CN102643749A - 一种微生物低温保存保护剂和微生物低温保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种微生物低温保存保护剂，该微生物低温保存保护剂含有低聚糖、甘油、甘露醇、脱脂奶粉和琼脂糖。本发明还提供了一种微生物低温保存方法，该微生物低温保存方法包括：将如上所述的微生物低温保存保护剂与水混合后再与待保存的微生物混合，然后将混合后的物料置于保存温度下；或者将待保存的微生物与含有水的微生物低温保存保护剂混合，然后将混合后的物料置于保存温度下。通过上述技术方案，微生物经过低温保存后的存活率和菌体活性得到显著提高。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体地，涉及一种微生物低温保存保护剂和低温保存方法。
背景技术
微生物菌种是一项重要的生物资源，菌种保藏是重要的微生物基础工作。菌种保藏就是利用一切方法使菌种不死、不衰、不变，以便于研究与应用。不同菌种或不同要求，适用不同的保藏方法，一般细菌培养物的保藏方法：斜面保藏、液体石蜡保藏、冷冻干燥保藏、液氮超低温保藏法、低温冷冻保藏法。
斜面保藏法，保藏期短；液体石蜡保藏法，必须直立存放，占空间大，不便携带；冻干保藏、液氮超低温保藏法，技术复杂，技术含量高，设备投入高，运行成本高，适合专业保藏机构，不适合生产企业。
低温保藏法是将菌种放置在低温冰箱中以减缓细胞的生理活动而进行的一种保藏方法。目前采用的保藏方法有两种：一是4℃冰箱直接保存(短期)；二是，菌液中加入一定比例的甘油混合后-80℃保存(中长期)。
低温保存，无论是4℃还是-20℃、-80℃，加入一定比例的保护剂，可有效保护微生物活性，提高菌体存活率。而由于各种微生物种类及结构不同，其在低温保存中的最佳保护剂配方也不同。目前，现有的微生物低温保存保护剂为甘油、甘露醇和脱脂奶粉中的至少一种。
但是，实验结果证明，在现有的微生物低温保存保护剂存在下，微生物经过低温保存后的存活率和菌体活性仍然不高。
发明内容
本发明的目的是克服在现有的微生物低温保存保护剂存在下，微生物经过低温保存后的存活率和菌体活性仍然不高的缺陷，提供一种微生物低温保存保护剂和一种微生物低温保存保护方法，以使微生物经过低温保存后的存活率和菌体活性得到提高。
为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种微生物低温保存保护剂，该微生物低温保存保护剂含有低聚糖、甘油、甘露醇、脱脂奶粉和琼脂糖。
另一方面，本发明还提供了一种微生物低温保存方法，该微生物低温保存方法包括：将如上所述的微生物低温保存保护剂与水混合后再与待保存的微生物混合，然后将混合后的物料置于保存温度下；或者将待保存的微生物与含有水的微生物低温保存保护剂混合，然后将混合后的物料置于保存温度下。
通过上述技术方案，微生物经过低温保存后的存活率和菌体活性得到显著提高。具体地，使用本发明提供的微生物低温保存保护剂，可以使得大肠埃希菌(Escherichia coli)在零下20℃的温度下保存半年后的存活率仍可达到95％，而以使用终浓度为15重量％的甘油作为保护剂，大肠埃希菌在零下20℃的温度下保存半年后的存活率仅仅为85％。此外，使用本发明提供的微生物低温保存保护剂，可以使得黄色短杆菌在4℃的温度下保存7天后的种子罐周期仅为15h，而以使用终浓度为15重量％的甘油作为保护剂，黄色短杆菌在4℃的温度下保存7天后的种子罐周期长达18h。
本发明中，术语“种子罐周期”的定义为将109个活菌体经历保藏后全部接种于LB培养基中培养到1012个活菌体量所需要的培养时间。经历保藏后的菌体活性越高，种子罐周期越短。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
根据本发明提供的微生物低温保存保护剂，该微生物低温保存保护剂含有低聚糖、甘油、甘露醇、脱脂奶粉和琼脂糖。
其中，该微生物低温保存保护剂可以为固体状的组合物，也可以进一步加水混合为液体状的组合物。典型地，该微生物低温保存保护剂的储存状态为固体状的组合物，使用状态为液体状的组合物。
根据本发明提供的微生物低温保存保护剂，其中，低聚糖、甘油、甘露醇、脱脂奶粉和琼脂糖的含量可以在较大范围内变动，例如，相对于100重量份的低聚糖，甘油的含量可以为20-70重量份，甘露醇的含量可以为20-70重量份，脱脂奶粉的含量可以为100-200重量份，琼脂糖的含量可以为0.1-1.0重量份。
优选情况下，相对于100重量份的低聚糖，甘油的含量为40-70重量份，甘露醇的含量为40-60重量份，脱脂奶粉的含量为150-200重量份，琼脂糖的含量为0.4-0.8重量份。
根据本发明提供的微生物低温保存保护剂，其中，为使所述微生物低温保存保护剂方便直接使用，优选情况下，所述微生物低温保存保护剂还含有水。
其中，相对于100重量份的低聚糖，水的含量可以为800-1500重量份，优选为900-1200重量份。
其中，为了使所述微生物低温保存保护剂在含有水的情况下能更加均匀稳定地保存和使用，优选情况下，将含有水的微生物低温保存保护剂加热至90℃以上后冷却至室温。
根据本发明提供的微生物低温保存保护剂，其中，所述低聚糖为由2-10个单糖单元通过糖苷键连接构成的物质，典型地，所述低聚糖为二糖，优选情况下，所述低聚糖为海藻糖、蔗糖和麦芽糖中的至少一种。所述低聚糖均可以为常规的市售品。
根据本发明提供的微生物低温保存保护剂，其中，所述琼脂糖是以琼脂和/或提纯的琼脂糖的形式添加到所述微生物低温保存保护剂中的，所述琼脂中，琼脂糖的含量至少为70重量％。所述琼脂和所述提纯的琼脂糖均可以为常规的市售品。其中，甘油、甘露醇和脱脂奶粉均可以为常规的市售品。所述脱脂奶粉是指符合GB 5410-1999标准的脱脂乳粉。本领域技术人员公知的是，用于微生物领域的上述市售品应当是洁净的，例如可以是食品级、化学纯或分析纯的。
本发明还提供了一种微生物低温保存方法，该微生物低温保存方法包括：将如上所述的微生物低温保存保护剂与水混合后再与待保存的微生物混合，然后将混合后的物料置于保存温度下；或者将待保存的微生物与含有水的微生物低温保存保护剂混合，然后将混合后的物料置于保存温度下。
其中，所述混合的方法没有特别的要求，可以为常规的吹打和/或振荡。其中，所述微生物可以为培养得到的培养物，也可以为该培养物离心分离得到的微生物体。
根据本发明提供的微生物低温保存方法，其中，所述微生物低温保存保护剂相对于一定量微生物的用量可以在较大范围内变化，相对于109个微生物，所述微生物低温保存保护剂的用量可以为1-5克，优选为1-3克。
根据本发明提供的微生物低温保存方法，其中，所述保存温度可以为本领域常规的微生物低温保存的保存温度，典型地，所述保存温度可以为零下260℃至5℃之间的任意温度。典型地，用于微生物低温保存方法的设备可以为常规的各种设备，例如温度设置为4℃左右的冰箱、温度设置为零下20℃左右的冰箱、温度设置为零下80℃左右的冰箱、温度设置为零下160℃左右的冰箱或液氮保存罐(零下196℃以下)等。一般地，保存温度越低，保存的效果越好。为了降低安装运行所述保存设备的成本，优选情况下，所述保存温度为0℃至5℃之间的任意温度，或者，所述保存温度为零下30℃至零下15℃之间的任意温度。
根据本发明提供的微生物低温保存方法，其中，作为一种特别优选的实施方式，所述保存温度为零下30℃至零下15℃之间的任意温度，并且，在将混合后的物料置于零下30℃至零下15℃之间的任意温度之前，先将混合后的物料置于0℃至5℃之间的任意温度下1-5h，更优选2-4h。在该优选实施方式下，微生物经过低温保存后的存活率和菌体活性得到进一步提高。
根据本发明提供的微生物低温保存方法，其中，该微生物低温保存方法适用于常规的各种微生物，特别是发酵工程领域常用的各种微生物，典型地，所述微生物为大肠埃希菌(拉丁学名为Escherichia coli)、黄色短杆菌(拉丁学名为Brevibacterium flavum)和谷氨酸棒状杆菌(拉丁学名为Corynebacterium glutamicum)中的至少一种。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，低聚糖、甘油、甘露醇、脱脂奶粉和琼脂糖均为购自国药集团公司的市售品。
制备实施例1
按照表1所示的重量份将低聚糖、甘油、甘露醇、脱脂奶粉和琼脂糖混合，分别得到储存状态下的微生物低温保存保护剂1-3。
表1(重量份)
制备实施例2
将制备实施例1得到的储存状态下的微生物低温保存保护剂1-3加水混合并加热到95℃后自然冷却到室温，得到使用状态下的微生物低温保存保护剂1-3。其中，相对于储存状态下的微生物低温保存保护剂1-3中每100重量份的低聚糖，水的用量为1000重量份。
测试实施例1
将大肠杆菌(Escherichia coli，菌株号为10586，购自ATCC)在LB培养基(将10克胰蛋白胨、5克酵母提取物和10克氯化钠加水定容至1L后高压灭菌得到1L的LB培养基)中，在37℃下培养到109个大肠杆菌/mL的菌体浓度，得到培养物。将该培养物作为待低温保存的微生物。
将1mL的上述培养物(含109个大肠杆菌)分别与1mL的制备实施例2得到的使用状态下的微生物低温保存保护剂1-3混合均匀，在4℃下2h后转至零下20℃下低温保存半年，然后在室温下用稀释涂平板计数法(参照文献(叶磊、杨学敏，微生物检测技术，化学工业出版社，2009年第1版)中的方法进行)测得大肠杆菌的存活率分别为98％、96％和97％。
测试实施例2
将大肠杆菌(Escherichia coli，菌株号为10586，购自ATCC)在LB培养基(将10克胰蛋白胨、5克酵母提取物和10克氯化钠加水定容至1L后高压灭菌得到1L的LB培养基)中，在37℃下培养到109个大肠杆菌/mL的菌体浓度，得到培养物。将该培养物作为待低温保存的微生物。
将1mL的上述培养物(含109个大肠杆菌)分别与1mL的制备实施例2得到的使用状态下的微生物低温保存保护剂1-3混合均匀，直接置于零下20℃下低温保存半年，然后在室温下用稀释涂平板计数法(参照文献(叶磊、杨学敏，微生物检测技术，化学工业出版社，2009年第1版)中的方法进行)测得大肠杆菌的存活率分别为95％、94％和93％。
对比例1
按照表2所示的重量份将各物料混合，得到微生物低温保存保护剂4-6。
表2(重量份)
将与测试实施例1相同的大肠杆菌在LB培养基(将10克胰蛋白胨、5克酵母提取物和10克氯化钠加水定容至1L后高压灭菌得到1L的LB培养基)中，在37℃下培养到109/mL的菌体浓度，得到培养物。将该培养物作为待低温保存的微生物。
将1mL的上述培养物(含109个大肠杆菌)分别与1mL的上述微生物低温保存保护剂4-6混合均匀，在4℃下2h后转至零下20℃下低温保存半年，然后在室温下用与测试实施例1相同的方法测得大肠杆菌的存活率分别为90％、89％和88％。
通过测试实施例1、测试实施例2和对比例1的比较，可以看出过本发明的技术方案，微生物经过低温保存后的存活率得到了显著提高；并且在优选在将混合后的物料置于零下30℃至零下15℃之间的任意温度之前，先将混合后的物料0℃至5℃之间的任意温度下放置1-5h的情况下，能够进一步提高微生物经过低温保存后的存活率。
测试实施例3
将黄色短杆菌(Brevibacterium flavum，商品号1551C0003000002018，购自四川省微生物资源保藏中心)在基本培养基(配制方法为10克胰蛋白胨、5克酵母提取物和10克氯化钠加水定容至1L后高压灭菌得到1L的LB培养基)中，在35℃下培养到109/mL的菌体浓度，得到培养物。将该培养物作为待低温保存的微生物。
将1mL的上述培养物(含109个黄色短杆菌)分别与1mL的制备实施例2得到的使用状态下的微生物低温保存保护剂1-3混合均匀，在4℃下低温保存7天，然后全部接种到1L的LB培养基(配制方法为10克胰蛋白胨、5克酵母提取物和10克氯化钠加水定容至1L后高压灭菌得到1L的LB培养基)中，以培养到1012个活菌体量所需要的培养时间为种子罐周期，测得种子罐周期分别为15h、15.5h和14.5h。
对比例2
将与测试实施例3相同的黄色短杆菌在LB培养基(配制方法为10克胰蛋白胨、5克酵母提取物和10克氯化钠加水定容至1L后高压灭菌得到1L的LB培养基)中，在35℃下培养到109/mL的菌体浓度，得到培养物。将该培养物作为待低温保存的微生物。
将1mL的上述培养物(含107个赖氨酸产生菌)分别与1mL的对比例1得到的微生物低温保存保护剂4-6混合均匀，在4℃下低温保存7天，然后用与测试实施例3相同的方法测得种子罐周期分别为18h、18.5h和17.5h。
通过测试实施例3和对比例2的比较，可以看出过本发明的技术方案，微生物经过低温保存后的菌体活性得到了显著提高。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (10)
1.一种微生物低温保存保护剂，该微生物低温保存保护剂含有低聚糖、甘油、甘露醇、脱脂奶粉和琼脂糖。
2.根据权利要求1所述的微生物低温保存保护剂，其中，相对于100重量份的低聚糖，甘油的含量为20-70重量份，甘露醇的含量为20-70重量份，脱脂奶粉的含量为100-200重量份，琼脂糖的含量为0.1-1重量份，优选情况下，相对于100重量份的低聚糖，甘油的含量为40-70重量份，甘露醇的含量为40-60重量份，脱脂奶粉的含量为150-200重量份，琼脂糖的含量为0.4-0.8重量份。
3.根据权利要求1或2所述的微生物低温保存保护剂，其中，所述低聚糖为海藻糖、蔗糖和麦芽糖中的至少一种。
4.根据权利要求1或2所述的微生物低温保存保护剂，其中，所述琼脂糖是以琼脂和/或提纯的琼脂糖的形式添加到所述微生物低温保存保护剂中的，所述琼脂中，琼脂糖的含量至少为70重量％。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的微生物低温保存保护剂，其中，所述微生物低温保存保护剂还含有水，相对于100重量份的低聚糖，水的含量为800-1500重量份，优选为900-1200重量份。
6.一种微生物低温保存方法，该微生物低温保存方法包括：将权利要求1-4中任意一项所述的微生物低温保存保护剂与水混合后再与待保存的微生物混合，然后将混合后的物料置于保存温度下；或者将待保存的微生物与权利要求5所述的微生物低温保存保护剂混合，然后将混合后的物料置于保存温度下。
7.根据权利要求6所述的微生物低温保存方法，其中，相对于109个微生物，所述微生物低温保存保护剂的用量为1-5克，优选为1-3克。
8.根据权利要求6或7所述的微生物低温保存方法，其中，所述保存温度为0℃至5℃之间的任意温度，或者，所述保存温度为零下30℃至零下15℃之间的任意温度。
9.根据权利要求8所述的微生物低温保存方法，其中，所述保存温度为零下30℃至零下15℃之间的任意温度，并且，在将混合后的物料置于零下30℃至零下15℃之间的任意温度之前，先将混合后的物料0℃至5℃之间的任意温度下放置1-5h，优选2-4h。
10.根据权利要求6-9中任意一项所述的微生物低温保存方法，其中，所述微生物为大肠埃希菌(Escherichia coli)、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)和谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)中的至少一种。
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Granted publication date: 20140716 Termination date: 20180428 |