CN101486986A

CN101486986A - 一种嗜酸乳杆菌冻干菌粉的制备方法

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Publication number: CN101486986A
Application number: CNA2009100568714A
Authority: CN
Inventors: 方曙光
Original assignee: SHANGHAI PULAI BIOLOGY TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Fang Shuguang
Priority date: 2009-02-12
Filing date: 2009-02-12
Publication date: 2009-07-22
Anticipated expiration: 2029-02-12
Also published as: CN101486986B

Abstract

一种嗜酸乳杆菌冻干菌粉的制备方法，其工艺流程包括嗜酸乳杆菌发酵培养、发酵液分离、菌泥乳化和乳化液真空冷冻干燥，其特征在于菌种发酵培养：将乳杆菌菌种接入三角瓶液体培养基中30～40℃下培养10～30小时；再接入大发酵罐35～40℃下发酵培养10～30小时；115℃灭菌15分钟；还有菌种发酵扩增培养10～30小时，发酵液pH值为5.5～6.5、OD600为2.0以上；乳化液真空冷冻干燥：先在－60～－40℃预冻1～5小时，后在－60℃、1～8Pa真空度下真空冷冻干燥10～30小时。本发明方法制备的1.0×10¹¹cfu/g的嗜酸乳杆菌冻干菌粉能在－18℃储存18个月，其活性和稳定性不受影响。

Description

一种嗜酸乳杆菌冻干菌粉的制备方法

技术领域

本发明公开一种嗜酸乳杆菌冻干菌粉的制备方法，应用于生物技术领域，是一种高效、低成本的嗜酸乳杆菌冻干菌粉制作技术，为嗜酸乳杆菌产品的开发及其在乳制品、食品、医药等方面的应用提供了必要的技术支持。

背景技术

嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)为乳杆菌属(Lactobacillus)，革兰氏阳性，不产芽抱，不运动，无鞭毛、荚膜、芽孢的细长杆菌，不运动，以单个、成双或短链的形式存在，可发酵糖产生乳酸、乙醇、过氧化氢等的厌氧或兼性厌氧的微生物。G+C含量为36.0％～37.4％，最适pH5.5～6.0，最适生长温度35～38℃，20℃以下基本不生长，耐热性差，能利用葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖进行同型发酵，产生DL型乳酸。嗜酸乳杆菌是人和动物肠道内的主要微生物种之一，最初是从婴儿的粪便中分离出来的，是人和动物肠道菌群中很重要的一种益生菌，也是目前乳酸菌家族中极为重视研究开发的益生菌。嗜酸乳杆菌在肠道中发酵，产生乳酸、醋酸及抗菌素，具有整肠作用，对防治和治疗慢性便秘、腹泻等肠道疾病有一定疗效。近年来，还发现嗜酸乳杆菌具有降低血液中胆固醇含量和抑制某些癌细胞生长的作用，使嗜酸乳杆菌的研究和应用更加引人注目。

在日本、法国、欧美等国家，以乳酸菌发酵的乳制品已有上百年的历史，且在乳制品市场占有相当大的比例。目前主要用于功能性食品和保健食品的生产，在美国和欧洲市场上的应用见。据英国某调研公司调查，欧共体国家对乳酸菌乳制品的消费，每年都以17％左右的比例增长，其中在法国含有嗜酸乳杆菌和双歧杆菌的产品已增加了300％，占牛乳销售总量的4％。北美活性乳酸菌发酵酸奶占乳制品的30％。而在我国台湾，活性乳酸菌发酵酸奶的消费量也已超过70％。另外，研究报道，许多种食品都可以作为嗜酸乳杆菌的载体，如糖果、果冻等。

含有嗜酸乳杆菌微生态制剂及药品也正逐渐风行于世界各地，2001年，我国***公布的可用于保健食品的益生菌名单中，嗜酸乳杆菌名列其中。嗜酸乳杆菌活菌制剂已广泛用于临床治疗。将嗜酸乳杆菌制剂与抗生素同时服用，能明显减轻口服广谱抗生素引起的胃肠道副作用和相关性腹泻，还可用于治疗滴虫性***炎。嗜酸乳杆菌抑制病原菌生长的机制可能有：分泌抑菌物质、占位性保护、营养竞争和促进宿主免疫功能等。近年来，国外一些研究表明：嗜酸乳杆菌能分泌细菌素，强烈抑制痢疾杆菌、***、肠炎沙门氏菌、***鞭毛虫等豹生长；人嗜酸乳杆菌LB菌株的培养上清液，能明显降低幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)的存活率及其对人黏膜细胞的黏附能力。

国外，对于乳酸菌、双歧杆菌等益生菌的研究工作开展较早，含益生菌的产品在日本和欧洲市场上已经非常普遍，同时，对益生菌的生理功能及作用机制也进行了比较全面和深入的研究。在益生菌的缓解乳糖不忍耐症、抑制腹泻、提高机体免疫功能、降低胆固醇水平和抑制肿瘤发生等方面的研究均取得了一定的进展。在最近的几十年里，有关乳酸菌等益生菌的健康促进作用在我国越来越受到人们的重视。益生菌的研究及使用时间虽然不长，但其进展较快并且效果也很明显。

近年来，益生菌的特殊生理活性已通过发酵乳制品和微生态制剂等多种形式被广泛的进行研究，并且其研究领域逐步得到拓宽，此类产品也正逐年增多。我国虽然对益生菌的研究比较热，但对嗜酸乳杆菌的研究与发达国家相比还有一定的距离。因此，研究和开发益生菌产品具有较大的市场空间，对振兴我国食品、饲料、医药及保健品等行业将具有非常重要的意义。

目前，含有嗜酸乳杆菌的益生菌的产品市场十分活跃，品种越来越多。在食品行业，包括益生菌发酵的乳制品、肉制品以及果蔬制品等；医药及保健品行业，如整肠生、丽珠常乐、昂立一号等均含有不同种类的益生菌，并且以胶囊、片剂、粉剂及口服液等多种形式投放。然而，产品中益生菌的稳定性直接关系到产品能否发挥其健康促进作用，也是检验产品质量的关键指标之一。研究表明，为了达到渴望的健康促进效果，以嗜酸乳杆菌等益生菌为主的产品中，活菌数量应保持在10⁶cfu/mL以上。因此，在益生菌类制品的加工、储运过程中应采取措施尽量减少益生菌的失活。同时，人体胃酸的pH值通常变化在1.5～5.0之间，肠道中胆汁盐的含量有时高达4％，许多微生物无法忍受人体肠道中的不良环境，导致到达人体内并存活下来的益生菌活菌数目很少。研究表明，嗜酸乳杆菌忍受低pH和高胆汁盐环境的能力随菌株不同而变化，因此，选择能够忍受高胃酸和高胆汁盐环境并具有潜在健康效应的嗜酸乳杆菌等益生菌使其能以较高的活菌数到达宿主肠道并定植下来，是保证它们充分发挥健康促进效果的一个重要标准，这已成为该领域发展的新方向之一。

嗜酸乳杆菌的研究与开发愈来愈受到人们的广泛关注。

由于嗜酸乳杆菌具有保健作用，近年来关于这方面的研究越来越多，现已成为活菌制剂的研究热点。活菌制剂在消费之前应当维持较高的活菌水平，而当前的许多产品都不能有效地防止活菌数的衰减。如何提高活菌量并延长活菌保藏期，已成为活菌制剂产品研究开发的技术关键。利用真空冷冻干燥技术生产活菌制剂是多种保藏方法中较为理想的一种，但冷冻和干燥过程会造成部分微生物细胞的损伤、死亡及某些酶蛋白分子的钝化，而且如果冻干工艺中保护剂选择不当，则发酵活力随之下降。

因此，在技术上寻求新的突破口，筛选具有优良性能的嗜酸乳杆菌菌株，提高嗜酸乳杆菌的活力，增加嗜酸乳杆菌的稳定性，减少各种加工条件对嗜酸乳杆菌生长和存活的影响，加强对嗜酸乳杆菌产品剂型的研究，在基础理论和生产技术等方面为嗜酸乳杆菌产品的开发提供支持。

发明内容

本发明的目的是公开一种嗜酸乳杆菌冻干菌粉的制备方法，通过30～40℃10～30小时高密度培养使发酵液菌体浓度达1.0×109cfu/g，通过高效发酵液分离技术使菌泥浓度达1.0×1010cfu/g，通过高活性乳化及真空冷冻干燥等优化工艺后得到1.0×10¹¹cfu/g的嗜酸乳杆菌冻干菌粉的方法，制备高密度高稳定性高活性的嗜酸乳杆菌冻干菌粉。

本发明是在对嗜酸乳杆菌菌株特性研究的基础上，对其高密度高活性发酵培养，高稳定性高活性分离、乳化、冻干等技术和工艺，抗冻保护剂的组成及浓度进行了优化，以期最大限度地获得较高密度的发酵培养和活性稳定性保护功能，减少菌体在制备过程中的死亡，提高细胞的存活率，为高效冻干菌粉的制备提供技术和工艺。

本发明是这样实现的：一种嗜酸乳杆菌冻干菌粉的制备方法，其工艺流程包括嗜酸乳杆菌发酵培养、发酵液分离、菌泥乳化和乳化液真空冷冻干燥，其特征在于：所述菌种发酵工艺是将嗜酸乳杆菌菌种接入三角瓶液体培养基中进行培养，培养基中接入的菌种重量百分含量为0.1％～0.01％，30～40℃培养10～30小时，所述三角瓶液体培养基的重量百分比组成为：蛋白胨0.5～1.5％、葡萄糖0.2～0.6％，酵母膏0.5～1.5％，牛肉膏0.4～0.8％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.02％，氯化钠0.003％，硫酸亚铁0.001％，醋酸钠0.4％，柠檬酸二胺0.2％，磷酸二氢钾0.2％，吐温-800.001％，其余为水，121℃灭菌20分钟。再接入大发酵罐进行发酵培养，培养基中的接种重量百分含量为1％～5％，30～40℃培养10～30小时，所述的大发酵罐发酵培养基的重量百分比组成为：蛋白胨0.5～1.5％，葡萄糖0.2～0.6％，酵母浸提物0.5～1.5％，乙酸钠0.067％，硫酸镁0.001％，硫酸锰0.001％，硫酸亚铁0.001％，氯化钠0.001％，其余为水；115℃灭菌15分钟，并以补加氢氧化钠溶液控制培养酸度为pH4.0～6.5，使发酵液pH值为4.0～5.0，OD600为2.0以上，镜检嗜酸乳杆菌形态正常，无杂菌，终止发酵。

所述的发酵液分离方法，以孔径大小在0.01～1μm，0.05MPa～0.5MPa水压条件下通过陶瓷膜过滤分离菌体，或以4000～10000rpm条件下进行以管式或碟片式离心机分离菌体，并以无菌水洗涤1～2次，得到菌泥。

所述的菌泥乳化工艺，按照活菌菌泥：菌泥保护剂＝0.1∶1～1∶0.1的比例将菌泥与菌泥保护剂混合乳化，菌泥保护剂配方各组份重量百分比为谷氨酸钠0.1～5.0％、乳糖0.1～8.0％、海藻糖1～15％、抗氧化剂0.1～1％、脱脂奶粉1～20％、甘油或吐温-800.1～5.0％，其余为水，菌泥保护剂在105℃～115℃条件下灭菌15分钟后冷却至5～20℃备用。所述的抗氧化剂在异维生素C、谷氨酸和甘氨酸中选择一种。

所述的乳化液真空冷冻干燥工艺，其特征在于干燥条件为：在—60～—40℃预冻1～5小时后真空冷冻干燥，冷冻干燥温度为—60℃，真空度为1～8pa，真空冷冻干燥10～30小时；干燥后得到活菌数大于1.0×10¹¹cfu/g的嗜酸乳杆菌冻干菌粉。

所述菌种发酵、发酵液分离和菌泥乳化的操作环境条件要求为在温度低于25度、湿度RH<35％的洁净环境中进行。

所述的嗜酸乳杆菌等乳杆菌，其筛选优良菌株均经过如下试验：①对酸、胆汁及渗透压的抵抗力，②对人体肠道细胞的黏附，③消化摄人的安全性，④对金黄色葡萄球菌、致病性大肠杆菌、白色念珠菌和加德纳菌等致病菌的抑制，⑤在结肠的短暂定植，⑥证实健康效果的临床研究等。

本发明所述嗜酸乳杆菌冻干菌粉的使用：

1、在乳品生产中做发酵剂及益生菌的应用；

2、在食品、饲料添加成分方面作整肠功效的应用；

3、在保健品药品等方面作调节微生态环境功效的应用。

本发明的有益效果是：本发明方法制备得到的大于1.0×1011cfu/g的嗜酸乳杆菌冻干菌粉，通过相关保护技术得到能在-18度储存18个月其活性和稳定性不受影响，为嗜酸乳杆菌产品的开发及其在乳制品、食品、医药等方面的应用提供了必要的技术支持。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明保护的范围，本发明保护的范围以本发明申请的权利要求书说阐述的为准。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量单位，除非特别说明。

实施例1：

将筛选出的嗜酸乳杆菌菌种先接入三角瓶液体培养基，后接入发酵罐中分别在30～40℃下培养10～30小时进行逐级扩增发酵培养，三角瓶液体培养基的重量百分比组成为：蛋白胨0.5％、葡萄糖0.2％，酵母膏0.5％，牛肉膏0.4％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.02％，氯化钠0.003％，硫酸亚铁0.001％，醋酸钠0.4％，柠檬酸二胺0.2％，磷酸二氢钾0.2％，吐温-80 0.001％，其余为水，氢氧化钠调pH值为6.0，121℃灭菌20分钟。大发酵罐发酵培养基的重量百分比组成为：蛋白胨0.5％，葡萄糖0.2％，酵母浸提物0.5％，乙酸钠0.067％，硫酸镁0.001％，硫酸锰0.001％，硫酸亚铁0.001％，氯化钠0.001％，其余为水。并以补加NaOH溶液控制培养酸度pH值为4.0～6.5，使发酵液pH值为4.0～5.0，OD600为2.0以上，镜检嗜酸乳杆菌形态正常，无杂菌，终止发酵。以孔径大小在0.01～1μm，0.05MPa～0.5MPa水压条件下通过陶瓷膜过滤分离菌体，得到菌泥。

菌泥保护剂配方各组份重量百分比为谷氨酸钠0.1％、乳糖0.1％、海藻糖1％、异维生素C 0.1％、脱脂奶粉1％、吐温-80 0.1％，其余为水，菌泥保护剂在105℃～115℃条件下灭菌15分钟后冷却至5～20℃备用。按照活菌菌泥：菌泥保护剂＝1:10的比例将菌泥与菌泥保护剂混合乳化。在—60～—40℃预冻1～5小时后真空冷冻干燥，冷冻干燥温度为—60℃，真空度为1～8pa，真空冷冻干燥10～30小时条件下干燥后得到高活性嗜酸乳杆菌冻干菌粉。

菌种发酵、发酵液分离和菌泥乳化的操作环境条件要求为在温度低于25度、湿度RH<35％的洁净环境中进行。

制备得到的产品中活菌数大于1.0×10¹¹cfu/g，用双铝膜密封真空包装，每袋50g或根据客户要求包装。

实施例2：

将筛选出的嗜酸乳杆菌菌种先接入三角瓶液体培养基，后接入发酵罐中分别在30～40℃下培养10～30小时进行逐级扩增发酵培养，三角瓶液体培养基的重量百分比组成为：蛋白胨1.0％、葡萄糖0.4％，酵母膏1.0％，牛肉膏0.6％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.02％，氯化钠0.003％，硫酸亚铁0.001％，醋酸钠0.4％，柠檬酸二胺0.2％，磷酸二氢钾0.2％，吐温-80 0.001％，其余为水，氢氧化钠调pH值为6.0，121℃灭菌20分钟。大发酵罐发酵培养基的重量百分比组成为：蛋白胨1.5％，葡萄糖0.6％，酵母浸提物1.5％，乙酸钠0.067％，硫酸镁0.001％，硫酸锰0.001％，硫酸亚铁0.001％，氯化钠0.001％，其余为水，115℃灭菌15分钟。并以补加NaOH溶液控制培养酸度为pH4.0～6.5。使发酵液pH值为4.0～5.0，OD600为2.0以上，镜检嗜酸乳杆菌形态正常，无杂菌，终止发酵。在8000rpm条件下进行以管式或碟片式离心机分离菌体，并以无菌水洗涤1～2次，得到菌泥。

菌泥保护剂配方各组份重量百分比为谷氨酸钠1.0％、乳糖2.0％、海藻糖5％、谷氨酸1％、脱脂奶粉20％、甘油1.0％，其余为水，保护剂在105℃～115℃条件下灭菌15分钟后冷却至5～20℃备用。按照活菌菌泥：菌泥保护剂＝1:2的比例将菌泥与菌泥保护剂混合乳化。

其他同实施例1。

实施例3：

将筛选出的嗜酸乳杆菌菌种先接入三角瓶液体培养基，后接入发酵罐中分别在30～40℃下培养10～30小时进行逐级扩增发酵培养，三角瓶液体培养基的重量百分比组成为：蛋白胨1.5％、葡萄糖0.6％，酵母膏1.0％，牛肉膏0.4％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.02％，氯化钠0.003％，硫酸亚铁0.001％，醋酸钠0.4％，柠檬酸二胺0.2％，磷酸二氢钾0.2％，吐温-80 0.001％，其余为水，氢氧化钠调pH值为6.0，121℃灭菌20分钟。大发酵罐发酵培养基的重量百分比组成为：蛋白胨1.5％，葡萄糖0.6％，酵母浸提物1.5％，乙酸钠0.067％，硫酸镁0.001％，硫酸锰0.001％，硫酸亚铁0.001％，氯化钠0.001％，其余为水，115℃灭菌15分钟。

菌泥保护剂配方各组份重量百分比为谷氨酸钠5.0％、乳糖8.0％、海藻糖15％、谷氨酸1％、脱脂奶粉20％、甘油5.0％，其余为水，保护剂在105℃～115℃条件下灭菌15分钟后冷却至5～20℃备用。按照活菌菌泥：菌泥保护剂＝10:1的比例将菌泥与菌泥保护剂混合乳化。

其他同实施例1。

本发明要求保护的范围不受所述具体实施方案的限制，本发明提供的具体实施例仅作为进一步说明本发明的例子，本领域技术人员参照本案说明书的描述可以很容易对本发明作出多种改进及组份的替换，这些无需创造性劳动的改进和替换也应落入本发明所附权利要求书的保护范围之内。

Claims

1.一种嗜酸乳杆菌冻干菌粉的制备方法，其工艺流程包括嗜酸乳杆菌发酵培养、发酵液分离、菌泥乳化和乳化液真空冷冻干燥，其特征在于：所述菌种发酵工艺是将嗜酸乳杆菌菌种接入三角瓶液体培养基中进行培养，30～40℃培养10～30小时，121℃灭菌20分钟，所述三角瓶液体培养基的重量百分比组成为：蛋白胨0.5～1.5％、葡萄糖0.2～0.6％，酵母膏0.5～1.5％，牛肉膏0.4～0.8％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.02％，氯化钠0.003％，硫酸亚铁0.001％，醋酸钠0.4％，柠檬酸二胺0.2％，磷酸二氢钾0.2％，吐温-800.001％，其余为水；再接入大发酵罐进行发酵培养，30～40℃培养10～30小时，所述的大发酵罐发酵培养基的重量百分比组成为：蛋白胨0.5～1.5％，葡萄糖0.2～0.6％，酵母浸提物0.5～1.5％，乙酸钠0.067％，硫酸镁0.001％，硫酸锰0.001％，硫酸亚铁0.001％，氯化钠0.001％，其余为水；115℃灭菌15分钟，并以补加氢氧化钠溶液控制培养酸度为pH4.0～6.5；所述的菌泥乳化工艺，按照活菌菌泥:菌泥保护剂＝0.1:1～1:0.1的比例将菌泥与菌泥保护剂混合乳化，菌泥保护剂配方各组份重量百分比为谷氨酸钠0.1～5.0％、乳糖0.1～8.0％、海藻糖1～15％、抗氧化剂0.1～1％、脱脂奶粉1～20％、甘油或吐温-800.1～5.0％，其余为水，菌泥保护剂在105℃～115℃条件下灭菌15分钟后冷却至5～20℃备用；所述的抗氧化剂在异维生素C、谷氨酸和甘氨酸中选择一种。

2.根据权利要求1所述的一种嗜酸乳杆菌冻干菌粉的制备方法，其特征在于：所述大发酵罐发酵培养，发酵液pH值为4.0～5.0，OD600为2.0以上，镜检嗜酸乳杆菌形态正常，无杂菌，终止发酵。

3.根据权利要求1所述的一种嗜酸乳杆菌冻干菌粉的制备方法，其特征在于：所述的发酵液分离方法，以孔径大小在0.01～1μm，0.05MPa～0.5MPa水压条件下通过陶瓷膜过滤分离菌体，或以4000～10000rpm条件下进行以管式或碟片式离心机分离菌体，并以无菌水洗涤1～2次，得到菌泥。

4.根据权利要求1所述的一种嗜酸乳杆菌冻干菌粉的制备方法，其特征在于：所述的乳化液真空冷冻干燥工艺，其特征在于干燥条件为：在—60～—40℃预冻1～5小时后真空冷冻干燥，冷冻干燥温度为—60℃，真空度为1～8pa，真空冷冻干燥10～30小时；干燥后得到活菌数大于1.0×10¹¹cfu/g的嗜酸乳杆菌冻干菌粉。

5.根据权利要求1或3所述的一种嗜酸乳杆菌冻干菌粉的制备方法，其特征在于：所述菌种发酵、发酵液分离和菌泥乳化的操作环境条件要求为在温度低于25度、湿度RH<35％的洁净环境中进行。