CN101451107B - 一种大量制备粘帚霉厚垣孢子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种大量制备粘帚霉厚垣孢子的方法，包括培养基配方和培养技术。由葡萄糖20-25克/升、豆饼粉1-3克/升、尿素1-3克/升、硫酸亚铁0.005-0.05克/升、磷酸氢二钾0.75-1.5克/升及蒸馏水组成的液体培养基和用其液体发酵培养对多种植物病原真菌(例如菌核病菌、灰霉病菌、纹枯病菌、根腐病菌等)有重寄生作用的粘帚霉。培养时间从接种开始计算，36-48小时后开始大量产生粘帚霉的厚垣孢子，且厚垣孢子各自单独分离开。本发明的目的是提供一种较廉价、原料来源丰富的培养基配方，利用其能够大量制备粘帚霉厚垣孢子，在液体发酵培养条件下重复性好、成本大大降低，以适应生产和应用中保证孢子的生物活性和防治效果。
Description
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，具体地说是一种大量制备粘帚霉厚垣孢子的方法，包括培养基配方和培养技术。
背景技术：
在防治植物病害的生物农药中，微生物真菌制剂扮演重要的角色。其中，粘帚霉(Gliocladium spp.)被认为是目前已发现的拮抗微生物中最有希望的植病生防因子之一，可用来防治多种植物病害。
粘帚霉是一种土壤习居菌，广泛存在于各种土壤生态环境中。常见的粘帚霉属种类有粉红粘帚霉(G.roseum)、链孢粘帚霉(G.catenulatum)和绿粘帚霉(G.virens)等，对植物病害表现出良好的防治效果。概括起来，粘帚霉由于具备以下优良性状生防潜力巨大：①具有广泛的环境适应性，可利用有各种简单或复杂的碳源和氮源，甚至还有转化和降解一些有害或持久存在的污染物的能力；②产生多样的拮抗作用(主要包括竞争作用、重寄生作用、产生抗生物质和溶菌酶类)；③具有广谱的寄生性。
粘帚霉在其生长周期内可以产生3种繁殖体，即菌丝体、厚垣孢子和分生孢子。目前生产上常用的粘帚霉菌剂多为活分生孢子和菌丝混合制剂，已有数个商品化的粘帚霉制剂问世，如美国开发的的粘帚霉SoilGard颗粒剂、芬兰开发的粘帚霉Primastop颗粒剂等。
然而，粘帚霉作为生物农药直接用于生产以及菌剂的保质期等方面还存在着一些问题。因为生物农药制剂要求具有一定的货架期，而影响菌剂保质期的主要因素是菌体类型。粘帚霉的菌丝在自然条件下容易失水导致死亡，而其分生孢子的虽然产孢量大，但存活期也较短，通常一年的贮藏期后有70％的孢子失去活力；显然，分生孢子和菌丝这两种菌体类型都难以满足粘帚霉作为生物农药制剂的要求。
在一些真菌的菌丝中能见到不规则的肥大的菌丝细胞，一般是在不良环境条件下，菌丝细胞内的原生质收缩，变圆，外面形成一层厚壁，以抵抗不良环境，表面一般具有刺或瘤状突起，这种结构称为厚垣孢子；厚垣孢子作为抵抗不良环境而休眠的生存结构，具有更容易大规模生产、存活时间长、容易贮藏、施用和商品化及货架寿命长等优点，能满足作为生物农药的要求，在土壤中的增殖比分生孢子更好，并且萌发率也更高。因此，建立一种大量产粘帚霉厚垣孢子的培养方法对这一拮抗菌生物农药的商品化生产具有重要的实践意义。
发明内容：
针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种大量制备粘帚霉厚垣孢子的方法，包括培养基配方和培养技术。因此，本发明的目的是提供一种较廉价、原料来源丰富的培养基配方，利用其能够大量制备粘帚霉厚垣孢子，在液体发酵培养条件下重复性好、成本大大降低，以适应生产和应用中保证孢子的生物活性和防治效果。
本发明的一个实施方案是提供一种能大量制备粘帚霉厚垣孢子的液体培养基。所述培养基由葡萄糖、豆饼粉、尿素、硫酸亚铁、磷酸氢二钾及蒸馏水组成。
本发明的一个实施方案是提供一种能大量制备粘帚霉厚垣孢子的液体培养基。所述培养基由葡萄糖20-25克/升、豆饼粉1-3克/升、尿素1-3克/升、硫酸亚铁0.005-0.05克/升、磷酸氢二钾0.75-1.5克/升及蒸馏水组成。
本发明的一个实施方案是提供由葡萄糖20-25克/升、豆饼粉1-3克/升、尿素1-3克/升、硫酸亚铁0.005-0.05克/升、磷酸氢二钾0.75-1.5克/升及蒸馏水组成的液体培养基和用其液体发酵培养对多种植物病原真菌，例如菌核病菌、灰霉病菌、纹枯病菌、根腐病菌等有重寄生作用的粘帚霉。
本发明的另一实施方案是提供由葡萄糖20-25克/升、豆饼粉1-3克/升、尿素1-3克/升、硫酸亚铁0.005-0.05克/升、磷酸氢二钾0.75-1.5克/升及蒸馏水组成的液体培养基和用其液体发酵培养对多种植物病原真菌具有重寄生作用的粘帚霉，培养时间从接种开始计算，36-48小时后开始大量产生厚垣孢子，且厚垣孢子各自单独分离开。
具体实施方式：
实施例1：大量制备粘帚霉厚垣孢子的配方
| 组分 | 含量(每升体积) |
| 葡萄糖 | 20克 |
| 豆饼粉 | 1克 |
| 尿素 | 3克 |
| 硫酸亚铁 | 0.05克 |
| 磷酸氢二钾 | 1克 |
| 蒸馏水 | 1升 |
将葡萄糖、豆饼粉、尿素、硫酸亚铁、磷酸氢二钾按上述比例依次加入蒸馏水，边加入边搅拌，直至各组分完全溶解混合均匀。
实施例2：大量制备粘帚霉厚垣孢子的配方
| 组分 | 含量(每升体积) |
| 葡萄糖 | 25克 |
| 豆饼粉 | 2克 |
| 尿素 | 2克 |
| 硫酸亚铁 | 0.01克 |
| 磷酸氢二钾 | 1克 |
| 蒸馏水 | 1升 |
将葡萄糖、豆饼粉、尿素、硫酸亚铁、磷酸氢二钾按上述比例依次加入蒸馏水，边加入边搅拌，直至各组分完全溶解混合均匀。
实施例3：液体发酵培养粘帚霉厚垣孢子的方法
| 组分 | 含量(每升体积) |
| 葡萄糖 | 25克 |
| 豆饼粉 | 2克 |
| 尿素 | 2克 |
| 硫酸亚铁 | 0.01克 |
| 磷酸氢二钾 | 1克 |
| 蒸馏水 | 1升 |
将葡萄糖、豆饼粉、尿素、硫酸亚铁、磷酸氢二钾按上述比例依次加入蒸馏水，边加入边搅拌，直至各组分完全溶解混合均匀。121℃高压湿热灭菌30分钟，待灭菌培养液冷却至室温时，按5％(体积比)的量接入粘帚霉的分生孢子液(浓度为105/ml)，25℃振荡黑暗培养48小时后，得到含大量厚垣孢子的发酵液。
Claims (3)
1.一种能大量制备粘帚霉厚垣孢子的液体培养基，其特征在于，所述培养基由葡萄糖20-25克/升、豆饼粉1-3克/升、尿素1-3克/升、硫酸铁0.005-0.05克/升、磷酸氢二钾0.75-1.5克/升及蒸馏水组成。
2.如权利要求1所述的液体培养基，其特征在于，用其可以液体发酵培养对菌核病菌、灰霉病菌、纹枯病菌、根腐病菌有重寄生作用的粘帚霉。
3.如权利要求1或2所述的液体培养基，其特征在于，用其液体发酵培养粘帚霉，培养时间从接种开始计算，36-48小时后开始大量产生厚垣孢子，且厚垣孢子各自单独分离开。
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Addressee: Beijing hi tech biological technology Co., Ltd. Document name: Notification to Pay the Fees |
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| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Beijing hi tech biological technology Co., Ltd. Document name: Notification of Termination of Patent Right |
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| REIN | Reinstatement of patent application or patent right | ||
| REIN | Reinstatement of patent application or patent right | ||
| RR01 | Reinstatement of patent right |
Former decision: cessation of patent right due to non-payment of the annual fee Former decision publication date: 20170301 |
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| CP02 | Change in the address of a patent holder |
Address after: 100193, room 3, building 3009, building 3, China Agriculture University international pioneer park, 10 Tian Xiu Road, Beijing, Haidian District Patentee after: Beijing hi tech biological technology Co., Ltd. Address before: 100081 Beijing City, Haidian District Zhongguancun South Street Truthzone international A No. 12 room 0943 Patentee before: Beijing hi tech biological technology Co., Ltd. |
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| CP02 | Change in the address of a patent holder |