罐空灭后从投料口加入配好的培养液和1%豆油，发酵罐装料系数为55%，打开气泵搅拌3min。
⑤灭菌：将料液在温度121℃、压力0.12下灭菌45min。
⑥接种：培养基灭菌后冷却至25℃，按照无菌操作要求，将摇瓶菌种按无菌操作要求从进料口接入发酵罐，接种量为12%。
⑦培养：启动设备控制柜进入培养状态，培养温度26℃、搅拌机转速为190r/min，通气量1：0.5V/V/min，培养时间4天。
⑧发酵终点判定：接种24小时后，每隔12小时，在火焰控制下从接种口取样观察菌种萌发和生长情况。发酵终点判断标准：菌球表面多毛刺、菌球数量200-260个/ml、菌球直径1.0-1.5mm，培养液澄清度90%以上，pH值3.0-4.0。
实施例5：
1．液体培养高效菌株筛选
优选液体培养菌球数量多、大小均匀、表面毛刺多的菌株，其菌球数量200-260个/ml、菌球直径1.0-1.5ml；
2．摇瓶培养
①摇瓶培养基配方：葡萄糖2%、玉米粉2%、酵母粉0.2%、麸皮3.0%、KH2PO41.2%、MgSO40.9%、PH值自然。
②摇瓶培养基配制：先清洗摇瓶，然后进行空灭，灭菌方法同常规。按照摇瓶培养基配方称取原料，土豆切片煮沸后维持15min，过滤后取滤液，麦麸煮沸后维持15min，过滤后取滤液，其余原料加热溶解后与滤液一起装瓶，摇瓶装料系数25%，在温度121℃、压力0.15Mpa下灭菌35min。
③摇瓶培养：摇瓶培养基灭菌后冷却到26℃，按照无菌操作要求，在摇瓶培养基液面上接入4块黄豆大小的斜面种子，菌种面朝上，24-26℃下恒温静止培养3天后，在温度23-25℃、转速180r/min条件下摇床培养，培养4天。发酵终点判断：菌球表面多毛刺、菌球数量900-1200个/ml、菌球直径0.5-1毫米和培养液澄清度92%。
3．发酵罐培养
①发酵罐培养基配方：马铃薯25%、麦麸2%、蛋白胨2%、KH2PO40.15%、MgSO4·7H2O0.06%、酵母粉0.2%、豆油1%。
②发酵罐培养基配制：按照发酵罐培养基配方称取原料，培养液的熬制、过滤同摇瓶培养基配制方法。
③发酵罐清洗和空灭：将发酵罐清洗后在温度121℃、压力0.12Mpa下空灭30min。
④上料：发酵罐空灭后从投料口加入配好的培养液和1%豆油，发酵罐装料系数为60%，打开气泵搅拌3min。
⑤灭菌：在温度121℃、压力0.12下灭菌45min。
⑥接种：培养基灭菌后冷却至25℃，按照无菌操作要求，将摇瓶菌种从进料口接入发酵罐，接种量为15%。
⑦培养：启动设备控制柜进入培养状态，培养温度26℃、搅拌机转速为180r/min，通气量1：0.5V/V/min，培养时间4天。
⑧发酵终点判定：接种24小时后，每隔12小时，在火焰控制下从接种口取样观察菌种萌发和生长情况。发酵终点判断标准：菌丝体含量不再增加，菌球表面多毛刺、菌球数量200-260个/ml、菌球直径1.0-1.5mm，培养液澄清度91%，pH值3.0-4.0。
实施例6：
1．液体培养高效菌株筛选
优选液体培养菌球数量多、大小均匀、表面毛刺多的菌株，其菌球数量200-260个/ml、菌球直径1.0-1.5ml；
2．摇瓶培养
①摇瓶培养基配方：葡萄糖3%、玉米粉3%、酵母粉0.3%、麸皮2.0%、KH2PO41.0%、MgSO40.8%、PH值自然。
②摇瓶培养基配制：先清洗摇瓶，然后进行空灭，灭菌方法同常规。按照摇瓶培养基配方称取原料，土豆切片煮沸后维持15min，过滤后取过滤滤液，麦麸煮沸后维持15min，过滤取滤液，其余原料加热溶解后与滤液一起装瓶，摇瓶装料系数25%，在温度121℃、压力0.15Mpa下灭菌35min。
③摇瓶培养：摇瓶培养基灭菌后冷却到26℃，按照无菌操作要求，在摇瓶培养基液面上接入3块黄豆大小的斜面种子，菌种面朝上，24-26℃下恒温静止培养3天后，在温度23-25℃、转速180r/min条件下摇床培养，培养4天。发酵终点判断：菌球表面多毛刺、菌球数量900-1200个/ml、菌球直径0.5-1.0mm和培养液澄清度94%。
3．发酵罐培养
①发酵罐培养基配方：马铃薯25%、麦麸2%、蛋白胨2%、KH2PO40.15%、MgSO4·7H2O0.06%、酵母粉0.2%、菜油1%。
②发酵罐培养基配制：按照发酵罐培养基配方称取原料，培养液的熬制、过滤同摇瓶培养基配制方法。
③发酵罐清洗和空灭：发酵罐清洗后在温度121℃、压力0.12Mpa下空灭30min。
④上料：发酵罐空灭后从投料口加入配好的培养液和1%菜油，发酵罐装料系数为60%，打开气泵搅拌3min。
⑤灭菌：在温度121℃、压力0.12下灭菌45min。
⑥接种：培养基灭菌后冷却至25℃，按照无菌操作要求，将摇瓶菌种从进料口接入发酵罐，接种量为15%。
⑦发酵罐培养：启动设备控制柜进入培养状态，培养温度26℃、搅拌机转速为180r/min，通气量1：0.5V/V/min，培养时间4天。
⑧发酵终点判定：接种24小时后，每隔12小时，在火焰控制下从接种口取样观察菌种萌发和生长情况。发酵终点判断标准：菌球表面多毛刺、菌球数量200-260个/ml、菌球直径1.0-1.5mm，培养液澄清度90%以上，pH值3.0-4.0。

Claims (1)

1.一种液体培养生产茶树菇菌种的方法，其工艺步骤和工艺参数为：
1.1筛选液体培养高效菌株：
选择液体培养菌球数量多、大小均匀、表面毛刺多的菌株，培养的菌球数量200-260个/ml、菌球直径1.0-1.5mm；
1.2摇瓶培养基配方：
葡萄糖1-3%、玉米粉2-4%、酵母粉0.2-0.4%、麸皮1.0-3.0%、KH2PO40.5-1.5%、MgSO40.5-1.0%、PH值自然；
1.3摇瓶培养工艺参数：
摇瓶装料系数为20-30%、24-26℃下恒温静止培养时间为2-3天，摇瓶培养温度为23-25℃、摇瓶培养转速为180-200r/min、摇瓶培养时间为3-4天，摇瓶培养发酵终点判断标准：菌球表面多毛刺、菌球数量为900-1200个/ml、菌球直径为0.5-1mm，培养液澄清度90%以上；
1.4发酵罐培养基配方：
马铃薯15-25%、麦麸2-4%、蛋白胨2-4%、KH2PO40.1-0.15%、MgSO4·7H2O0.05-0.1%、酵母粉0.2-0.4%、消泡剂1%；
1.5发酵罐培养参数：
发酵罐装料系数为50-60%、接种量为10-15%、培养温度为24-26℃、搅拌机转速为150-200r/min，通气量为1：0.5-0.6V/V/min，培养时间3-4天，发酵终点判断标准：菌球表面多毛刺、菌球数量200-260个/ml、菌球直径1.0-1.5mm、培养液澄清度90%以上、pH值3-4.0。
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