CN102649945B - 一种嗜酸乳杆菌冻干保护剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种嗜酸乳杆菌冷冻干燥保护剂，其含有：1.0‑5.0％海藻糖；5.0‑20.0％脱脂奶粉；2.0‑8.0％蔗糖；0.4‑1.0％D‑异抗坏血酸；0.5‑2.0％谷氨酸钠。本发明提供的冻干保护剂具有体积小、含菌量高、低污染、便于保藏、运输，使用方便等优点。用本发明的冷冻干燥保护剂制备的嗜酸乳杆菌干粉的活菌数可达到4.0×1011CFU/g以上。

Description

一种嗜酸乳杆菌冻干保护剂

技术领域

本发明具体涉及一种嗜酸乳杆菌冻干保护剂及含有其的嗜酸乳杆菌冻干剂，属于微生态制剂工艺技术领域。

背景技术

嗜酸乳杆菌是动物体中固有的有益菌，它和双歧杆菌占动物体肠道内益生菌的95％以上，它们主要是通过维护肠道的微生态平衡而起到促进动物健康作用的。嗜酸乳杆菌主要存在在肠道的上半部，与主要存在在下半部的双歧杆菌共同维护着整个肠道的健康。综合起来具有以下几方面的作用：

(1)提高免疫力：嗜酸乳杆菌可产生大量的免疫球蛋白，从而激活集体的免疫细胞，使得外在菌难以留存在动物体内，达到免疫调节作用。

(2)改善胃肠道功能：嗜酸乳杆菌在肠道粘膜表面形成保护屏障，能够产生乳酸和醋酸，形成不利于有害菌生长的环境，抑制有害菌的生长，从而起到调节肠道菌群平衡的作用。

(3)营养功能：嗜酸乳杆菌能够产生乳酸和醋酸，能够提高钙、磷、铁的利用率，促进铁和维生素的吸收，产生维生素K和维生素B，产生乳糖酶帮助消化乳糖。

(4)恢复因使用抗生素后而破坏的肠道菌群。

但是，嗜酸乳杆菌作为益生菌在生产制备、贮藏和进入肠道之前很容易失活，为了得到较高的活菌，需要对其进行必要的保护，因此，嗜酸乳杆菌的保护技术成为其应用于在动物生产时的核心技术问题。

冷冻保藏和冻干技术是生物学的一个重要应用技术，近年来这一技术因为“功能性食品”的快速发展而被应用于食品生产中，酸奶中的乳酸菌发酵剂的制备也常用该技术。然而，要想获得理想的冷冻及冻干效果，除工艺外，主要是筛选和使用适宜的冷冻保护剂。适宜的冻干保护剂能够使得益生菌在冻干过程中的保藏最小限度死亡，减轻冷冻干燥所引起的对菌体的损伤，在保存时耐受较高的温度不损害菌体的活力。因而，冻干保护剂的种类、浓度和配制方法对益生菌的保存效果有明显的影响。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种嗜酸乳杆菌的冷冻干燥保护剂。

首先，本发明提供一种嗜酸乳杆菌冷冻干燥保护剂，其含有：

1.0-5.0％海藻糖；

5.0-20.0％脱脂奶粉；

2.0-8.0％蔗糖；

0.4-1.0％D-异抗坏血酸；

0.5-2.0％谷氨酸钠。

进一步地，本发明提供一种嗜酸乳杆菌冷冻干燥保护剂，其含有5％海藻糖、15％脱脂奶粉、4％蔗糖、1％D-异抗坏血酸和2.0％谷氨酸钠。

其中，所述冷冻干燥保护剂的悬浮基质为无菌生理盐水或MRS液体培养基。

其中，所述的脱脂奶粉为伊利高蛋白脱脂高钙奶粉。

本发明还提供一种嗜酸乳杆菌冻干剂，其含有所述的冷冻干燥保护剂。

进一步地，所述的嗜酸乳杆菌为嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093。

本发明中的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)为申请人从动物肠道中分离得到，能分泌抗生物素类物质(嗜酸乳菌素、嗜酸杆菌素、乳酸菌素)，对肠道致病菌产生拮抗作用，抑制肠道不良微生物的增殖，调整肠道菌群平衡，它的生物学特征如下：杆菌，两端圆，0.6-0.9×1.5-6μm，以单个、成双或短链出现；不运动，无边帽，菌落粗糙。在显微镜下观察，显示缠绕或微绒毛丝状物，从似暗影的菌堆的中心放射伸出。无特有的色素。可同化苦杏仁苷、纤维二糖、七叶苷、果糖、麦芽糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、蜜二糖、棉籽糖、海藻糖，不能同化***糖、葡萄糖酸盐、甘露糖。同型发酵，产生DL-乳酸。15℃下不生长，最适生长温度为35℃-38℃，生长初始pH值为5.0-7.0，最适生长pH值为5.5-6.0。本发明的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)申请人已于2011年7月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.5093。

本发明提供的冻干保护剂具有体积小、含菌量高、低污染、便于保藏、运输，使用方便等优点。用本发明的冷冻干燥保护剂制备的嗜酸乳杆菌干粉的活菌数可达到4.0×10¹¹CFU/g以上。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1嗜酸乳杆菌的种子液制备

嗜酸乳杆菌的活化培养：将甘油冻存管中保藏菌种嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093用接种针在MRS琼脂培养基平板中划线，37℃恒温培养20h。然后将平板上长出的单菌落接种至装有100mLMRS液体培养基的250mL锥形瓶中，37℃恒温培养20h。再次将培养好的菌液在MRS培养基平板上划线培养，37℃恒温培养20h后，将单菌落接种至装有100mLMRS液体培养基的250mL锥形瓶中，37℃恒温培养20h。将以上操作重复3次，完成嗜酸乳杆菌的活化。

嗜酸乳杆菌的种子液的制备：将活化好的嗜酸乳杆菌的单菌落接种至装有100mL MRS培养基的250mL锥形瓶中，37℃恒温培养20h。

培养嗜酸乳杆菌所用的MRS液体培养基配方如下：蛋白胨，10.0g/L；牛肉膏，8.0g/L；酵母膏，4.0g/L；葡萄糖，20.0g/L；吐温80，1mL/L；磷酸氢二钾，2.0g/L；三水乙酸钠，5.0g/L；柠檬酸三铵，2.0g/L；七水硫酸镁，0.2g/L；硫酸锰，0.05g/L；pH 6.2±0.2。

MRS琼脂培养基是在MRS液体培养基的基础上添加琼脂15g/L。

实施例2不同材料对嗜酸乳杆菌冷冻干燥保护的效果比较

1、实验材料

(1)悬浮基质：MRS增菌液MRS液体培养基，经121℃灭菌15分钟。

(2)供试菌种：嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093。

(3)保护剂材料：蔗糖、乳糖、脱脂奶粉、D-异抗坏血酸、玉米淀粉、谷氨酸钠、海藻糖、山梨醇、甘油。

(4)补料：50％的葡萄糖，经121℃灭菌15分钟。

(4)菌落计数培养基：MRS琼脂培养基。

(5)真空冷冻干燥机：德国CHRIST ALPHA2-4LSC型。

2、嗜酸乳杆菌的冷冻干燥

2.1嗜酸乳杆菌的增殖培养

将培养好的种子液300mL接种至4L优化培养基的5L发酵罐中，培养参数为：温度，37℃；搅拌速度，50rmp；pH值，6.0±0.5；培养时间，24h。

嗜酸乳杆菌的增殖培养所用的优化培养基配方如下：蛋白胨，10.0g/L；牛肉膏，8.0g/L；酵母膏，6.0g/L；葡萄糖，25.0g/L；吐温80，1mL/L；磷酸氢二钾，3.0g/L；三水乙酸钠，5.0g/L；柠檬酸三铵，2.0g/L；七水硫酸镁，0.2g/L；硫酸锰，0.05g/L；pH 6.2±0.2。发酵过程中加入0.5-1％的CaCO₃，调节pH在6.2～6.5；发酵8h后进行补料，即加入50％的葡萄糖200mL。

将发酵完成的嗜酸乳杆菌发酵液取出，并进行活菌计数，发酵液中嗜酸乳杆菌活菌数达到1.8×10⁹CFU/mL。

活菌计数采用平板涂布计数法：取1mL菌液加入到9mL无菌水中，用十倍梯度稀释法稀释，选择适宜的三个稀释梯度进行测定。分别吸取样品稀释液0.1mL，每个稀释度做三个平板，倒置于37℃恒温箱中培养36h，计数，并按如下公式计算。

嗜酸乳杆菌发酵液活菌数(CFU/mL)＝每平皿平均菌体数(CFU)×10×稀释倍数

2.2嗜酸乳杆菌发酵液的收集浓缩

将嗜酸乳杆菌发酵液进行高速离心，转速4000rmp，20min，得到菌泥，并进行活菌计数，活菌数4.28×10¹²CFU/g。

活菌计数方法：取1g菌泥加入到9mL无菌水中，用十倍梯度稀释法稀释，选择适宜的三个稀释梯度进行测定。分别吸取样品稀释液0.1mL，每个稀释度做三个平板，倒置于37℃恒温箱中培养36h，计数，并按如下公式计算。

嗜酸乳杆菌菌泥活菌数(CFU/g)＝每平皿平均菌体数(CFU)×10×稀释倍数

2.3冻干保护剂的筛选

选取与发酵液同体积的保护剂将离心后的菌泥稀释均匀成菌悬液(悬浮基质为MRS液体培养基)，分装于小瓶中，在超低温冰箱(-80℃)进行预冻贮藏，贮藏4h后，取出在40℃水浴中化冻后，用平板计数法测定活菌数，然后计算出冻干前活菌数。预冻后，置于真空冷冻干燥机中干燥，冷阱温度-50℃左右，真空度20Pa，干燥24h左右后得到嗜酸乳杆菌菌干粉，测定干粉的活菌数。

用倒平板法进行活菌计数，试验重复3次，每次试验取2个平行样。并按照如下公式计算在不同保护剂作用下嗜酸乳杆菌的存活率，由此确定较好的保护剂。

存活率(％)＝V₂×100/V₁

V₁——干燥前的活菌数(1mL液体样的活菌数，CFU/mL)

V₂——干燥后的活菌数(1mL液体样干燥后的活菌数，CFU/mL)

冻干保护剂的筛选结果见表1。

表1冻干保护剂的筛选结果

从表1可以看出，在MRS液体培养基为基质的条件下，蔗糖、脱脂奶粉、海藻糖的冻干保护效果显著，其次是D-异抗坏血酸、谷氨酸钠。另外，从表1中可看出，甘油对嗜酸乳杆菌的冻干保护效果也较好，但申请人在后续的试验中发现，由于甘油黏稠的特性，混合操作不易，且真空冷冻干燥时需要时间较长，从操作简易性和经济性考虑，不适于用作嗜酸乳杆菌的冷冻干燥保护剂。此外，进一步地试验结果也表明，添加了甘油的冷冻干燥保护剂，并没有提高嗜酸乳杆菌冻干粉的活菌数，相反，有些组合与未添加的相比，还降低了活菌数，因此在后续的筛选中，弃用了甘油。

实施例3最佳保护剂优化配方设计

根据菌体冻伤及冷冻保护机理，结合各保护剂的保护效果与作用特点、保护剂的来源、性状，研究由海藻糖、蔗糖、脱脂奶粉、D-异抗坏血酸、谷氨酸钠作为嗜酸乳杆菌冻干保护剂组成的最优配方。

确定好各个保护剂的水平后，设计了5因素4水平L1654的正交试验(见表2)进行嗜酸乳杆菌冻干保护剂最佳组合的优化。正交实验因素水平表见表2，试验设计及实施方案见表3。

表2正交实验因素水平表

表3试验设计及实施方案

注：A：海藻糖，％。B：脱脂奶粉，％。C：蔗糖，％。D：D-异抗坏血酸，％。E：谷氨酸钠，％。1，2，3，4：表示各个保护剂的不同水平。

正交实验结果及统计分析见表4。

从表4中正交试验效果可以看出可知影响程度大小依次为B-C-A-E-D，最佳冻干保护剂的配方组合是A₃B₃C₂D₄E₄，即海藻糖，5％；脱脂奶粉，15％；蔗糖，4％；D-异抗坏血酸，1.0％；谷氨酸钠，2.0％。

表4正交试验实验结果及统计分析

从表4中正交试验效果可以看出可知影响程度大小依次为B-C-A-E-D，最佳冻干保护剂的配方组合是A₃B₃C₂D₄E₄，即海藻糖，5％；脱脂奶粉，15％；蔗糖，4％；D-异抗坏血酸，1.0％；谷氨酸钠，2.0％。

实施例4

将嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093接种到由10.0g/L蛋白胨，8.0g/L牛肉膏，6.0g/L酵母膏，25.0g/L葡萄糖，1mL/L吐温80，3.0g/L磷酸氢二钾，5.0g/L三水乙酸钠，2.0g/L柠檬酸三铵，0.2g/L七水硫酸镁，0.05g/L硫酸锰和余量的水组成的优化培养基中，发酵温度，37℃左右；搅拌速度，50rmp；pH值，6.0～6.5；培养时间，24h。在发酵过程中加入0.5-1％的CaCO₃，调节pH在6.2～6.5；发酵进行8h后进行补料，加入50％的葡萄糖200mL；发酵完成后在4℃进行发酵液的离心处理，转数为4000rmp，20min，得到菌泥。

选取与发酵液同体积的保护剂将离心后的菌泥在无菌条件下稀释均匀成菌悬液(悬浮基质为MRS液体培养基)，冻干保护剂由5％的海藻糖、15％的脱脂奶粉、4％的蔗糖、1％的D-异抗坏血酸和2.0％的谷氨酸钠组成；在-80℃冷冻冰箱中进行预冷冻处理4h，然后进行真空冷冻干燥，冷阱温度-50℃左右，真空度20Pa，干燥24h左右后得到嗜酸乳杆菌干粉，测定干粉的活菌数，活菌数达到4.2×10¹¹CFU/g。

实施例5

基本同实施例4，不同之处在于使用无菌生理盐水为冷冻干燥剂的悬浮基质。由此得到的嗜酸乳杆菌干粉的活菌数达到4.0×10¹¹CFU/g。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093冷冻干燥方法，其为将嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093种子液300mL接种到由10.0 g/L蛋白胨，8.0 g/L牛肉膏，6.0 g/L酵母膏，25.0 g/L葡萄糖，1 mL/L吐温80，3.0 g/L磷酸氢二钾，5.0 g/L三水乙酸钠，2.0 g/L柠檬酸三铵，0.2 g/L七水硫酸镁，0.05 g/L硫酸锰和余量的水组成的4L培养基中，发酵温度，37℃；搅拌速度，50rmp；pH值，6.0~6.5；培养时间，24h，在发酵过程中加入0.5-1%的CaCO₃，调节pH在6.2~6.5；发酵进行8h后进行补料，加入50%的葡萄糖200mL；发酵完成后在4℃进行发酵液的离心处理，转数为4000rmp，20min，得到菌泥；

选取与发酵液同体积的保护剂将离心后的菌泥在无菌条件下稀释均匀成菌悬液，悬浮基质为MRS液体培养基或无菌生理盐水，冻干保护剂由5%的海藻糖、15% 的脱脂奶粉、4% 的蔗糖、1% 的D-异抗坏血酸和2.0%的谷氨酸钠组成；在-80℃冷冻冰箱中进行预冷冻处理4h，然后进行真空冷冻干燥，冷阱温度-50℃左右，真空度20Pa，干燥24h后得到嗜酸乳杆菌干粉。