CN104710206A

CN104710206A - 一种草菇液体菌种制备的方法

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Publication number: CN104710206A
Application number: CN201310291383.8A
Authority: CN
Inventors: 蔡德华; 张萍
Original assignee: Ludong University
Current assignee: Ludong University
Priority date: 2013-07-12
Filing date: 2013-07-12
Publication date: 2015-06-17

Abstract

一种草菇液体菌种制备的方法，草菇[Volvariella volvacea (Bull.ex.Fr.) Sing.] 又名兰花菇﹑苞脚菇等，是一种生长在热带和亚热带的炎热夏季的菇类，也是我国重要的食用菌，我国产量居世界首位。在我国，主要产在广东和福建等省。近年来，在华东和华北一带草菇生产迅猛发展，由于菌株的命名比较混乱，目前传统的食用菌制种和栽培方式已不能满足市场对食用菌产品的需求。用大规模工业化生产方式来生产某些食用菌菌丝体已成为食用菌生产的一个新途径，因此发酵技术在食用菌上的应用便应运而生。为筛选出适合栽培的优良品种，更好的指导生产，对这一带常用的6个菌株进行了综合研究，对6个菌株进行了菌丝生长速度、菌株间的拮抗性、CMC酶相对活性、同工酶和抗霉性等特性的研究。

Description

一种草菇液体菌种制备的方法

技术领域

一种草菇液体菌种制备的方法，属于食用菌栽培学领域。

背景技术

草菇 [Volvariella volvacea (Bull. ex Fr.) Sing.]，又名苞脚菇、兰花菇、麻菇、杆菇、南华菇、贡菇、家生菇等,国外又称草菇为"中国蘑菇"。隶属于真菌门（Eumycota）、担子菌纲(Basidiomycetes)，伞菌目(Agaricales)，光柄菇科（Pluteaceae），苞脚菇属（ Volvariella）。草菇是热带和亚热带地区广泛栽培的食用菌。它不仅味道鲜美,而且营养价值很高。据测定,干草菇蛋白质含量为37.13%，明显高于一般的蔬菜，每百克鲜草菇含维生素C206.27毫克,比富含维生素C而著名的柚、橙、番茄、辣椒都高，居于水果蔬菜之首，此外,草菇中还含有包括人体必需的8种氨基酸在内的17种氨基酸等物质。

草菇性寒、味甘，具有补脾益气、清暑去热、发乳肥孩、护肝健胃及解毒之功效，常食草菇，有利于降血压,抗肿瘤,增强机体抗病，加速伤口的愈合。现代医学研究表明，草菇含有异构蛋白，可增强人体免疫机能，降低胆固醇含量，预防动脉粥样化。草菇中含有一种叫民种蛋白的物质,有抗癌作用,它还含有氮浸出物和嘌呤碱,又能抑制癌细胞的生长。

中国是草菇的生产消费大国，此外，日本、泰国、越南、马来西亚等国草菇的栽培也很普遍。过去我国的草菇生产区主要集中在广东、浙江、福建等南方沿海各省。近20年来，我国的草菇生产有了很大的发展，北方各省利用麦秸、棉子皮、种过其它蘑菇的菌糠进行草菇栽培，创造了适合北方气候特点的多科栽培模式。草菇产品的销售主要有2个方面：一个是加工成盐渍去皮草菇出口日本等因素，这种产品多年来在国际市场上畅销不衰。草菇的另一个销售市场是内销，草菇的国内销售市场潜力巨大。广州果菜公司就在广州江南蔬菜批发市场附近，建了广州最大的草菇批发市场（长堤草菇交易市场）。随着人们生活水平的不断提高，草菇罐头在北方的销量也逐年增加。

面对入世给食用菌产业带来的机遇和挑战与技术落后现状，我们必须在技术上有所突破和创新。因此这迫切需要用液体菌种来代替固体菌种的栽培。我们着眼于进行草菇深层发酵技术的研究，改变了传统的用固体菌种生产的方法。我们经过几年的研究、反复实验终于研究成功了草菇液体菌种规模化生产新技术，该技术不仅可以大大缩短菌种的制种时间，提高菌种质量，降低菌种生产成本，提高子实体品质、产品质量和商品价值等等，而且投资少，技术易掌握，适合我国国情，具有很高的推广价值。

发明内容

1.草菇液体培养碳氮源的优选

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种草菇V₁₁₀，引自江苏高邮市食用菌研究所。

1.1.2母种培养基

马铃薯20%, 葡萄糖2%，麦麸3%，蛋白胨0.15%， KH₂PO₄0.2%，MgSO₄·7H₂O 0.15%.，琼脂2%。

1.1.3一级摇瓶培养基

马铃薯5%，蔗糖2%，蛋白胨0.15%，麦麸3%， KH₂PO₄0.1%，MgSO₄ 0.05%，VB₁0.001%

1.1.4碳源供试培养基

蛋白胨0.5%，KH₂PO₄0.05%，MgSO₄0.1%，V_B10.001%，碳源。分别用2%的葡萄糖、乳糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、红糖和淀粉替换其中的碳源。

1.1.5氮源供试培养基

葡萄糖2%，KH₂PO₄ 0.05%，MgSO₄ 0.1%，V_B10.001%，氮源。分别用0.5%的蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、KNO₃、甘氨酸和谷氨酸替换其中的氮源。_.

1.1.6无机盐供试培养基

将葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，VB₁0.001%培养基中的MgSO₄·7H₂O，分别用0.2%的ZnSO₄、KH₂PO₄、CaCI₂、MgSO₄·7H₂O和Fe₂(SO₄)₃替换。

1.1.7农副产品水解液供试培养基：

将麦麸4%，葡萄糖2%，土豆5%，KH₂PO₄0.1%，MgSO₄ 0.05%，VB₁0.001%培养基中的麦麸，分别用等量的玉米馇、黄豆渣和淀粉替换。

1.2方法

1.2.1培养基制备

马铃薯削皮后切成长条状，与麦麸一起放入水中，煮沸后维持25min左右。八层纱布过滤后取滤液，然后分别加入各药品，定容。趁热将培养基分装入试管，装量为试管的1/4~1/3，在0.15mPa，121℃灭菌0.5h取出摆斜面。液体培养基分装于500ml锥形瓶，每瓶装150ml，121℃灭菌0.5h.。

1.2.2菌种活化

将保藏的草菇菌种无菌操作接至试管斜面上，30℃下培养一周左右，此时菌丝长满斜面，即可使用。

1.2.3液体菌种的制备

1.2.3.1接种一级摇瓶：无菌操作从斜面上取大小相近的0.5㎝×0.5㎝的母种块，接种于液体培养基中（菌块要薄，少带培养基，尽量使菌块漂浮在液面上）。每瓶接种3块。25℃静置24h，然后置于30℃ ，220 r/min左右旋转式摇床上培养5天左右。

1.2.3.2接种二级摇瓶无菌操作，接种量为10%，置于旋转式摇床上30℃，220r/min培养3天。每组设3次重复。

1.2.4结果处理

①菌球体积比的测定将发酵液倒入量筒中，充分静止后，测量菌球体积，计算其体积比。

②菌球的大小测定用移液管从量筒中分别吸取1ml发酵液放入3个培养皿中，培养皿下方衬以方格纸，测量菌球直径。

③ 菌丝生长量的测定将发酵液用脱脂棉过滤后，再用蒸馏水冲洗数次，沥干，然后在60℃烘箱中烘干至恒重，用电子分析天平称重。

2结果与分析

2.1不同的碳源对草菇液体培养的影响

2.1.1最适碳源的筛选结果（见表1）：

表1 不同碳源对草菇液体培养的影响

从表1中，可以看出草菇对碳源的利用比较广泛，单糖、双塘、多糖均可利用。在以蔗糖为碳源的培养基上，菌丝长势最好，菌球生长比较均匀。在以葡萄糖、麦芽糖为碳源的培养基上，草菇生长也较好，但不及在葡萄糖为碳源的培养基上长势好。在以淀粉为碳源的培养基上，草菇生长较差。

2.1.2方差分析

由表1可知，草菇在以葡萄糖、果糖、乳糖、红糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉为碳源的培养基上，都生长较好。通过对它干重的进行方差分析，筛选出较优的碳源。对7种培养基中菌丝干重进行方差分析，结果见表2。

表2 碳源培养基菌丝体干重方差分析表

差异源	SS	df	MS	F值	F(0.05)	F(0.01)
							组间	0.233	6	0.0388	19.5107	2.8477	4.4558
组内	0.0279	14	0.0020
							总计	0.2609	20

SS-离差平方和，df-自由度，MS-均方，F_(0.05)-F临界值（以下同）

由表2可知，碳源F值19.5107＞F_(0.05)= 2.8477，且F值4.1001＞F_(0.01)= 4.4558，可以看出草菇在各供试培养基中利用碳源的能力不同，差异极显著。为了进一步说明培养基间的差异显著性，又进行了均数间的多重比较，结果见表3。

表3 碳源培养基菌丝体干重SSR检验表

由菌丝体干重SSR检验可以看出：蔗糖、麦芽糖、葡萄糖和红糖间差异不显著，而蔗糖、麦芽糖、葡萄糖与、果糖、可溶性淀粉之间差异显著，蔗糖与果糖、乳糖、可溶性淀粉差异极显著。从菌丝体干重可知蔗糖是最适于草菇生长的碳源，其次是麦芽糖和葡萄糖，而淀粉不适于草菇的生长。

2.2不同氮源对草菇深层发酵的影响

2.2.1最适氮源的筛选结果：

表4 不同氮源对草菇液体培养的影响

由表4可知，草菇在酵母膏、蛋白胨、牛肉膏培养基中生长较好，菌球形态较好；在无机氮源培养基中生长较快，但菌球不均匀，具有刺突；在谷氨酸和甘氨酸培养基上，菌丝生长慢，菌球小。总体看来，草菇在酵母膏、蛋白胨、牛肉膏培养基中生长明显优于其它氮源培养基。

2.2.2方差分析

由表4可知，草菇在复合氮源和无机氮源培养基中均能较好地生长，但在菌球形态、大小上存在着差异，对其干重进行方差分析，筛选出较优的氮源。对7种培养基中菌丝干重进行方差分析，结果见表5：

表5 氮源培养基菌丝体干重方差分析表

差异源	SS	df	MS	F	F(0.05)	F(0.01)
							组间	0.88	6	0.1467	72.092	2.8477	4.4558
组内	0.0285	14	0.0020
							总计	0.9085	20

由表5可知，氮源F值72.092＞F（0.05）=2.8477，且F值＞F（0.01）=4.4558。可以看出，草菇利用氮源的能力不同，差异极显著。

表6 氮源培养基菌丝体干重SSR检验表

由表6菌丝体干重SSR检验可以看出：蛋白胨、牛肉膏、酵母膏与硝酸钾、硝酸铵之间差异不显著，两种氨基酸差异不显著；而蛋白胨、牛肉膏、酵母膏与硝酸铵、甘氨酸和谷氨酸差异极显著。由此可知，草菇在以蛋白胨、酵母膏、牛肉膏为氮源的培养基上生长较好，而在以甘氨酸、谷氨酸为单一氮源的培养基上生长较差，所以草菇利用复合氮源的能力要比氨基酸强得多，这与其在固体培养基上的结果是一致的。

2.3不同无机盐对草菇液体培养的影响

2.3.1最适无机盐的筛选结果：

表7 不同无机盐对草菇液体培养的影响

由表7可以看出，草菇在含MgSO₄、Fe₂(SO₄)₃、KH₂PO₄ 和ZnSO₄的培养基上生长较好，其中，在含KH₂PO₄的培养基上生长最好，在含CaCI₂的培养基上生长最差。可见草菇菌丝生长过程中需要K⁺和Mg²⁺等离子，对Ca²⁺的需求很少。

2.3.2方差分析

由表7 可以看出，不同无机盐的菌丝体干重有所差异，对其干重进行方差分析，筛选出比较适合草菇生长的无机盐。对5种培养基中菌丝干重进行方差分析，结果见表8。

表8不同无机盐菌丝体干重方差分析表

差异源	SS	df	MS	F值	F(0.05)	F(0.01)
							组间	0.3825	4	0.0956	10.4209	3.4780	5.9943
组内	0.0918	10	0.0092
							总计	0.4742	14

由表8可知，无机盐的F值10.4209>F(0.05)=3.478，且F值> F(0.01)=5.9943，由此可以看出，草菇在不同无机盐培养基上生物量不同，存在极显著差异。为了进一步说明培养基间的差异显著性，又进行了均数间的多重比较，结果见表9。

表9 不同无机盐菌丝体干重SSR检验表

由表9可知，KH₂PO₄与ZnSO₄、CaCI₂、MgSO₄、Fe₂(SO₄)₃差异显著，而ZnSO₄与Fe₂(SO₄)₃、CaCI₂差异不显著，与MgSO₄、KH₂PO₄差异显著。由SSR_0.01可以看出：KH₂PO₄与ZnSO₄、CaCI₂、Fe₂(SO₄)₃差异极显著，与MgSO₄差异不显著。因此，草菇生长需要KH₂PO₄和MgSO₄的参与。

2.4农副产品水解液对草菇液体培养的影响

2.4.1农副产品水解液的筛选结果：

表10 不同农副产品水解液对草菇液体培养的影响

2.4.2方差分析

由表10可以看出，不同农副产品水解液的菌丝体干重有所差异，对其干重进行方差分析，筛选出最适碳氮比（见表11）：

表11 不同农副产品水解液培养基菌丝体干重方差分析表

差异源	SS	df	MS	F	F(0.05)	F(0.01)
							组间	0.0553	3	0.0184	9.0993	4.0662	7.5910
组内	0.0162	8	0.0020
							总计	0.0716	11

由表11可知，不同农副产品水解液的F值9.0993>F(0.05)= 4.0662，且F值> F(0.01)= 7.5910，由此可以看出，草菇在不同农副产品水解液培养基上生物量不同，存在极显著差异。为了进一步说明培养基间的差异显著性，又进行了均数间的多重比较，结果见表9。

表12 不同农副产品水解液菌丝体干重SSR检验表

由表12可知，麸皮和黄豆渣培养基、黄豆渣和玉米粉培养基、玉米粉与淀粉培养基之间差异不显著，而麸皮与玉米粉、淀粉之间差异极为显著。由此可知，草菇在以麦麸和黄豆渣为原料的培养基上生长较好，而在以淀粉为原料的培养基上生长较差。

3讨论

经上述实验与分析，可以得出如下结论：草菇在以蔗糖为碳源的培养基上均能良好生长，在多糖培养基上生长较差，最适宜的碳源是蔗糖。在复合氮源培养基上生长均好于无机氮源和两种氨基酸培养基，而在以蛋白胨、酵母膏、牛肉膏为氮源的培养基上生长最好。草菇在含KH₂PO₄、MgSO₄、Fe₂(SO₄)₃的培养基上生长良好，而在含KH₂PO₄的培养基上生长最好。草菇在农产品水解液制备的培养基上都可良好生长，能获得较大的生物量。而麦麸制备的培养基最适于草菇生长，可获得最大的生物量。

2.草菇液体培养基的正交试验研究

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试菌株：草菇V₁₁₀，引自江苏高邮市食用菌研究所。

1.1.2培养基

A.母种培养基：马铃薯20%, 葡萄糖1%,麦麸3%, 蛋白胨0.15%，琼脂2%,，KH₂PO₄0.2%, MgSO₄·7H₂O 0.15%.

B.一级摇瓶培养基：马铃薯5%，蔗糖2%，蛋白胨0.15%，麦麸3%， KH₂PO₄0.1%，MgSO₄ 0.05%，VB₁0.001%

C.碳源供试培养基：蛋白胨0.5%，KH₂PO₄0.05%，MgSO₄0.1%，V_B10.001%，碳源。分别用2%的葡萄糖、乳糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、红糖和淀粉替换其中的碳源。

D.氮源供试培养基：葡萄糖2%，KH₂PO₄ 0.2%，MgSO₄ 0.1%，V_B10.001%，氮源。分别用0.2%的蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、KNO₃、甘氨酸和谷氨酸替换其中的氮源。_.

E.无机盐供试培养基：葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，VB₁0.001%。分别用0.2%的硫酸锌、氯化钙、硫酸镁、硫酸铁和磷酸二氢钾替换其中的无机盐。

F.农副产品水解液供试培养基：将麦麸4%，葡萄糖1%，土豆5%，KH₂PO₄0.1%，MgSO₄ 0.05%，VB₁0.001%培养基中的麦麸，分别用等量的玉米馇、黄豆渣和淀粉替换。

G.正交试验培养基配方：马铃薯5%，KH₂PO₄0.2%， V_B10.001%，碳源1%，氮源0.2%，农产品3%、无机盐 0.1%，。其中碳源、氮源、无机盐、农副产品见表13。

表13 因素水平表

1.2 方法

1.2.1 菌种活化：将保存的菌种无菌操作接种至斜面母种培养基，30℃下培养7d左右。

1.2.2 接种一级摇瓶：无菌操作从斜面母种取0.5㎝²大小的菌种块，接种于装有培养基的一级摇瓶中，每瓶接种3块，尽量使菌种块漂浮在液面上。30℃条件下静置24hr，然后置于30℃、220 r/min左右的旋转式摇床上培养5天左右。

1.2.3 接种碳源、氮源、无机盐和农副产品水解液摇瓶按配方C、D、E、F将做好的培养基装入500mL的摇瓶中，每瓶约装150mL，在121℃下灭菌30min，冷却后无菌操作将培养好的一级摇瓶种接入各种成分的培养集中，接种量为10%，然后放入30℃、220r/min的摇床上培养3d。观察并记录菌球的生长状况，称量菌丝体的干重。

1.2.4 正交试验

（1）试验设计从碳源、氮源、无机盐和农副产品水解液供试培养结果中，选取较好的三种碳、氮源，无机盐，再加上三种较好的农副产品，设计四因素三水平试验方案，见表3所示。

（2）结果处理

菌丝生长量的测定将发酵液抽滤后，再用蒸馏水冲洗数次，沥干，然后在60℃烘箱中烘干至恒重，用电子分析天平称重。

2结果与分析

2.1 碳源、氮源、无机盐、农产品试验结果与分析

从图1-4可知，草菇菌丝利用氮源的顺序是蛋白胨＞牛肉膏＞酵母膏＞硝酸铵＞硫酸铵＞氯化铵，利用碳源的顺序是蔗糖＞麦芽糖＞葡萄糖＞乳糖＞果糖＞红糖＞淀粉，利用无机盐的顺序是磷酸二氢钾＞硫酸镁＞硫酸铁＞氯化钠＞氯化钙，利用农产品水解液的顺序是麦麸＞黄豆渣＞玉米渣＞淀粉，所以草菇菌丝生长的最适氮源是蛋白胨、牛肉膏、酵母膏，最适碳源是葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，最适无机盐是磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸铁，最适农产品是麦麸、黄豆渣、玉米渣。选择其中的3种最适氮源、碳源、无机盐和农产品进行正交试验，筛选出液体培养基配方的最优组合。

2.2正交试验结果及方差分析

从图5分析可以看出，碳源对草菇菌丝生长的影响最大，其次为氮源和农产品，无机盐影响最小，这与大部分食用菌菌丝生长的条件是一致的。以菌丝干重为参考指标，培养基配方的最佳组合为A₁B₃C₃D₁，即：蔗糖1%＋蛋白胨0.2%＋麦麸3%＋MgSO₄0.1%。

3讨论

通过以上试验和分析可知，草菇可以较广泛地利用各种碳、氮源，其液体培养基的最优配方是马铃薯5%、蔗糖1%、蛋白胨0.2%、麦麸3%、MgSO₄0.1%、KH₂PO₄0.2%、V_B10.001%。至于配方中各成分的含量多少对菌丝体产量的影响，将进一步试验研究。

3.不同碳氮源浓度对草菇深层培养的影响

1. 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种草菇V₁₁₀，引自江苏高邮市食用菌研究所。。

1.1.2 母种培养基马铃薯20%, 葡萄糖1%,，麦麸3%, 蛋白胨0.15%， KH₂PO₄0.1%, MgSO₄·7H₂O 0.05%.，琼脂2%。

1.1.3 一级摇瓶培养基马铃薯20%，麦麸3%，葡萄糖2%，蛋白胨 0.2%， KH₂PO₄0.25%， MgSO₄ 0.15% , 维生素B₁ 0.001% 。

1.1.4 碳源浓度供试培养基马铃薯5%，蛋白胨0.2% , KH₂PO₄0.25%, MgSO₄0.15%, 维生素B₁ 0.001% , 葡萄糖。其中葡萄糖的浓度分别为 0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%。

1.1.5 氮源浓度供试培养基马铃薯5%，葡萄糖2%, KH₂PO₄ 0.25%, MgSO₄0.15%, 维生素B₁0.001%, 蛋白胨。其中蛋白胨浓度分别为 0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%。

1.1.6 正交试验培养基选取较适宜的葡萄糖（2.0%、2.5%、3.0%）和蛋白胨（0.1%、0.2%、0.3%），及常用的无机盐MgSO₄+KH₂PO₄（0.10%+0.20%, 0.15%+0.25% , 0.20%+0.30%）进行正交试验。

1.2 方法

1.2.1 培养基制备马铃薯削皮后切成小块，与麦麸一起放入水中，煮沸后维持约30min,用8层纱布过滤后，取滤液依次加入其他成分，待其他成分溶解后定容。固体培养基分装入试管，装量为试管的1/4～1/5，121℃灭菌30min , 取出摆斜面。液体培养基分装于500mL 锥形瓶，每瓶装150mL, 121℃灭菌30min。

1.2.2 菌种活化将保藏的菌种无菌操作接至斜面，30℃下培养约5d，此时菌丝长满斜面，即可使用。

1.2.3 一级摇瓶种的制备无菌操作从斜面上取大小约为0.5cm²的母种块，接种于液体培养基，尽量使菌块漂浮在液面上。每瓶接种3块。25℃静置培养24h , 然后置于30℃，约220r/min旋转式摇床上培养约5 d 。

1.2.4 接种二级摇瓶无菌操作条件下，将长好的一级摇瓶种用无菌移液管接入二级摇瓶中，接种量为10%, 置于旋转式摇床上，30℃，220r/min 培养3～4 d。每组设3次重复。

1.2.5 结果处理 ⑴ 菌球密度的测定。将发酵液倒入量筒中，待充分静止后，测量菌球体积，计算其体积比。⑵ 菌丝体生长量的测定。将发酵液用滤纸抽滤后，再用蒸馏水冲洗数次，沥干，然后在60℃烘箱中烘干至恒重，用电子分析天平称重。

2 结果与分析

2 . 1 碳源浓度对草菇深层培养的影响

表15 不同浓度的碳源对草菇深层培养的影响

蔗糖浓度（%）	0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
		菌球直径/mm	2-3 2-3 2-4 2-4 2-4 2-4 3-4
菌丝干重/g·(100ml)^-1	0.326 0.484 0.578 0.625 0.583 0.473 0.412

由表15可知，草菇在以不同浓度的葡萄糖为碳源的液体培养基中生长，菌球大小较为一致，在1~3mm之间，但菌丝体干重有明显的差异；随着碳源浓度的增加，菌丝体干重逐渐增加，到浓度为2.0%达最高，而后随着浓度的升高菌丝体干重降低。这说明较低或较高的碳源浓度皆不适宜草菇菌丝体的生长。而各个浓度的菌球密度差异不大，只是在高浓度条件下有明显的减少。

对7种不同浓度碳源培养基中菌丝体干重进行方差分析，结果见表16。

表16 不同浓度的碳源培养基菌丝体干重方差分析

由表16可以看出：不同浓度的碳源F =e＞F_0.05=2.8477 , 但F=3.4678＜F _0.01=4.4558 , 说明草菇在各供试培养基中利用不同浓度的碳源的能力不同，差异显著。为进一步说明培养基间的差异显著性，再进行均数间的多重比较，结果见表17。

表 17 不同浓度碳源培养基菌丝体干重SSR检验

由表17可以看出：碳源浓度在2.0%、3.0%、2.5%、1.0%时的菌丝体干重差异不显著，而碳源浓度在0.5%、3.5%时的菌丝体干重差异也不显著，但碳源浓度在2.0%和3.5%时的菌丝体干重差异是显著的，因此草菇菌丝体生长的较佳碳源浓度是1.5%、2.0%和2.5%。.

2.2 氮源浓度对草菇深层培养的影响

表18 不同浓度的氮源对草菇深层培养的影响

蛋白胨浓度（%）	0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
		菌球直径/mm	1-2 2-3 2-3 3-4 3-4 4-5 5-6*
菌丝干重/g·(100ml)^-1	0.564 0.597 0.615 0.587 0.553 0.497 0.481

由表18可以看出，草菇在含有不同浓度的蛋白胨的液体培养基中生长时，在0.1%、0.2%、0.3%的低浓度时，菌丝体干重较大，菌球密度较大，菌球的直径相对较小；而在高浓度0.4%、0.5%、0.6%、0.7%时，菌丝体长势明显减弱，菌球密度呈下降的趋势，菌丝体干重也变小，菌球直径相对增大。

对7种不同浓度氮源培养基中草菇菌丝体干重进行方差分析，结果见表19。

表19 不同浓度的氮源培养基菌丝体干重方差分析

由表19可以看出：不同浓度的氮源F=12.2156＞F_0.05=2.8477, 但F=12.2156＞F_0.01= 4.4558 , 说明草菇在各供试培养基中利用不同浓度氮源的能力不同，差异极显著。为进一步说明各浓度间的差异显著性，再进行均数间的多重比较，结果见表20。

表20 不同浓度氮源培养基菌丝体干重SSR检验

由表20可以看出：氮的浓度在0.3%、0.4%、0.2%时，所得菌丝体干重差异不显著；在浓度为0.1%、0.2%、0.4%、0.5%时的菌丝体干重也不存在显著的差异性，但在浓度0.1%和0.3%间的菌丝体干重存在显著的差异性。因此适宜草菇菌丝体生长的较佳氮浓度为0.2%、0.3%、0.4%，此时草菇菌丝体生长旺盛，菌球大小适中、均匀，可得到较多的菌丝体。

2.3 正交试验

2.3.1 试验设计

依据前面单因素分析结果，选择3个适宜碳源、氮源、麦麸浓度及常用的无机盐MgSO₄与KH₂PO₄不同浓度搭配组合进行四因素三水平的试验设计（见表21）。从中选取最佳碳源浓度、氮源、麦麸浓度及无机盐浓度的搭配方案，确定该菌种的最适培养基。

表21 因素水平

2.3.2 正交试验结果：

由图6分析可知：A因素（碳源）的R值最大，B因素（氮源）的R值较小，C因素(无机盐）和C因素的R值最小,由此可以判断，碳源浓度对草菇深层培养的影响最大，无机盐浓度的影响最小。从进一步分析可以看出，以菌丝体干重为参考指标，各种营养元素的浓度最佳组合为A₂B₁C₃D₁，即蔗糖2%，蛋白胨2%，麦麸4%，无机盐MgSO₄0.05%， KH₂PO₄0.1%。

3. 结论

通过以上试验和分析可知，草菇可以较广泛地适应不同浓度的碳、氮源、麦麸及无机盐，但是其液体培养基的最优配方是蔗糖2%，蛋白胨2%，麦麸4%，无机盐MgSO₄0.05%， KH₂PO₄0.1% , 再加VB₁ 0.001%。至于其他碳、氮源、农产品水解液及无机盐的最佳浓度还有待于以后的进一步实验。

4.草菇深层培养条件的研究

1. 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种：草菇V₁₁₀，引自江苏高邮市食用菌研究所。

1.1.2 母种培养基马铃薯20%, 葡萄糖2%，麦麸3%，蛋白胨0.15%， KH₂PO₄0.2%，MgSO₄·7H₂O 0.1%.，琼脂2%。

1.1.3一级摇瓶培养基马铃薯5%，蔗糖2%，蛋白胨0.15%，麦麸3%， KH₂PO₄0.1%，MgSO₄ 0.05%，VB₁0.001%

1.1.4二级摇瓶培养基马铃薯20%，葡萄糖2%，蛋白胨0.3%，KH₂PO₄0.1%，MgSO₄0.05%，V_B10.001%

1.2 方法

1.2.1一级摇瓶种的制备：将培养好的试管母种取0.5cm²菌块，在无菌条件下接入500ml盛有150ml培养液的一级摇瓶培养基中，尽量使菌种块漂浮在液面，25℃下静止培养一天，而后置于温度为30℃，转速220r/min。摇床培养约5d，作为液体菌种。

1.2.2试验摇瓶的制备：均采用500mL的锥形瓶，每瓶装二级摇瓶培养基150mL，接种量为10%，摇床培养温度为30℃、转速为220r/min。均重复三次。

1.3不同因素对草菇深层培养的影响：

1.3.1不同温度对草菇深层培养的影响：接种好的二级摇瓶分别置于24℃、27℃、30℃、33℃、36℃和39℃的摇床培养。

1.3.2不同pH对草菇深层培养的影响：将制好的二级摇瓶培养基pH分别调试为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，灭菌后接种培养。

1.3.3不同粘度对草菇深层培养的影响：将制好的二级摇瓶培养基分别添加0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的琼脂，并以不添加琼脂的空白做对照组。

1.3.4不同接种量对草菇深层培养的影响：将制好的二级摇瓶分别接入1%、5%、10%、15%、20%的一级摇瓶种，培养观察。

1.3.5不同瓶装量对草菇深层培养的影响：分别将瓶装量为90mL、120mL、150mL、180mL、210mL、240mL的二级培养基接入10%的一级摇瓶种，培养后测结果。

1.3.6不同转速对草菇深层培养的影响：将接种好的二级摇瓶分别在转速为100r/min、 130r/min、160r/min、190r/min、220r/min、250r/min的摇床上培养测结果。

1.4测定方法：在设置的条件下，培养三天后测菌球密度和菌丝体干重。

1.4.1菌球密度的测定：将发酵液置于200mL的量筒中，静置5min，计算菌丝体与发酵液的体积比。

1.4.2菌丝体干重的测定：将抽滤后的菌丝体置于60℃的烘箱烘至恒重，用分析天平测其重量。

2. 结果与讨论：

2.1 温度对草菇深层培养的影响：

表23 不同温度对草菇菌丝体生长的影响

温度（℃）	24℃ 27℃ 30℃ 33℃ 36℃ 39℃
		菌球直径/mm	2-3 2-3 3-4 3-4 4 5-6
菌丝干重/g·(100ml)^-1	0.209 0.326 0.647 0.638 0.528 0.316

从表23可以看出，随着温度的上升，菌丝体干重逐渐增加，30℃时达到最大，而后随着温度的升高菌丝体的干重反而下降；因此可以初步判断30℃是较适宜的生长温度。而菌球的大小随着温度的增加也有所增加，主要是小菌球的比例降低。为了进一步说明不同温度之间菌丝体干重的差异性，对不同温度条件下的菌丝体干重进行方差分析，结果见表24。

表24 不同温度的草菇菌丝体干重方差分析

差异源	SS	df	MS	F	F_（0.05）	F_（0.01）	显著性
								组间	0.4982	5	0.0996	69.3753	3.1059	5.0643	**
组内	0.0172	12	0.0014
								总计	0.5155	17

由表24可以看出：不同温度下，草菇菌丝体干重组内间差异显著,而各组间差异极显著。为进一步说明各组间的差异，再进行均数间的多重比较，结果见表25。

表25 不同温度的菌丝体干重SSR检验

由表25可以看出，30℃与24℃、27℃、36℃、39℃的菌丝体干重差异均极显著，而30℃与33℃的菌丝体干重差异不显著，而30℃时的菌丝体干重最高，30℃以后菌丝体干重下降，由此可见，30-33℃是最适合草菇菌丝体生长的温度。考虑到经济的因素，草菇生长的温度范围一般设在30-31 ℃。

2.2 pH对草菇深层培养影响：

表26 初始pH值对草菇菌丝体生长的影响

pH值	4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0
		菌球直径/mm	1-1.5 1.8 1.5-2 2-3 1-1.2 个别有球
菌丝干重/g·(100ml)^-1	0.162 0.495 0.593 0.567 0.256 0.036

从表26可以看出，在pH6.0之前，菌丝体干重逐渐增加，在pH6.0时菌丝体干重最大，而后随着pH的升高，菌丝体干重逐渐降低，在pH6.0~7.0间，菌丝体干重维持较高水平；菌球的直径亦随着菌丝体干重的增加而增加，在pH7.0时达最高，pH7.0以后菌球大小急剧降低。由此可见，草菇适合在中性环境下生长，初步可以判断其较适pH为6.0~7.0。为了进一步说明不同pH之间菌丝体干重的差异性，对其进行方差分析。

表27 不同pH的草菇菌丝体干重方差分析

差异源	SS	df	MS	F	F_（0.05）	F_（0.01）	显著性
								组间	0.8257	5	0.1651	139.0986	3.1059	5.0634	**
组内	0.0142	12	0.0012
								总计	0.8400	17

由表27可以看出：不同pH条件下，草菇菌丝体干重组内间差异显著,而各组间差异极显著。为进一步说明各组间的差异，再进行均数间的多重比较，结果见表28。

表28 不同pH的菌丝体干重SSR检验

由表28可以看出，pH6.0时，菌丝体干重最大，但在pH6.0~7.0时，菌丝体干重差异并不显著，pH6.0与4.0、5.0、8.0、9.0差异极显著，我们还做过pH6.3~6.5实验，菌丝体干重比pH6.0高，菌球大小没有差别。因此，草菇液体培养的最适pH是6.5左右，接近中性，并不像报道的偏碱性。

2.3 粘度对草菇深层培养影响：

表29 琼脂浓度对草菇菌丝体生长的影响：

琼脂浓度（%）	0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
		菌球直径/mm	5-6 3-4 2-2.5 2 1.5-2 2-4*
菌丝干重/g·(100ml)^-1	0.582 0.603 0.631 0.563 0.554 0.495

由表29可以看出，菌丝体干重在粘度0.2%时为最大，之后，菌丝体干重不断下降；而菌球直径在添加琼脂的培养基中都明显小于对照，在0.1~0.4%间逐渐减小，到0.4%时菌球直径最小，小球的比例最多，而后随着粘度的增加，培养液中菌球的数量减少，出现不规则大块，由此可初步判断，适合草菇生长的粘度范围为0.1~0.2%的琼脂。为了进一步说明不同粘度之间菌丝体干重的差异性，对不同粘度条件下的菌丝体干重进行方差分析。

表30 不同粘度的草菇菌丝体干重方差分析

差异源	SS	df	MS	F	F_（0.05）	F_（0.01）	显著性
								组间	0.0326	5	0.0065	9.3997	3.1059	5.0643	**
组内	0.0083	12	0.0007
								总计	0.0409	17

由表30可以看出：不同粘度下，草菇菌丝体干重组内间差异不显著,而各组间差异显著。为进一步说明各组间差异显著性，再进行均数间的多重比较，结果见表31。

表31 不同粘度的菌丝体干重SSR检验

由表31可以看出，菌丝体干重最大时粘度为0.2%，0.2与0、0.3差异显著，但0.1与0.2、0.3与0.4间的差异并不显著，因此，适宜于草菇深层培养的粘度为添加0.1~0.4%的琼脂。考虑到黏度太低，菌球较大，小直径的菌球比例也低，不利于接种，而添加多又比较浪费，因此；制作草菇液体培养基时，一般应添加0.2%的琼脂，如果添加一定量的农产品水解液，也可不必添加琼脂。

2.4 接种量对草菇深层培养的影响种量：

表32 接种量对草菇菌丝体生长的影响

接种量（%）	1％ 5％ 10％ 15％ 20％
		菌球直径/mm	4 3-4 2-3 2-3 2*
菌丝干重/g·(100ml)^-1	0.315 0.475 0.631 0.614 0.570

从表32可以看出，随着接种量的增加，菌丝体干重和菌球密度都相应增加，但在10%接种量时，菌丝体干重增加幅度较大，达15%时，由所下降，但不明显。可初步判断，最适合的接种量为10%~15%。为了进一步说明不同接种量之间菌丝体干重的差异性，对不同接种量下的菌丝体干重进行方差分析。

表33 不同接种量的草菇菌丝体干重方差分析

差异源	SS	df	MS	F	F_（0.05）	F_（0.01）	显著性
								组间	0.1949	4	0.0487	46.6938	3.4780	5.9943	**
组内	0.0104	10	0.0010
								总计	0.2054	14

由表33可以看出：不同接种量下，草菇菌丝体干重组内间差异不显著,而各组间差异极显著。为进一步说明各组间的差异，再进行均数间的多重比较，结果见表34。

表34 不同接种量的菌丝体干重SSR检验

由表34可以看出，草菇的接种量在20%与15%时，菌丝体干重差异极显著，但在10%与15%之间差异并不显著，考虑到经济因素，10%左右为其适宜的接种量。

2.5瓶装量对草菇深层培养的影响

表36 装液量对草菇菌丝体生长的影响

装液量（ml）	90 120 150 180 210 240
		菌球直径/mm	4-5 3-4 2-3 2-3 2-4 2-4
菌丝干重/g·(100ml)^-1	0.326 0.483 0.598 0.625 0.531 0.343

由表36可以看出，瓶装量为120~210mL时，菌丝体干重变化不大，240mL时下降明显；而菌球直径变化不大。可初步判定，最适瓶装量为150~210mL/500mL。为了进一步说明不同瓶装量之间菌丝体干重的差异性，对不同瓶装量的菌丝体干重进行方差分析。

表37 不同瓶装量的草菇菌丝体干重方差分析

差异源	SS	df	MS	F	F_（0.05）	F_（0.01）	显著性
								组间	0.2546	5	0.0509	17.4495	3.1059	5.0643	**
组内	0.0350	12	0.0029
								总计	0.2896	17

由表37可以看出：不同瓶装量下，草菇菌丝体干重组内间差异显著,而各组间差异极显著。为进一步说明各组间的差异，再进行均数间的多重比较，结果见表38。

表 38 不同瓶装量的菌丝体干重SSR检验

由表38可以看出，瓶装量为180mL时，菌丝体干重最大，与150ml和210ml瓶装量间差异不显著，故189mL/500mL的瓶装量是其菌丝体培养的最佳瓶装量。这主要是因为草菇是嗜氧菌，过高的瓶装量影响通气，菌丝缺氧而生长缓慢；过低的瓶装量震荡时易对菌丝造成较大的损伤而影响其生长。

2.6 转速对草菇深层培养的影响：

表39 不同转速对草菇菌丝体生长的影响

由表39可以看出，菌丝体干重随着转速的上升而不断增加，220r/min时菌丝体干重达最高，190~250r/min间趋于稳定，190r/min后呈下降趋势；菌球直径在160r/min以下菌球极少，一般菌球增大、粘连，出现不规则块状，160r/min以上菌球增加，到250r/min时，菌球开始减少，而且大小不均匀，形状不规则。可见，最适合草菇菌丝体生长的转速为190~220r/min。为了进一步说明不同转速之间菌丝体干重的差异性，对不同转速条件下的菌丝体干重进行方差分析。

表40 不同转速的草菇菌丝体干重方差分析

差异源	SS	df	MS	F	F_（0.05）	F_（0.01）	显著性
								组间	0.6299	4	0.1575	217.2724	3.4780	5.9943	**
组内	0.0072	10	0.0007
								总计	0.6372	14

由表41可以看出：不同转速下，草菇菌丝体干重组内间差异显著,而各组间差异极显著。为进一步说明各组间的差异性，再进行均数间的多重比较，结果见表42。

表 42 不同转速的菌丝体干重SSR检验

由表42可以看出，不同转速之间草菇菌丝体干重差异极显著，在转速为220 r/min时，草菇度菌丝体干重最高，因此，可以确定最适合草菇生长的转速为150~180r/min。这主要是因为转速过低，菌丝不易断裂，形不成小球，加之溶氧不够，影响菌丝体的生长；转速过高对菌丝体的损伤较大，而不利于其生长。

3. 结论：

由以上试验结果可以看出，最适宜草菇深层培养的条件是：温度为30~33℃，pH为6.0~7.0，粘度为添加0.2%的琼脂，接种量为10～15%左右，瓶装量为180mL/500mL，转速为220r/min左右。

5.草菇液体菌种发酵罐培养的研究

1、材料

1.1菌株：草菇V₁₁₀，引自江苏高邮市食用菌研究所。

1.2培养基

1.2.1斜面培养基：PDA

1.2.2摇瓶培养基：土豆5% 、蔗糖2%、蛋白胨0.2%、麦麸4%、MgSO₄0.1%、KH₂PO₄0.2%、V_B10.001%、pH值自然。

1.2.3发酵罐培养基：淀粉浆5%、玉米粉5%、葡萄糖0.3%、蛋白胨0.3%、VB₁0.001%、 MgSO₄0.05%、泡放0.03-0.05%、KH₂PO₄0.1%、pH7.5

1.3 培养设备：HZQ-Q型振荡器(哈尔滨东联电子有限公司)、LS-B-50L型立式压力蒸汽灭菌锅（上海医用核子仪器厂）LRH-250-A型生化培养箱（广东医疗器械厂）FA2004型上海电子分析天平（上海精科电子天平厂）、精密pH计（上海雷磁）、FMLT-52型5L台式发酵罐（上海国强生化工程装备有限公司）、。

2、方法

2.1工艺路线：草菇保藏菌种→菌种活化、斜面扩大培养→一级摇瓶→二级摇瓶→5L发酵罐或100L发酵罐发酵研究

2.2菌种活化：将保存于冷藏箱内的草菇菌种接种到斜面培养基上，与32℃培养箱中，培养4-5天。

2.3液体菌种的制备：取三块0.5m²的斜面菌种接种于500mL（装液量为150mL）锥形瓶中,放在25℃恒温箱中静置24hr，然后在32℃、180r/min 旋转式摇床振荡培养5d,制作液体菌种备用（一级摇瓶）。在500mL锥形瓶中装入150mL培养基，将制备好的一级摇瓶菌种按照10%的接种量进行接种，在32℃、220r/min 旋转式摇床振荡培养3d，制作液体菌种备用（二级摇瓶）。

2.4深层发酵培养研究：

2.4.1 5L发酵罐培养：5L发酵罐装入4L发酵罐培养基，按10%接种量接二级摇瓶种，于30℃，220 r/min通气培养，每12hr取样检测菌丝体的生长情况。

2.4.2 100L发酵罐培养：100L发酵罐装入60L培养基，按10%接种量接二级摇瓶种，发酵罐内的压力维持在0.025Mpa，温度为32-34℃培养，每12hr取样检测菌丝体的生长情况。

2.4.3菌丝体干重测量：发酵过程中，5L发酵罐将瓶中的全部培养液，用干燥的滤纸抽滤，100L发酵罐，每次取100ml培养液，用干燥的滤纸抽滤；然后用蒸馏水多次冲洗后，放于60℃干燥箱内烘干至恒重，测定干重。

2.4.4 pH值测定：5L发酵罐自动监测。

2.5结果与分析

2.5.1发酵罐培养菌丝生长曲线：

由图7和图8可以看出，5L和100L的发酵罐菌丝的生长量均同培养时间呈双对数曲线关系，0～12hr为草菇液体菌种生长的适应期，12hr以后生长逐渐加快，24～48hr生长速度最快，随后逐渐减慢，发酵60hr后菌丝体产量有所下降，菌丝体干重最高可达到1.1021g/100mL。

在培养过程中，草菇菌丝体不断生长，形成大量菌球，不断消耗培养基中营养成分，菌丝体干重不断增加，在48～60hr达到最大，此时生物量最高，培养物呈粘稠状。继续发酵培养，营养物质贫乏，菌丝体开始衰老，发生自溶，生物量开始下降。根据曲线分析，发酵终点应确定在时间为 48～54hr。因为此时菌丝生物量虽然不是最大，但由于这段期间的菌丝正处于生命力极为旺盛的对数生长期，菌丝活力最强，接种后，菌丝极易萌发生长。

2.5.2发酵时间与pH值的变化曲线

5L发酵罐培养，自动记录得pH变化曲线如图9 。

由摇瓶试验可知，草菇液体培养最适初始pH值为6～7，而培养基在灭菌过程使pH下降约0.5，因而在灭菌前，将培养基的pH值调至7～7.5。由曲线可知，菌丝生长初期，由于环境条件适宜，菌丝本身具有一定的调节pH值的能力，从而使pH值处于比较平稳的状态.随着菌丝代谢活动不断加强，有机酸积累等原因，使pH值下降，菌丝停止生长以后，pH值又上升，此时菌丝趋于自溶而代谢活动较弱。这与测得菌体生长的干重曲线是相吻合的，由此可以初步判断，草菇菌丝体发酵罐的培养时间约为48～54hr左右，虽然此时的菌丝体干重不能达到最高，接种后极易萌发。因此发酵罐培养时应很好地控制发酵时间，同时可通过发酵过程的pH的观察，判断菌体是否处于适宜的生长环境，这也表明在适合于菌丝生长的初始条件下无须在发酵过程中对发酵液的pH进行控制。

3 讨论

通过了解草菇菌丝在发酵罐内的及菌丝生长过程中pH变化的规律，一方面可以掌握发酵罐培养草菇的最佳时间，及时做好接种的准备工作，在菌丝活性最高时接入培养了。另一方面，可以判断发酵的进展情况，可作为发酵异常的指标。

附图说明

图1是不同碳源对草菇菌丝体干重的影响图；图2 是不同氮源对草菇菌丝体干重的影响图；图3 是不同无机盐对草菇菌丝体干重的影响图；图4 是不同农产品对草菇的影响图；图5是L9(3⁴)正交试验结果图；图6是L9(3⁴)正交试验结果图；图7 是草菇5L发酵罐生物量图；图8是草菇100L发酵罐生物量图；图9 是草菇5L发酵罐Ph变化曲线图。

Claims

1.一种草菇液体菌种制备的方法，其特征在于草菇液体培养基的最优配方是蔗糖2%，蛋白胨2%，麦麸4%，无机盐MgSO₄0.05%， KH₂PO₄0.1% , 再加VB₁ 0.001%。

2.一种草菇液体菌种制备的方法，其特征在于最适宜草菇深层培养的条件是：温度为30~33℃，pH为6.0~7.0，粘度为添加0.2%的琼脂，接种量为10～15%左右，瓶装量为180mL/500mL，转速为220r/min左右。